La família de les paraoxonases (PON) comprèn 3 enzims: PON1, PON2 y PON3. En humans, PON1, el membre més estudiat, s'expressa bàsicament en el fetge i circula associada a les HDL. PON1 es un enzim polimòrfic que pot degradar des d'organofosforats fins a diferents tipus d'ésters, lactones i xenobiòtics, però la seva funció fisiològica és la d'hidrolitzar peròxids lipídics. També té una acció anti-inflamatòria, ja que pot atenuar la secreció de MCP-1, una quimioquina pro-inflamatòria. L'estrés oxidatiu i la inflamació juguen un paper fonamental en el desenvolupament de malalties hepàtiques. Tenint en compte l'efecte protector de PON1 contra l'estrés oxidatiu, seria molt probable trobar una associació entre PON1 i les hepatopaties cròniques. Objectius de la Tesi: a) investigar la presència d'alteracions en l'activitat i expressió de PON1 en hepatopaties cròniques humanes i experimentals, i estudiar els mecanismes moleculars relacionats; b) avaluar un nou assaig enzimàtic utilitzant un substrat no tòxic que mesura l'activitat lactonasa de PON1; c) estudiar l'eficàcia diagnòstica de la determinació de l'activitat PON1 en l'avaluació clínica de la malaltia hepàtica.Conclusions: 1) PON1 podria regular l'estrés oxidatiu mitjançant la degradació de lipoperòxids; la inflamació, actuant com una barrera contra la inflamació induïda per MCP-1; i l'apoptosi cel·lular, correlacionant-se amb un augment en la forma soluble del receptor FAS (sFAS) 2) L'activitat PON1 en sèrum de pacients hepatòpates podria disminuir a causa d'alteracions en la mida i composició de les HDL, i/o d'un augment en l'estrés oxidatiu 3) L'expressió hepàtica i sèrica de PON1 augmentarien a causa d'una disminució en la síntesi d'HDL, i d'una disminució de la proteòlisi cel·lular 4) La determinació de l'activitat lactonasa de PON1 en sèrum, utilitzant el substrat TBBL, és un mètode fiable, no tòxic i semi-automàtic, i està menys influenciada pels polimorfismes genètics que l'activitat esterasa utilitzant paraoxó 5) La determinació de l'actividad PON1 sèrica té una elevada eficàcia diagnòstica i pot ser un útil complement a les proves de valoració de la funció hepàtica que s'utilitzen en la pràctica clínica. / The family of serum paraoxonases (PON) consist of three enzymes: PON1 (the most investigated member), PON2 and PON3. In humans, PON1 expression is mainly found in the liver, and circulates tightly bound to HDL. PON1 is a polymorphic enzyme that is able to degradate organophosphates and different type of esters, lactones and xenobiotics, but its physiological function is to hydrolise lipid peroxides. It has also an antiinflamatoy role since it can attenuate MCP-1 (a proinflamatory chemokine) secretion. Oxidative stress and inflammation play key roles in the development of liver diseases. Since PON1 has a protective effect against oxidative stress, it could be plausible to find an association between PON1 and chronic hepatic diseases.Aims of the Thesis: a) to investigate the presence of alterations in PON1 activity and expression in human and experimental chronic hepatic diseases, and to study the molecular mechanisms involved; b) to evaluate a new enzymatic assay using a non toxic substrate that measures PON1 lactonase activity; c) to assess the diagnostic accuracy of the measurement of serum PON1 activity in the clinic evaluation of liver diseases.Conclusions: 1) PON1 could regulate oxidative stress by lipid peroxides degradation; inflammation, by acting as a barrier against MCP-1 induced inflammation; and cell apoptosis, by its relationship with the increase of sFAS, the soluble form of FAS receptor 2) Serum PON1 activity in patients with chronic liver disease could decreased as a consequence of alterations in the size and composition of HDL, and/or an increase of oxidative stress 3) Serum and hepatic PON1 expression would increase because of the decrease in HDL synthesis, and the decrease of cellular proteolysis 4) Serum PON1 lactonase activity measurement, using TBBL as a susbtrate, is a reliable, non-toxic, semi-automated assay, and is less influenced by genetic polymorphisms than PON1 esterase activity using paraoxon 5) Serum PON1 activity measurement has a high diagnostic accuracy and may contribute significantly to the evaluation of liver function in the clinical setting.

