CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O presente estudo avaliou a possÃvel proteÃÃo do tenoxicam ( txc ), um antiinflamatÃrio nÃo esterÃide, em um modelo experimental de isquemia-reperfusÃo. Foram utilizados ratos machos com idade acima de 1 ano Wistar (200-450g), submetidos à oclusÃo das artÃrias carÃtidas comuns por 45 min e decapitados 1h ou 24 h apÃs a isquemia, para a retirada do cÃrebro e dissecÃÃo dos hipocampos . Os animais foram divididos em 5 grupos : 1) Isquemia ; 2) Isquemia + txc 2,5mg/Kg IP; 3) Isquemia + txc 10mg/Kg IP ; 4) Controle falso-operado e 5) controle + txc 10 mg/kg I.P. A anÃlise histolÃgica revelou alteraÃÃo significativa no grupo 1 em relaÃÃo ao 4 usando-se uma escala de escores variando de 0 a 3. O uso do txc revela uma tendÃncia para reversÃo das lesÃes. A atividade da enzima mieloperoxidase mostrou aumento significativo no grupo 1 em relaÃÃo ao 4 revertidos para valores de controle com o uso de dose Ãnica de txc (2,5 ou 10 mg/kg, i.p.). Os nÃveis de nitrito tambÃm aumentaram no grupo 1 e com o uso do txc houve tendÃncia para atenuaÃÃo desses valores. Houve aumento nos nÃveis de dopamina no grupo 1 que foi revertido com o uso do txc em ambas as doses . Os nÃveis de glutamato se elevaram no grupo 1 mesmo apÃs 24 h de reperfusÃo que sugere um maior dano da excitotoxicidade nos animais idosos. Os nÃveis de ATP na reperfusÃo por 1 h foram inferiores em relaÃÃo aos de 24 h, refletindo ainda lesÃo mesmo no inÃcio da reperfusÃo. Os nÃveis de lactato aumentaram nos grupos 3 e 5 reperfundidos por 24 h em relaÃÃo aos de 1 h , sugerindo maior dano metabÃlico nos animais idosos. Os nÃveis de piruvato diminuÃram na reperfusÃo por 24 h em relaÃÃo aos de 1 h, refletindo uma normalizaÃÃo da atividade da enzima piruvato-desidrogenase, restabelecendo a taxa metabÃlica desse substrato. O possÃvel papel neuroprotetor do txc na reversÃo dos danos secundÃrios à reperfusÃo na lesÃo isquÃmica à associado à sua aÃÃo anti-inflamatÃria, inibindo a atividade da COX e reduzindo a cascata inflamatÃria desencadeada no processo isquÃmico, com reduÃÃo da infiltraÃÃo de cÃlulas inflamatÃrias, inibiÃÃo indireta da produÃÃo de citocinas e quimocinas e reduÃÃo da produÃÃo de radicais livres e lesÃo neuronal. O txc pode ser portanto uma possÃvel alternativa no tratamento de doenÃas vasculares cerebrais isquÃmicas, como uma terapia adjuvante por exemplo ao uso de trombolÃticos / The present work shows effects of tenoxicam (TXC ) in rats submitted to transient cerebral ischemia. Male aged Wistar rats (250-450g) were submitted to the both common carotid arteries occlusion with aneurysmal clips to induce ischemia. At the end of 45 min of bilateral carotid arteries occlusion (BCAO), blood flow was restored by releasing the clips and the incision was closed with a single suture. After 1h or 24h of reperfusion, the rats were decapitated, brains dissected and hippocampi removed for measurements of MPO activity, nitrite , monoamine , glutamate/aspartate, ATP, lactate and piruvate levels. The animals were divided in 5 groups (N=4-10): 1) sham-operated, 2) BCAO, 3) BCAO + TXC 2.5mg/kg, 4) BCAO + TXC10mg/kg and 5) sham-operated + TXC 10mg/kg . The TXC administration was made after 45 minutes of BCAO. The histological analysis were made and showed significant changes on group 2 in comparison with group 1 (p<0.05, Kruskal-Wallis and Dunnâ test). The use of TXC showed a tendency of decrease these alterations. The MPO activity in the group 2 was significantly greater than that in the group 1 (p< 0.0001, ANOVA and Tukey). The treatment with TXC reduced the MPO activity to control levels (p<0.0001, ANOVA and Tukey). There was increased levels of nitrite in the group 2 in comparison with group 1 (p<0.05), and the treatment with TXC failed to attenuate the ischemic levels. The hippocampal levels of DA were increased after ischemia when compared with group 1 (p<0.01, Anova e Dunnett ) and were reverted with TXC in both doses (p<0.01, Anova e Dunnett). Hippocampal level from group 2 of both glutamate and aspartate were higher than group 1 (p < 0.05 , ANOVA , Dunnettâs Test). Ischemia-induced elevations in glutamate and aspartate were not attenuated with TXC . The ATP levels have showed decreases in the group with 1 h of reperfusion in comparison with 24 h . The lactate levels were increased in the 24 h reperfusionâs group in relation of 1 h. These results indicated more metabolic damage in aged rats. So, the neuroprotective role of TXC is possibly through the anti-inflammatory action with inhibition of cyclooxygenase activity, and interfering on the inflammatory process of post-ischemic reperfusion. The TXC, therefore, could be a possible therapeutic alternative on stroke treatment like an adjunct drug associated with, for example, a thrombolitic

Introdução: Nas últimas décadas, a reestenose tem sido o \"calcanhar de Aquiles\" da intervenção coronária percutânea (ICP), limitando seus resultados no médio e longo prazo. Estudos preliminares demonstraram que após a injúria inicial com catéter balão e/ou com stents coronarianos, há desnudação endotelial, dissecção, deposição plaquetária e atração de leucócitos como resposta imediata, podendo levar à reestenose no seguimento mais tardio. A injúria local na parede arterial após implante de stent pode promover a expressão genética e liberação de mediadores inflamatórios, interleucinas, proteínas de fase aguda e fatores de coagulação, deposição de plaquetas e formação de trombos. Estes processos podem estar diretamente relacionados ao prognóstico da doença cardiovascular, porém são escassos os estudos que caracterizem a resposta inflamatória aguda pós-implante de stent coronariano e à ocorrência de