Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Fabio Tebaldi Silveira Nogueira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:23:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanca_AlmirSamuel_M.pdf: 11034884 bytes, checksum: 0545b58df6802e07009aef761dda3003 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: RNAs não-codificantes de 20-27 nucleotídeos (nt) regulam transcricionalmente ou pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas. Dentre estes, microRNAs (miRNAs) desempenliam papel chave no desenvolvimento vegetal, observação comprovada pela avaliação fenotípica e molecular de plantas transgênicas e de mutantes defectivos na produção de tais RNAs. MiRNAs são produzidos a partir de precursores longos (pri-miRNAs), os quais são posteriormente processados por enzimas específicas, gerando o miRNA maduro (20-22 nt). O miRNA maduro, por sua vez, guia a clivagem do mRNA de genes-alvo e bloqueia a tradução de proteínas, afetando diversos aspectos do desenvolvimento. O sequênciamento de populações de RNAs regulatórios possibilitou a identificação de miRNAs conservados e específicos em diferentes espécies vegetais, embora estudos em plantas de importância econômica sejam ainda incipientes. Atualmente, existem diversos bancos públicos de sequências ESTs disponíveis. Esses bancos possuem um grande número de sequências não-codíficantes, dentre as quais podem estar presentes pri-miRNAs, os quais são também são moléculas poliadeniladas similares a mRNAs codifícantes. O banco público de ESTs de cana-de-açúcar TIGR Gene Index foi usado como base para uma busca de miRNAs. O processo criado possibilitou a identificação de 20 precursores de miRNAs, agrupados em 15 famílias distintas. No presente trabalho desenvolveu-se também ferramenta para predição de potenciais alvos para os miRNAs encontrados. As famílias de miRNAs de cana-de-áçucar e a ferramenta de predição de genes-alvo estão integrados em banco de dados que estará disponível brevemente. Análise de expressão gênica demonstrou que precursors de miRNAs de cana-de-açúcar acumulam em níveis variáveis em distintos tecidos/órgãos. Além disso, tanto o acúmulo do miRNA maduro quanto a degradação do mRNA-alvo foram avaliados para alguns casos estudados. A caracterização de um miRNA específico de monocotiledôneas (miR528) e a confirmação de seu alvo, um gene comum em angiospermas, predito pela primeira vez neste trabalho, gera um interessante questionamento sobre a regulação desse gene via miRNA apenas em monocotiledôneas / Abstract: No-coding RNAs of 20-27 nucleotides (nt) transcriptional or posttranscriptionally regulate endogenous gene expression, affecting the cellular output of transcripts and proteins. Among these RNAs, microRNAs (miRNAs) play an important role in plant development as confirmed by phenotypic and molecular evaluation of transgenic plants and knockout mutants defective in miRNA biogenesis and function. miRNAs are produced from long precursors (pri-miRNAs), which are processed by specific enzymes into the mature miRNA (20-22 nt). The mature miRNA guides the cleavage of target genes as well as impairs protein translation, affecting several development processes. Deep sequencing of small RNAs identified conserved and species-specific miRNAs. Nevertheless, studies on crops are still in their infancy. Public ESTs databases are an important source of no-coding sequences, in which we can find miRNAs precursors, which are polyadenilated RNAs as messenger RNAs. In this work, the public sugarcane EST database TIGR Gene Index was used to search conserved miRNAs. The pipeline developed in this work made possible the identification of 20 miRNAs precursors, grouped into 15 families. It was also developed a search tool for potential miRNAs targets. Sugarcane miRNAs precursors displayed tissue/organ differential expression profiles. Moreover, a new identified miRNA target was confirmed experimentally. This new target is regulated by a monocot specific miRNA, miR528. Interestingly, this miRNA target is conserved in eudicots and monocots, even though its regulation by miRNA is not. This finding raises the question of why this gene has evolved in having a miRNA-mediated posttranscriptional regulation only in monocots / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-10-05T15:40:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇAO NATALIA MOYSES.pdf: 1041310 bytes, checksum: de2100786e43db8c2d408683c6cadf90 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-10-05T15:40:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇAO NATALIA MOYSES.pdf: 1041310 bytes, checksum: de2100786e43db8c2d408683c6cadf90 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T15:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇAO NATALIA MOYSES.pdf: 1041310 bytes, checksum: de2100786e43db8c2d408683c6cadf90 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Ciências Médicas. Instituto Biomédico / O silenciamento do gene pINK4a por hipermetilação tem sido sugerido como cofactor importante envolvido na carcinogênese cervical. O objetivo deste estudo foi investigar o padrão de metilação do gene pINK4a no epitélio cervical e avaliar uma possível associação com a infecção pelos papilomavírus humanos (HPV) e o genótipo viral. Nesse estudo transversal