O HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) foi o primeiro retrovírus humano a ser identificado. O HTLV-1 tem a capacidade de ativar e gerar uma intensa resposta inflamatória, podendo levar a alterações em diversos tecidos que mimetizam uma doença autoimune. Do complexo de doenças associadas ao HTLV-1, a Síndrome de Sjögren (SS) figura entre as mais estudadas. No entanto, nenhuma relação definitiva foi ainda estabelecida. Este trabalho propõe-se a investigar indícios da presença do HTLV-1 em glândulas salivares menores de pacientes infectados por esse retrovírus e comparar as alterações morfológicas em glândulas salivares menores de pacientes com HTLV-1 e de pacientes com SS não infectados. Amostras de glândula salivar menor foram coletadas de 14 pacientes HTLV+ que apresentavam síndrome seca (grupo de estudo) e 5 pacientes diagnosticados com SS e negativos para o HTLV (grupo controle). No grupo de estudo, o infiltrado inflamatório visto era composto principalmente por linfócitos T CD4+, no grupo controle a população majoritária foi de linfócitos B CD20+. Alterações morfológicas como fibrose e infiltração gordurosa foram mais comumente vistas nas amostras do grupo de estudo, sendo a diferença estatisticamente significativa (p=0,038 e 0,033 respectivamente). Na análise por PCR 11 (78,57%) dos casos do grupo de estudo foi detectado o gene tax e/ou rex do HTLV-1, no entanto 4 (80%) das amostras do grupo controle também foram positivas. O HTLV-1 mostra indícios de estar presente nas glândulas salivares de indivíduos com síndrome seca, no entanto pacientes HTLV-1+ apresentam alterações morfológicas em padrões diferentes dos vistos em pacientes com SS, denotando uma provável diferença no processo de ativação imunológica. / Human T-cell lymphotropic virus type I (HTLV-1) was the first human retrovirus to be discovered. HTLV-1 has the ability to activate and generate an intense inflammatory response, which can lead to changes in several tissues that mimic an autoimmune disease Of the complex of diseases associated with HTLV-1, Sjögren\'s Syndrome (SS) is among the most studied. The aim of this study is to investigate the presence of HTLV-1 in the minor salivary glands of patients infected with this retrovirus and to compare the morphological alterations in the salivary glands of patients with HTLV-1 and patients with SS uninfected. Minor salivary gland samples were obtained from 14 HTLV + patients with dry syndrome (study group) and 5 patients diagnosed with SS and HTLV negative (control group). In the study group, the inflammatory infiltrate was mainly composed of CD4+ T lymphocytes, in the control group the majority population was of CD20+ B lymphocytes. Morphological changes such as fibrosis and adipose tissue infiltration were more common in the study group, the difference was statistically significant (p = 0.038 and 0.033, respectively). The HTLV-1 tax and/or rex genes were detected by PCR in 11 (78.57%) patients of the study group, but 4 (80%) samples from the control group were also positive. HTLV-1 shows signs of being present in the salivary glands of individuals with dry syndrome however, HTLV-1+ patients present morphological alterations in different patterns from those observed in SS patients, denoting a probable difference in the immunological activation process.

O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus associado a duas manifestações clínicas principais: i) mielopatia associada ao HTLV- 1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a ii) leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL). Devido à ausência de tratamentos específicos e efetivos, faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento das doenças associadas ao HTLV-1. Nesse sentido, nosso objetivo foi realizar a triagem de compostos químicos para identificar indutores de apoptose e/ou bloqueadores da proliferação celular em linhagem celular infectada pelo HTLV-1 (MT-2), bem como drogas com efeito sobre a atividade de Tax viral. Inicialmente, foi estabelecido um ensaio baseado em células, o qual permitiu realizar a triagem de compostos pelo método de redução da resazurina. A partir de 26 derivados 1,2,3-triazólicos, oito compostos (hits) apresentaram atividade >= 70% por reduzirem de forma significativa a atividade metabólica da MT-2. Tais hits foram selecionados para as etapas de validação. O composto 61 foi o único a induzir uma parada na fase S do ciclo celular, enquanto os compostos 48, 49, 65 e 66 induziram a apoptose da linhagem MT-2. Na avaliação do efeito dos compostos sobre a atividade da proteína viral Tax, uma linhagem repórter com a expressão induzida de Tax foi estabelecida. Verificamos que apenas os compostos 48 e 49 foram capazes de reduzir a expressão de GFP, e consequentemente, interferir na atividade de Tax. Uma biblioteca de 707 compostos do NIH também foi avaliada neste estudo. A partir da triagem primária, 34 compostos (hits) com atividade >= 50% foram obtidos, enquanto na triagem secundária, apenas cinco hits foram confirmados. Entretanto, apenas dois destes foram selecionados para as futuras etapas de validação (dissulfiram e bromidrato de galantamina). Por fim, exceto os compostos 65 e 66, os demais hits não interferiram na viabilidade da linhagem hepática Huh-7. Os resultados deste estudo mostraram que os compostos 48, 49, 61, dissulfiram e bromidrato de galantamina deveriam ser explorados como novas abordagens terapêuticas das doenças associadas ao HTLV-1. / Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus associated with two main clinical manifestations: i) HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and ii) adult T cell leukemia/lymphoma (ATL). Due to