eventos adversos. Objetivos: Neste estudo, pretendeu-se avaliar os efeitos de dose de ataque de Rosuvastatina (40mg) sobre a resposta inflamatória aguda após implante de stent coronariano, bem como correlacionar as variações das concentrações de citocinas e a respectiva expressão gênica. Métodos: Pacientes portadores de doença coronária estável sem uso de estatina (há mais de 7 dias), submetidos à intervenção coronária percutânea eletiva em artéria coronária nativa foram randomizados para receberem dose única de ataque de rosuvastatina (40 mg via oral, 3 horas prévias ao procedimento; Grupo Tratado (GT); n=63) versus Grupo Controle (GC) (Ausência da administração de rosuvastatina); n=61. Foram obtidas amostras do sangue periférico antes da administração via oral da medicação (A), 3 horas após medicação (B) e 3 horas após implante do stent coronariano (C). Avaliou-se hemograma completo, dosagem de proteína C reativa (PCR), óxido nítrico (NO) e análise da expressão dos genes e das proteínas, por meio de RT-qPCR e multiplex luminex, dos mediadores IL-1 ?, IL-6, IL-8, PAI-1, MCP- 1, TNF-? e TGF-?. Os pacientes foram acompanhados clinicamente por doze meses após o procedimento. Resultados: Os grupos não apresentaram diferenças significantes em relação às características clínicas, angiográficas e técnicas, com exceção da ICP para lesões em bifurcação, mais comum no GC (19,7% versus 6,2%; p=0,032). Para a expressão gênica, observou-se redução para IL-6 (p<0,001), da IL-1 ? (p=0,016) e PAI-1 (p=0,002) no Grupo Tratado. Para as interleucinas analisadas, observou-se uma diminuição progressiva nas concentrações de IL-6 0,209 pg/ml (IC 0,156;0,28 p<0,001), IL-1? 0,491 pg/ml (IC 0,349;0,692; p<0,001) e PAI-1 0,986 pg/ml com pinteração<0,001) no Grupo Tratado. Houve redução da concentração de PCR no tempo C no GT (p=0,04). Para o NO, ocorreu elevação dos valores do tempo A para C no Grupo Tratado (p=0,004). Na fase intra-hospitalar, ocorreu mais infarto periprocedimento entre os pacientes do Grupo Controle (23% vs 4,7%; p=0,004). No acompanhamento clínico de 12 meses ocorreram mais eventos combinados no Grupo Controle GC (9,8% vs 1,6%; p=0,058). Conclusão: Os resultados deste estudo demonstraram que a rosuvastatina em sua dose de ataque máxima preconizada (40mg), reduz os níveis séricos de marcadores inflamatórios agudos (IL-1 ?, IL-6, PAI-1 e PCR), com incremento dos valores de NO após ICP. / Restenosis remains as the \"Achilles\' heal\" of interventional cardiology, limiting the mid to long term efficacy of percutaneouos coronary interventions (PCI). Preliminary studies have shown that after initial injury with balloon catheter and/or metallic stents, there is endothelial denudation, dissection, platelet deposition and leukocyte attraction as an immediate response, which might limit the late benefits of PCI. Local injury to the arterial wall after stent implantation may promote the gene expression and release of inflammatory mediators, interleukins, acute phase proteins and coagulation factors, platelet deposition and thrombus formation, which are directly related to the prognosis of cardiovascular disease. Despite their importance, there are few studies that characterize the acute inflammatory response after coronary stent implantation and correlate it to the occurrence of adverse events.Objectives: We sougth to evaluate the effects of the loading dose of Rosuvastatin (40mg) on the acute inflammatory response after PCI with mettalic stents, as well as to correlate the variations in cytokine levels and their respective gene expression. Methods: Patients with stable coronary disease without statin (>=7 days) undergoing elective PCI to de novo lesions in the native coronary arterywere randomized to receive a loading dose of 40 mg of rosuvastatin [N = 63] versus a control group (CG) (absence of loading dose); [N = 61]. Blood samples were obtained prior to oral administration of the statin (A), 3 hours after medication (B) and 3 hours after PCI (C). The following laboratory tests were conducted: complete blood count, C-reactive protein (CRP), nitric oxide (NO) and analysis of gene and protein expression by means of RT-qPCR and multiplex luminex, IL-1 mediators, IL-6, IL-8, PAI-1, MCP-1, TNF-? and TGF-?. Clinical follow up was achieved up to 12 months after the procedure. Results: The groups did not significantly differ regarding clinical, angiographic and procedure characteristics, except for the higher amount of bifurcation lesions in the CG (19.7% versus 6.2%, p = 0.032). Among patients pre treated wit the statin, there was a reduction in gene expression for IL-6 (p <0.001), IL-1? (p = 0.016) and PAI-1 (p = 0.002). For the IL analyses, a progressive decrease in the concentrations of IL-6 0.209 pg / ml (IC 0.156; 0.28 p <0.001), IL-1? 0.491 pg / ml (IC 0.349; 0.692, p <0.001) and PAI-1 0.986 pg / ml with paving <0.001) were observed among patients treated with the statin. Furthermore, a progressive reduction in the concentration of CRP was observed in the three timepoints among patients of the rosuvastatin cohort (p = 0.04). An increase in NO concentration was observed from timepoint A to C in the statin group (p = 0.004). During the in hospital period, more periprocedural MI occurred among patients in the control group (23% vs 4.7%, p = 0.004). Also, 12-month MACE rate was higher in the control group (9.8% vs 1.6%, p = 0.058). Conclusion: Pre loading with high dose of rosuvastatin resulted in a marked reduction in the expression of the main inflammatory markers (IL-1 ?, IL-6, PAI-1 and CRP) associated with restenosis after PCI with stents. Additionally, an increase in the NO blood concentration and expression was noticed among these patients.

