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Développement et validation d'un nouveau modèle de fermentation colique in vitro avec cellules immobiliséesCinquin, Cécile Françoise 11 April 2018 (has links)
Le microbiote intestinal est un écosystème complexe jouant un rôle très important dans la santé humaine. L’établissement du microbiote intestinal s’effectue dans la première année de vie. Afin de stimuler chez les enfants nourris avec des préparations infantiles les bifidobactéries et lactobacilles, les laits infantiles pourraient être supplémentés avec des probiotiques ou des prébiotiques. Cette supplémentation pourrait leur apporter une protection renforcée contre les troubles intestinaux, les infections et les risques allergiques. Les études in vivo chez les enfants étant difficiles à réaliser à cause de problèmes d’accessibilité et d’éthique, des outils permettant de faire des études in vitro ont été développés. Les systèmes de fermentation continu sont ceux qui se rapprochent le plus des conditions in vivo. Différents modèles ont été proposés, tous utilisent des bactéries fécales libres alors que la microflore bactérienne est présente à l’état planctonique et sessile dans le côlon. Peu de modèles in vitro ont été proposés pour simuler l’écosystème colique chez l’enfant. Le but de cette étude était donc de développer un nouveau modèle de fermentation colique avec cellules immobilisées pour simuler l’écosystème intestinal chez l’enfant. Nous avons montré qu’une microflore fécale pouvait être immobilisée et que sa diversité bactérienne était conservée au cours de la fermentation en continu. La composition et l’activité métabolique de la microflore bactérienne s’équilibraient en fonction des conditions de fermentation à des niveaux voisins de ceux observés in vivo chez l’enfant. Ensuite un modèle de fermentation en continu à trois réacteurs pour simuler le côlon proximal, distal et transverse chez l’enfant a été développé et validé. Ce nouveau modèle a ensuite permis de comparer les effets d’un prébiotique connu (fructooligosaccharide) et d’un exopolysaccharide produit par L. rhamnosus RW-9595M sur l’écosystème intestinal chez l’enfant. Le fructooligosaccharide testé influençait favorablement l’écosystème intestinal alors que l’exopolysaccharide n’était pas métabolisé par le microbiote intestinal chez les enfants. Ce nouveau modèle avec cellules immobilisées possède l’avantage d’obtenir une grande stabilité à la fois de la composition bactérienne et de l’activité métabolique de la microflore, faisant de ce nouveau modèle de fermentation colique un outil de travail pratique, fiable et facile à opérer. / The intestinal microbiota is a complex ecosystem playing a key role in human health. The intestinal microbiota establishment occurred during the first year of life. To stimulate bifidobacteria and lactobacilli in formula fed infants, infant formula could be supplemented with probiotics or prebiotics, food ingredient able to improve human health. This supplementation could provide to them a better protection against gastro-intestinal disorders, infections and allergic risks. In vivo studies are difficult to carry out in infants due to accessibility and ethic problems, then in vitro studies become important. Continuous fermentation systems display the closest conditions to those encountered in vivo. Different fermentation systems have been proposed, all are using free-cell cultures whereas in vivo bacteria are present in colon at planktonic and sessile states. To our knowledge only one in vitro model has been proposed to simulate infant colonic fermentation. The aim of this study was to develop a new in vitro system with immobilized cells to simulate infant colonic ecosystem. First a feasibility study was done, we showed that a complex fecal microflora could be immobilized and the inoculum bacterial diversity was conserved in the ecosystem established in the fermentation system. The bacterial composition and metabolic activities of the microbiota reached an equilibrium specific to the fermentation conditions tested. These equilibriums were closed to those detected in vivo in infant colon. Then a three-stage chemostat using immobilized fecal bacteria was developed and validate to simulate simultaneously, proximal, transverse and distal infant colon conditions. This last in vitro colonic fermentation model was used to compared the effect of a well-known prebiotic (fructooligosaccharide) with an exopolysaccharide produced by L. rhamnosus RW-9595M on the infant colonic microbiota. The fructooligosaccharide used beneficially influenced the bacterial ecosystem whereas exopolysaccharide substrate did not seem to be metabolized by infant colonic microbiota. The main advantage of this system with immobilized cells is the great stability of the bacterial composition and metabolic activities of the microflora established in the model. For this, the in vitro colonic fermentation system with immobilized cells is a very efficient tool, easy to operate and reliable.