the lack of a specific and an effective therapy, the development of new drugs for treatment of HTLV-1 associated diseases is urgently required. Thus, our aim was to perform a drug screening for identification of apoptosis inducers and/or cell proliferation inhibitors in a HTLV-1-infected cell line (MT-2), as well as drugs with effect on activity of viral Tax. First, it was established a cell-based assay in order to perform a drug screening by resazurin reduction method. From 26 1,2,3-triazole derivatives, eight compounds (hits) presented >= 70% of activity, since they significantly reduced the metabolic activity of MT-2. These hits were selected for the further validation steps. Compound 61 was the only one that induced an S phase cell cycle arrest, while compounds 48, 49, 65 and 66 promoted apoptosis of MT-2. In the evaluation of the effect of these compounds on activity of Tax viral protein, an inducible-tax reporter cell line was established. We verified that only compounds 48 and 49 were able to reduce GFP expression and, then, get involved on the Tax activity. A NIH library of 707 compounds was also assessed in this study. From a primary screening, 34 compounds (hits) with activity >= 50% were obtained, while in secondary screening, five hits were confirmed, of which two of them were selected for future validation steps (disulfiram and galantamine hydrobromide). Finally, except for compounds 65 and 66, other hits did not interfere in cellular viability of hepatic cell line, Huh-7. The results of this study showed that compounds 48, 49, 61, disulfiram and galantamine hydrobromide should be explored as new therapeutic approaches of HTLV-1-associated diseases.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DENISE PICCOLI DE PAULA.pdf: 7499605 bytes, checksum: acd6b8560cb237be607f00ebc352a85c (MD5) Previous issue date: 2014-08-14 / Co-infection with Human T Lymphotropic (HTLV) in individuals infected by the human immunodeficiency virus (HIV) occurs because these viruses share similar routes of transmission is through sexual, parenteral or vertical route, besides infecting the same cell type, and can accelerate as much retard the development of diseases related to them. Rates of HIV (HTLV) coinfection vary according to the geographical region and the population studied. Objective: To determine the prevalence of co-infection in HIV seropositive patients with HTLV 1 and 2, attended two reference centers in Goiânia. Methods: This was a cross-sectional epidemiological study of descriptive type. Were selected to study the first 2 groups, with 86 patients who had at least one laboratory test in the Reference Center on Diagnosis and Therapy (CRDT) Cândido José Santiago de Moura, in Goiania, from march 14 to may 27, 2011. And the second, with 103 HIV seropositive patients treated at the Hospital of the Federal University of Goiás, from september 13, 2013 to february 5, 2014. Questionnaire was applied and held for identification of HTLV serology. Statistically we used the t test and the chi-square (X2) applying the confidence interval of 95% and significance level p<0,05. Results: Males comprised 83.1% and females 16.9%. The most prevalent age group was 26-33 years old, 27.5%. According to sexual behavior, homosexuality excelled with 43.39%. A male patient, showed positive reaction for HTLV 1, demonstrating that there was a prevalence of co-infection of 0.53%. Conclusion: Although prevalence has been found to HTLV-1 below the national average in individuals infected with HIV (6.3%), highlights the importance of research on this virus, allowing a better prognosis related to potential complications in clinical progression to AIDS. / A co-infecção pelo Vírus Linfotrópico de Células T Humana (HTLV) em indivíduos infectados pelo vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ocorre em virtude destes vírus compartilharem vias de transmissão similares, seja por via sexual, parenteral ou vertical, além de infectarem o mesmo tipo de célula, podendo tanto acelerar como retardar o desenvolvimento de doenças a eles relacionadas. As taxas de co-infecção HIV(HTLV) variam de acordo com a região geográfica e a população estudada. Objetivo: Determinar a prevalência da co-infecção em pacientes HIV soropositivos, com o HTLV 1 e 2, atendidos em dois centros de referência de Goiânia. Métodos: Trata-se de um estudo epidemiológico transversal de tipo descritivo. Foram selecionados para o estudo 2 grupos, o primeiro, com 86 pacientes que realizaram pelo menos um exame laboratorial no Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica (CRDT) Cândido José Santiago de Moura, em Goiânia, de 14 de março a 27 de maio de 2011. E o segundo, com 103 pacientes HIV soropositivos atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, de 13 de setembro de 2013 a 5 de fevereiro de 2014. Foi aplicado questionário e realizada sorologia para identificação do HTLV. Estatisticamente foram utilizados o Teste T e o Qui-quadrado (X2) aplicando o intervalo de confiança de 95% e nível de significância estatística p < 0,05. Resultados: O sexo masculino correspondeu a 83,1% e o feminino 16,9%. A faixa etária que mais prevaleceu foi de 26 a 33 anos, 27%. De acordo com o comportamento sexual, sobressaiu o homossexualismo com 43,39%. Um paciente do sexo masculino, apresentou reação positiva para o HTLV 1, demonstrando que houve uma prevalência de co-infecção de 0,53%. Conclusão: Embora tenha sido encontrada prevalência para HTLV-1 inferior à média nacional em indivíduos infectados por HIV (6,3%), destaca-se a importância da investigação desta virose, permitindo um melhor prognóstico relacionado às potenciais complicações clínicas na progressão para AIDS.