Orientador: Heloisa Helena de Araújo Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:48:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_JackelineAmaral_M.pdf: 3206748 bytes, checksum: a2ba24233e4b17f3e6d3d8a4326a499c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Estudos mostram que o sulfeto de hidrogênio (H2S) possui um papel relevante na fisiopatologia de doenças pulmonares. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos pelos quais o H2S influência a apoptose, o infiltrado de células inflamatórias, e o remodelamento das vias respiratórias na inflamação alérgica pulmonar. Para isso, camundongos BALB-C foram sensibilizados e desafiados com ovalbunina (OVA). Os camundongos tratados receberam o hidrosulfeto de sódio (NaHS) 30 minutos antes do desafio com OVA (OVA/NaHS). Alguns camundongos sensibilizados receberam salina estéril sem a OVA na ocasião do desafio (grupo salina). A eutanásia dos animais foi realizada 48 horas após o desafio, quando foi coletado o lavado broncoalveolar, para separação imunomagnética de eosinófilos para verificação da apoptose desta célula, e retirados os pulmões. O lobo direito dos pulmões foram homogeneizados para verificação da expressão das proteínas Caspase 3, Caspase 9, Bax, Fas-L e TGF-?1 e para dosagem dos níveis de citocinas. O lobo esquerdo foi fixado no formol para alguns procedimentos de análise histológica. Verificamos o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar pela coloração HE (hematoxilina/eosina) e o colágeno no pulmão utilizando a coloração TM (tricômico de masson). Observamos, também, a apoptose in situ em células epiteliais do pulmão através do ensaio TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Por fim, realizamos a imunohistoquímica no pulmão para verificação da expressão das enzimas cistationia-?-liase (CSE) e cistationina-?-sintetase (CBS). Os resultados dos camundongos alérgicos não tratados (OVA) mostraram um aumento do infiltrado inflamatório ao redor dos brônquios e bronquíolos, com prevalência de eosinófilos. O tratamento com NaHS foi efetivo em reduzir este infiltrado inflamatório. No grupo salina não se verificou infiltrado inflamatório. Ao estudarmos a expressão das proteínas Caspase 3, Caspase 9, Fas-L e Bax, observamos que nos animais sensibilizados e desafiados (OVA) a expressão da Caspase 3, Caspase 9 e Bax não sofrem qualquer alteração. No entanto, o tratamento dos animais com NaHS diminui a expressão da Caspase 3, mas não da Caspase 9 e Bax. A expressão do Fas-L é aumentada nos animais sensibilizados e desafiados (OVA) quando comparado ao grupo salina e o tratamento com NaHS diminui essa expressão á níveis semelhantes ao grupo salina. Não foram observadas modificações na apoptose dos eosinófilos isolados dos camundongos alérgicos ou dos tratados com NaHS. Os animais sensibilizados e desafiados apresentaram um aumento da apoptose de células do epitélio brônquico quando comparado ao grupo salina. O tratamento com NaHS foi capaz de reduzir esta apoptose a níveis semelhantes ao grupo salina. Verificamos um aumento dos níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-25 nos pulmões dos camundongos sensibilizados e desafiados, e este aumento foi evitado pelo o tratamento dos animais com NaHS, com exceção da IL-13. A concentração da eotaxina, fator quimiotático de eosinófilos, não sofreu qualquer influência do tratamento com NaHS nos pulmões dos camundongos sensibilizados em resposta ao desafio com OVA. O desafio com OVA aumentou os níveis do IFN-? no homogenato pulmonar, e este aumento foi revertido pelo tratamento dos animais com NaHS a níveis semelhantes aos observados no grupo salina. Os níveis de TNF-? não sofreram alteração do desafio com OVA e nem do tratamento com NaHS. Relacionado ao remodelamento das vias aéreas, não houve formação de colágeno peribronquiolar nos camundongos sensibilizados e desafiados com OVA e nem naqueles tratados com NaHS. O mesmo foi observado na expressão do TGF-?1 que não sofreu influência nem da indução da alergia pulmonar pela OVA nem do tratamento com NaHS. A expressão da enzima CSE tanto no epitélio brônquico como no endotélio vascular estava aumentada nos pulmões dos camundongos alérgicos, e este aumento foi amplificado pelo tratamento com NaHS. Diferentemente da expressão desta enzima, o tratamento com NaHS não modificou a expressão da enzima CBS em nenhuma das estruturas pulmonares estudadas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que o H2S tem um efeito protetor no pulmão contra os danos provocados pela alergia. A redução do infiltrado de eosinófilos peribronquiolar pode ser explicada pela diminuição nos níveis pulmonares da IL-4, IL-5 e IL-25, devido à ação do H2S. O H2S também evitou a apoptose e, consequentemente, a destruição do epitélio brônquico, o que contribui para a diminuição da inflamação no processo alérgico pulmonar. A enzima CSE pode estar envolvida neste processo. O H2S possui um importante potencial terapêutico para as doenças alérgicas pulmonares como a asma / Abstract: Many studies show that hydrogen sulfide (H2S) has a relevant role in the pathophysiology of lung diseases. The objective of this study was to investigate the mechanisms by which H2S influence apoptosis, the inflammatory cell infiltrate, and airway remodeling in allergic lung inflammation. To this end, BALB-C mice were sensitized and challenged with ovalbunina (OVA). The treated mice received the sodium hydrosulfide (NaHS) 30 minutes before challenge with OVA (OVA / NaHS). Some sensitized mice received sterile saline without OVA at the time of challenge (saline group). The euthanasia was performed 48 hours after challenge, when it was collected bronchoalveolar lavage for immunomagnetic separation of eosinophils to check this cell apoptosis, and the lungs were removed. The right lobe of the lungs was homogenized for checking the expression of caspase 3, caspase 9, Bax, Fas-L and TGF-?1 protein and for determination of cytokine levels. The left lobe was fixed in formalin for histological analysis. We checked the inflammatory infiltrate in the lung parenchyma by HE staining (hematoxylin/eosin) and collagen in the lung using the TM (Masson trichrome) staining. We also observe in situ apoptosis in lung epithelial cells by TUNEL assay (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Finally, we performed immunohistochemistry in the lung to check the expression of cistationia ?-lyase enzymes (CSE) and cystathionine ?