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Mesure de la toxicité de polluants par biocapteur. Réalisation d'une électrode à butyrylcholinestérase. Automatisation de la détection de pesticidesEl Yamani, Hayat 29 June 1987 (has links) (PDF)
L'étude porte sur une électrode à butyrylcholinestérase immobilisée, destinée à la détection de pesticides et insecticides inhibiteurs de cette enzyme, en particulier les organophosphorés et les carbamates. Les conditions optimales de mise au point et d'utilisation de cette électrode sont étudiées, ainsi que son comportement en présence d'inhibiteurs solubles dans l'eau, représentés, par le paraoxon. La détection d'inhibiteurs insolubles dans l'eau est effectuée dans un mélange tampon phosphate-éthanol ou méthanol. Le champ des interférences connues est élargi aux sels d'halogénures, et les possibilités de régénération de la butyrylcholinestérase inhibée optimisées. La détection en routine d'inhibiteurs dans les eaux exposées à des risques de pollution accidentelle est mise au point grâce à un ensemble automatisé, dont le fonctionnement est explicité. Un modèle théorique permet d'expliciter certains résultats de l'expérience.
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Hydrolyse de la cellulose par enzymes immobiliséesRoche, Brigitte 18 December 1984 (has links) (PDF)
Depuis longtemps, le bois est utilisé comme combustible, matériau de construction et dans la fabrication de pâtes à papier. Actuellement des procédés thermochimiques, biochimiques et microbiologiques permettent une valorisation du bois conduisant à l'obtention d'intermédiaires chimiques directement utilisables dans l'industrie. L'hydrolyse enzymatique de la cellulose est l'une de ces méthodes. Elle conduit à l'obtention du glucose, point de départ de nombreuses synthèses chimiques dans l'industrie chimique. L'immobilisation de l'enzyme sur support insoluble permet une utilisation répétée de l'enzyme. Cette étude met en évidence le comportement de la cellulase immobilisée vis-à-vis de son substrat. La cellulose est rendue amorphe et soluble par un traitement chimique préalable. Ensuite les différents paramètres influençant l'activité de l'enzyme immobilisée sont étudiés afin de déterminer les conditions optimales de fonctionnement d'un tel système
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Développement d'outils analytiques basés sur la spectrométrie de masse pour le suivi d'interactions enzyme-ligand dans le domaine de la santé / Development of analytical tools-based on mass spectrometry for the monitoring of enzyme-ligand interactions in the healthcare fieldFerey, Justine 24 November 2017 (has links)
Les enzymes et leur diversité d’actions sont appréciées dans des domaines d’applications variés allant del’agroalimentaire à la thérapeutique. Ainsi, une attention toute particulière est portée à leur étude afin d’améliorer uneaction (contre le vieillissement de la peau, antivirale, anticancéreuse…) ou un procédé de synthèse. Ce projet derecherche s’inscrit dans une démarche de développement d’outils analytiques basés sur la spectrométrie de masse,permettant le suivi rapide et sensible d’interactions enzyme-ligand.Dans une première étude, l’approche TLC couplée à une détection par UV a été évaluée pour la déterminationde constantes enzymatiques de l’enzyme invertase. Cette approche couplée à un MALDI/TOF MS a permis d’identifierdes substrats spécifiques de l’invertase au sein d’extraits de plantes. Pour preuve de concept, l’interactioncellobiohydrolase II–ligand est présentée dans le cadre de l’identification d’inhibiteur par TLC-MALDI/TOF et TLCENALDIMS.En seconde étude, nos travaux ont porté sur la caractérisation directe de différentes enzymes kinases, puis