La inflamació s’ha considerat tradicionalment com un mecanisme de defensa, molt lligat a la supervivència de l’espècie, per la seva capacitat de combatre les infeccions o restaurar el dany produït. No obstant, un estat d’inflamació crònic produeix un efecte totalment contrari, que s’associa a un mal funcionament de teixits i òrgans. L’objectiu d’aquest treball és l’estudi de la proteïna quimioatraient de monòcits-1 (MCP-1), una proteïna descrita per la seva funció en l’atracció de monòcits a la lesió arterioscleròtica, i que pot tenir un paper rellevant en el metabolisme. Els resultats mostren que MCP-1 està implicada en el control del metabolisme dels lípids i de la glucosa, i que l’expressió hepàtica de MCP-1 està sobre-expressada per la dieta i que contribueix al desenvolupament i progressió de l’esteatosi hepàtica en el model LDLr-/-. Precisament, l’últim treball demostra que l’estudi dels canvis metabolòmics en el teixit hepàtic ens pot ajudar a entendre aquesta patologia / Inflammation has been traditionally regarded as a defense mechanism, closely linked to the survival of the species for their ability to fight infections or restore the damage. However, a state of chronic inflammation produced a completely opposite effect, which is associated with tissue and organ malfunction. The aim of this work is the study of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), a protein described by its role in attracting monocytes to atherosclerotic lesions, which may also play an important role in metabolism. The results show that MCP-1 is involved in the control of lipids and glucose metabolism. Hepatic MCP-1 is over-expressed by diet and contributes to the development and progression of fatty liver disease (NASH) in LDLr-/- model. Indeed, the latest study shows that metabolomic changes in the liver can help us to understand the NASH progression.

INTRODUCCIÓ: Hi ha molt poca informació a la literatura mèdica que suggereix que existeix una alta prevalença de la infecció pel virus hepatitis B (VHB) i C (VHC) en malalts amb malaltia inflamatòria intestinal (MII). El seu coneixement és important per la possibilitat de reactivació viral relacionada amb el tractament immunosupressor. HIPÒTESI: La infecció per VHB i C és més freqüent en la MII que en la població general de referència. El tractament immunosupressor pot reactivar la infecció per VHB i C. OBJECTIUS: Avaluar: 1) La prevalença d'infecció per VHB i C en pacients amb MII de diferents àrees geogràfiques d'Espanya. 2) L'efecte del tractament immunosupressor i els fàrmacs biològics sobre l'evolució de la infecció per VHB i C. METODOLOGIA: Estudi 1: inclusió de 2076 pacients amb MII, als quals s'avalua l'existència d'infecció per VHB i C mitjançant tècniques analítiques estàndard (ELISA i PCR). Es van registrar els factors relacionats amb la MII i la infecció. Estudi 2: Inclusió de 162 pacients amb MII i infecció per VHB i / o C i que van rebre tractament immunosupressor per la MII. Es van registrar variables clíniques i analítiques relacionades amb la reactivació. Tots dos són estudis multicèntrics amb registre electrònic (www.repentina.com). Per a l’anàlisi de resultats es van utilitzar tests univariants (2 i test de t Student) i multivariants (regressió logística i model de risc proporcional de Cox). RESULTATS: Estudi 1: El 9.7% de pacients amb colitis ulcerosa (CU) i malaltia de Crohn (MC) van presentar positivitat de marcadors d'infecció pel VHB i C actual o passada (CU: HBsAg 0.8 % , anti-HBc 8 % , anti-VHC 1.3 % ; MC: HBsAg 0.6 % , anti-HBc 7.1 % , anti-VHC 2.3 % ). El 12% de pacients amb MII van presentar marcadors de vacunació eficaç. En l’anàlisi multivariant, l'edat, la història familiar d'hepatitis i la MII moderada-greu, es van relacionar de manera significativa amb el VHB, mentre que les transfusions i l'ús d'antibiòtics ho van fer amb el VHC. Estudi 2: Un 36% de pacients van presentar disfunció hepàtica (DH) relacionada amb el VHB, un 66% dels quals van presentar insuficiència hepàtica. L’anàlisi multivariant va demostrar que l’únic factor relacionat amb la DH per VHB va ser l'ús simultani de 2 o més immunosupressors. En canvi només un 15.7% dels pacients amb VHC van presentar DH. CONCLUSIONS:Estudi 1: El pacients amb MII presenten una prevalença d’infecció pels VHB i VHC similar a la de la població general de referència, i aquesta és més baixa del que prèviament s’havia publicat. L’escassa relació de la infecció pel VHC i VHB amb els procediments invasius i ingressos hospitalaris suggereix que aquestes infeccions rarament s’adquireixen en l’àmbit