As doenças virais têm sido importantes causas de morbidade e mortalidade nas últimas décadas, sendo que algumas delas são relacionadas com polimorfismos genéticos, que determinam a susceptibilidade do hospedeiro ou a resistência a essas infecções, influenciando na patogênese, além de desempenhar importante papel em respostas ao tratamento. Entre elas, destaca-se o HTLV-1, sendo que cerca de 10 a 20 milhões de pessoas em todo o mundo possuem esse vírus. Apenas 5% dos indivíduos infectados desenvolverão algum tipo de doença relacionada a tal infecção, entre elas destaca-se a HAM/TSP. Apesar da complexidade, o entendimento das interações hospedeiro versus HTLV-1 é de fundamental importância para avaliar prognóstico clínico dos portadores assintomáticos, visto que as opções diagnósticas e de tratamento não são adequadas, até o momento, para determinar o risco de progressão para HAM/TSP. Com isso, este trabalho objetivou estudar a associação entre alguns marcadores virais, genéticos e imunológicos relacionados ao desenvolvimento de HAM/TSPem pacientes infectados por HTLV-1. O ambulatório de HTLV do Instituto de Infectologia \"Emilio Ribas\" (IIER) possui uma coorte de portadores de HTLV em seguimento há 19 anos, para o presente estudo foram selecionados 247 voluntários portadores de HTLV-1, por conveniência. Somente pacientes adultos, com seguimento ativo no ambulatório no período de junho de 2011 até julho de 2016 foram convidados a participar. Este protocolo foi aprovado pelo CEP do IIER (Nº13/2011), e o TCLE foi obtido de todos os voluntários participantes. Os indivíduos foram classificados de acordo com seu quadro clínico neurológico em dois grupos: Grupo I (160 assintomáticos) e Grupo II (87 HAM/TSP). Amostra de sangue venoso foi coletada e as células mononucleares separadas. O material foi utilizado para o ensaio de PVL e para a genotipagem de IFN-?4, HLA-C e KIR, pela técnica de qPCR . A análise estatística no modelo multivariado mostrou associação de risco para HAM/TSP com as variáveis LPA (p=0,001) e a idade (p=0,019), além disso, o polimorfismo doIFN-?4 no rs8099917 foi associado no modelo recessivo(OR=0,31, IC=0,105 - 0,961) como fator de proteção ao desfecho.:Esse modelo estudado explica 8% dos fatores de progressão e de proteção para HAM/TSP. Desse modo, estudos genéticos multicêntricos envolvendo análise de exoma e maior número de casos de HAM/TSP, deveriam ser realizados. O entendimento da patogênese da mielopatia pode oferecer marcadores de valor prognóstico importantes para o manejo clínico, além de contribuir para o achado de novas intervenções terapêuticas no futuro. / The viral diseases have been major causes of morbidity and mortality in recent decades, some of which are related to genetic polymorphisms, which determine the susceptibility or resistance to these infections, influencing the pathogenesis, besides of playing an important role in responses to treatment. Among them, it is highlighted HTLV-1, in which around 10 to 20 million people worldwide. Only 5% of infected subjects will develop some kind of disease related to such infection, including HAM/TSP. Despite the complexity, the understanding of host interactions versus HTLV-1 is fundamental importance to evaluate clinical prognosis of asymptomatic subjects, once the diagnostic options and treatment are not adequate, so far, to determine the risk of progression to HAM/TSP. Therefore, the purpose of this study was to investigate the association among some genetic polymorphisms, viral and immunological markers related to the development of HAM/TSP in HTLV-1-infected subjects. At the Institute of Infectious Diseases \"Emilio Ribas\" (IIER) has a cohort of HTLV subjects followed up for 19 years, for this study 247 volunteers with HTLV-1were selected for convenience. Only adult patients with active follow up in the period from June 2011 to July 2016 were invited to participate. This protocol was approved by the ethical committee at IIER (nº13/2011), informed consent was obtained. Subjects were classified according to their neurological status in two groups: Group I (160 asymptomatic) and Group II (87 HAM / TSP). Blood sample was collected and PBMCs The DNA was used to the PVL assay and IFN-?4, HLA-C and KIR genotyping using qPCR. It has been observed an association to HAM/TSP with LPA variables (p=0.001) and age (p=0.019) in the multivariable analysis. On the other hand, the polymorphism of IFN-?4 rs8099917 was associated in the recessive model (OR=0.31, CI=0.105-0.961) as a protective factor to HAM/TSP. This study explains 8% of progression and protective factors for HAM/TSP. Thus, multi-center studies involving genetic analysis and more cases of HAM/TSP, should be done. The understanding of the HAM/TSP pathogenesis can provide important markers of prognostic value for clinical management and contribute to the discovery of new therapeutic interventions in the future.

O HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) foi o primeiro retrovírus humano a ser identificado. O HTLV-1 tem a capacidade de ativar e gerar uma intensa resposta inflamatória, podendo levar a alterações em diversos tecidos que mimetizam uma doença autoimune. Do complexo de doenças associadas ao HTLV-1, a Síndrome de Sjögren (SS) figura entre as mais estudadas. No entanto, nenhuma relação definitiva foi ainda estabelecida. Este trabalho propõe-se a investigar indícios da presença do HTLV-1 em glândulas salivares menores de pacientes infectados por esse retrovírus e comparar as alterações morfológicas em glândulas salivares menores de pacientes com HTLV-1 e de pacientes com SS não infectados. Amostras de glândula salivar menor foram coletadas de 14 pacientes HTLV+ que apresentavam síndrome seca (grupo de estudo) e 5 pacientes diagnosticados com SS e negativos para o HTLV (grupo controle). No grupo de estudo, o infiltrado inflamatório visto era composto principalmente por linfócitos T CD4+, no grupo controle a população majoritária foi de linfócitos B CD20+. Alterações morfológicas como fibrose e infiltração gordurosa foram mais comumente vistas nas amostras do grupo de estudo, sendo a diferença estatisticamente significativa (p=0,038 e 0,033 respectivamente). Na análise por PCR 11 (78,57%) dos casos do grupo de estudo foi detectado o gene tax e/ou rex do HTLV-1, no entanto 4 (80%) das amostras do grupo controle também foram positivas. O HTLV-1 mostra indícios de estar presente nas glândulas salivares de indivíduos com síndrome seca, no entanto pacientes HTLV-1+ apresentam alterações morfológicas em padrões diferentes dos vistos em pacientes com SS, denotando uma provável diferença no processo de ativação imunológica. / Human T-cell lymphotropic virus type I (HTLV-1) was the first human retrovirus to be discovered. HTLV-1 has the ability to activate and generate an intense inflammatory response, which can lead to changes in several tissues that mimic an autoimmune disease Of the complex of diseases associated with HTLV-1, Sjögren\'s Syndrome (SS) is among the most studied. The aim of this study is to investigate the presence of HTLV-1 in the minor salivary glands of patients infected with this retrovirus and to compare the morphological alterations in the salivary glands of patients with HTLV-1 and patients with SS uninfected. Minor salivary gland samples were obtained from 14 HTLV + patients with dry syndrome (study group) and 5 patients diagnosed with SS and HTLV negative (control group). In the study group, the inflammatory infiltrate was mainly composed of CD4+ T lymphocytes, in the control group the majority population was of CD20+ B lymphocytes. Morphological changes such as fibrosis and adipose tissue infiltration were more common in the study group, the difference was statistically significant (p = 0.038 and 0.033, respectively). The HTLV-1 tax and/or rex genes were detected by PCR in 11 (78.57%) patients of the study group, but 4 (80%) samples from the control group were also positive. HTLV-1 shows signs of being present in the salivary glands of individuals with dry syndrome however, HTLV-1+ patients present morphological alterations in different patterns from those observed in SS patients, denoting a probable difference in the immunological activation process.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 392212.pdf: 1435232 bytes, checksum: c5e320809f8271743be3719e2d01aeda (MD5) Previous issue date: 2007-06-12 / Introdu??o e Objetivos: As infec??es por HTLV-I/II se caracterizam pelo tropismo viral por infectar c?lulas T humanas e promover um estado de prolifera??o espont?nea deste tipo celular. Leucemia e doen?as inflamat?rias graves, com destaque para as doen?as neurol?gicas, est?o fortemente associadas ?s infec??es por HTLV-I/II e o tratamento usual destas patologias envolve a administra??o de antiinflamat?rios da classe dos glicocortic?ides. Embora haja relatos de resist?ncia farmacol?gica ? terapia com glicocortic?ides, n?o se sabe ao certo se essa condi??o se deve ? infec??o viral ou ao hospedeiro. Neste estudo, avaliou-se a rela??o entre prolifera??o celular espont?nea e sensibilidade de linf?citos T aos efeitos dos glicocortic?ides (dexametasona - DEX). Materiais e M?todos: C?lulas mononucleares de sangue perif?rico foram isoladas de pacientes assintom?ticos e livres de tratamento, com infec??o por HTLV-I (n=18) e HTLV-II (n=10), e foram cultivadas na presen?a e na aus?ncia do mit?geno fitohemaglutinina (PHA 1%). C?lulas foram tamb?m cultivadas com PHA 1% e concentra??es variadas de DEX (10-9 a 10-4 M). Para fins comparativos, as mesmas avalia??es foram realizadas em sujeitos saud?veis (Controle, n=11). Resultados e Discuss?o: Os pacientes com HTLV-I/II apresentaram taxas similares de prolifera??o estimulada (PHA 1%) e n?o-estimulada (PHA 0%), bem como sensibilidade compar?vel ? DEX. N?o houve diferen?a na freq??ncia de indiv?duos resistentes versus sens?veis ? DEX entre os grupos HTLV-I e HTLV-II. Entretanto, linf?citos T de pacientes com prolifera??o espont?nea n?o responderam ao est?mulo mitog?nico por PHA e foram mais resistentes ? modula??o por DEX do que as c?lulas de pacientes com prolifera??o normal. Os resultados aqui apresentados sugerem que a baixa resposta cl?nica ? terapia com glicocortic?ides pode estar associada a um estado de prolifera??o celular espont?nea decorrente da infec??o por HTLV.

Thesis (M. Sc.)--University of Alberta, 2009. / Title from pdf file main screen (viewed on January 10, 2010). "A thesis submitted to the Faculty of Graduate Studies and Research in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Applied Mathematics, Department of Mathematics and Statistical Sciences, University of Alberta." Includes bibliographical references.