-synthase (CBS). The results of allergy untreated mice (OVA) showed an increase in inflammatory infiltrates around the bronchi and bronchioles, with a prevalence of eosinophils. Treatment with NaHS has been effective in reducing this inflammatory infiltrate. In saline there was no inflammatory infiltrate. By studying the expression of Caspase 3, Caspase 9, Fas-L and Bax proteins, we observed that in animals sensitized and challenged (OVA) the expression of Caspase 3, Caspase 9 and Bax remain unchanged. However, treatment of the animals with NaHS decreases the expression of Caspase 3 but not caspase 9 and Bax. The Fas-L expression is increased in sensitized and challenged (OVA) animals when compared to saline treatment group and NaHS will decrease the expression levels similar to saline group. No changes in apoptosis of eosinophils isolated from allergic mice or those treated with NaHS were observed. The sensitized and challenged animals showed an increase in apoptosis in bronchial epithelial cells as compared to saline group. Treatment with NaHS was able to reduce this apoptosis to similar levels to the saline group. Verified increased levels of IL-4, IL-5, IL-13 and IL-25 in the lungs of sensitized and challenged mice, and this increase was prevented by treating the animals with NaHS, with the exception of IL-13. The concentration of eotaxin, eosinophil chemotactic factor, suffered no influence of treatment with NaHS in the lungs of sensitized in response to challenge with OVA mice. The OVA challenge increased the levels of IFN-? in lung homogenates, and this increase was reversed by treating animals with NaHS levels similar to those observed in the saline group. The levels of TNF-? did not change the OVA challenge nor treatment with NaHS. Related to airway remodeling, there was no formation of peribronchial collagen in mice sensitized and challenged with OVA and not in those treated with NaHS. The same was observed in the expression of TGF-?1 not affected either by the induction of OVA lung allergy or treatment with NaHS. The expression of both enzyme CSE in the bronchial epithelium and the vascular endothelium was increased in the lungs of allergic mice, and this increase was amplified by treatment with NaHS. Unlike the expression of this enzyme, treatment with NaHS did not alter the expression of the enzyme CBS in any of the studied pulmonary structures. In conclusion, our results suggest that H2S has a protective effect against lung damage caused by allergy. The reduced peribronchiolar infiltrate of eosinophils can be explained by the reduction in lung levels of IL-4, IL-5 and IL-25 due to the action of H2S. H2S also avoided apoptosis, and consequently, the destruction of the bronchial epithelium, which contributes to the reduction of pulmonary inflammation in allergic process. The CSE enzyme may be involved in this process. H2S has an important therapeutic potential for allergic pulmonary disorders such as asthma.? / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

Orientador: Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:17:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bombassaro_Bruna_M.pdf: 2789722 bytes, checksum: 84c9ac89c77f8ea14c7c63e6f9bfdfc6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A proteína PGC1? é um co-ativador de transcrição gênica que desempenha papel importante na regulação de uma série de fenômenos metabólicos que compreendem desde o controle da termogênese e mitocondriogênese até a regulação da secreção de insulina e a produção hepática de glicose. Como vários dos fenômenos biológicos controlados direta ou indiretamente pela PGC1? tem importância vital, a regulação dos níveis de PGC1? nos tecidos deve ser finamente ajustada. Nos últimos anos, inúmeros estudos exploraram os mecanismos envolvidos com o controle da expressão gênica e tradução da PGC1?. Entretanto, apenas alguns poucos estudos avaliaram a degradação da mesma. Um dos mais importantes mecanismos envolvidos com a regulação funcional e da meia-vida de proteínas é a ubiquitinação, que pode direcionar proteínas alvo ao proteassoma para degradação ou a outras modificações pós-traducionais. O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação de uma proteína com atividade deubiquitinase e ubiquitina ligase, a A20, na manutenção da homeostase do tecido adiposo de animais submetidos à dieta rica em gordura e voluntários humanos magros e obesos antes e após cirurgia de redução de peso. Foram utilizados o tecido adiposo branco visceral e subcutâneo e o tecido adiposo marrom de camundongos Swiss machos submetidos a 16 semanas de dieta hiperlipídica e o tecido adiposo subcutâneo de voluntários magros e obesos antes e após a cirurgia bariátrica. Esses tecidos foram avaliados quanto ao conteúdo protéico e expressão gênica da proteína A20, e sua associação com a PGC1? por imunoprecipitação e imunofluorescência, bem como a ubiquitinação desta última. Os resultados obtidos a partir do tecido adiposo de humanos mostram uma diminuição na expressão da proteína A20 nos pacientes antes e após a cirurgia bariátrica com relação aos voluntários magros. A PGC1? aparece mais ubiquitinada nos pacientes obesos em relação e a associação entre A20 e PGC1? parece aumentar com o ganho de peso na mesma proporção que o conteúdo protéico de PGC1? parece diminuir. No tecido adiposo subcutâneo de camundongos obesos, observamos uma diminuição de PGC1? bem como redução da marcação por cadeias de poliubiquitina desta proteína, associado a um aumento de A20 e aumento da associação de A20 com PGC1?. Camundongos obesos foram também tratados com um oligonucleotídeo antisense (ASO) para A20, resultando na redução de sua expressão gênica. Os animais tratados apresentaram uma piora na tolerância à glicose no teste de GTT o que ocorreu concomitantemente a redução de PGC1?. Nossos resultados indicam que, no tecido adiposo, a A20 se associa a PGC1? e a redução da sua expressão resulta em redução da expressão da PGC1? o que é acompanhando de uma piora no controle homeostático da glicose / Abstract: Peroxisome proliferator-activated receptor ? coactivator 1 alpha (PGC-1?) plays an important role in whole body metabolism and, particularly in glucose homeostasis. Its expression is tightly regulated and, small variations in tissue levels can have a major impact in a number of physiological and pathological conditions. Recent studies have shown that the ubiquitin/proteasome system plays a role in the control