hospitalari al nostre país. Es detecta un baix percentatge de vacunació eficaç pel VHB, el que obliga a intensificar els programes de vacunació en aquests pacients. Estudi 2: La DH en pacients amb MII tractats amb immunosupressors, és més freqüent i greu en els pacients amb infecció pel VHB que en el pacients amb infecció pel VHC. La immunosupressió combinada va ser l’únic factor predictiu independent de reactivació pel VHB. / Background: Limited information suggests the existence of a high prevalence of hepatitis B (HBV) and C virus (HCV) in inflammatory bowel disease (IBD). Hypothesis: HBV and HCV infection is more common in IBD than in the general population. Immunosuppressants can reactivate these infections.Objectives: To asses: 1) the prevalence of HBV and HCV in IBD, in a nationwide study, and to evaluate associated risk factors. 2) the influence of immunosuppressants on the course of HBV and HCV in IBD.Methods: Study 1: inclusion of 2076 IBD patients, which evaluates the existence of HBV and HCV using ELISA and PCR. Factors related to IBD and to infection were registered. Study 2: Inclusion of 162 IBD patients with HBV and HCV infection and immunosuppressants. Registration of clinical and laboratory variables related to reactivation. Both are multicentre studies with electronic data base (www.repentina.com). The results are analyzed by univariate and multivariate analysis. Results: Study 1: Present and / or past HBV and HCV infection was found in 9.7 % of IBD patients (HBsAg 0,6-0,8% / antiHBc 7-8% / anti-HCV 1.3-2.3%). Effective vaccination was present in 12 % of patients. In multivariate analysis, age, family history of hepatitis and moderate-to-severe IBD were significantly associated with HBV, whereas transfusions and antibiotics were significantly associated with HCV. Study 2: Liver dysfunction (LD) was observed in 36% HBsAg positive patients, 66% of whom developed hepatic failure. In contrast LD in HCV was observed in 15.7% of HCV-RNA positive patients. Treatment with ≥2 immunosuppressants was an independent predictor of HBV reactivation.Conclusions: Study 1: Prevalence of HBV and HCV infection in IBD is similar to that of the general population and lower than that in previously published series. This fact, in addition to the lack of association with invasive procedures, suggests the existence of adequate preventive measures in centres attending to these patients. The low percentage of effective vaccination makes it mandatory to intensify B virus vaccination in IBD. Study 2: LD in patients with IBD treated with immunosuppressants is more frequent and severe in those with HBV than in HCV carriers and is associated with combined immunosuppression.

Las células hepáticas estrelladas (CHE) representan entre 5-8% del total de las células hepáticas y un 13% del total de las células sinusoidales. Se encuentran situadas en el espacio de Disse (espacio virtual entre las células endoteliales y el parénquima). En el hígado normal, presentan un fenotipo quiescente, morfológicamente se caracterizan por la presencia de vacuolas intracitoplasmaticas que contienen vitamina A. En el hígado normal funcionalmente están implicadas en: la regulación del recambio de la matriz extracelular, secreción de una variedad de citoquinas y factores de crecimiento, control del diámetro de los sinusoides y almacenamiento de vitamina A. En situaciones de lesión celular las CHE sufren un proceso de activación y se transforman en un fenotipo tipo miofibroblasto, adquiriendo características propias de este linaje: una elevada capacidad proliferativa, sintética y contráctil. En este estado de activación las CHE están implicadas en procesos de fibrogenesis, al ser las principales productoras de matriz extracelular, en procesos inflamatorios, debido a su capacidad de secretar al medio mediadores solubles de la inflamación (ej. quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyetico, etc.) y en procesos de contracción, las CHE son capaces de contraerse o relajarse en respuesta a diferentes sustancias vasoactivas. Nuestro objetivo fue identificar nuevas moléculas expresadas en la superficie CHE y posteriormente estudiar su posible papel funcional en procesos fisopatologicos como la inflamación, fibrogenesis y contracción. Para alcanzar tal objetivo la estrategia que seguimos fue la producción de anticuerpos monoclonales que reconociesen proteínas de la membrana expresadas principalmente en CHE.Los resultados obtenidos fueron los siguientes:1.1. Producción de anticuerpos monoclonales: Obtuvimos una panel de 13 anticuerpos monoclonales contra