Two areas of the HTLV-I genome were targeted for an in-house molecular diagnostic test, namely the pol and env regions. The pol primers proved the most sensitive (100%)and specific (100%). Amplification using the env primer pair was not reproducible, and was not pursued further. The AmpliSensor assay (Acugen Systems, Lowell, MA) was also tested. The assay was very specific, but not as sensitive as our in-house PCR. To investigate the predominant HTLV-I subtype in the region, a 1535 by env gene was isolated from peripheral blood obtained from five local HTLV-I seropositive patients. Four of the patients presented with HAM/TSP, and the fifth presented with a skin disease. Nucleotide sequencing of the amplified products revealed the local strains to be very conserved, differing by 0.1% to 0.9% among themselves. No apparent difference was noted for the two clinical manifestations. Phylogenetic analysis was performed using repesentative strains from around the world. The local strains clearly fell within the cosmopolitan subtype. The local strains were most closely related to the North American strains suggesting an unexpected link between the two countries. / Thesis (M.Med.Sc.)-University of Natal, Durban, 1998.

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) está associado etiologicamente à duas principais manifestações clínicas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças associadas ao vírus, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Os linfócitos T CD4+ são os principais reservatórios do HTLV-1 in vivo e possuem uma participação importante na resposta imunológica dirigida a este retrovírus. Essas células são ativadas precocemente durante a infecção pelo HTLV-1 e auxiliam na resposta dos linfócitos T CD8 citotóxicos (CTLs), bem como na produção de anticorpos. No presente estudo, foi avaliado o perfil de expressão gênica global dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores assintomáticos (HAC), pacientes com HAM/TSP e de indivíduos sadios (CT) por meio da metodologia de microarray. Os linfócitos T CD4+ utilizados foram isolados por separação imunomagnética e foram realizados microarrays de doze amostras individuais: quatro amostras do grupo CT, quatro amostras do grupo HAC e quatro do grupo HAM/TSP. Os dois últimos grupos continham duas amostras com alta e duas com baixa expressão da proteína Tax. As análises de agrupamento hierárquico revelaram que o perfil de expressão gênica dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 difere dos indivíduos do grupo CT pela formação de dois agrupamentos distintos. Ademais, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 se agruparam de acordo com o estado clínico e independente da expressão de Tax. Foram realizadas as comparações entre os grupos CT vs. HAC, CT vs. HAM/TSP e HAM/TSP vs. HAC e os dados demonstraram que 221, 254 e 70 genes estavam diferencialmente expressos, respectivamente. Além disso, foram observados 86 genes presentes nas intersecções entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes entre CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC e apenas um gene entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. Estes genes diferencialmente expressos estavam associados à citocinas, lise e migração celular. Os achados foram validados por PCR quantitativo em um total de 23 indivíduos assintomáticos, 17 com HAM/TSP e 25 indivíduos sadios. A validação evidenciou o aumento da expressão dos genes PXN, CXCR4, PRF1 e Foxp3 no grupo HAM/TSP em relação ao grupo HAC, além do aumento de IL-27 nos indivíduos do grupo HAC comparados com os indivíduos do grupo HAM/TSP. Adicionalmente, foi realizada a quantificação dos níveis protéicos de PRF1, GZMB, CXCR4 por citometria de fluxo. Entretanto, nenhuma diferença foi observada entre os diferentes grupos analisados. Ainda, por meio de citometria de fluxo, a população de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+, bem como CD4+Foxp3+ foram analisadas e observou-se maiores níveis de expressão de CD4+Foxp3+ nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A porcentagem de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ não mostrou diferença significativa entre os três grupos comparados. Os resultados evidenciados neste projeto ressaltam a importância das células CD4+ no controle da resposta imune contra a infecção pelo HTLV-1. O aumento na expressão gênica de PXN e CXCR4, que fazem parte da via de sinalização de CXCR4, sugere a ocorrência de migração celular nos indivíduos com HAM/TSP, provavelmente para o SNC. Além disso, o aumento das células Treg parecem suprimir a atividade das células T CD8+ pela via perforina/granzima, que por sua vez aumentaria a carga proviral, aumentando assim o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) is etiologically associated with two major diseases: the adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and the HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). About 2 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1-related diseases, while the majority remains life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is not well elucidated. CD4+ T cells are the predominant subset of cells infected with HTLV-1 in vivo and they are also important as effector cells against the infection. These cells are early activated during infection with HTLV-1 and assist the response of CD8 cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and antibody production. To identify genes differentially expressed among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied the microarray using CD4+ T cells isolated from these individuals. The CD4+ T lymphocytes were isolated by magnetic cell