of PGC-1? degradation. Here we evaluated the interaction of PGC-1? with the protein A20, which plays a dual-role in the control of the ubiquitin/proteasome system acting as a deubiquitinase and as an E3 ligase. We employed immunoprecipitation, quantitative real-time PCR and immunofluorescence staining to evaluate PGC-1?, A20, PPAR? and ubiquitin in the adipose tissue of humans and mice. Our results show that, in distinct sites of the adipose tissue A20 binds to PGC-1?. At least in the subcutaneous fat of humans and mice the levels of PGC-1? decrease during obesity, while its physical association with A20 increases. The inhibition of A20 leads to a reduction of PGC-1? and PPAR? expression, suggesting that A20 acts as a protective factor against PGC-1? disposal. Thus, we provide evidence that mechanisms regulating PGC-1? ubiquitination are potentially involved in the control of the function of this transcriptional co-activator / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Orientador: Mário José Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campionas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T00:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_BrunodeMelo_D.pdf: 4847412 bytes, checksum: e05413650182e8b4049ebd41d6f06e7b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A ingestão de alimentos ricos em gordura leva à obesidade e inflamação crônica sub-clínica, a qual desenvolve papel importante na resistência à insulina. Aumentados níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias, ácidos graxos livres e lipopolissacarídeos ativam o sistema imune inato, que desencadeia inflamação e aumento na expressão de citocinas, levando à resistência à insulina. Dessa forma, nós investigamos o efeito da modulação da flora intestinal, na resistência à insulina e avaliamos o baço como uma nova fonte de inflamação e células do sistema imune, responsáveis pela resistência à insulina induzida por obesidade, cujas funções ainda não estão completamente determinadas. Para investigar os efeitos da modulação da flora intestinal, nós submetemos camundongos a dieta hiperlipídica com antibióticos ou em regime de pair-feeding por oito semanas e realizamos análises metagenômicas de amostras de DNA provenientes das fezes dos camundongos. A fim de avaliar a influência do baço no metabolismo, nós realizamos esplenectomia em camundongos e induzimos obesidade com a utilização de dieta rica em gordura, além de fazer abordagens proteômicas para determinar novas moléculas que poderiam estar envolvidas na inflamação e migração de células. Em ambos os experimentos, glicose, insulina e citocinas circulantes foram avaliadas, assim como as vias de sinalização da insulina e inflamatória em fígado, músculo e tecido adiposo, como também avaliamos a infiltração de macrófagos no fígado e no tecido adiposo. A flora intestinal estava extremamente modificada pelo tratamento com antibióticos, reduzindo a prevalência de Bacteroidetes e Firmicutes, a quantidade de bactérias no intestino e LPS circulante, bem como glicemia, insulinemia e citocinas. Este quadro também apresentou regulação negativa do TLR4 e redução na inflamação, a qual induziu aumento na sensibilidade à insulina, além da notável redução de macrófagos infiltrados nos tecidos dos camundongos tratados com antibióticos. Em camundongos obesos esplenectomizados, houve grande aumento na sensibilidade à insulina, refletida por redução na glicemia, insulinemia e TNF-'alfa' circulante quando comparado com camundongos obesos. A inflamação estava reduzida no fígado, músculo e tecido adiposo dos camundongos obesos esplenectomizados, e como consequência, a via de sinalização de insulina estava mais ativa em comparação aos camundongos obesos que tiveram os baços mantidos. Também houve uma imensa redução na infiltração de macrófagos, no fígado e no tecido adiposo dos camundongos esplenectomizados após a indução de obesidade, quadro semelhante ao encontrado na indução da infiltração de macrófagos pela lipólise. A análise proteômica do baço indicou que GMF-'gama' está mais expresso nos camundongos obesos em relação aos magros, dado confirmado por immunoblot. Concluindo, a modulação da flora intestinal por uma terapia com antibióticos reduziu os níveis circulantes de LPS, inflamação e infiltração de macrófagos, aumentando a sensibilidade à insulina em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Além disso, a esplenectomia também reduziu a inflamação e promoveu melhora na sensibilidade à insulina, bem como inibiu a infiltração de macrófagos induzida pela obesidade, fenômeno que pode ser coordenado pelo baço e quimiocinas, e possivelmente pelo GMF-'gama', uma nova proteína, que estariam envolvidas na regulação da migração celular e estabelecimento de resistência à insulina / Abstract: A high-fat diet intake induces obesity and chronic subclinical inflammation, which play important roles in insulin resistance. Increased circulating levels of proinflammatory cytokines, free fatty acids and lipopolysaccharides activate innate immune system, which triggers inflammation and cytokine expression, leading to insulin resistance. Thus, we investigated the effect of gut microbiota modulation, on insulin resistance and evaluated the spleen as a novel source of inflammation and immune cells, responsible for the obesity-induced insulin resistance, which roles are not yet fully understood. To investigate microbiota modulation effects, we submitted Swiss mice to a high-fat diet with antibiotics or pair-feeding for eight weeks and performed metagenomic analyses from mice fecal DNA samples. In order to evaluate the spleen influence over the metabolism, we performed splenectomy in Swiss mice and induced obesity with a high-fat diet and performed proteomic approaches to determine novel molecules that could promote inflammation and immune cell migration. In both experiments, blood glucose, serum insulin and cytokines were evaluated, as well as liver, muscle and adipose tissue insulin and inflammatory signaling pathway, and liver and adipose tissue macrophage infiltration. Gut microbiota was greatly modified by the antibiotic treatment, reducing Bacteroidetes and Firmicutes prevalence, overall bacterial count and circulating LPS, as well as fasting blood glucose and serum insulin and cytokines. It also promoted TLR4 downregulation and reduction in inflammation, which promoted improvement in insulin sensitivity, besides a striking reduction in