retrospectivo foram analisados 141 esfregaços cervicais, classificados pelo Sistema Bethesda como normal (28), lesão intraepitelial de baixo grau (35), lesão intraepitelial de alto grau (49) e câncer invasivo (29). A detecção e genotipagem de HPV foram feitas pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). A hipermetilação foi avaliada através de Nested-PCR metilação específica. Para analisar a associação entre presença de metilação e variáveis como: presença de HPV, genótipo viral, hábito de fumar e idade, foi feita análise multivariada por regressão logística. Mais de 60% dos casos apresentaram infecção por HPV e 44,6% apresentaram o gene pINK4a hipermetilado. Houve um aumento significativo da freqüência da metilação de acordo com o grau da lesão cervical (p<0,001). A análise multivariada mostrou associação entre a presença de HPV de alto risco e a metilação (p=0,01). Encontramos também correlação entre metilação e resultados da citologia classificados como lesão intraepitelial de alto grau (p=0.007) e câncer (p<0.0001). Nossos resultados indicam que a metilação do gene pINK4a pode contribuir para o surgimento de lesões pré-malignas e transformação neoplásica do epitélio cervical, juntamente com a infecção por HPV de alto risco / pINK4a gene silencing through hypermethylation have been suggested as a cofactor involved in cervical carcinogenesis. We aimed to investigate its methylation status in cervical epithelia and evaluate an association with HPV infection and genotype. This retrospective cross-sectional study was performed with 141 cervical exfoliated cell samples, classified through Bethesda System as Normal (28), low grade intraepithelial lesion (35), high grade intraepithelial lesion (49) and Invasive cancer (29). HPV detection and genotyping was performed through polymerase chain reaction (PCR). Hypermethylation was assessed with nested-methylation specific PCR. To evaluate an association between pINK4a methylation variables such as HPV infection, viral genotyping, tobacco exposure and age a multivariate analysis was performed. HPV positivity was detected in 62% of the samples and 44.6% showed pINK4a hypermethylation. An upward trend was observed according to lesion severity (p<0.001). Multivariate analysis showed an association between high-risk HPV infection and methylated pINK4a profile (p=0.01). We found a correlation between high grade intraepithelial lesion (p=0.007) and cancer (p<0.0001) cytology results and the presence of methylation. Our results point out that pINK4a methylation may contribute to the establishment of premalignant lesions and neoplastic transformation of cervical epithelium along with hr-HPV infection

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_D.pdf: 3895694 bytes, checksum: d999bfc92e9a2e2c757db34bbfc7d7fa (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Rovilson Gilioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:47:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grippo_MariangelaCarnivalli_D.pdf: 1241429 bytes, checksum: 5f05623ad1e884a0014d2eca9109fb9a (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A interferência do RNA (RNAi) pode ser usada como uma ferramenta eficaz no silenciamento gênico específico mediado por moléculas de dupla fita de RNA (dsRNAs). Nesse contexto possui uma variedade de aplicações biológicas, incluindo o combate a patógenos infecciosos de importância biomédica. O objetivo do estudo foi determinar a eficiência e a especificidade da técnica de RNAi em eliminar o vírus da hepatite murina tipo 3 (MIN-3) in vitro. MHVs são vírus envelopados, cujo genoma é formado por uma cadeia de RNA fita simples (+) pertecentes a família Coronaviridae. Seu genoma codifica quatro proteínas estruturais: S (proteína da espícula); M (glicoproteína da transmembrana), N (proteína do nucleocapsídeo) e E (proteína associada à membrana) . Neste trabalho foi escolhido como alvo para o silenciamento gênico a proteína N, tendo sido produzidas moléculas de dsRNA complementares a sua seqüência genômica (GenBank AF 201929). Foram obtidas duas moléculas siRNAs transcritas por T7 RNA polimerase e uma terceira molécula interferente sintetizada comercialmente. Foi observado que os siRNAs produzidos pela transcrição in vitro, induziram uma resposta antiviral não específica. Além disso demonstrou-se que este efeito foi mediado através de substâncias secretadas no meio de cultura celular, provavelmente interferons (IFNs). Este efeito foi eficientemente eliminado após tratamento dos siRNAs com fosfatase alcalina. Observou-se também que a técnica de RNAi in vitro, tendo como alvo a proteína N de MHV-3, foi um tratamento eficaz e específico na infecção viral, confirmados através de estudos fenotípicos e moleculares. Desse modo, concluímos que experiências que utilizam RNAi contra alvos virais devem ser cuidadosamente monitoradas devido aos efeitos não específicos que podem ser induzidos por moléculas de dsRNA / Abstract: RNA Interference (RNAi) can be used as a powerful tool for post transcriptional gene-silencing mediated by double stranded RNA (dsRNAs) molecules. RNAi has a variety of biological applications including the combat against pathogens of biomedical importance. The objective of our study was to determine the efficiency and