O polimorfismo de IL28B foi descrito como fator importante na patogênese de infecções causadas por alguns vírus. O objetivo desta pesquisa foi avaliar se polimorfismos (SNP rs8099917 IL28B e SNP rs12979860) foram associados na presença de HAM/TSP. Métodos: O estudo incluiu 188 pacientes do Instituto de Infectologia \"Emilio Ribas\" de São Paulo, divididos em três grupos: 117 Indivíduos infectados pelo HTLV-1 (49 assintomáticos e 68 com HAM TSP), 47 Pacientes monoinfectados pelo vírus da Hepatite C (HCV) e 24 coinfectados pelo HTLV- 1 e HCV. Amostras de sangue foram coletadas, e o PBMC separado através da centrifugação por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. O DNA foi extraído usando um kit comercial, e armazenado a - 80 ° C e, a carga proviral do HTLV-1 foi quantificada. Os SNPs da IL28B na região rs8099917 e rs12979860 foram analisados em todos os grupos por PCR StepOnePlus. Resultados: A análise estatística usando modelo multivariado que incluiu as variáveis: gênero, idade, e carga proviral do HTLV-1, mostrando que o polimorfismo IL28B SNP rs12979860 não foi associado com a HAM/TSP. Em contraste, o SNP rs8099917 GG alelo foi associada com HAM/TSP, quando comprado aos indivíduos assintomáticos (OR = 6,25; IC95% = 1,22- 32,00). Conclusão: Pessoas com SNP rs8099917 genótipo GG podem apresentar uma resposta imune distinta contra a infecção pelo HTLV-1. Assim, parece razoável sugerir que uma pesquisa de polimorfismos IL28BSNP rs8099917 deve ser realizada em todos os indivíduos HTLV-1, a fim de monitorar o risco de desenvolvimento da doença. / The polymorphism of IL28B was described as important in the pathogenesis of infections caused by some viruses. The aim of this research was to evaluate whether IL28B gene polymorphisms (SNP rs8099917 and SNP rs12979860) were associated with HAM/TSP. Methods: The study included 188 patients of the Institute of Infectious Diseases \"Emilio Ribas\" of São Paulo, they formed three groups: 117 subjects infected with HTLV-1(49 asymptomatic and 68 with HAM TSP), 47 chronic HCV monoinfected patients and 24 co-infected with HTLV-1 and HCV. Blood samples were collected and PBMC separated by density gradient centrifugation in Ficoll-Hypaque. DNA was extracted using a commercial kit, and the DNA was stored at -80 ° C for later analysis. Thereafter, the proviral load of individuals with HTLV-1 was quantified SNPs rs12979860 and rs8099917 in the region of IL28B were analyzed in all groups by PCR StepOnePlus system in real time. Results: A multivariate model analysis, including gender, age, and HTLV-1 DNA proviral load, showed that IL28B polymorphism SNP rs12979860 was not independently associated with HAM/TSP outcome. In contrast, the SNP rs8099917 allele GG was independently associated with HAM/TSP outcome (OR=6.25; IC95%=1.22- 32.00). Conclusion: Persons with SNP rs8099917 genotype GG may present a distinct immune response against HTLV-1 infection. So, it seems reasonable to suggest that a search for IL28B polymorphisms should be performed for all HTLV-1-infected subjects in order to monitor their risk for disease development; however, since this is the first description of this finding in the literature, we should first replicate this study with more HTLV-1-infected persons to strengthen the evidence already provided by our results.