separation system and twelve samples underwent microarray analysis, as follows: 4 CT, 4 HAC and 4 HAM/TSP samples. Two samples had high tax expression and two samples had low tax expression for both infected groups. The hierarchical clustering analysis showed that the gene expression profile of infected individuals is distinct from healthy individuals because two separate clusters were observed. HTLV-1-infected individuals clustering meets with patients clinical status. However, HTLV-1 CD4+ T cells clustering did not correlate with Tax protein expression. We found 221 genes differently expressed between CT and HAC groups, 254 genes between CT and HAM/TSP and 70 genes between HAC and HAM/TSP. Moreover, we observed 86 genes differently expressed in the intersections between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes between CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC and only one gene between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. These genes were associated with cytokines, cell lysis and cell migration. These results were validated by quantitative PCR in 23 HTLV-1 asymptomatic carriers, 17 patients with HAM/TSP and 25 healthy individuals. The validation revealed increased levels of expression of the genes PXN, CXCR4, PRF1, and Foxp3 in the HAM/TSP group compared with HAC group. IL-27 gene expression was increased in HAC group when compared with HAM/TSP group. Additionally, we performed the protein quantification of PRF1, GZMB, and CXCR4 by flow cytometry. However, no difference was observed among the three groups. We also analyzed CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ and CD4+Foxp3+ populations by flow cytometry. There was an increase of CD4+Foxp3+ expression in HTLV-1-infected individual. No differences were observed in CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ population among the three groups. The results shown in this project highlight the importance of CD4+ cells in controlling the immune response against HTLV-1. The gene expression profile of PXN and CXCR4 was increased. These genes are related to CXCR4 signaling pathway that can result in CD4+ T cells migration, probably to the central nervous system. It is also suggested that Treg cells can suppress the T CD8+ activity through perforin/granzyme pathway. This pathway enhances the proviral load increasing the risk of HAM/TSP development.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T19:10:27Z No. of bitstreams: 1 Isabela Archanjo Nunea. Analise dos níveis...2013pdf.pdf: 2339102 bytes, checksum: 867cc830f16593d9b7dad5bc1ec36aec (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T19:10:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isabela Archanjo Nunea. Analise dos níveis...2013pdf.pdf: 2339102 bytes, checksum: 867cc830f16593d9b7dad5bc1ec36aec (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Leucemia/Linfoma de células T do adulto (Adult T-cell leukemia - ATL) é uma neoplasia humana agressiva das células T CD4+ e que foi associada ao retrovírus HTLV-1. A diversidade das manifestações clínicas da ATL determinou a subdivisão desta neoplasia em cinco formas clínicas: aguda, linfoma, tumoral primária de pele, crônica e smoldering. O HTLV-1 é capaz de estimular a proliferação das células infectadas através dos produtos de alguns genes virais, sendo esta uma das estratégias para aumentar a carga proviral (proviral load – PVL). Dentre eles, o gene viral tax e o gene HBZ (HTLV-1 basic leucine zipper factor) são apontados como os principais responsáveis pela oncogenicidade do HTLV-1. Não está bem estabelecida a relação ente os níveis de carga proviral e os níveis de expressão dos genes virais tax e HBZ nas diferentes formas clínicas desta neoplasia. Foram descritos dois transcritos para o gene HBZ, o HBZ e o HBZ-SI. Este estudo teve como objetivo a análise da carga proviral e da expressão dos genes virais tax e HBZ nas diferentes manifestações da ATL. Foram incluídos no estudo 60 pacientes de ATL para a análise da carga proviral e destes, foi realizado a análise da expressão viral em 38 pacientes. Adicionalmente, foram incluídos 16 portadores assintomáticos adultos. A expressão dos genes tax e HBZ e a carga proviral foram quantificadas pela técnica de PCR em tempo real considerando para a carga proviral a região tax do provírus e utilizando a β-globina como gene de referência e para expressão viral foi utilizado a β-actina como gene de referência. A mediana da carga proviral na ATL foi maior do que nos portadores assintomáticos (p<0,001). Foi observada também uma correlação positiva entre a carga proviral e a linfocitose. As formas smoldering, linfoma e tumoral primária de pele apresentaram carga proviral similar a observada nos portadores assintomáticos. Na expressão dos genes viriais na ATL e em portadores assintomáticos a mediana do transcrito HBZ-SI foi maior em relação ao transcrito HBZ (p<0,0001 e p=0.003, respectivamente) e ao gene tax (p<0,0001 e p=0.003, respectivamente). Observou-se uma correlação positiva entre os níveis de expressão de todos os transcritos estudados. Os níveis de expressão do gene tax e do transcrito HBZ também correlacionaram positivamente com a carga proviral, enquanto que a expressão do transcrito HBZ-SI não correlacionou. Os portadores assintomáticos apresentaram níveis maiores de expressão destes transcritos por célula infetada que os pacientes com ATL com forma aguda. O gene HBZ, principalmente o transcrito HBZ-SI parece ter um papel mais importante que o gene tax na infecção pelo HTLV-1, independentemente da condição clínica. Os portadores assintomáticos parecem ter maior dependência da expressão destes transcritos para estimulação da