la CHE. El estudio lo centramos en los anticuerpos 5.520, 8.9 y 14.27, ya que por datos preliminares de citometría de flujo e inmunohistoquimica, fueron los mas específicos.1.2. Identificación de proteínas; Purificamos la proteína reconocida por el anticuerpo 14.27 y por espectrometría de masas (MALDI-TOF), pudimos identificar que proteína estaba reconociendo, se trato del CD38.1.3. Clonaje del CD38 de rata y transfección en células COS: Para acabar de confirmar que el anticuerpo 14.27 estaba reconociendo la molécula CD38. El CD38 de rata fue clonado a partir del mRNA procedente de un cultivo primario de CHEs. Posteriormente se subclono en un vector de expresión y se transfectaron células COS. Los experimentos demostraron que el anticuerpo reconocía el CD38 expresado en células COS.1.4. Caracterización bioquímica del anticuerpo anti-CD38 (14.27): A partir de lisados de cultivos primarios de CHE, el anticuerpo 14.27 inmunoprecipitó la molécula CD38. El anticuerpo también pudo detectar el CD38 mediante Western-Blott. 1.5. Estudio de la expresión del CD38: mediante un esudio inmunohistoquimico realizados con secciones de hígado procedente de ratas sanas, pre-tratadas con LPS y cirróticas, se determinó la distribución del CD38 en el hígado. Su localización fue mayoritariamente sinusoidal. Estudios "in Vitro" y "in vivo" demostraron que la expresión del CD38 en CHE aumentaba tras su activación.1.6. Estudios funcionales demostraron que el anticuerpo anti-CD38 (14.27):1.6.1. Funciona como un anticuerpo agonista al inducir la movilización de calcio en CHE.1.6.2. Induce la secreción de IL-6 tanto en CHEs activadas como en CHEs quiescentes (independiente estado de activación)1.6.3. Induce la expresión de las moléculas de adhesión I-CAM, V-CAM y N-CAM en CHE activadas pero no en CHE quiescente (dependiente estado de activación)1.6.4. Produce un aumento de la presión portal en ratas.1.6.5. Induce la contracción de CHE en cultivo, la fosforilación de la cadena ligera de la miosina y la reorganización de citoesqueleto. (datos pre-liminares).1.6.6. Media la regulación del colageno I, metaloproteinasa II (MMP-2) y del inhibidor de metaloproteinasas I (TIMP-I) (datos pre-liminares).Estos resultados indican el posible papel del CD38 en la inflamación, contracción y fibrogenesis.

La Diabetis Mellitus tipus 2 (DM2) és una malaltia metabòlica complexa que afecta entre un 4 i un 5% de la població en les societats industrialitzades. Aquesta patologia es caracteritza per la presència, en la seva fase inicial, de resistència a la insulina (RI). Freqüentment, una de les primeres alteracions que s´observen en els individus amb predisposició a patir RI/DM2 és l´acumulació de grassa intraabdominal. De fet, la relació epidemiològica entre l´obesitat i la RI és molt sòlida. A més, en l´última dècada nombroses evidències han posat de manifest l´existència d´una estreta relació entre un estat d´inflamació crònic de baixa intensitat i la presència d´obesitat-RI-DM2. De tota manera, tot i que el vincle entre l´increment d´àcids grassos lliures en plasma i la diabetis està ben acceptat, els mecanismes implicats en l´aparició de RI i DM2 induïdes per aquests àcids grassos no són ben coneguts. Per aquest motiu, l´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha estat aprofundir en els mecanismes implicats en l´aparició de RI induïda per l´àcid gras saturat palmitat i estudiar la funció de l´enzim COX-2 en aquestes condicions, així com també determinar la capacitat de l´àcid gras monoinsaturat oleat i de l´agonista PPARdelta GW501516 per a prevenir la inflamació i la RI induïdes pel palmitat en miotubs de ratolí C2C12.Els estudis realitzats indiquen que la presència elevada de l´àcid gras saturat palmitat provoca una disminució de PGC-1alfa(coactivador que controla l´expressió de gens mitocondrials) a través de l´activació de la via ERK-MAPK-NF-kB, així com també l´acumulació de diacilglicerol intramiocel·lular, fent que apareguin estats d´inflamació i RI. A més, s´ha observat que un augment agut de determinats marcadors inflamatoris, com la COX-2, contribueixen a resoldre aquest procés inflamatori generat per l´acumulació de lípids, tot i que la seva presència de manera crònica accentua l´estat inflamatori. Segons hem pogut constatar amb el nostre model in vitro de RI, l´àcid gras monoinsaturat oleat i el GW501516 podrien ser dues noves possibilitats terapèutiques per evitar la inflamació induïda per àcids grassos i millorar la sensibilitat a la insulina, ja que tenen la capacitat d´incrementar la beta-oxidació mitocondrial impedint així que