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) está associado etiologicamente à duas principais manifestações clínicas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças associadas ao vírus, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Os linfócitos T CD4+ são os principais reservatórios do HTLV-1 in vivo e possuem uma participação importante na resposta imunológica dirigida a este retrovírus. Essas células são ativadas precocemente durante a infecção pelo HTLV-1 e auxiliam na resposta dos linfócitos T CD8 citotóxicos (CTLs), bem como na produção de anticorpos. No presente estudo, foi avaliado o perfil de expressão gênica global dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores assintomáticos (HAC), pacientes com HAM/TSP e de indivíduos sadios (CT) por meio da metodologia de microarray. Os linfócitos T CD4+ utilizados foram isolados por separação imunomagnética e foram realizados microarrays de doze amostras individuais: quatro amostras do grupo CT, quatro amostras do grupo HAC e quatro do grupo HAM/TSP. Os dois últimos grupos continham duas amostras com alta e duas com baixa expressão da proteína Tax. As análises de agrupamento hierárquico revelaram que o perfil de expressão gênica dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 difere dos indivíduos do grupo CT pela formação de dois agrupamentos distintos. Ademais, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 se agruparam de acordo com o estado clínico e independente da expressão de Tax. Foram realizadas as comparações entre os grupos CT vs. HAC, CT vs. HAM/TSP e HAM/TSP vs. HAC e os dados demonstraram que 221, 254 e 70 genes estavam diferencialmente expressos, respectivamente. Além disso, foram observados 86 genes presentes nas intersecções entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes entre CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC e apenas um gene entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. Estes genes diferencialmente expressos estavam associados à citocinas, lise e migração celular. Os achados foram validados por PCR quantitativo em um total de 23 indivíduos assintomáticos, 17 com HAM/TSP e 25 indivíduos sadios. A validação evidenciou o aumento da expressão dos genes PXN, CXCR4, PRF1 e Foxp3 no grupo HAM/TSP em relação ao grupo HAC, além do aumento de IL-27 nos indivíduos do grupo HAC comparados com os indivíduos do grupo HAM/TSP. Adicionalmente, foi realizada a quantificação dos níveis protéicos de PRF1, GZMB, CXCR4 por citometria de fluxo. Entretanto, nenhuma diferença foi observada entre os diferentes grupos analisados. Ainda, por meio de citometria de fluxo, a população de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+, bem como CD4+Foxp3+ foram analisadas e observou-se maiores níveis de expressão de CD4+Foxp3+ nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A porcentagem de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ não mostrou diferença significativa entre os três grupos comparados. Os resultados evidenciados neste projeto ressaltam a importância das células CD4+ no controle da resposta imune contra a infecção pelo HTLV-1. O aumento na expressão gênica de PXN e CXCR4, que fazem parte da via de sinalização de CXCR4, sugere a ocorrência de migração celular nos indivíduos com HAM/TSP, provavelmente para o SNC. Além disso, o aumento das células Treg parecem suprimir a atividade das células T CD8+ pela via perforina/granzima, que por sua vez aumentaria a carga proviral, aumentando assim o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) is etiologically associated with two major diseases: the adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and the HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). About 2 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1-related diseases, while the majority remains life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is not well elucidated. CD4+ T cells are the predominant subset of cells infected with HTLV-1 in vivo and they are also important as effector cells against the infection. These cells are early activated during infection with HTLV-1 and assist the response of CD8 cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and antibody production. To identify genes differentially expressed among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied the microarray using CD4+ T cells isolated from these individuals. The CD4+ T lymphocytes were isolated by magnetic cell separation system and twelve samples underwent microarray analysis, as follows: 4 CT, 4 HAC and 4 HAM/TSP samples. Two samples had high tax expression and two samples had low tax expression for both infected groups. The hierarchical clustering analysis showed that the gene expression profile of infected individuals is distinct from healthy individuals because two separate clusters were observed. HTLV-1-infected individuals clustering meets with patients clinical status. However, HTLV-1 CD4+ T cells clustering did not correlate with Tax protein expression. We found 221 genes differently expressed between CT and HAC groups, 254 genes between CT and HAM/TSP and 70 genes between HAC and HAM/TSP. Moreover, we observed 86 genes differently expressed in the intersections between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes between CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC and only one gene between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. These genes were associated with cytokines, cell lysis and cell migration. These results were validated by quantitative PCR in 23 HTLV-1 asymptomatic carriers, 17 patients with HAM/TSP and 25 healthy individuals. The validation revealed increased levels of expression of the genes PXN, CXCR4, PRF1, and Foxp3 in the HAM/TSP group compared with HAC group. IL-27 gene expression was increased in HAC group when compared with HAM/TSP group. Additionally, we performed the protein quantification of PRF1, GZMB, and CXCR4 by flow cytometry. However, no difference was observed among the three groups. We also analyzed CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ and CD4+Foxp3+ populations by flow cytometry. There was an increase of CD4+Foxp3+ expression in HTLV-1-infected individual. No differences were observed in CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ population among the three groups. The results shown in this project highlight the importance of CD4+ cells in controlling the immune response against HTLV-1. The gene expression profile of PXN and CXCR4 was increased. These genes are related to CXCR4 signaling pathway that can result in CD4+ T cells migration, probably to the central nervous system. It is also suggested that Treg cells can suppress the T CD8+ activity through perforin/granzyme pathway. This pathway enhances the proviral load increasing the risk of HAM/TSP development.