auxsuivis des réactions de phosphorylation de nucléosides /tides endogènes. Ces études, basées sur des approches « offline» (Flow Injection Analysis, FIA) et « on-line » (Frontal Affinity Chromatography, FAC) couplées à unspectromètre de masse haute résolution, ont été réalisées au moyen de ces kinases libres et immobilisées. Dans le cadrede la recherche de nouveaux candidats médicamenteux antiviraux, le suivi d’une phosphorylation spécifique desmolécules de synthèse, au regard de souches humaine ou virale de kinase, a également été évalué par ces deuxméthodologies. / Enzymes are very appreciated and useful in various application fields from agri-business to therapeutic due to theirdiversity of actions. Therefore, their action mechanisms are widely studied in order to enhance an action (anti-aging ofskin, antiviral, antitumorous) or a synthesis process. This research project is part of the approach to propose analyticaltools based on mass spectrometry, allowing rapid and sensitive follow-up of enzyme-ligand interactions.In a first study, the Thin-Layer Chromatography (TLC) approach coupled with UV detection was evaluated forthe determination of invertase kinetic constants. This approach coupled with a MALDI / TOF-MS led to theidentification of invertase substrates in plant extracts. As a proof of concept, the cellobiohydrolase II - ligand interactionwas presented in the framework of the identification of inhibitor by TLC-MALDI / TOF and TLC-ENALDI MS.In the second study, our work aimed at developing a direct method for the determination of kinetic parametersof kinases and following-up the phosphorylation reactions of endogenous nucleosides / tides. These studies, based on“off-line” (Flow Injection Analysis, FIA) and “on-line” (Frontal Affinity Chromatography, FAC) approaches coupledwith a high-resolution mass spectrometer, were carried out using free and immobilized kinases. In the context of thesearch for new antiviral drug candidates, a specific phosphorylation of synthetic molecules regards to human or viralkinase was also evaluated by these both approaches.
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Développement d’un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée en vue d’un couplage en ligne à un système d’électrophorèse capillaireGusetu, Georgiana 10 1900 (has links)
Réalisé en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort. / L’objectif principal de ce projet de recherche est d’étudier l’efficacité de la
microencapsulation, technique d’immobilisation d’enzymes utilisée pour la
réalisation des nouveaux biocapteurs électrochimiques. Généralement, l’analyte
d’intérêt produit ou consomme des électrons, et la réponse électrochimique est
mesurée, afin d’identifier ou quantifier l’analyte. Dans le développement d’un
biocapteur, il est désirable de quantifier la conversion du substrat (analyte) et/ou
la formation de produit de réaction enzymatique. Les similarités structurales entre
le substrat et le produit de réaction dans les réactions redox demandent que la
technique utilisée pour les identifier soit très sélective. Le haut pouvoir de
résolution de l’électrophorèse capillaire (EC) pour des séparations rapides de
produits similaires en fait une méthode de choix, spécialement quand le substrat
et le produit peuvent être suivis pendant et après la réaction catalysée par
l’enzyme immobilisée. Un choix judicieux du substrat, compte tenu de son
comportement en EC peut fournir des informations autant sur l’activité de
l’enzyme que sur l’efficacité de la microencapsulation. Pour cette raison, nous
avons choisi le substrat o-phenylènediamine qui est oxydé par la laccase, pour
former le produit 2,3-diaminophenazine, tout en réduisant l’oxygène en eau.