macrophage infiltration in antibiotic-treated mice. In splenectomized obese mice, a great improvement in insulin sensitivity was seen, reflected by blood glucose, serum insulin and TNF-'alpha' levels reduction. Inflammation was reduced in the liver, muscle and adipose tissue of obese splenectomized mice, in consequence, insulin signaling was improved when compared to obese mice that maintained the spleen. There was an immense reduction in liver and adipose tissue macrophage infiltration in splenectomized mice after obesity induction, which was repeated when we observed lipolysis-induced adipose tissue macrophage infiltration. Spleen proteomic studies indicated that GMF-'gamma' is overexpressed in obese mice compared to lean ones. In conclusion, gut microbiota modulation by antibiotic therapy reduced circulating LPS levels, inflammation and macrophage infiltration, improving insulin sensitivity in mice fed a high-fat diet. In addition, splenectomy also reduced inflammation and promoted insulin sensitization, as well as inhibited obesity-induced macrophage infiltration, which can be ruled by the spleen and chemokines, and possibly by GMF-'gamma', a novel protein, that could be involved in the regulation of cell migration and insulin resistance settlement / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutor em Ciências

Neste trabalho foram pesquisados os efeitos in vitro da metaloproteinase jararagina, em modelo de células de tumores de mama humana MCF7, T47D e murina (Tumor de Ehrlich), além de células normais, avaliando-se a viabilidade celular, morfologia, modificações nas fases do ciclo celular e tipo de morte celular; como os efeitos no modelo murino nas formas ascítica e sólido-ortotópica de Ehrlich. Os resultados obtidos mostraram que a jararagina diminui significativamente a viabilidade e adesão de maneira dose dependente, formação de agregados e estruturas tipo esferoides com formação túbulo-acinar. Os parâmetros antitumorais in vivo, não mostraram diminuição no volume tumoral ascítico, entretanto, no modelo ortotópico, a jararagina induz resposta inflamatória e remodelação da matriz extracelular e resulta em alterações na distribuição e organização do colágeno. Conclui-se que a jararagina induz citotoxicidade nas linhagens de células tumorais de mama e normais, e foi capaz de induzir infiltrado inflamatório durante o crescimento e disseminação das células tumorais. / The present study investigated the in vitro effects of metalloproteinase jararhagin in human breast tumor cells model MCF7 and T47D, murine tumor cells (Ehrlich\'s tumor), and normal cells, assessing cell viability, morphological alterations, changes in the cell cycle phases and death cell, as the effects on ascitic and solid orthotopic murin Ehrlich tumor. The results showed that jararhagin significantly decreases adhesion and cell viability in a dose dependent, with cells aggregates and spheroids with tubulo-acinar formation. The in vivo parameters showed no decrease in ascites tumor volume, however, the orthotopic model, jararhagin induces the inflammatory response and extracellular matrix remodeling with changes in the collagen distribution and organization. It is concluded that jararhagin induces cytotoxicity in breast tumor and normal cell lines, and was able to induce inflammatory infiltrate during the growth and dissemination of tumor cells.

O sobrepeso/obesidade é uma condição multifatorial e poligênica que pode resultar em desequilíbrio calórico. Uma vez instalada, a obesidade tende a se manter, de modo que a prevenção figura como principal recurso e, a compreensão das causas, essencial. Este estudo teve o objetivo de avaliar a associação da expressão de genes relacionados à obesidade, inflamação e perfil lipídico em gestantes com sobrepeso/obesidade e eutróficas, na adiposidade dos recém-nascidos. Trata-se de um estudo prospectivo, inserido em estudo coorte de base populacional, realizado em 33 Unidades Básicas de Saúde e em hospital municipal de Araraquara (SP). Foram acompanhadas desde o início do pré-natal até o pós-parto, 78 gestantes, das quais 46 delas eram obesas ou com sobrepeso e 32, eutróficas. Trimestralmente, realizava-se aplicação de questionário digital sociodemográfico, de estilo de vida e morbidade, exames de ultrassonografia e exames de sangue para determinação de: glicemia de jejum, insulina, colesterol total, LDL, HDL, VLDL, triglicérides e PCR-us, hemoglobina glicada e hemograma completo). A análise da expressão gênica materna foi realizada apenas no terceiro trimestre, utilizando o método de extração por fenolclorofórmio para obter RNA a partir do sangue total, e a expressão gênica relativa foi analisada em triplicata por RT-qPCR no equipamento 7500 Fast Real PCR System (Applied Biosystems®, USA). A adiposidade do neonato foi estimada por pletismografia por deslocamento de ar (PEA POD®), na alta hospitalar. O presente estudo é inédito e mostrou que tanto o fator genético (expressão gênica dos genes LEPR, STAT3, PPARG, TLR4, IL6, NFkB e TNF) como fatores nutricionais e metabólicos maternos (IMC pré-gestacional, ganho de peso, HOMA-IR e diabetes mellitus gestacional) estão relacionados com a adiposidade do concepto logo após ao nascimento. O desenvolvimento fetal é um processo biológico complexo, regulado tanto por fatores maternos quanto fetais, incluindo influências genéticas e ambientais. Os mecanismos genéticos influenciam a regulação anti e pró-inflamatória que têm impacto na saúde materna. Expressões de sete dos dez genes investigados mostraram-se estatisticamente associados com a adiposidade do recém-nascido, independente de alguns genes serem mais ou menos expressos em gestantes obesas/sobrepeso. Portanto, o entendimento das diferentes vias do processo inflamatório, imunológico e sinalização da resistência à insulina são intimamente relacionados e dependentes. A elucidação dos fatores envolvidos no início da vida, observados neste estudo, e que podem ser prevenidos no pré-natal, devem ser cruciais para as políticas de saúde pública, na prevenção da obesidade infantil. / Overweight/obesity is a multicausal and polygenic condition that can result in energy imbalance. Once obesity tends to persist, prevention is the more effective strategy and understanding its causes is essential. This study aimed to evaluate the association of the gene expression related to obesity, inflammation and lipid profile in overweight/obese and eutrophic pregnant women and in