Introdução: Vírus Linfotrópico de células T Humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL), mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), dermatite infectiva associada ao HTLV-1 (DIH) entre outras doenças, sendo que algumas delas podem ocorrer em associação. Sabe-se que a infecção pelo HTLV-1 pode aumentar o risco de desenvolvimento de doenças de pele. Este estudo avaliou a prevalência das doenças cutâneas em infectados pelo HTLV-1 independente do estado clínico e a relação entre a contagem de células T CD4+ e CD8+, carga proviral inicial de HTLV-1 e linfoproliferação em grupo de indivíduos portadores assintomáticos da infecção pelo HTLV-1 ou com HAM/TSP, com ou sem doenças de pele associada. Método: 193 indivíduos infectados pelo HTLV-1 do ambulatório de HTLV no Instituto de Infectologia Emílio Ribas foram avaliados e submetidos à entrevista, exame dermatológico completo e contagens de células T CD4+ e CD8+; carga proviral de HTLV-1 e linfoproliferação (LPA) no sangue periférico. Resultados: Cento e quarenta e sete pacientes mostraram-se com alguma condição anormal da pele, destes, 116 (79%) apresentaram doença dermatológica associada ao HTLV-1 (DD-HTLV-1) (xerose/ictiose, dermatite seborreica ou dermatite infectiva associada ao HTLV-1), e 21% (n=31) tiveram outros diagnósticos dermatológicos. As DD-HTLV-1 mais prevalentes foram: xerose/ictiose adquirida (49%) e dermatite seborreica (27%). Três pacientes apresentaram DIH de início durante a vida adulta associada à HAM/TSP. Os pacientes com DD-HTLV-1 eram mais velhos (51 vs 47 anos), apresentaram maior prevalência de HAM/TSP (p=0.015), maior carga proviral do HTLV-1 (p=0.009) e linfoproliferação basal de três dias aumentada (p=0.008). As contagens de células T CD4+ e CD8+ não mostraram diferença estatística quando comparados os grupos com ou sem DD-HTLV-1. Quando os pacientes com HAM/TSP foram excluídos da análise, a carga proviral do HTLV-1 continuou mostrando diferença significativa (p=0,021), enquanto LPA, contagem de células T CD4+ e CD8+ não mostraram nenhuma diferença. Conclusões: Houve uma alta prevalência de doenças de pele (76%) entre indivíduos infectados pelo HTLV-1, independente do estado clínico. Carga proviral inicial do HTLV-1 e idade foram maiores em indivíduos com DD-HTLV-1, mas LPA apresentou aumento apenas em indivíduos com DD-HTLV-1 e HAM / TSP / Background: Human T cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the aetiologic agent of adult T-cell leukaemia/lymphoma (ATLL), HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), infective dermatitis associated with HTLV-1 (IDH) and various other clinical conditions. Several of these diseases can occur in association. HTLV-1 infection can increase the risk of developing skin disorders. This study evaluated the prevalence of skin diseases among HTLV-1 infected and the relation between HTLV-1 proviral load, lymphocyte proliferation and CD4+ and CD8+ T cells count among HTLV-1 infected individuals, regardless of clinical status, with or without associated skin disorders. Methods: A total of 193 HTLV-1-infected subjects from the HTLV outpatient clinic at the Emilio Ribas Institute were studied. Patients underwent an interview, a complete dermatological examination, a lymphocyte proliferation assay (LPA), an assay for HTLV-1 proviral load and CD4+ and CD8+ T cells count. Results: A total of 147patients had an abnormal skin condition; 116 (79%) of these patients also had skin disorder associated with HTLV-1 infection (SD-HTLV-1) (xerosis/ichthyosis or seborrheic dermatitis), and 21% (n=31) of the patients had other dermatological diagnoses. The most prevalent SD-HTLV-1 was xerosis/acquired ichthyosis (49%), followed by seborrheic dermatitis (27%). Three of them had the association of adult onset IDH and HAM/TSP. The patients with SD-HTLV-1 were older (51 vs. 47 years), had a higher prevalence of myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) (p=0.015), higher HTLV-1 proviral load (p=0.009) and had an increased 3-days basal LPA compared with patients without SD-HTLV-1 (p=0.008). The T CD4+ and CD8+ cells counts did not show significance when compared to SD-HTLV-1 group or individuals without SD-HTLV-1. When HAM/TSP patients were excluded from the analysis, the HTLV-1 proviral load showed a significant difference (p=0.021), while LPA showed no difference, such as T CD4+ and CD8+ cells counts. Conclusions: There was a high prevalence of skin disorders (76%) among HTLV-1-infected individuals, regardless of clinical status Initial HTLV-1 proviral load and age was higher in SD-HTLV-1 individuals, but the LPA showed an increase only in SD-HTLV-1 subjects with HAM/TSP