Pour commencer, nous avons préparé les microcapsules et évalué l’impact de la
microencapsulation sur le comportement de l’enzyme. Ensuite, nous avons
développé une méthode de séparation en EC afin de quantifier la conversion de
l’OPD en DAP par la laccase libre. La même méthode d’analyse a été utilisée
pour caractériser la laccase immobilisée dans les microcapsules. Par la suite, afin
de suivre la réaction enzymatique, un microréacteur à base d’enzyme
microencapsulée a été couplé hors ligne au système d’EC. Finalement, nous
avons essayé l’implémentation du système en ligne et les résultats préliminaires
seront présentés. / The principal objective of this research project is to study the efficiency of
microencapsulation, technique used for enzyme immobilization in order to create
new types of electrochemical biosensors. Generally, the target analyte involved
either produces or consumes electrons and the electrochemical response is
measured to identify or quantify the analyte. In the development of a biosensor, it
is desirable to quantify the conversion of substrate (analyte) and/or the formation
of product of the enzymatic reaction. The structural similarity between substrate
and product in redox reactions means that the technique used to determine these
species must be very selective. The high resolving power of capillary
electrophoresis (CE) for rapidly separating similar compounds is thus an
attractive method, particularly if substrate and product can both be monitored
during or following the reaction catalyzed by microencapsulated enzyme. A
judicious choice of substrate with respect to its behaviour in CE separations can
help provide information on enzyme activity as well as microencapsulation
efficiency. To achieve this, we chose the substrate o-phenylenediamine (OPD),
which is oxidized by laccase to form the product 2,3-diaminophenazine (DAP)
concomitant with the reduction of molecular oxygen to water.
We firstly prepared the microcapsules and evaluate the impact of
microencapsulation on the behaviour of the enzyme. After that, we developed a
CE based separation method to quantify the conversion of OPD to DAP by free
laccase. We also used the CE method to characterize laccase immobilized in
microcapsules. Subsequent, the microencapsulated laccase was packed into a
microreactor format permitting its off-line coupling with CE as a means to follow
the enzymatic reaction. Finally, we tried to implement the on-line system and the
preliminaries results are presented.
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Développement d’un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée en vue d’un couplage en ligne à un système d’électrophorèse capillaireGusetu, Georgiana 10 1900 (has links)
L’objectif principal de ce projet de recherche est d’étudier l’efficacité de la
microencapsulation, technique d’immobilisation d’enzymes utilisée pour la
réalisation des nouveaux biocapteurs électrochimiques. Généralement, l’analyte
d’intérêt produit ou consomme des électrons, et la réponse électrochimique est
mesurée, afin d’identifier ou quantifier l’analyte. Dans le développement d’un
biocapteur, il est désirable de quantifier la conversion du substrat (analyte) et/ou
la formation de produit de réaction enzymatique. Les similarités structurales entre
le substrat et le produit de réaction dans les réactions redox demandent que la
technique utilisée pour les identifier soit très sélective. Le haut pouvoir de
résolution de l’électrophorèse capillaire (EC) pour des séparations rapides de
produits similaires en fait une méthode de choix, spécialement quand le substrat
et le produit peuvent être suivis pendant et après la réaction catalysée par
l’enzyme immobilisée. Un choix judicieux du substrat, compte tenu de son
comportement en EC peut fournir des informations autant sur l’activité de
l’enzyme que sur l’efficacité de la microencapsulation. Pour cette raison, nous
avons choisi le substrat o-phenylènediamine qui est oxydé par la laccase, pour
former le produit 2,3-diaminophenazine, tout en réduisant l’oxygène en eau.