specificity of this new technique in eliminating mouse hepatitis virus type 3 (MIN-3) in vitro. MIN-3 is a subtype of enveloped viroses with a large plus-stranded RNA genome belonging to the Coronavirus family. Its genome codifies four structural proteins: S (spike protein); M (membrane protein); E (transmembrane glycoprotein); N (nucleocapsid protein). In the present study we target protein N by designing and producing dsRNA molecules complementary to its genomic sequence (GenBank AF 201929). We obtained three small interfering RNAs (siRNA) by in house T7 polymerase in vitro transcription and a fourth siRNA molecule that was commercially synthetized. We identified that siRNAs produced by in vitro transcription triggered a potent and sequence-unspecificied antiviral response. In addition, we demonstrated that this antiviral effect was mediated through molecules that were secreted in medium culture, probably interferons (IFNs). This unspecific effect was efficient1y suppressed when siRNAs were treated with aIkaline phosphatase prior to in vitro experiments. We also observed that RNAi targeting the N protein ofMIN-3 was a potent and specific treatment against in vitro infection, showing significant phenotypic protection and molecular evidence of specific gene-silencing. We concluded that experiments using RNAi against viral targets, although efficient, must be carefully controlled and monitored against possible sequence-unspecific effects triggered by dsRNA molecules / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Júlio Cézar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaCristinaCaribedos_D.pdf: 6201793 bytes, checksum: ec32c93bb2e8f1111e029a6a82d77abd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença "vassoura-de-bruxa" (VB) do cacaueiro (Theobroma cacao L.) é responsável pela diminuição da produção de cacau no Brasil e em outras regiões da América do Sul e Central. Esse decréscimo está diretamente associado a graves problemas sociais e ambientais, particularmente nas regiões amazônica e Sul da Bahia. A interação cacau-M. perniciosa envolve mecanismos genéticos complexos e pouco estudados em nível molecular. Portanto, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) em M. perniciosa, visando análises funcionais de genes relacionados à sua patogenicidade. RNAi é uma eficiente ferramenta para reprimir a expressão gênica experimentalmente, portanto, uma alternativa tecnológica muito promissora. Devido ao fato de RNAi ser um mecanismo pós-transcricional que promove o silenciamento de genes com alta especificidade e de modo sistêmico é considerado uma ferramenta versátil para o estudo de fungos filamentosos heterocarióticos. O trabalho foi conduzido em três etapas integradas: 1) estabelecimento e avaliação das condições adequadas para eletroporação e regeneração de protoplastos de M. perniciosa, como método alternativo para a transfecção de DNA e de dsRNAs nos experimentos de transformação e de silenciamento do fungo, respectivamente; 2) produção de uma linhagem transgênica de M. perniciosa que expresse o gene heterólogo gfp e o estabelecimento da metodologia de silenciamento por RNAi, usando o gene gfp como modelo; 3) silenciamento mediado por dsRNAs de dois genes endógenos de M. perniciosa, vinculados a detoxificação de ROS e a produção de corpos de frutificação. Os parâmetros que promoveram a maior freqüência de regeneração dos protoplastos eletroporados foram a aplicação de um pulso de 1.5 kV. Em relação à transformação de M. perniciosa, o gene repórter gfp foi estavelmente introduzido no genoma do fungo e posteriormente silenciado por transfecção de gfpdsRNA sintetizado in vitro, comprovando a operacionalidade do mecanismo de RNAi em M. perniciosa. Em adição, os genes endógenos MpPRX1 e MpHYD que codificam para peroxiredoxina e hidrofobina, respectivamente, foram silenciados, usando dsRNAs específicos e apresentaram níveis reduzidos de mRNAs que variaram de 18% a 98% quando comparados aos controles. O silenciamento dos genes gfp e MpPRX1 foi corroborado pela redução da fluorescência de GFP e da atividade da peroxidase, bem como da sobrevivência do micélio submetido a H2O2, respectivamente. O silenciamento de gfp e de MpPRX1 persistiu por aproximadamente quatro meses, indicando silenciamento sistêmico. O estabelecimento da técnica de silenciamento gênico por RNAi em M. perniciosa abre novos caminhos para explorar funcionalmente o genoma deste fitopatógeno, bem como o desenvolvimento de mecanismos que bloqueiem ou diminuam a ação deste / Abstract: The fungus Moniliophthora perniciosa, causal agent of cacao (Theobroma cacao L.) witches' broom (WB) disease, is responsible for the decrease in cacao production in Brazil and other regions of South and Central America. This decrease is directly associated to severe social and ecological problems, particularly in the Amazon and Southern Bahia regions. The cacao-M. perniciosa interaction involves complex genetic mechanisms little studied at the molecular level. Therefore, this study aimed to establish a methodology of gene silencing by RNA interference (RNAi) in M. perniciosa, aiming functional analyses of genes related to his pathogenicity. RNAi is a powerful tool to experimentally suppress or regulate gene expression, therefore, a very