O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus associado a duas manifestações clínicas principais: i) mielopatia associada ao HTLV- 1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a ii) leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL). Devido à ausência de tratamentos específicos e efetivos, faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento das doenças associadas ao HTLV-1. Nesse sentido, nosso objetivo foi realizar a triagem de compostos químicos para identificar indutores de apoptose e/ou bloqueadores da proliferação celular em linhagem celular infectada pelo HTLV-1 (MT-2), bem como drogas com efeito sobre a atividade de Tax viral. Inicialmente, foi estabelecido um ensaio baseado em células, o qual permitiu realizar a triagem de compostos pelo método de redução da resazurina. A partir de 26 derivados 1,2,3-triazólicos, oito compostos (hits) apresentaram atividade >= 70% por reduzirem de forma significativa a atividade metabólica da MT-2. Tais hits foram selecionados para as etapas de validação. O composto 61 foi o único a induzir uma parada na fase S do ciclo celular, enquanto os compostos 48, 49, 65 e 66 induziram a apoptose da linhagem MT-2. Na avaliação do efeito dos compostos sobre a atividade da proteína viral Tax, uma linhagem repórter com a expressão induzida de Tax foi estabelecida. Verificamos que apenas os compostos 48 e 49 foram capazes de reduzir a expressão de GFP, e consequentemente, interferir na atividade de Tax. Uma biblioteca de 707 compostos do NIH também foi avaliada neste estudo. A partir da triagem primária, 34 compostos (hits) com atividade >= 50% foram obtidos, enquanto na triagem secundária, apenas cinco hits foram confirmados. Entretanto, apenas dois destes foram selecionados para as futuras etapas de validação (dissulfiram e bromidrato de galantamina). Por fim, exceto os compostos 65 e 66, os demais hits não interferiram na viabilidade da linhagem hepática Huh-7. Os resultados deste estudo mostraram que os compostos 48, 49, 61, dissulfiram e bromidrato de galantamina deveriam ser explorados como novas abordagens terapêuticas das doenças associadas ao HTLV-1. / Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus associated with two main clinical manifestations: i) HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and ii) adult T cell leukemia/lymphoma (ATL). Due to the lack of a specific and an effective therapy, the development of new drugs for treatment of HTLV-1 associated diseases is urgently required. Thus, our aim was to perform a drug screening for identification of apoptosis inducers and/or cell proliferation inhibitors in a HTLV-1-infected cell line (MT-2), as well as drugs with effect on activity of viral Tax. First, it was established a cell-based assay in order to perform a drug screening by resazurin reduction method. From 26 1,2,3-triazole derivatives, eight compounds (hits) presented >= 70% of activity, since they significantly reduced the metabolic activity of MT-2. These hits were selected for the further validation steps. Compound 61 was the only one that induced an S phase cell cycle arrest, while compounds 48, 49, 65 and 66 promoted apoptosis of MT-2. In the evaluation of the effect of these compounds on activity of Tax viral protein, an inducible-tax reporter cell line was established. We verified that only compounds 48 and 49 were able to reduce GFP expression and, then, get involved on the Tax activity. A NIH library of 707 compounds was also assessed in this study. From a primary screening, 34 compounds (hits) with activity >= 50% were obtained, while in secondary screening, five hits were confirmed, of which two of them were selected for future validation steps (disulfiram and galantamine hydrobromide). Finally, except for compounds 65 and 66, other hits did not interfere in cellular viability of hepatic cell line, Huh-7. The results of this study showed that compounds 48, 49, 61, disulfiram and galantamine hydrobromide should be explored as new therapeutic approaches of HTLV-1-associated diseases.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T15:59:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaInfeccaoHtlv.pdf: 1964806 bytes, checksum: ae43958480bc27b75a0d66a9f4afa5af (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-12-01T13:31:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaInfeccaoHtlv.pdf: 1964806 bytes, checksum: ae43958480bc27b75a0d66a9f4afa5af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T13:31:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaInfeccaoHtlv.pdf: 1964806 bytes, checksum: ae43958480bc27b75a0d66a9f4afa5af (MD5) Previous issue date: 2012-12-17 / A prevalência de infecção pelo vírus HTLV é alta no Brasil (0,8 a 1,8%) principalmente na região amazônica, acometendo na sua maioria mulheres a partir dos 40 anos de idade. O crescimento do número de mulheres em idade fértil, infectadas pelos vírus HIV/AIDS e HTLV 1 e 2 tem sido considerado um importante fenômeno, trazendo consigo a não recomendação do aleitamento materno. Este estudo foi composto por uma amostra de 400 gestantes que realizavam acompanhamento pré-natal nos serviços públicos de saúde do município de Santarém-Pará, essas gestantes eram encaminhadas ao Centro de Testagem e Aconselhamento de Santarém para realizar os exames de rotina do pré-natal, sendo a sorologia para HTLV acrescentada aos exames já solicitados após o esclarecimento e consentimento das mesmas. Dos 400 (quatrocentos) testes realizados houve a ocorrência de 3 (três) soropositivos, demonstrando uma prevalência de 0,75% da infecção por HTLV na população do estudo. Todas as gestantes responderam a um inquérito, que permitiu traçar o perfil epidemiológico desta população onde a maioria foi de mulheres entre 18 a 29 anos de idade, pardas, com ensino fundamental completo, casadas e que buscaram o serviço de testagem sorológica no segundo trimestre de gestação.