Pour commencer, nous avons préparé les microcapsules et évalué l’impact de la
microencapsulation sur le comportement de l’enzyme. Ensuite, nous avons
développé une méthode de séparation en EC afin de quantifier la conversion de
l’OPD en DAP par la laccase libre. La même méthode d’analyse a été utilisée
pour caractériser la laccase immobilisée dans les microcapsules. Par la suite, afin
de suivre la réaction enzymatique, un microréacteur à base d’enzyme
microencapsulée a été couplé hors ligne au système d’EC. Finalement, nous
avons essayé l’implémentation du système en ligne et les résultats préliminaires
seront présentés. / The principal objective of this research project is to study the efficiency of
microencapsulation, technique used for enzyme immobilization in order to create
new types of electrochemical biosensors. Generally, the target analyte involved
either produces or consumes electrons and the electrochemical response is
measured to identify or quantify the analyte. In the development of a biosensor, it
is desirable to quantify the conversion of substrate (analyte) and/or the formation
of product of the enzymatic reaction. The structural similarity between substrate
and product in redox reactions means that the technique used to determine these
species must be very selective. The high resolving power of capillary
electrophoresis (CE) for rapidly separating similar compounds is thus an
attractive method, particularly if substrate and product can both be monitored
during or following the reaction catalyzed by microencapsulated enzyme. A
judicious choice of substrate with respect to its behaviour in CE separations can
help provide information on enzyme activity as well as microencapsulation
efficiency. To achieve this, we chose the substrate o-phenylenediamine (OPD),
which is oxidized by laccase to form the product 2,3-diaminophenazine (DAP)
concomitant with the reduction of molecular oxygen to water.
We firstly prepared the microcapsules and evaluate the impact of
microencapsulation on the behaviour of the enzyme. After that, we developed a
CE based separation method to quantify the conversion of OPD to DAP by free
laccase. We also used the CE method to characterize laccase immobilized in
microcapsules. Subsequent, the microencapsulated laccase was packed into a
microreactor format permitting its off-line coupling with CE as a means to follow
the enzymatic reaction. Finally, we tried to implement the on-line system and the
preliminaries results are presented. / Réalisé en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort.
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Cinétique enzymatique d'une réaction exothermique en phase hétérogène et sous pression. Réacteur utilisant la catalyse immobilisée pour la décomposition de l'eau oxygénéeBilhou-Bougnol, Viviane 13 October 1976 (has links) (PDF)
L'étude de l'activité de la catalase immobilisée nous a permis de trouver là un catalyseur qui permet une décomposition rapide de l'eau oxygénée. On peut facilement préparer l'enzyme fixée et en assurer une bonne conservation au froid : Son activité reste la même pendant un mois et ne diminue que très légèrement au bout de six mois. Nous avons montré que l'activité de la catalase fixée diminue à partir d'un certain seuil de température. Pour maintenir cette activité, nous avons intérêt à travailler dans un domaine de faibles concentrations en eau oxygénée afin de ne pas trop élever la température Ceci provient du fait que, la cinétique de la réaction étant approximativement d'ordre 1 dans ces conditions, la quantité de chaleur dégagée est proportionnelle à la concentration de l'eau oxygénée utilisée. L'analyse théorique de la diffusion-réaction a permis de voir que la température de la membrane enzymatique est proportionnelle à la concentration en eau oxygénée utilisée ; Elle atteint sa valeur maximale au milieu de la membrane. Ces conclusions ne sont valables que dans un domaine assez restreint de températures. Dans le cas où il n'est pas possible de travailler à faible concentration, il est nécessaire de maintenir une température faible au niveau de l'enzyme par un refroidissement tel que nous l'avons décrit dans la deuxième partie. Nous pouvons penser que, soit par une dilution progressive soit par une membrane protectrice à gradient de H<sub>2</sub>0<sub>2</sub>, nous pourrions concilier le stockage peu encombrant de l'eau oxygénée concentrée et son utilisation à