promising technological alternative. Because RNAi is a post-transcriptional event that promotes gene silencing with high specificity and in a systemic way, it is considered a versatile tool for the study of heterokaryotic fungi. The work was conducted in three integrated steps: 1) establishment and evaluation of appropriate conditions for electroporation and regeneration of M. perniciosa protoplasts, as an alternative method for transfection of transgenic DNA and dsRNAs in transformation and fungus silencing experiments, respectively; 2) production of a transgenic strain of M. perniciosa that expresses the heterologous gene gfp and the establishment of methodology for silencing by RNAi, using the gfp gene as a model; 3) silencing mediated by dsRNAs of two endogenous M. perniciosa genes linked to detoxification of ROS and the production of fruiting bodies. The parameters that promoted the highest frequency of regeneration of electroporated protoplasts were the application of one pulse of 1.5 kV. Regarding M. perniciosa transformation, the gfp reporter gene was stably inserted into the genome of the fungus and subsequently silenced by transfection of gfpdsRNA synthesized in vitro, demonstrating the operationality of the RNAi mechanism in M. perniciosa. In addition, the endogenous genes MpPRX1 and MpHYD, coding for peroxiredoxin and hydrophobin, respectively, were silenced using specific dsRNAs showing reduced levels of mRNAs ranging from 18% to 98% when compared to controls. Silencing of gfp and MpPRX1 was validated by experiments that showed correlation between reduced levels of GFP fluorescence and peroxidase activity, as well as survival of mycelium subjected to H2O2, respectively. The silencing of gfp and MpPRX1 persisted for approximately four months, indicating systemic silencing. The establishment of the gene silencing technique by RNAi in M. perniciosa opens new paths to functionally explore the genome of this pathogen and the development of mechanisms that block or decrease his action / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O câncer de mama é o tumor mais incidente entre as mulheres no mundo. Assim como em outros tumores, a tumorigênese nas mamas é um processo complexo resultante da combinação de fatores genéticos e ambientais que dirigem a transformação das células normais em células malignas. O gene PAWR, conhecido como PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4) foi primeiramente identificado em células de câncer de próstata de rato induzidas a apoptose e codifica uma proteína de 342 aminoácidos que é efetiva na indução de apoptose nas células tumorais e causa regressão dos tumores ativando Fas/FasL e inibindo a atividade de NF-B. O aumento de Par-4 é suficiente para causar apoptose seletiva em células tumorais, mas não em células normais ou imortalizadas. Recentemente, um estudo de nosso grupo demonstrou que a expressão reduzida de Par-4 está associada a um pior prognóstico em câncer de mama e que esta proteína pode ter um papel importante na morfogênese da glândula mamária. O estudo funcional do gene Par-4 em diferentes linhagens de mama é importante para o melhor entendimento do papel deste gene no processo tumorigênico da glândula mamária. Portanto, a proposta do presente estudo foi investigar os efeitos do aumento de expressão ou supressão de Par-4 na proliferação celular e sobrevivência das células normais e tumorais de mama. As células MCF10A e MCF-7 foram transfectadas com os vetores de expressão para Par-4 (pCMV6-PAR-4) ou com oligos siRNA para supressão transiente de Par-4. A caracterização dos clones foi feita por Real Time PCR e Western Blot. Os ensaios de proliferação foram feitos por MTT e os ensaios de apoptose por dupla marcação com Laranja de Acridina/ Hoechst 33342 e por citometria de fluxo. O aumento da expressão de Par-4 diminuiu a proliferação de ambas às células comparadas às células-controle (p<0,01). Por outro lado, a diminuição de expressão de Par-4 por siRNA levou ao aumento da proliferação das células tumorais MCF-7 (p<0,01). A quantificação das células em apoptose mostrou um aumento significativo de apoptose nas células MCF-7 com aumento de Par-4 em relação às células controle MCF-7 pcNEO tratadas com ambas as concentrações de docetaxel (5 nM 13,24% versus 3,89%; p=0.001; 100 nM 24,81% versus 6,07%; p=0,0001) por 24 horas. Embora preliminares, os resultados de citometria também mostraram que as células MCF-7 com aumento de Par-4 apresentam maior porcentagem de células em apoptose na ausência de tratamento e após tratamento com 100 nM de docetaxel por 24 horas. Embora novos estudos sejam necessários, nossos dados sugerem que o aumento de expressão de Par-4 sensibilizou as células MCF-7 ao quimioterápico docetaxel. Pela primeira vez, mostramos o efeito inibitório de Par-4 no crescimento e sobrevivência das células epiteliais mamárias / Breast cancer is the most common tumor among women in the world. As for other malignancies the tumorigenic process of the breast involves genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into malignant cells with and aggressive phenotype. Alterations in cells that upregulate proliferation or downregulate apoptosis are one of essential mechanisms that dictate tumor growth. The PAWR gene, also known as PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4), was first identified in prostate cancer cells undergoing apoptosis and encodes a 332 aminoacid protein that is effective in inducing cancer cell apoptosis and cause regression of tumors by activating Fas/FasL and inhibiting NF-B activity. Interestingly, Par-4 overexpression is sufficient to cause apoptosis in cancer cells, but not in normal or immortalized cells. Recently, we demonstrated that reduced expression of PAR-4 is associated with breast cancer poor prognosis and this protein may have a role in the process of the mammary gland morphogenesis. The functional study of Par-4 gene in different cell lines of breast is important to better understand its role in the tumorigenic process of the breast. Therefore, the purpose of the present study was to investigate the effects of overexpression and suppression of PAR-4 in cell proliferation and survival in mammary epithelial cells. MCF10A and MCF-7 cells were transfected with expression vectors for PAR-4 overexpression (pCMV6-PAR-4) or with small interfering RNAs duplexed oligonucleotides. Clone characterization was performed using real time PCR and western blot. Proliferation assays were carried out using MTT and apoptotic assays were performed by doublefluorescence staining technique (Acridine Orange/Hoechst 33342) or using flow cytometry. PAR-4 overexpression decreased the proliferation rates in both MCF10A and MCF-7 cells compared to the parental or control cells (p<0,01). On the other hand, PAR-4 knockdown leads to increased proliferation in MCF7 cells (p<0,01). We observed a significant increase in apoptosis of MCF-7 cells with increased expression of Par-4 compared to control cells (MCF-7 pcNEO) in both concentrations of docetaxel (5 nM 13,24% versus 3,89%, p = 0,001; 100 nM 24,81% versus 6,07%, p < 0,0001). Cytometry analysis, although preliminary, showed that MCF-7 pcPar-4 have a higher percentage of apoptotic cells in the absence of treatment and after treatment of 100 nM of docetaxel. Although more studies are needed, our data suggest that increased expression of Par-4 sensitizes breast cancer cells to treatment with docetaxel. This is the first report showing that PAR-4 has inhibitory effects on mammary epithelial cells proliferation and survival

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:15:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AnaHelenaMacedo_M.pdf: 6567293 bytes, checksum: b9a8c070b3b65fe7a4fb095ccfc59d42 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Doenças do coração são freqüentemente associadas à hipertrofia miocárdica. Estímulos mecânicos induzem o crescimento hipertrófico e contribuem para a degeneração e morte dos miócitos cardíacos. Dentre os fatores de transcrição envolvidos no processo de hipertrofia miocárdica, estão os da família MEF2 (Myocyte Enhancer Factor-2), que é composto por 4 membros, MEF2A, B, C e D. O MEF2C é descrito como o principal transcrito no miocárdio. Tanto a deleção quanto a hiperexpressão de seu gene causam efeitos deletérios na formação e na função do músculo cardíaco. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o MEF2 é ativado por estiramento de cardiomiócitos e influencia a expressão de genes do programa hipertrófico. O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do silenciamento gênico do MEF2C nas alterações estruturais e funcionais do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica. Para isso, utilizamos a técnica de interferência por RNA para o MEF2C. A padronização constituiu de: 1) avaliação do silenciamento do MEF2C em cultura de células C2C12 e no ventrículo esquerdo de camundongos Swiss; 2) determinação da dose necessária de siRNA para o silenciamento da expressão protéica do MEF2C; 3) determinação do curso temporal do silenciamento; 4) avaliação dos efeitos do tratamento com molécula irrelevante de siRNA direcionada para a proteína exógena GFP; 5) avaliação da especificidade do silenciamento (off-targets) pela análise do RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2; 6) avaliação do silenciamento em outros órgãos, como pulmão e rim; 7) avaliação da efetividade do silenciamento de MEF2C em miócitos cardíacos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos. O tratamento com siRNA diminuiu a expressão protéica do MEF2 em 70% das células C2C12. Também verificamos que o tratamento com siRNA silenciou 85% da expressão protéica e do RNAm do MEF2C no ventrículo esquerdo de camundongos em até 4 dias de seguimento. Não foi verificada alteração na expressão de RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2. O silenciamento foi efetivo no pulmão e nos cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos tratado com siRNAMEF2C. Após a padronização do silenciamento, procedeu-se à determinação dos efeitos do silenciamento na estrutura e na função do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica crônica. Para isso, realizaram-se as análises ecocardiográfica, hemodinâmica, gravimétrica e morfométrica do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à coarctação da aorta com seguimento de 15 dias. Demonstramos que o tratamento com siRNAMEF2C atenuou a hipertrofia cardíaca nos animais coarctados. Esta conclusão foi baseada em dados de ecocardiografia que revelaram