Duas patologias principais estão associadas ao HTLV-1: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). O mecanismo pelo qual ocorre o desenvolvimento destas doenças em apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados é desconhecido. Sabe-se que diversos fatores estão associados ao desenvolvimento destas patologias, como carga proviral, características celulares, genéticas e imunológicas do hospedeiro. No entanto, tais mecanismos não foram totalmente elucidados e novas abordagens de estudos são necessárias para a compreensão da patogênese viral. Nesse sentido, vários estudos relatam o papel dos exossomos no desenvolvimento de infecções virais como HIV, EBV e HCV através do transporte de componentes incluindo proteínas, RNAm e miRNA. A possibilidade da transferência do conteúdo viral por essas vesículas para células não infectadas na ausência de vírus é um mecanismo intrigante. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo isolar os exossomos diretamente do soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar o conteúdo dessas vesículas quanto à expressão dos genes virais tax e HBZ entre os grupos assintomático e sintomático. Para tanto, os exossomos foram isolados por precipitação polimérica (Exoquick(TM)) e caracterizados por Western Blot (expressão dos marcadores CD9, CD81, Alix e citocromo c) e Análise de Rastreamento de Nanopartículas (tamanho e concentração). Além disso, o conteúdo dos exossomos foi analisado por PCR em tempo real para quantificação dos genes virais regulatórios tax e HBZ. Por fim, no intuito de estabelecer o papel dos exossomos como biomarcadores para o desenvolvimento da HAM/TSP, os níveis de expressão destes genes foram associados à carga proviral do HTLV-1. Os transcritos de RNAm de tax e HBZ foram detectados apenas em exossomos isolados do soro dos indivíduos sintomáticos, com ausência nos assintomáticos. Além disso, a expressão de tax e HBZ nos exossomos dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 foi correlacionada positivamente com a CPV. Dessa forma, os resultados sugerem que os exossomos podem desempenhar importante papel na patogênese da mielopatia, através do transporte de genes virais de uma célula infectada para não-infectada. No entanto, mais estudos que relacionam o papel dos exossomos na infecção pelo HTLV-1 são necessários. / Two major pathologies has been associated with HTLV-1 infection: adult T- cell leukemia/lymphoma (ATLL) and HTLV-1 associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis (HAM / TSP). The mechanism which is responsible for the appearance of these diseases in only 1 to 5% of the infected individuals is unknown. Is known that several factors has been related to the development of these diseases, such as proviral load and cellular, genetic and immunological characteristics of the host. However, these mechanisms have not been fully elucidated and new approaches are necessary to understand the viral pathogenesis. Thus, several studies have reported the involvement of exosomes in the development of the HIV, HCV, and EBV viral infections carrying components including proteins, mRNA and miRNA. The possibility of transfer of viral content via these vesicles to uninfected cells in the absence of virus is an intriguing mechanism. Therefore, this proposal aimed to isolate exosomes from serum of HTLV-1 infected patients and compare the content of these vesicles regarding viral gene expression of tax and HBZ between asymptomatic and symptomatic group. For this, the exosomes were isolated by polymeric precipitation (Exoquick(TM)) and characterized by Western Blot (expression of markers CD9, CD81, and Alix) and Nanoparticle tracking Analysis (size and concentration). Furthermore, the exosomes content were analyzed by real-time PCR for the quantification of tax and HBZ regulatory viral genes. Finally, to establish the role of exosomes like biomarkers to HAM/TSP development, levels of these genes were associated with proviral load of HTLV-1. Viral mRNA transcripts including tax and HBZ were found only in exosomes isolated from serum of symptomatic individuals and absence in assymptomatic. Furthermore, tax and HBZ expression in exosomes from HTLV-1 infected individuals were positive correlated with proviral load. Thus, the results suggests that exosomes can able to develop important role in myelopathy pathogenesis carrying viral genes of infected cell to uninfected cell. However, more studies that relate the role of exosomes in HTLV-1 are needed

MicroRNAs (miRNAs) são RNA de fita simples (22 nucleotídeos) que atuam como reguladores da expressão gênica celular. Estudos recentes têm demonstrado o papel dos miRNAs como moduladores da resposta celular frente às infecções virais. O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus que apresenta genes estruturais comuns aos demais, além dos genes tax e rex, os quais dão origem às proteínas regulatórias. Entre elas, destaca-se a oncoproteína Tax, que é capaz de modular a expressão de genes celulares e virais, além de estar associada ao desencadeamento de patologias. Destacam-se duas manifestações clínicas associadas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Fatores relacionados ao hospedeiro também estão correlacionados ao aparecimento das patologias. No intuito de estabelecer se miRNAs humanos podem influenciar em processos celulares que se encontram desregulados pela Tax (diferenciação, transdução de sinais, apoptose, proliferação celular e tumorigênese), o objetivo deste projeto foi analisar a expressão de miRNAs em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos infectados HTLV-1. Para tanto, realizamos análises in silico para mapear alvos de miRNAs humanos no gene tax do HTLV-1. Foram utilizados dois algoritmos (miRanda e RNAhybrid), com os seguintes parâmetros: score de 120 