proliferação celular e manutenção da carga proviral que as formas crônicas e agudas da ATL, que apresentam marcada linfocitose. Os níveis de expressão do transcrito HBZ-SI por célula infectada variam entre as diferentes formas clinicas da ATL. / Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive neoplasm of human CD4+ T cells and was associated with the retrovirus HTLV-1. ATL has different clinical manifestations and hás been classified into five clinical types: acute, lymphoma, primary cutaneous tumoral, chronic and smoldering. The HTLV-1 is capable of stimulating of proliferation of infected cells through the products of some viral genes, this being one of strategies to increase the proviral load (PVL). Among them, the tax viral gene and the gene HBZ (HTLV-1 basic leucine zipper factor) are pointed as the main responsible for the oncogenicity of HTLV-1. Is not fully understood the relation between the levels of proviral load and the levels of expression of the viral genes tax and HBZ in different clinical type of this neoplasm. We describe two transcripts for the HBZ gene, the HBZ and HBZ-SI. The goal of this study was to analyze the proviral load and the expression of viral genes tax and HBZ in the different manifestations of ATL. Was included 60 patients for the proviral load analysis and these was performed the analysis of viral expression in 38 patients. Additionally, we included 16 asymptomatic adults. The expression of tax and HBZ genes and proviral load were quantified by PCR real time considering to proviral load the region tax of the provirus and using the β-globin gene as a reference gene and for the viral expression was used β-actin as a reference gene. The proviral load median on ATL was higher than in asymptomatic patients (p<0.001). It was also observed a positive correlation between the proviral load and lymphocytosis. The smoldering, lymphoma and primary cutaneous tumoral types showed similar proviral load to that observed in asymptomatic carriers. In the expression of viral genes in ATL and in asymptomatic carriers the median of transcript HBZ-SI was higher compared to the transcript HBZ (p<0.001 and p=0.0003, respectively) and the tax gene (p<0.001 and p=0.0003, respectively). There was a positive correlation between the expression levels of all the transcripts studied. The expression levels of the tax gene and the transcript HBZ also positively correlated with the proviral load whereas the expression of transcript HBZ-SI did not correlate. Asymptomatic carriers had higher levels of expression of these transcripts per cell infected that the ATL patients with acute type. The HBZ gene, mainly the transcript HBZ-SI seems to have a more important role than the tax gene in HTLV-1, regardless of the clinical condition. Asymptomatic carriers appear to have greater dependency of the expression of these transcripts for stimulation of cell proliferation and maintenance of the proviral load that the chronic and acute types of ATL, which have marked lymphocytosis. The expression levels of transcript HBZ-SI by infected cell vary between different clinical types of ATL.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-19T20:54:41Z No. of bitstreams: 1 Giselle Calasans de Souza Costa. Investigação de Polimorfismos no gene humano da Glut1 - CPqGM - Dissertação de Mestrado - 2008.pdf: 901999 bytes, checksum: f8d18c6846f38a411006c2e451309767 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-19T20:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giselle Calasans de Souza Costa. Investigação de Polimorfismos no gene humano da Glut1 - CPqGM - Dissertação de Mestrado - 2008.pdf: 901999 bytes, checksum: f8d18c6846f38a411006c2e451309767 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O HTLV-1 é o agente etiológico da Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV-1 (TSP/HAM) e da Leucemia/Linfoma das Células T do Adulto (ATLL). No entanto, o desenvolvimento de manifestações clínicas associadas ao HTLV-1 ocorre em 2-4% da população infectada e ainda não se sabe por que esta infecção permanece assintomática na maioria dos portadores. Tem sido sugerido que o desfecho da infecção pode ocorrer devido a variações (mutações) em genes do hospedeiro e/ou do vírus. Recentemente, foi demonstrado que o HTLV é capaz de utilizar a glicoproteína transportadora de glicose do tipo 1 (GLUT1) para infectar linfócitos T CD4+. Diversos estudos têm demonstrado uma associação entre mutações em regiões regulatórias de genes humanos e manifestação de doença. Polimorfismos no gene da GLUT1 foram associados à susceptibilidade a nefropatia diabética, em pacientes com diabetes mellitus dos tipos 1 e 2 em diferentes populações. Com o objetivo de verificar possíveis correlações entre polimorfismos nas regiões regulatórias e codificante do gene humano da GLUT1 com o desenvolvimento de TSP/HAM, analisamos os polimorfismos -2841A>T, XbaIG>T e HaeIIIT>C em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e em indivíduos não-infectados de Salvador. Os SNPs XbaIG>T e HaeIIIT>C foram verificados por PCR/RFLP e o SNP -2841A>T, por seqüenciamento. Além disso, a carga proviral do HTLV-1 foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Com o intuito de verificar a freqüência dos polimorfismos em GLUT1 na população brasileira com diferentes etnias, foi realizada a análise dos polimorfismos XbaIG>T e HaeIIIT>C em Ameríndios da tribo Tiriyó; descendentes de europeus da região Sul do Brasil; descendentes de japoneses, descendentes de europeus e afro-descendentes da região Sudeste. As freqüências genotípicas para os polimorfismos analisados estavam de acordo com o esperado pelo Equilíbrio de Hardy- Weinberg. O polimorfismo HaeIIIT>C estava em desequilíbrio de ligação com os polimorfismos XbaIG>T (χ2=37,555, p=0,003, 4 d.f.) e -2841A>T (χ2=∞, p=0,000, 4 d.f.). A freqüência do genótipo T/T do polimorfismo XbaIG>T foi mais elevada nos indivíduos assintomáticos e com TSP/HAM do que nos indivíduos oligosintomáticos. Em relação ao polimorfismo HaeIIIT>C, nós observamos uma maior freqüência do genótipo T/C nos pacientes com TSP/HAM. Quanto ao polimorfismo -2841A>T, foi verificada uma distribuição similar dos genótipos analisados em todos os grupos estudados. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes nas distribuições genotípicas e alélicas entre os indivíduos infectados e não-infectados pelo HTLV-1, assim como em relação ao status clínico dos pacientes infectados pelo HTLV- 1 nos polimorfismos XbaIG>T, HaeIIIT>C e -2841A>T. Em relação ao seqüenciamento de 339pb da região promotora de GLUT1, foi observada uma nova mutação G>T na posição -2807 em 6 indivíduos (1 assintomático, 2 com TSP/HAM e 3 não-infectados), caracterizando esta mutação como um polimorfismo. Nossos resultados indicam que os polimorfismos XbaIG>T, HaeIIIT>C e -2841A>T, apesar de, possivelmente, estarem relacionados com a entrada de glicose na célula (XbaIG>T e -2841A>T) não estão relacionados com a infecção pelo HTLV-1 nem com o desenvolvimento de TSP/HAM, sugerindo que as diferentes atividades realizadas pela proteína GLUT1 (transporte de glicose e recepção do HTLV-1) são mediadas por diferentes domínios da mesma. Quanto ao estudo de base populacional, nós confirmamos que as freqüências alélicas dos polimorfismos XbaIG>T e HaeIIIT>C variaram de acordo com a etnia. / The HTLV-1 is the etiological agent of Tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated mielopathy (TSP/HAM) and Adult T cell leukemia/lymphoma (ATLL). However, the development of HTLV-1 associated clinic manifestations occurs in 2-4% of the infected population and it is still an answered question why this infection remains asymptomatic at the most of the infected carriers. It has been suggested that the outcome of HTLV-1 associated disease manifestations may occur by individual and/or viral genetic variations (mutations). Recently, it was demonstrated that HTLV is able to use the Glucose transporter type 1 (GLUT1) to infect T CD4+ lymphocytes. Many studies have demonstrating an association between mutations in regulatory regions of human genes and disease manifestations. Polymorphisms in the GLUT1 gene were associated with susceptibility to diabetic nephropathy in patients with types 1 and 2 diabetes mellitus in different populations. To evaluate the role of GLUT1 gene polymorphisms in the development of TSP/HAM in HTLV-1 infected individuals, we had analyzed the -2841A>T, XbaIG>T and HaeIIIT>C polymorphisms in HTLV-1 infected and non-infected individuals from Salvador. The XbaIG>T and HaeIIIT>C SNP were analyzed by PCR/RFLP and the -2841A>T polymorphism, by sequencing. The proviral load of the HTLV-1 infected patients was analyzed by Real Time Quantitative PCR. We also analyzed the XbaIG>T and HaeIIIT>C polymorphisms in distinct Brazilian populations with different ethnic backgrounds: Amerindians from Tiriyó tribe, European descendants from Brazil South region; Japanese descendants, Europeans descendants and African descendants from Southeast region. Genotypic frequencies of the polymorphisms analyzed were in agreement with the expected by the Hardy-Weinberg Equilibrium. The HaeIIIT>C polymorphism was in linkage disequilibrium with the XbaIG>T (χ2=37.555, p=0.003, 4d.f.) and -2841A>T polymorphisms (χ2=∞, p=0.000, 4d.f.). T/T genotypic frequency of the XbaIG>T polymorphism was higher in asymptomatic and TSP/HAM individuals than in oligosymptomatics. Concerned to the HaeIIIT>C polymorphism, we observed a higher frequency of the T/C genotype in TSP/HAM patients. In relation to the -2841A>T polymorphism, it was verified a similar distribution of the analyzed genotypes in all studied groups. Genotypic and allelic frequencies of the three sites analyzed did not differ significantly for controls and HTLV-1 infected individuals. There were no differences in genotypic and allelic distribution among patients for either the presence or absence of HTLV-1 associated clinic manifestations. In relation to the sequencing of 339 bp of GLUT1 promoter region, it was observed a new mutation G>T at -2807 position in 6 individuals (1 asymptomatic, 2 with TSP/HAM and 3 non-infected). Regarding the quantification of the provirus load according to GLUT1 genotypes, we did not observe any differences. These results suggest that the XbaIG>T, HaeIIIT>C and -2841A>T polymorphisms, although possibly related with cell glucose entry (XbaIG>T and -2841A>T), do not contribute to HTLV-1 infection and to the genetic susceptibility of TSP/HAM in Brazilian HTLV-1 infected individuals, suggesting that different activities performed by GLUT1 protein (glucose transport and HTLV-1 entry) are mediated by its different domains. Concerned to the population study, we confirmed that the allelic frequencies from the XbaIG>T and HaeIIIT>C are influenced by ethnicity among the six Brazilian ethnic groups studied.