menor espessura da parede posterior (30% menor) e por gravimetria que revelou atenuação de aproximadamente 45% da massa do ventrículo esquerdo. Apesar de ter havido aumento do gradiente sistólico nos animais coarctados, a pressão arterial sistêmica não apresentou diferença estatisticamente significativa com o tratamento do siRNAMEF2C. Morfologicamente, o siRNA atenuou a fração de colágeno no ventrículo esquerdo de camundongos coarctado com 15 dias de seguimento. Entretanto, o diâmetro dos miócitos e o infiltrado de células inflamatórias foram comparáveis dentre os grupos. Somente os animais coarctados por 24 horas tiveram maior expressão de ß- MHC, e quando tratados com siRNAMEF2C apresentaram menor razão ATP/ADP. Dessa forma, esses dados sugerem que o MEF2C regula múltiplos aspectos da hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga pressórica tais como a expressão de genes sarcoméricos e genes envolvidos na adaptação metabólica do músculo cardíaco. / Abstract: Heart diseases are frequently associated with myocardial hypertrophy. Mechanical stimuli can trigger hypertrophic growth as well as degeneration and death of the cardiac myocytes. The MEF2C family of transcription factors plays a role in the process of myocardial hypertrophy. It is composed by 4 members, MEF2A, B, C and D, and the MEF2C is the main transcript in the heart. Both the deletion and overexpression of mef2c induce deleterious effects in the formation and function of the heart. Previous studies of the our laboratory has shown that the transcription factor MEF2C is activated by mechanical stretch in cardiomyocytes and regulates the expression of genes related to cardiac hypertrophy. This study was performed to address the effects of MEF2C gene silencing in the structural and functional changes of the left ventricle (LV) induced by pressure overload in mice. To silence MEF2C, it was employed the RNA interference technique, specific siRNA target to MEF2C was administered through the mice jugular vein. To optimize the MEF2C knockdown, it was necessary to 1) analyze the MEF2C silencing in C2C12 cells, 2) determine the dose required to induce significant MEF2C silencing in LV of mice, 3) determine the time course of gene silencing, 4) assess the effects of the treatment with irrelevant siRNA target to the protein GFP, 5) evaluate the specificity of gene silencing by siRNAMEF2C through the expression analysis of the transcription factor MEF2A and other non-related proteins, 6) analyze of the MEF2C knockdown in other organs, 7) determine the effectiveness of the MEF2C silencing in cardiac myocytes harverst from the LV of mice treated systemically with siRNAMEF2C. Treatment with 100ng/mL of siRNAMEF2C induced MEF2C silencing (~70%) in C2C12 cells. Intrajugular delivery of 30µg of siRNAMEF2C in mice induced the reduction in the mRNA and protein levels (~85%) until 4 days after the injection. The treatment with siRNAMEF2C did not affect the expression of MEF2A and other non-related proteins. The MEF2C silencing was effective in lung and in cardiac myocytes harverst from LV of mice treated with siRNAMEF2C. After knockdown optimization, echocardiographic, hemodynamic, gravimetric and morphometric analysis was performed to address the effects of MEF2C silencing in the structure and function of the LV from 15 days aorticbanded mice. Myocardial MEF2C silencing attenuated the load-induced hypertrophy in banded mice, indicated by the reductions of the wall thickness and the mass (~45%) of the LV. An increase in transconstriction gradient was observed in banded mice but the systemic blood pressure did not shown a significant statistically difference with the siRNAMEF2C treatment. The siRNAMEF2C injection reduced the collagen fraction in the LV of 15 days banded mice. On the other hand, the myocytes diameter and inflammatory cells level were comparable between the groups. Only the 24 hours banded mice showed an increase in the â-MHC expression and the treatment with siRNAMEF2C reduced ATP/ADP ratio. This study indicate that MEF2C regulates many aspects of the cardiac hypertrophy induced by pressure overload, like the expression of sarcomeric genes and genes involved in metabolic adaptation of the heart muscle. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

O câncer de mama é o tumor mais incidente entre as mulheres no mundo. Assim como em outros tumores, a tumorigênese nas mamas é um processo complexo resultante da combinação de fatores genéticos e ambientais que dirigem a transformação das células normais em células malignas. O gene PAWR, conhecido como PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4) foi primeiramente identificado em células de câncer de próstata de rato induzidas a apoptose e codifica uma proteína de 342 aminoácidos que é efetiva na indução de apoptose nas células tumorais e causa regressão dos tumores ativando Fas/FasL e inibindo a atividade de NF-B. O aumento de Par-4 é suficiente para causar apoptose seletiva em células tumorais, mas não em células normais ou imortalizadas. Recentemente, um estudo de nosso grupo demonstrou que a expressão reduzida de Par-4 está associada a um pior prognóstico em câncer de mama e que esta proteína pode ter um papel importante na morfogênese da glândula mamária. O estudo