s´acumulin metabolits lipotòxics com el diacilglicerol. / Insulin resistance (IR) is a major characteristic of type 2 diabetes mellitus and is also associated with obesity. Impairment of glucose utilization and insulin sensitivity has been related to the presence of high free fatty acids in plasma and a low-grade chronic systemic inflammation. However, the mechanisms by which free fatty results in inflammation and IR are not well understood. After exposing C2C12 cells (mouse myotubes) to the saturated fatty acid palmitate, we observed, on the one hand, a reduction in PGC-1-alpha gene expression through the activation of ERK-MAPK-NF-kB pathway, and on the other hand, an increase in diacylglycerol accumulation. Moreover, we observed that the presence of palmitate increased COX-2 expression, which seems to contribute to resolve the acute, but not chronic, inflammation. Our in vitro model of IR also showed that the monounsaturated fatty acid oleate and the PPAR-delta agonist GW501516, could avoid the development of inflammation and IR induced by fatty acids through an increase in mitochondrial beta-oxidation, thus preventing the accumulation of lipotoxic metabolites, such as dicylglycerol.

L'obesitat és un estat inflamatori que porta a l'activació crònica de la resposta immune caracteritzada per la inducció de gens i mediadors proinflamatoris. L'objectiu principal d'aquesta tesi va ser estudiar els efectes antiinflamatoris de les procianidines i les possibles dianes moleculars modulades per aquests flavonoids. Degut al paper central del macròfag en la inducció de inflamació sistèmica, vam analitzar els efectes d'un extracte de procianidines en un model d'inflamació in vitro. Utilitzant models d'obesitat i síndrome metabòlic en rata, vam avaluar els efectes antiinflamatoris de les procianidines in vivo. Els resultats indiquen que les procianidines actuen com antiinflamatoris in vitro inhibint la resposta inflamatòria al macròfag i in vivo com agents preventius tant de la inflamació local com sistèmica, modulant els nivells de mediadors inflamatoris. Aquests resultats indiquen que les procianidines podrien ser candidats per la suplementació dietètica i components d'aliments funcionals per la prevenció de malalties amb component inflamatòria. / Once established that obesity is an inflammatory condition leading to chronic activation of the immune system response, the aim of this thesis was to characterize and understand if dietary procyanidins could modulate the low grade inflammatory response related to obesity and the Metabolic Syndrome. Due to the central role of macrophages in obesity induced low-grade inflammation, we analyzed procyanidin effects in an in vitro model of inflammation. By using rat models of obesity, we also assessed procyanidin anti-inflammatory effects in vivo. To sum up, our results showed that procyanidins act as anti-inflammatory agents both in vitro, by modulating the macrophage inflammatory response, and in vivo, by preventing both local and systemic inflammation through the modulation the inflammatory mediators. In conclusion, the use of procyandins will represent an additional nutritional approach that, in association with lifestyle interventions, would improve the obesity induced inflammation and as a consequence ameliorate the metabolic syndrome.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal degenerative disorder of locomotor and respiratory muscles, in which myofibers are progressively replaced by non-muscular fibrotic tissue. Here, we show that fibrin/ogen accumulates in dystrophic muscles of DMD patients and of the mdx mouse model of DMD. Genetic loss or pharmacological depletion of fibrin/ogen in mdx mice attenuated muscular dystrophy progression and improved locomotor capacity. More importantly, fibrin/ogen depletion reduced fibrosis in mdx mouse diaphragm. Our data indicate that fibrin/ogen, through induction of IL-1 Ò, drives the synthesis of TGF Ò by mdx macrophages, which in turn, induces collagen production in mdx fibroblasts. Fibrin/ogen-produced TGF Ò further amplifies collagen accumulation through recruitment and activation of pro-fibrotic alternatively activated macrophages. Fibrin/ogen also stimulated collagen synthesis directly in mdx fibroblasts, via Ñv Ò3 integrin engagement. In addition, when analyzing a group of 39 DMD patients, fibrin/ogen accumulation in locomotor muscles was found associated with fibrosis and disease severity. These data unveil a novel role of fibrin/ogen in muscular dystrophy and, importantly, in the replacement of muscle by fibrotic tissue.