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-23T21:20:51Z No. of bitstreams: 1 Lorena Pinto. Avaliação ex vivo da proliferação espontanea em PBMC de individuos infectados pelo HTLV-1 por citometria de fluxo.pdf: 1267124 bytes, checksum: 830b004821bb96ca261aed15410bcb82 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T21:20:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena Pinto. Avaliação ex vivo da proliferação espontanea em PBMC de individuos infectados pelo HTLV-1 por citometria de fluxo.pdf: 1267124 bytes, checksum: 830b004821bb96ca261aed15410bcb82 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) infecta cerca de 2% da população de Salvador-Bahia. O HTLV-1 é o agente etiológico da ATLL, HAM/TSP e uveíte. Este vírus também está relacionado a outras doenças inflamatórias como artrites, dermatites infectivas, polimiosites, alveolites e Síndrome de Sjögren. Uma das características imunológicas mais marcantes da infecção pelo HTLV-1 é a proliferação espontânea dos linfócitos T induzida por proteínas transativadoras virais, como Tax e HBZ. O papel da proliferação na patogênese da infecção não é conhecido, porém alguns trabalhos indicam que sua intensidade é maior nos pacientes com HAM/TSP, além disso pode ser responsável pela manutenção da carga proviral do HTLV-1, uma vez que o vírus se replica por divisão da célula infectada. A dinâmica da proliferação ex vivo não é muito conhecida, sendo normalmente avaliada por adição de 3[H]-Timidina às culturas, que possui várias desvantagens, entre as quais a toxicidade. Este é um estudo piloto que objetivou padronizar um método para avaliação da dinâmica da proliferação espontânea de linfócitos T utilizando o marcador CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester (CFSE), por citometria de fluxo. Além de quantificar os índices de proliferação celular de linfócitos T totais e das subpopulações linfocitárias T CD4+ e T CD8+, correlacionar proliferação celular com a carga proviral do HTLV-1 e a expressão da proteína viral TAX. Para tal, PBMC de 30 pacientes infectados pelo HTLV-1 (16 assintomáticos e 14 HAM/TSP) foram cultivados por 24, 48, 72, 96 e 120 horas, em presença de CFSE. As células foram adquiridas em citometro de fluxo e os resultados analisados pelo programa FlowJo, através da porcentagem de células divididas e do índice de divisão celular. Observou-se proliferação em 66,7% dos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A proliferação espontânea de PBMC foi superior no grupo de pacientes com HAM/TSP (porcentagem de células divididas: 79%, índice de divisão celular: 79%), comparada aos assintomáticos (porcentagem de células divididas: 50%, índice de divisão celular: 56,3%), porém essa diferença não foi significante A proliferação espontânea pode ser detectada nas primeiras 24 horas de cultura. A intensidade de proliferação é semelhante para as subpopulações de linfócitos T CD4 e T CD8, tanto em indivíduos assintomáticos como naqueles com HAM/TSP. Não houve correlação entre a carga proviral e a porcentagem de células divididas (r= -0,009; p= 0,9) e índice de divisão celular (r=0,1; p=0,5). A média de expressão de TAX em linfócitos TCD4+ foi de 2,4±2,4 %. Houve correlação entre a expressão da proteína Tax e a porcentagem de células divididas (r=0,59; p =0,05) e o índice de divisão celular (r=0,60; p=0,05), porém sem significância estatística. No entanto, encontrou-se uma correlação positiva entre a porcentagem de células T CD4+ divididas e a expressão da proteína Tax (r=0,79; p<0,003), bem como entre o índice de divisão das células TCD4+ e a expressão da proteína Tax (r=0,75; p=0,008). Em conclusão, a avaliação da proliferação espontânea por citometria de fluxo, em culturas com CFSE avaliadas pelo programa FlowJo permite identificar a proliferação celular nas 24 horas inicias da cultura e quantificar a proporção de linfócitos T CD4 e TCD8 que proliferam. Este método pode ser útil na avaliação de drogas que modulam a proliferação espontânea em PBMC de indivíduos infectados pelo HTLV-1. / Around 2% of the population of Salvador-Bahia are infected by the Human-T Lymphocyte virus type I (HTLV-1). This virus is the etiologic agent of ATLL, HAM/TSP and uveitis. It is also related to inflammatory illness like arthritis, infective dermatitis, polymyositis, alveolitis and Sjorgen syndrom. The spontaneous proliferation of T-lymphocytes induced by viral transactivating proteins like Tax and HBZ is one of the most outstanding immunological characteristics of the infection. The role of the proliferation in the pathogenesis is still unknown though some studies have shown that it is higher among HAM/TSP patients. Moreover, it could be responsible for the HTLV-1 remaining proviral load since the virus replicate through division of infected cell. The dynamics of the proliferation ex-vivo is not well known and is usually assessed by incorporating 3[H]-Thymidine to the cultures. This method has several disadvantages one of them being the 3[H]-Thymidine toxicity. This pilot study was aimed at the standardization of a method that assesses the dynamics of the spontaneous T-lymphocytes proliferation using flow cytometry and CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) as a marker. Other objectives were to assess the rates of celular proliferation of both total T lymphocytes and CD4+ and T CD8+ subpopulations; to correlate the celular proliferation with the HTLV-1 viral load and the expression of the viral TAX protein. PBMCs of 30 HTLV-1 infected patients (16 assymptomatic and 14 HAM/TSP) were cultivated for 24, 48, 72, 96 and 120 hours in the presence of CFSE. Cells were obtained by flow cytometry and the results were analysed with the software Flowjo through the percentage of divided cells and the rate of celular division. Cell proliferation was observed in 66.7% of the HTLV-1 infected people. The PBMC spontaneous proliferation was higher in the group of HAM/TSP patients (percentage of divided cells:79%, rate of cellular division79%) compared to the assymptomatic individuals (percentage of divided cells: 50%, rate of cellular division: 56,3%) though this difference was not significant. Spontaneous proliferation can be detected in the first 