l'état dilué nécessaire pour préserver l'activité enzymatique. Une application directe de l'utilisation de la catalase fixée s'est matérialisée dans le réacteur enzymatique que nous avons construit. Le caractère exothermique de la réaction a pu être maîtrisé grâce à la conception et à la réalisation d'un réacteur qui permet de bien fixer et protéger la couche d'enzyme et d'évacuer les calories. On empêche aussi une baisse d'activité trop rapide de l'enzyme. Le réacteur, de dimensions modestes, peut fournir, à la pression atmosphérique, de l'oxygène à raison de 40 litres/heure, à partir de 260 mg de catalase et d'une surface géométrique de mousse enzymatique égale à 300 cm<sup>2</sup>. Le nettoyage du réacteur est aisé du fait de l'utilisation des ailettes démontables. Grâce à son pouvoir d'emmagasiner de l'oxygène sous un faible volume [jusqu'à 478 litres d'oxygène par litre d'eau oxygénée pure], l'eau oxygénée nous permet d'avoir rapidement à notre disposition de l'oxygène au moyen du réacteur à catalase fixée. L'utilisation, pour l'alimentation en oxygène d'une personne, de ce réacteur sous la forme décrite ne semble pas poser de problèmes importants ; Il pourrait être utile notamment pour des premiers secours. Sous pression, nous avons vu que l'enzyme fixée donne lieu à une réaction comparable à celle sous pression atmosphérique. A 50°C, l'utilisation de pressions de plus en plus élevées pour la réaction de décomposition de l'eau oxygénée à 0,5 mole par litre provoque une baisse de l'activité apparente de la catalase fixée. Des températures de travail trop élevées provoquent, sous pression, une dénaturation rapide de l'enzyme fixée par effet thermique. Les résultats de l'expérience de fonctionnement de la catalase immobilisée sous 2 atmosphères, à 50°C, en utilisant une concentration en eau oxygénée de 0,05 à 0,5 mole par litre, montrent qu'il n'y a pas dénaturation de l'enzyme dans ces conditions. Si la cinétique de la réaction a pu ainsi être étudiée jusqu'à 5 atmosphères, l'utilisation du réacteur enzymatique en vue des plongées sous-marines de courte durée demande, quant à elle, une mise au point ultérieure plus approfondie.
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Etude du comportement des enzymes immobiliséees par capteurs enzymatiques. Activités catalytiques et phénomènes d'inhibition, analyse mathématique et applications analytiquesBeaux, Jacques 15 November 1983 (has links) (PDF)
L'étude du comportement des enzymes immobilisées, au moyen de capteurs, a été effectuée grâce à la réalisation d'électrodes enzymatiques fiables, ayant des réponses reproductibles dans le temps. Ces capteurs ont permis de vérifier les résultats de l'étude fondamentale qui débouche ainsi sur la compréhension détaillée des phénomènes essentiels se déroulant au sein de la membrane enzymatique. La méthode mathématique que nous avons adoptée a permis de résoudre un certain nombre de problèmes, en particulier la détermination des paramètres d'une matrice enzymatique, conditionnant le transfert de masse dans les réacteurs biologiques, et la mise en évidence de la "frontière libre" délimitant une zone "gelée". Ainsi nous avons pu expliquer des phénomènes couramment observés en pratique : comportement de l'enzyme immobilisée vis à vis du pH, de la température, de la dénaturation et face au vieillissement. Ces connaissances devraient permettre de prévoir l'action des agents dénaturants pouvant affecter le fonctionnement des réacteurs bi0logiques et d'en améliorer les performances. Nous avons ensuite abordé l'étude du comportement des enzymes en présence des inhibiteurs, étant donné qu'ils sont les principaux effecteurs de la réaction enzymatique. Les essais cinétiques réalisés avec des enzymes en solution ne correspondaient pas à une approche exacte, compte tenu du temps souvent long, nécessaire pour séparer l'enzyme de ses inhibiteurs par dialyse, perméation sur gel, ... Les électrodes munies de membranes contenant des enzymes immobilisées, constituent le moyen idéal pour pallier à cet inconvénient, car nous pouvons à tout instant, mettre l'enzyme en présence ou non de l' inhibiteur. Cette étude a débouché sur la mise en évidence directe du phénomène de réversibilité de l'action d'un inhibiteur. Face aux inhibiteurs non réversibles immédiatement, nos recherches ont conduit à l'utilisation de substances autorisant la régénération rapide et efficace de l'enzyme inhibée. L'étude mathématique