funcional do gene Par-4 em diferentes linhagens de mama é importante para o melhor entendimento do papel deste gene no processo tumorigênico da glândula mamária. Portanto, a proposta do presente estudo foi investigar os efeitos do aumento de expressão ou supressão de Par-4 na proliferação celular e sobrevivência das células normais e tumorais de mama. As células MCF10A e MCF-7 foram transfectadas com os vetores de expressão para Par-4 (pCMV6-PAR-4) ou com oligos siRNA para supressão transiente de Par-4. A caracterização dos clones foi feita por Real Time PCR e Western Blot. Os ensaios de proliferação foram feitos por MTT e os ensaios de apoptose por dupla marcação com Laranja de Acridina/ Hoechst 33342 e por citometria de fluxo. O aumento da expressão de Par-4 diminuiu a proliferação de ambas às células comparadas às células-controle (p<0,01). Por outro lado, a diminuição de expressão de Par-4 por siRNA levou ao aumento da proliferação das células tumorais MCF-7 (p<0,01). A quantificação das células em apoptose mostrou um aumento significativo de apoptose nas células MCF-7 com aumento de Par-4 em relação às células controle MCF-7 pcNEO tratadas com ambas as concentrações de docetaxel (5 nM 13,24% versus 3,89%; p=0.001; 100 nM 24,81% versus 6,07%; p=0,0001) por 24 horas. Embora preliminares, os resultados de citometria também mostraram que as células MCF-7 com aumento de Par-4 apresentam maior porcentagem de células em apoptose na ausência de tratamento e após tratamento com 100 nM de docetaxel por 24 horas. Embora novos estudos sejam necessários, nossos dados sugerem que o aumento de expressão de Par-4 sensibilizou as células MCF-7 ao quimioterápico docetaxel. Pela primeira vez, mostramos o efeito inibitório de Par-4 no crescimento e sobrevivência das células epiteliais mamárias / Breast cancer is the most common tumor among women in the world. As for other malignancies the tumorigenic process of the breast involves genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into malignant cells with and aggressive phenotype. Alterations in cells that upregulate proliferation or downregulate apoptosis are one of essential mechanisms that dictate tumor growth. The PAWR gene, also known as PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4), was first identified in prostate cancer cells undergoing apoptosis and encodes a 332 aminoacid protein that is effective in inducing cancer cell apoptosis and cause regression of tumors by activating Fas/FasL and inhibiting NF-B activity. Interestingly, Par-4 overexpression is sufficient to cause apoptosis in cancer cells, but not in normal or immortalized cells. Recently, we demonstrated that reduced expression of PAR-4 is associated with breast cancer poor prognosis and this protein may have a role in the process of the mammary gland morphogenesis. The functional study of Par-4 gene in different cell lines of breast is important to better understand its role in the tumorigenic process of the breast. Therefore, the purpose of the present study was to investigate the effects of overexpression and suppression of PAR-4 in cell proliferation and survival in mammary epithelial cells. MCF10A and MCF-7 cells were transfected with expression vectors for PAR-4 overexpression (pCMV6-PAR-4) or with small interfering RNAs duplexed oligonucleotides. Clone characterization was performed using real time PCR and western blot. Proliferation assays were carried out using MTT and apoptotic assays were performed by doublefluorescence staining technique (Acridine Orange/Hoechst 33342) or using flow cytometry. PAR-4 overexpression decreased the proliferation rates in both MCF10A and MCF-7 cells compared to the parental or control cells (p<0,01). On the other hand, PAR-4 knockdown leads to increased proliferation in MCF7 cells (p<0,01). We observed a significant increase in apoptosis of MCF-7 cells with increased expression of Par-4 compared to control cells (MCF-7 pcNEO) in both concentrations of docetaxel (5 nM 13,24% versus 3,89%, p = 0,001; 100 nM 24,81% versus 6,07%, p < 0,0001). Cytometry analysis, although preliminary, showed that MCF-7 pcPar-4 have a higher percentage of apoptotic cells in the absence of treatment and after treatment of 100 nM of docetaxel. Although more studies are needed, our data suggest that increased expression of Par-4 sensitizes breast cancer cells to treatment with docetaxel. This is the first report showing that PAR-4 has inhibitory effects on mammary epithelial cells proliferation and survival