La nostra proposta ha profunditzat per primera vegada en l’estudi de les lipoproteïnes d’alta densitat (HDL) en la infecció pel virus de la immunodeficiència humana (VIH), i hem determinat la seva implicació en el curs de la infecció i en el desenvolupament de l’arteriosclerosi amb la finalitat de dissenyar noves estratègies terapèutiques. Els nostres resultats mostren com l’estat inflamatori i oxidant persistent associat a la infecció té un paper central en l’aparició d’alteracions metabòliques i el desenvolupament d’aterosclerosi en aquests pacients. Concretament, utilitzant tècniques cromatogràfiques i proteòmiques, mostrem com la presència anòmala de gammaglobulines, molècules pro-inflamatories i reactants de fase aguda en el plasma d’aquests pacients indueixen la modificació del metabolisme, composició i distribució de les partícules HDL, suggerint que la monitorització de les partícules HDL en aquests pacients no ha d’estar basada únicament en la determinació de la concentració del contingut de colesterol, sinó que ha d’incloure la determinació d’altres paràmetres associats a la qualitat, i per tant, a la funcionalitat, de les partícules HDL. / Our proposal has explored for the first time the effect of human immunodeficiency virus (HIV)- infection on high-density lipoprotein (HDL) particles, and we determined their involvement in the course of infection itself and the development of atherosclerosis in order to design novel therapeutic strategies. Our results show how the chronic oxidant and inflammatory status associated with infection plays a central role in the onset of metabolic disorders and the development of subclinical atherosclerosis in these patients. Concretely, using both, chromatographic and proteomic techniques, we observed how the increased levels of gammaglobulin, pro-inflammatory molecules and acute phase reactants in the plasma of these patients induced metabolism alterations and modifications on the distribution and composition of HDL particles, suggesting that the monitoring of HDL particles in these patients should not be only based on the determination of the concentration of cholesterol content, but must include the determination of other parameters associated with particle quality, and therefore the functionality, of HDL particles

El canvi en l’estil de vida que s’ha produït en les societats desenvolupades els darrers anys ha tingut com a contrapartida l’aparició de conductes sedentàries i modificacions en la dieta. Com a conseqüència d’aquests factors s’han produït diverses alteracions metabòliques que han causat un augment de la prevalença de l’obesitat. Aquesta obesitat té una sèrie d’efectes adversos sobre la fisiologia cardiovascular i és considerada un important factor de risc pel desenvolupament de la insuficiència cardíaca. De fet, el consum de dietes amb un elevat contingut en greixos (HFD) s’ha relacionat amb una sèrie d’alteracions cardíaques directes com són la inflamació, la hipertròfia i la disfunció contràctil. Durant el procés inflamatori que es produeix en les esmentades malalties cardiovasculars, les cèl•lules cardíaques humanes secreten citocines i quimiocines proinflamatòries com el TNF-α, MCP-1, i IL-6, molècules que es troben sota el control transcripcional del factor de transcripció ubic i induïble anomenat NF-κB. Aquestes citocines exerceixen diversos efectes pleiotròpics autocrins en les cèl•lules cardíaques, tot produint un efecte de retroalimentació positiva del procés inflamatori que contribueix al desenvolupament d’aquestes malalties. En condicions normals, el cor de mamífers adults obté energia en forma d’ATP principalment a partir de la β-oxidació d’àcids grassos en el mitocondri, encara que aquest orgànul és capaç de catabolitzar altres substrats com la glucosa o el lactat per tal d’assegurar una font constant d’energia. Ara bé, en determinades circumstàncies, com és el cas de la hipertròfia i la insuficiència cardíaques, aquesta flexibilitat de substrat es veu compromesa i la β-oxidació d’àcids grassos es redueix degut a que la font principal d’energia passa a ser la glucosa. Aquests canvis metabòlics comporten una desregulació del control transcripcional de gens relacionats amb el transport, captació i catabolisme