newborn adiposity. It is a prospective study, inserted in a cohort study with population-based data, which was carried out at 33 Health Units and at a municipal maternity in Araraquara, Sao Paulo, Brazil. Seventy-eight pregnant women were followed since conception until postpartum, of whom 46 were obese or overweight and 32 were eutrophic. Every trimester, a sociodemographic, lifestyle and morbidity questionnaire was applied, ultrasonography and blood tests (fasting glucose, insulin, total cholesterol, LDL, HDL, VLDL, triglycerides and hs-CRP, glycated hemoglobin and complete blood count). The analysis of maternal gene expression was performed only in the third trimester, using the phenolchloroform extraction method to obtain RNA from whole blood, and relative gene expression was analyzed in triplicate by RT-qPCR in the 7500 Fast Real PCR System (Applied Biosystems®, USA). Newborn adiposity was estimated by air displacement plethysmography (PEA POD®) at hospital discharge. As far as we know this is the first study that verified that both genetic factors (LEPR, STAT3, PPARG, TLR4, IL6, NFkB and TNF gene expressions) and maternal nutritional and metabolic factors (pre-gestational BMI, gestational weight gain, HOMA-IR and gestational diabetes) are related to newborn adiposity at birth. Genetic mechanisms that participate in pro and anti-inflammatory regulation impact on maternal health, that may consequently play a role in the complex biological process of fetal development, that depends not only from maternal and fetal factors, but also of genetic and environmental influences. Expression of seven from ten genes investigated were statistically associated with newborn adiposity, regardless that some genes were more and other less expressed in obese/overweight pregnant women. Understanding immune and inflammatory pathways and insulin resistance signaling is crucial because its close association to maternal and newborn obesity, as observed in this study. The elucidation of factors involved in early life, as shown, should guide prenatal care in public health policies to prevent childhood obesity.

A inflamação é um evento intrínseco ao transplante que é desencadeado após o dano causado pela cirurgia. No presente trabalho realizou-se a caracterização fenotípica e funcional das células inflamatórias presentes no enxerto, após o transplante alogênico ou singênico de pele em camundongos. Os resultados obtidos mostraram diferenças significativas na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias entre o transplante alogênico e singênico, diferenças já detectáveis nas primeiras 24 horas pós-transplante. Mostrou-se que existe produção aumentada de IL-10 no transplante singênico em relação ao transplante alogênico indicando que a produção de IL-10 no enxerto possui um importante papel para o aceite de transplantes de pele. Além disso, na ausência de IL-10, a rejeição de enxertos alogênicos apresentou-se acelerada e surpreendentemente uma grande parcela dos enxertos singênicos não foi aceita e apresentava aspecto de fibrose com grande deposição de colágeno. O conjunto dos dados indica que a IL-10 possui um importante papel regulatório na inflamação local do enxerto. / Inflammation is an intrinsic event of transplantation that occurs due to to damage caused by surgery. In this study, phenotypic and functional characterization of inflammatory cells present in the graft was performed, after allogeneic or syngeneic skin transplantation in mice. Our results show significant differences in the production of pro and anti-inflammatory cytokines between the syngeneic and allogeneic grafts, detectable as early as 24 hours after transplantation. Higher production of IL-10 was shown in the syngeneic grafts in comparison to allogeneic grafts, indicating that production of IL-10 in the graft is important for acceptance. This is reinforced by data that shows that in the absence of IL-10, rejection of allografts is accelerated and that, surprisingly, a high percentage of the syngeneic grafts is not accepted as well, or shows fibrosis with high deposition of collagen. Taken together, this data indicates that IL-10 has an important regulatory function in the local inflammation of the graft.

A rabdomiólise é uma causa importante de lesão renal aguda (LRA) e decorre da lise das células musculares esqueléticas, com liberação do conteúdo intracelular para o compartimento extracelular e para a circulação. O extresse oxidativo e o processo inflamatório contribui para as alterações da função e estrutura renal que ocorrem na LRA. Estudos recentes tem evidenciado a participação da Vitamina D (Vit. D) no controle do processo inflamatório e do estresse oxidativo. Este estudo avaliou o efeito do tratamento com calcitriol (1,25-dihidroxivitamina D3) na evolução das alterações de estrutura e função renal, estresse oxidativo e no processo inflamatório renal provocados pela administração de glicerol. Ratos Wistar Hannover machos foram tratados com calcitriol (6 ng/dia, s.c., osmotic pump) ou veículo (salina 0,9%) por 7 dias, sendo no 3º dia injetados com glicerol (50%; 8ml/kg, i.m.) ou salina (8ml/kg, i.m). Os animais foram divididos em 4 grupos: Controle (n=7): receberam veículo s.c. e no 3º dia, injeção i.m de salina; Controle+Vit. D (n=7): receberam calcitriol s.c. e no 3º dia, injeção i.m de salina; Glicerol (n=13): receberam veículo s.c. e no 3º dia, injeção i.m de glicerol; Glicerol+Vit.D (n=10): receberam calcitriol s.c. e no 3º dia, injeção i.m de glicerol. Quatro dias após as injeções foram coletadas amostras de urina, plasma e tecido renal para estudos de função renal, histologia, imunoistoquímica, ELISA e Western blot. Os animais do grupo Glicerol tiveram aumento dos níveis plasmáticos de creatinina, redução da taxa de filtração glomerular, aumento da fração de excreção de sódio e redução da osmolalidade urinária comparados com os dos grupos controles. A análise histológica evidenciou aumento da área intersticial relativa e do número de túbulos com necrose no córtex renal dos animais tratados com glicerol. A lesão tubular foi também constatada pelo aumento da expressão de vimentina e PCNA nos animais do grupo Glicerol, em relação aos controles e ao grupo Glicerol+ Vit. D. Essas alterações foram menos intensas no grupo Glicerol+ Vit. D. A expressão de mioglobina estava aumentada no tecido renal de ambos os grupos tratados com glicerol. O estresse oxidativo foi observado pela aumento da expressão