24 hours of cell cultivation. The intensity of proliferation is similar in T CD4 e T CD8 subpopulations of assympomatic individuals and HAM/TSP patients. There was no correlation between proviral load and percentage of divided cells (r= -0,009; p= 0,9) and the rate of cellular division (r=0,1; p=0,5). The average of the TAX expression in T CD4+ was 2,4±2,4 %. There was a correlation between the expression of TAX protein and the percentage of divided cells (r=0,59; p =0,05) and the rate of cellular division (r=0,60; p=0,05), although not statistically significant. Nevertheless, a positive correlation was found between the percentage of divided T CD4+ cells and the expression of TAX protein (r=0,79; p<0,003), as well as between the rate of cellular division of TCD4+ cells and the expression of TAX protein (r=0,75; p=0,008). As a conclusion, the assessment of spontaneous proliferation by flow cytometry in cultures with CFSE analysed with the FlowJo software allows to identify the cellular proliferation in the first 24 hours of cultivation and to quantify the proportion of T CD4 and TCD8 lymphocytes that proliferated. This method could be usefull to assess drugs that modulate the spontaneous proliferation in PBMCs from HTLV-1 infected individuals.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-30T18:02:27Z No. of bitstreams: 1 Marcelo Magalhaes Silva Estudo de alterações genéticas....pdf: 2168493 bytes, checksum: 48c50f165408a4314aa5ad8de3c72ca0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T18:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcelo Magalhaes Silva Estudo de alterações genéticas....pdf: 2168493 bytes, checksum: 48c50f165408a4314aa5ad8de3c72ca0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) é uma severa doença linfoproliferativa de células T CD4+ associada ao HTLV-1. Por apresentar diferentes manifestações clínicas, essa neoplasia pode ser classificada em cinco formas: aguda, crônica, smoldering, linfomatosa e tumoral primária de pele. Embora alguns trabalhos venham estudando o processo oncogênico mediado pelo HTLV-1, diversos fatores responsáveis pelo desenvolvimento da ATL ainda permanecem desconhecidos. Este estudo teve como objetivo a investigação de alterações genéticas em células ATL (mutações pontuais em genes supressores de tumor e alterações microssatélites) e sua associação com a evolução clínica da doença e sobrevida dos pacientes. A presença de mutações pontuais nos supressores de tumor TP53, p15INK4B e p16INK4A foram avaliadas em 31 pacientes com diferentes formas da ATL (16 agudos, dez crônicos e cinco smoldering) por análise de seqüenciamento de DNA. Cinco pacientes (16%) apresentaram mutações pontuais no gene TP53, sendo que quatro dentre os mesmos foram classificados com a forma aguda. A presença de mutações nos genes avaliados foi associada com pior prognóstico em pacientes com a forma aguda. Em um dos pacientes incluídos neste trabalho (forma aguda) foi verificada a presença de alteração no éxon 2 do gene p16INK4A. Mutações pontuais não foram detectadas no gene p15INK4B em nenhum dos pacientes incluídos. Os marcadores D10S190, D10S191, D11S1391 e D18S21 foram utilizados para a análise de alterações microssatélites por metodologia semi-automatizada. Dentre os 25 pacientes ATL avaliados (seis agudos, oito crônicos, dez smoldering e um linfomatoso), sete apresentaram alterações microssatélites. Três desses pacientes apresentaram instabilidade (MSI), três pacientes apresentaram perda de heterozigosidade (LOH) e em um paciente foi verificado ambas as alterações. Na Bahia, mutações pontuais em TP53 foram detectadas principalmente na forma aguda da ATL e parece estar associada com pior prognóstico. Além disso, de acordo com nossos conhecimentos, este é o primeiro estudo a descrever tanto MSI com LOH em pacientes portando formas crônica e smoldering da ATL. / Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) is a severe CD4+ lymphoproliferative disease associated to human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1). ATL has different clinical manifestations and is classified in five clinical forms: acute, chronic, smoldering, lymphoma and primary cutaneous tumoral. Although the mechanisms of oncogenesis of the HTLV-1 have been investigated, the factors related to ATL development are still unknown. The goal of this study was to investigate genetic alterations in ATL cells (point mutations in tumor suppressor genes and microsatellite alterations) and their association with the clinical evolution of the disease and survival. The presence of point mutations in TP53, p15INK4B e p16INK4A were evaluated in 31 ATL patients (16 acute, ten chronic and five smoldering) by direct sequencing. Five of them (16%) had TP53 point mutations, four of them with the acute form of ATL. The presence of point mutations in this gene was associated to poor prognosis in acute patients. Only one case (acute form) has an alteration in the exon 2 of the p16INK4A gene. No point mutations of the p15INK4B were found in the patients included. The markers D10S190, D10S191, D11S1391 and D18S21 were considered for the microsatellite analysis using a semiautomated technique. From the twenty-five ATL cases included (six acute, eight chronic, ten smoldering and one lymphoma), seven showed microsatellite alteration. Among them, three patients had microsatellite instability (MSI), three had loss of heterozygosity and one patient presented both alterations. In Bahia, point mutations in TP53 were detected mainly in acute form of ATL and were associated to poor prognosis. The presence of MSI and LOH in the smoldering and chronic forms of ATL were demonstrated for the first time in this study.