dels àcids grassos i la glucosa. En el miocardi, els factors de transcripció implicats en el control d’aquests gens inclouen ERRα i PPARβ/δ. Ambdós factors de transcripció, participen en l’activació de la PDK4, enzim clau en la modulació homeostàtica de la glucosa. Aquesta cinasa regula l’activitat de la PDC, enzim que catalitza la reacció de descarboxilació del piruvat a acetil-CoA, tot limitant l’ús de carbohidrats com a font d’energia en mitocondris i afavorint així la β-oxidació d’àcids grassos. En l’activació de la transcripció de PDK4 també hi participa PGC-1α, que interacciona amb ERRα i PPARβ/δ, tot incrementant-ne la seva activitat transcripcional. Estudis recents però, semblen indicar que no només aquests dos factors de transcripció participen en la regulació de PDK4. És el cas d’E2F1, un factor de transcripció clau en la regulació de la transició de la fase G1 a la fase S del cicle cel•lular i del qual la regió promotora del gen que codifica per PDK4 en presenta dos llocs d’unió. Estudis recents suggereixen que PPARβ/δ, que és la forma predominant en les cèl•lules cardíaques, pot atenuar les vies de senyalització inflamatòries i, per tant, interferir en la remodelació cardíaca. Aquesta funció és en gran mesura deguda a la capacitat dels PPAR, un cop han estat activats per agonistes, de formar complexos amb altres factors de transcripció activats, com ara NF-κB i STAT resultant així en la inhibició de l’activitat transcripcional d’aquests últims. Així l’ús d’agonistes PPARβ/δ podria ser un camí força interessant de cara a trobar potencials fàrmacs per tal de pal•liar les afeccions cardíaques derivades d’alteracions metabòliques i amb un rerefons inflamatori. En conjunt en aquest treball es presenten una sèrie de resultats destinats a conèixer de forma més detallada els mecanismes moleculars que relacionen les alteracions metabòliques i els processos inflamatoris en cor, per tal de poder buscar potencials dianes farmacològiques amb l’objectiu de prevenir i tractar aquests estats patològics. / The change in lifestyle that has occurred in developed societies in recent years has been accompanied by the rise of sedentary behavior and changes in diet that have caused an increasing obesity prevalence. Obesity has a huge number of adverse effects on cardiovascular physiology and is considered an important risk factor for heart failure developement. In fact, high fat diets have been linked with direct cardiac abnormalities such as inflammation, hypertrophy and contractile dysfunction. During the inflammatory process that occurs in these diseases, human cardiac cells secrete proinflammatory cytokines and chemokines such as TNF-α, MCP-1, and IL-6, molecules that are under the control of the ubiquitous and inducible transcription factor NF-κB. In certain circumstances, such in hypertrophy and heart failure, the substrate flexibility in heart is compromised and the fatty acids β-oxidation is reduced because the main source of energy becomes the glucose. These metabolic changes lead to a deregulation on the transcriptional control of genes associated with transport, uptake and catabolism of fatty acids and glucose. In the myocardium, among the transcription factors involved in the control of these genes we found ERRα and PPARβ/δ. Both transcription factors, are involved in PDK4 activation, an important enzyme in the homeostatic modulation of glucose. This kinase regulates PDC activity, an enzyme that catalyzes the decarboxylation from pyruvate to acetyl-CoA, limiting the use of carbohydrates as energy source in mitochondria and thus favoring the fatty acid β-oxidation. In the PDK4 transcription activation also participates PGC-1α, which interacts with ERRα and PPARβ/δ, increasing its transcriptional activity. However recent studies, suggest that not only these two transcription factors are involved in PDK4 regulation. Other transcription factors as E2F1, which is crucial for cell cycle control, may regulate PDK4 expression. Overall, the results shown in this work are aimed to learn in more detail the molecular mechanisms linking the metabolic disorders and inflammatory processes in heart, in order to find potential drug targets to prevent and treat these pathological states.