appliquée aux inhibiteurs, a permis de différencier les grands types d'inhibition, les méthodes classiques de transformation linéaires telles que celles de Lineweaver-Burk n'ayant plus de raison d'être en phase hétérogène, car les hypothèses de base ne sont plus vérifiées, les enzymes ne fonctionnant pas dans les mêmes conditions (concentrations en substrat, pH, ...) en tout point de la membrane. Le couplage de cette étude fondamentale avec les possibilités de régénération a abouti à la mise au point d'électrodes pour le dosage d'inhibiteurs. Cette méthode de dosage constitue une reproduction du phénomène naturel d'inhibition de notre organisme par des composés polluants. D'autre part, nous avons mis en évidence la possibilité de masquer les effets des inhibiteurs par un choix de conditions telles que l'activité apparente de la membrane enzymatique soit conservée. Le dosage de l'urée sanguine, en présence d'ions fluorures, en est l'exemple le plus marquant. Les capteurs enthalpimétriques nous semblaient être la solution quasi universelle au dosage des composés biologiques, toute réaction s'accompagnant en général d'une variation de l'enthalpie libre. Cependant avec le bruit de fond actuel observé au niveau de tels capteurs, seules quelques substances peuvent donner lieu à un dosage significatif. Nous avons volontairement limité notre étude à un certain nombre de paramètres qui nous ont permis d'obtenir une concordance suffisante entre les prévisions mathématiques et les résultats expérimentaux. D'autres paramètres, affectant l'activité enzymatique, pourraient être mis en évidence dans d'autres conditions expérimentales et font l'objet d'études au sein de notre laboratoire [Thèse Didier Vallin, 1984]. Les progrès réalisés, de nos jours, tant au niveau industriel, qu'agricole, s'accompagnent souvent d'une perte de la qualité de notre environnement. On connaît la pollution des eaux par les rejets industriels et les pesticides, et les conséquences parfois dramatiques aussi bien sur la faune, la flore et,... l'être humain. Aussi l'Homme a-t-il besoin de maîtriser son avenir par une meilleure connaissance des nuisances possibles pouvant provenir d'une amélioration forcenée de sa condition de vie. Aussi, je pense que les électrodes à enzymes immobilisées mises au point, tant pour le dosage des substrats que des inhibiteurs, participent à la réalisation de cet objectif. La qualité de la vie ne doit pas être un vain mot dans les années à venir.
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Investigation of charge transport/transfer and charge storage at mesoporous TiO2 electrodes in aqueous electrolytes / Etude des processus de transport / transfert et accumulation de charges au sein d’un film semi-conducteur mésoporeux de TiO2 en solution électrolytique aqueuseKim, Yee Seul 08 November 2018 (has links)
Améliorer notre compréhension des mécanismes de transport/transfert de charges et de stockage de charges dans les films d'oxyde métallique semi-conducteur mésoporeux transparents (fonctionnalisés ou non par des chromophores redox-actifs) dans des électrolytes aqueux est d'une importance fondamentale pour le développement et l'optimisation d'une large gamme de dispositifs de production ou de stockage d'énergie éco-compatibles et/ou éco-durables (cellules solaires à colorants, batteries, photoélectrolyseurs, ….). Dans ce but, des films de TiO2 semi-conducteur mésoporeux préparés par dépôt sous incidence rasante (GLAD-TiO2) ont été sélectionnés pour leur grande surface spécifique, leur morphologie bien contrôlée, leur transparence élevée dans le visible et leur semiconductivité bien définie qui peut être facilement ajustée par l’application d’un potentiel externe, autorisant ainsi leur caractérisation aisée par spectroélectrochimie en temps réel. Nous avons d'abord étudié le transfert et transport de charges dans des électrodes GLAD-ITO et GLAD-TiO2 fonctionnalisées par une porphyrine de manganèse redox-active jouant à la fois le rôle de chromophore et de catalyseur. Nous avons démontré que la réponse électrochimique des électrodes ainsi modifiées, enregistrée en l'absence ou en présence du substrat O2, dépend fortement de la conductivité du film mésoporeux. En utilisant la voltamétrie cyclique couplée à la spectroscopie d'absorption UV-visible, nous avons pu extraire des informations clés telles que la vitesse du transfert d'électrons hétérogène entre le chromophore redox