na região da semente; energia livre de até -15 kcal/mol. Assim, selecionou-se os hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Adicionalmente, foi observado que as regiões do gene tax, onde se ligam os miRNAs selecionados, são extremamente conservadas entre os diferentes subtipos de HTLV-1. Após estas análises in silico, realizou-se a validação dos miRNAs eleitos. Para tanto, foram isolados PBMC de 21 amostras de indivíduos-controle (CT), 10 portadores assintomáticos do HTLV-1 (HAC) e 12 com HAM/TSP (HAM). Do total de células, 1x106 tiveram seu DNA genômico extraído para quantificação da carga proviral (CPV) pela metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR); 1x106 foram criopreservadas para quantificação de Tax por citometria de fluxo; 1x 107células foram utilizadas na extração de RNA para validação dos miRNAs por qRT-PCR. A fase orgânica do Trizol® foi utilizada para extração de proteínas totais e posterior análise da expressão de Tax por Western blot. A CPV apresentou-se significativamente aumentada (p= 0,0046) no grupo HAM, quando utilizado teste de Mann-Whitney. A expressão de Tax apresentou correlação significativa (p=0,0128) com a CPV, pelo teste de Spearmann e auxiliou na caracterização dos pacientes. O nível de expressão dos miRNAs foi avaliado nos grupos: CT vs Pacientes e CT vs HAC vs HAM por testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-wallis, respectivamente. Os miRNAs se mostraram desregulados no grupo de pacientes quando comparado ao grupo CT. Dentre estes, o hsa-miR-125b encontra-se aumentado significativamente no grupo de pacientes em relação ao controle (p=0,0285). Utilizou-se o teste de correlação de Spearmann, para associar a expressão de Tax com os miRNAs, porém os resultados encontrados não foram significativos. Apesar de não estar correlacionado com expressão de Tax, o hsa-miR-125b é responsável pela regulação de diversas proteínas, como TNF-, uma proteína inflamatória hiper-expressa em portadores do HTLV-1. Deste modo, acreditamos que este miRNA estaria aumentado proporcionalmente na tentativa de inibir a tradução desta proteína. Os resultados deste projeto sugerem a importância de esclarecer como os miRNAs humanos podem regular a infecção pelo HTLV-1 e gerar informações para o desenvolvimento de estratégias que possam interferir com a replicação e patogênese viral. / MicroRNAs (miRNAs) are simple strand RNA (22 nucleotides), which are regulators of cellular gene expression. Recent studies have been showed miRNAs role as modulators of cellular responses, when viral infection occurs. The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus that presents the same regular structural genes compared to the other retrovirus, besides tax and rex genes, which encode regulatory proteins. In regard to this, Tax oncoprotein is a major determinant of viral persistence and pathogenesis. Two major diseases are related to this virus adult T cell leukemia (ATLL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Host-related factors are also correlated with HAM/TSP development. To establish if human miRNAs could influence in the unregulated cellular process caused by Tax (differentiation, signal transduction, apoptosis, cellular proliferation and tumorigenesis), this study analyzed miRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HTLV-1 infected patients. For this purpose, we performed in silico analyses to find human miRNAs that could targeted HTLV-1 tax region. We performed two algorithms (miRanda e RNAhybrid) and we set up two distinct parameters: score more than 120 in the seed region and minimum free energy until -15 kcal/mol. So, we have selected these hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Besides this, we compared several HTLV-1 sub-types and we observed that regions, where miRNAs are regulating, are extremely conserved. After the in silico analysis, we validated miRNAs that we have been chosen. We isolated PBMC samples from 21 control-individuals (CT), 10 from asymptomatic carriers and 12 from HAM/TSP (HAM). After the procedure, genomic DNA were extracted from 1x106 cells, in order to quantify the proviral load (PL) performing quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Tax was measured by flow cytometry and for this procedure, we used 1x106 criopreserved cells. Amount 1x 107cells were used to total RNA extraction that was used to miRNAs validation by qRT-PCR. The organic phase from Trizol® was employed to extract total proteins, which were used to analyze Tax expression by Western blot. The PL was significantly higher in HAM group than HAC (p= 0,0046), when Mann-Whitney statistical test was employed. The Tax expression was significantly correlated to PL (p=0,0128) by Spearmann test and this finding provided us a better characterization of the patients. The miRNAs expression was detected in the following groups: CT vs Patients and CT vs HAC vs HAM by non-parametrical tests Mann-Whitney and Kruskal-wallis, respectively. The miRNAs presented unregulated themselves in the patient group, when we compared to CT group. We observed that hsa-miR-125b expression are significantly higher in patients group than controls (p=0,0285). We have tried to associate miRNAs with Tax expression, employing Spearmann test, but this analysis did not show significant values. Despite this, hsa-miR-125b is responsible for regulating several proteins, such as TNF-, which is an inflammatory protein overexpressed in HTLV-1 carriers. In conclusion, we propose that this miRNA could be increased as a way to inhibit TNF- translation. These results suggest the importance in understanding how human miRNAs could regulated the HTLV-1 infection. In addition to this, they could generate data to be used as therapeutic strategies for the control of viral replication and pathogenic processes.