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos. Uma combinação de terapia padrão com outras terapias baseadas no conhecimento de sua biologia é necessária para melhorar a sobrevida de pacientes com GBM. Muitos estudos foram desenvolvidos em busca de proteínas de membrana expressas em GBM, pois são potenciais alvos para imunoterapia. A proteína transmembrânica CD99 foi descrita como altamente expressa em astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente compreendido, CD99 está envolvido na adesão e migração celular em diferentes tipos de tumores. O gene CD99 codifica duas proteínas distintas, denominadas isoforma 1, maior, de 32 kDa, e isoforma 2, gerada por splicing alternativo e menor, de 28 kDa. No presente estudo, foi demonstrada a expressão predominante da isoforma 1 em astrocitomas de diferentes graus de malignidade em comparação com o cérebro normal, bem como na linhagem celular de GBM humano U87MG. O transcriptoma das células U87MG transfectadas com siRNA para CD99 foi analisado em relação ao controle. Um total de 2.670 genes diferencialmente expressos foi identificado. Uma análise de enriquecimento no banco de dados DAVID revelou os seguintes processos como os mais significativos: junções aderentes célula-célula; adesão célula-célula envolvendo ligação de caderina e adesão celular. Ensaios funcionais baseados nestes achados (migração, invasão e adesão) foram realizados com células U87MG após o silenciamento de CD99 com dois shRNAs diferentes. A eficiência de silenciamento foi de 80 e 97%, para o shCD991 e 2, respectivamente, confirmada a nível de expressão do gene e da proteína. O silenciamento de CD99 reduziu a migração e invasão para ambos os shRNAs, com diminuição mais acentuada da migração para o shCD99 2, com maior nível de silenciamento de CD99. No ensaio de adesão, a linhagem U87MG shCD99 1 apresentou propriedades adesivas mais baixas que o controle, enquanto o shCD99 2 apresentou resultado oposto, com maior adesão celular do que seu controle. Provavelmente o silenciamento de CD99 afetou a redução da adesão celular em um padrão distinto, sugerindo que o resultado pode ser dependente do nível de expressão remanescente de CD99. Além disso, o CD99 e a faloidina colocalizaram nos lamelipódios e filopódios, sugerindo um papel importante no rearranjo do citoesqueleto. Foi demostrado, ainda, que o silenciamento de CD99 levou à redução da proliferação celular in vitro e diminuição do tumor in vivo. Camundongos imunodeficientes nos quais foram implantadas células silenciadas no cérebro apresentaram uma maior sobrevida que os animais que receberam células controle. A via de sinalização pela qual CD99 modula a proliferação no GBM ainda precisa ser elucidada. Migração, invasão e proliferação são as principais características do GBM que limitam uma ressecção cirúrgica completa e, consequentemente, levam frequentemente à recorrência. Portanto, análises posteriores das vias ativadoras do CD99 no contexto da migração, invasão, proliferação celular e apoptose são válidas para revelar novas estratégias terapêuticas para limitar a progressão do GBM / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults. A combination of standard therapy with other biologically based therapies is necessary to improve the survival of patients with GBM. Many studies have been developed in pursuit of expressed membrane proteins in GBM, which are potential targets for immunotherapy. The transmembrane protein CD99 is highly expressed in different malignant grades of astrocytomas. Although its mechanism of action is not still fully understood, CD99 is involved in cell adhesion and migration in different type of tumors. The CD99 gene encodes two distinct transmembrane proteins, named isoform 1, longer with 32 kDa, and isoform 2, generated by alternative splicing, shorter with 28 kDa. In the present study, we demonstrated predominant expression of isoform 1 in astrocytomas of different malignant grades compared to normal brain, and in the human GBM cell line U87MG. The transcriptome of U87MG cell line transfected with siRNA for CD99 was analyzed in relation to control. A total of 2.670 differentially expressed genes were identified. An enrichment analysis by DAVID Bioinformatics Database revealed the following processes as the most significant: cell-cell adherens junction; cadherin binding involved in cell-cell adhesion and cell-cell adhesion. Functional assays based on these findings (migration, invasion and adhesion) were performed with U87MG cells after knocking down CD99 with two different shRNAs. The CD99 silencing efficiency was 80 and 97%, for shCD99 1 and 2, respectively, confirmed at gene and protein level. The CD99 knockdown reduced migration and invasion for both shRNA, with the highest decrease of migration observed in the higher CD99 knocked down cells. In adhesion assay, shCD99 1 U87MG showed lower adhesive properties than the control, whereas shCD99 2 cells presented opposite results, with higher cell adhesion than control. Probably CD99 knockdown affected in the reduction of cell adhesion in a distinct pattern, suggesting that the result is dependent on CD99 remaining expression level. Additionally, CD99 and phalloidin colocalized at lamellipodia and filopodia, sugesting that CD99 plays an important role to cytoskeleton rearrangement. It has also been demonstrated that CD99 silencing caused reduction of cell proliferation in vitro and decreased tumor in vivo. Immunodeficient mice in which knocked down cells were implanted in the brain had a longer survival than animals that received control cells. The signaling pathway by which CD99 modulates proliferation in GBM still needs to be elucidated. Migration, invasion and proliferation are major characteristics of GBM, which limits the complete surgical tumor resection, and consequently leads to tumor recurrence. Therefore, further analysis of CD99 activating pathways in the context of cell migration, invasion, proliferation and apoptosis is worthwhile to unveil new therapeutic strategies to halt GBM progression