immobilisé et le matériau semi-conducteur, et aussi pu rationaliser le comportement électrochimique spécifique obtenu sur un film GLAD-TiO2 modifié par la porphyrine en condition catalytique. En parallèle, nous avons développé un procédé de fonctionnalisation de ces films d'oxyde métallique mésoporeux (en l’occurrence des films GLAD-ITO) par électrogreffage de sels d'aryldiazonium générés in situ, permettant d'obtenir des électrodes fonctionnalisées avec un taux de recouvrement surfacique élevé et une stabilité dans le temps particulièrement bonne en conditions hydrolytiques. Nous avons également étudié le stockage de charges au sein d’électrodes GLAD-TiO2 dans divers électrolytes aqueux. Nous avons notamment démontré pour la première fois qu’une insertion rapide, massive et réversible de protons peut être effectuée dans des films de TiO2 nanostructurés amorphes immergés dans un tampon aqueux neutre, le donneur de protons étant alors la forme acide faible du tampon. Nous avons également démontré que ce processus de stockage d’électrons couplé à l’insertion de protons peut se produire sur toute la gamme de pH et pour un vaste panel d'acides faibles organiques ou inorganiques, mais aussi de complexes aqueux d'ions métalliques multivalents, à condition que le potentiel appliqué et le pKa de l'acide faible soient correctement ajustés. / Better understanding of the mechanisms of charge transport/transfer and charge storage in transparent mesoporous semiconductive metal oxide films (either functionalized or not by redox-active chromophores) in aqueous electrolytes is of fundamental importance for the development and optimization of a wide range of safe, eco-compatible and sustainable energy producing or energy storage devices (e.g., dye-sensitized solar cells, batteries, photoelectrocatalytic cells, …). To address this question, mesoporous semiconductive TiO2 films prepared by glancing angle deposition (GLAD-TiO2) were selected for their unique high surface area, well-controlled morphology, high transparency in the visible, and well-defined semiconductivity that can be easily adjusted through an external bias, allowing thus their characterization by real-time spectroelectrochemistry. We first investigated charge transfer/transport at GLAD-ITO and GLAD-TiO2 electrodes functionalized by a redox-active manganese porphyrin that can play both the role of chromophore and catalyst. We demonstrate that the electrochemical response of the modified electrodes, recorded either in the absence or presence of O2 as substrate, is strongly dependent on the mesoporous film conductivity. By using cyclic voltammetry coupled to UV-visible absorption spectroscopy, we were able to recover some key information such as the heterogeneous electron transfer rate between the immobilized redox-active dye and the semiconductive material, and also to rationalize the specific electrochemical behavior obtained at a porphyrin-modified GLAD TiO2 film under catalytic turnover. In parallel, we developed a new functionalization procedure of mesoporous metal oxide films (GLAD-ITO in the present case) by electrografting of in-situ generated aryldiazonium salts, allowing for modified electrodes characterized by both a high surface coverage and a particularly good stability over time under hydrolytic conditions. Also, we investigated charge storage at GLAD-TiO2 electrodes under various aqueous electrolytic conditions. We notably evidenced for the first time that fast, massive, and reversible insertion of protons can occur in amorphous nanostructured TiO2 films immersed in near neutral aqueous buffer, with the proton donor being the weak acid form of the buffer but not water. We also demonstrated that this proton-coupled electron charge storage process can occur over the entire range of pH and for a wide range of organic or inorganic weak acids, but also of multivalent metal ion aquo complexes, as long as the applied potential and pKa of weak acid are properly adjusted.
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Marquage fluorescent des protéines pour étudier les enzymes protéolytiques solubles et immobilisées par la cartographie peptidique électrophorétiqueGan, Shao MIng 06 1900 (has links)
La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués.
Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted.
Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.
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