CD40 (TNFRSF5) és una glicoproteïna de membrana que pertany a la família de receptors del factor de necrosi tumoral (TNF-R). La interacció amb el seu lligand fisiològic (CD40L o CD154) regula una àmplia varietat de funcions biològiques, des de l'activació del sistema immune, tant humoral com cel·lular, a diferents aspectes de la resposta inflamatòria. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat 1) l'estudi a nivell molecular del paper de CD40 en l'activació de les cèl·lules endotelials, i 2) les conseqüències del bloqueig d'aquesta via de senyalització en la resposta immunoinflamatòria. S'ha obtingut un siRNA potent i específic capaç de reduir l'expressió del receptor CD40 humà en un 85%, tant a nivell de mRNA com a nivell de proteïna. Aquest siRNA expressat en forma de shRNA en un vector lentiviral permet assolir un silenciament gènic eficient i estable de CD40 al llarg del temps. S'ha validat l'activitat antiinflamatòria d'aquest siRNA analitzant les conseqüències funcionals del silenciament d'aquest receptor en cèl·lules endotelials. Aquest siRNA bloqueja l'activació endotelial via CD40L impedint la inducció de l'expressió de les molècules d'adhesió ICAM-1, VCAM-1 i E-selectina, i inhibint l'adhesió leucocitària en aquestes cèl·lules en un 87%. S'ha utilitzat el potencial antiinflamatori del siRNA dirigit contra CD40 humà per estudiar el paper d'aquest receptor en cèl·lules endotelials en inflamació. Utilitzant microarrays, s'ha realitzat una anàlisi comparativa del perfil global d'expressió gènica en cèl·lules endotelials humanes en les quals s'inactiva específicament aquesta via de senyalització mitjançant RNAi, en el context de la interacció cèl·lula endotelial i limfòcit T activat (CD40L+), com a primer pas en l'inici de la resposta immunoinflamatòria. Aquest estudi d'expressió gènica ha permès identificar nous gens i noves vies de senyalització implicades en la inducció de la resposta inflamatòria desencadenada per l'activació de CD40 en endoteli.Per altra banda, es volia avaluar l'eficàcia del silenciament gènic de CD40 per a la inducció de tolerància immunològica en un model experimental d'al·lotrasplantament renal. Amb aquesta finalitat s'ha obtingut un siRNA anti-CD40 de rata amb una potent eficiència silenciadora i s'ha optimitzat la transferència d'aquest siRNA en el ronyó a trasplantar mitjançant electroporació in vivo de l'òrgan. L'objectiu d'aquest estudi era silenciar temporalment l'expressió d'aquest receptor en les cèl·lules renals i bloquejar la interacció CD40-CD40L essencial per a la inducció de procés inflamatori que dóna lloc al rebuig del ronyó trasplantat. Resultats preliminars mostren que la teràpia gènica local amb siRNA redueix la resposta inflamatòria posttrasplantament. El siRNA anti-CD40 causa una reducció significativa de l'expressió del mRNA de CD40, disminuint l'aparició de rebuig agut humoral i allargant el temps mig de supervivència dels animals trasplantats amb els ronyons tractats amb siRNA en comparació amb els animals control. / CD40 (TNFRSF5) belongs to the tumor necrosis factor receptor family (TNF-R). Its interaction with its physiological ligand (CD40L or CD154) regulates a wide variety of biological functions, from the activation of the immune system, to different aspects of the inflammatory response.The main goals of this work have been 1) the molecular study of the role of CD40 in the activation of the endothelial cells, and 2) the consequences of blocking this signaling in the immunoinflammatory response. We have obtained a powerful and specific siRNA able to reduce human CD40 expression by 85%. The anti-inflammatory activity of this siRNA has been validated by analyzing the functional consequences of CD40 silencing in endothelial cells activated via CD40L. This siRNA blocks the induction of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression, and inhibits leukocyte adhesion in these cells by 87%.We have used the anti-inflammatory potential of this siRNA directed against human CD40 to carry out a global gene expression profiling analysis in order to study the role of CD40 in endothelial cells during inflammation. Using microarrays, we have performed a comparative transcriptome analysis in human endothelial cells, in the context of the endotelial cell interaction with activated T lymphocyte (CD40L+), as the first step of the immunoinflammatory response. This study has allowed us to identify new genes and signaling pathways involved in the induction of the inflammatory response by CD40 activation in endothelium.On the other hand, we have obtained an siRNA against rat CD40 with a powerful silencing activity and we have optimized its transfer to the kidney through in vivo electroporation. The purpose of this study was to determine the CD40 gene silencing effectiveness in inducing immunological tolerance in an experimental model of renal allotransplantation. Preliminary results show that local gene therapy with siRNA reduces the inflammatory response post-transplantation. The anti-CD40 siRNA treatment causes a significant reduction of the incidence of acute humoral rejection and increases the survival half life of animals transplanted with kidneys treated with siRNA compared to control animals.