de 8-isoprostano nos animais do grupo Glicerol, essa alteração não estava presente nos animais controles e nos animais Glicerol+Vit. D. Ambos os grupos tratados com glicerol tiveram aumento do número de macrófagos, da expressão de NF-?B e dos níveis de IL1-? no córtex renal. Essas alterações foram atenuadas pelo tratamento com Vit. D. O grupo Glicerol apresentou também maior excreção urinária de VDBP, proteína transportadora de Vit. D e menor número de túbulos com bordadura em escova marcados com cubulina, receptor de Vit. D, em comparação aos grupos Controles e Glicerol+Vit. D. Portanto, a redução do receptor e a perda do transportador, reduz a captação de Vit. D nesse modelo, comprometendo a ativação renal de Vit. D e a sua ação no processo inflamatório e no estresse oxidativo no tecido renal. Concluindo, nossos resultados mostram que o tratamento com calcitriol reduziu as alterações de função e estrutura renal provocadas pelo glicerol. Esse efeito estava associado com a diminuição do processo inflamatório e do estresse oxidativo no tecido renal dos animais tratados com Glicerol+Vit. D. / Rhabdomyolysis provoked by the lysis of skeletal muscle cells can induce acute kidney injury (AKI) with release of intracellular content to the extracellular compartment and circulation. The oxidative stress and the inflammatory process contribute to the changes in renal function and structure in AKI. Recent studies have show the effect of vitamin D (Vit. D) on inflammatory process control and in the oxidative stress. This study evaluated the effect of calcitriol (1,25- dihydroxyvitamin D3) in the renal function and structure induced by glycerol and its relationship with the inflammatory process and the oxidative stress. Male Wistar Hannover rats were treated with calcitriol (6 ng/day, s.c., administered through an osmotic pump) or vehicle (saline 0.9%) for 7 days, and injected with glycerol (50%; 8ml/kg, i.m.) or saline (8ml/kg, i.m) 3 days after the beginning of this treatment. The animals were divided into 4 groups: Control (n = 7): received vehicle s.c. and on 3rd day after an injection i.m of saline; Control + Vit. D (n = 7): received Calcitriol s.c. and 3rd day after an injection i.m of saline; Glycerol (n = 13): received vehicle s.c and on 3rd day after an injection i.m of glycerol and Glycerol + Vit. D (n = 10): received Calcitriol s.c. and 3rd day after an injection i.m of glycerol. Four days after injections, urine samples, plasma and renal tissue were collected for renal function, histology, immunohistochemistry, ELISA and Western blot studies. Glycerol injected rats presented increase in plasma creatinine levels and sodium fractional excretion, and reduction glomerular filtration rate and urinary osmolality compared to controls groups. Histological analysis showed an increase in the relative interstitial area and in the number of tubules with necrosis in the renal cortex of these animals treated with glycerol. The tubular lesion was also evidenced by increased expression of vimentin and PCNA in the animals of the Glycerol group compared to controls. These changes were less intense in the Glycerol + Vit. D group. The myoglobin expression was increased in the renal tissue of both groups of the animal treated with glycerol. The oxidative stress was observed by the increased expression of 8-isoprostane in the kidneys from Glycerol group. However, this change was not observed in the control and Glycerol + Vit. D treated rats. Both glycerol-treated groups had increased number of macrophages, NF-?B expression and IL1- ? levels in the renal cortex. These changes were less intense in Vit. D treated animals. Glycerol group also presented higher urinary excretion of VDBP and less number of tubules with brush border marked with cubilin (Vit. D receptor) compared to the Control and Glycerol + Vit. D. Therefore, the reduction of the receptor and the loss of the transporter, reduces the uptake of Vit. D in this model, compromising the renal activation of Vit. D and its action in the inflammatory process and oxidative stress in renal tissue. In conclusion, our results show that treatment with calcitriol reduced the changes in renal function and structure caused by glycerol. This effect was associated with decreased inflammatory process and oxidative stress in the renal tissue of animals treated with Glycerol + Vit. D.

Linhagens de camundongos selecionadas para a máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda diferem tanto na susceptibilidade a infecção por Salmonella entérica sorotipo Typhimurium (S. Typhimurium) e ao LPS. Diferentes frequências dos alelos do gene Nramp1, envolvido na resistência inata a infecção por S. Typhimurium, foram encontradas nas linhagens AIRmax e AIRmin. Para o estudo da interação do gene Nramp1 com os loci da inflamação, sublinhagens homozigotas para os alelos R e S deste gene foram produzidas, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR e AIRminSS. Os animais AIRmaxRR foram sensíveis ao LPS, enquanto que os AIRminSS foram os mais resistentes a endotoxina. Quando desafiados com LPS, os animais AIRmaxRR apresentaram maior nível sérico de citocinas inflamatórias e maior expressão gênica de Tnf, Il6 e Il1b em células de fígado e medula óssea. Os AIRminRR expressaram e produziram maiores níveis de Il10. Através da análise da expressão gênica global em células de medula óssea, os AIRminSS mostraram um número maior de genes envolvidos na resposta ao LPS. / Lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) and minimal (AIRmin) acute inflammatory reaction differ in susceptibility to infection with Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and to LPS sensitivity. Different frequencies of Nramp1 alleles, involved in innate resistance to S. Typhimurium infection, were found in AIRmax and AIRmin mouse lines. To study the Nramp1 gene interaction with acute inflammatory QTL, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS sublines were produced. AIRmaxRR were found to be extremely sensitive to LPS, while the AIRminSS were the most resistant line to endotoxin. After LPS challenged, AIRmaxRR animals showed higher levels of inflammatory cytokine sera and as well as Tnf, Il6 and IL1b gene expression intensities in liver and bone marrow cells. Il10 expression was higher in AIRminRR mice. The global gene expression analysis in bone marrow cells after LPS stimulus showed higher number of differently expressed genes in AIRminSS mice.