El objetivo general fue la construcción de una inmunoglobulina reportera y su expresión en plantas a fin de evaluar la factibilidad de generar un reportero funcional. Los objetivos específicos fueron: Objetivo 1: Diseñar y construir una fusión del gen codificante para la cadena liviana del anticuerpo 14D9 a proteínas fluorescentes (kappa-PF). Objetivo 2: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF por expresión temporal. Objetivo 3: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF en presencia de la cadena pesada.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Valida la respuesta contra antígenos de T. gondii en un modelo experimental de ratón de Toxoplasmosis en dos etapas de la infección. Veinticuatro ratones hembras Swiss Webster fueron infectados por vía oral con quistes de T. gondii cepa Me49 y cuatro ratones fueron inoculados con solución salina (grupo control). La sangre se recogió a los 1 ,3 ,7 días y 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 semanas después. Las infecciones cerebrales con quistes del parásito de ratón se confirmaron mediante microscopía óptica. La técnica de Western blot se realizó utilizando las proteínas de lisado del taquizoíto de la cepa RH como antígeno, e IgM e IgG como anticuerpos de detección. Para la detección de anticuerpos IgM anti -T. gondii se identificaron 18 proteínas inmunogénicas, de las cuales cinco (25,28 ,35.5, 58 y 83 kDa) aparecieron dentro de 8 y 16 días después de la infección y mantuvieron una alta sensibilidad hasta 64 días. Para la detección de anticuerpos IgG anti -T. gondii se observaron un total de 30 proteínas, las mismas observadas para IgM, además de otras proteínas inmunogénicas y también el reconocimiento específico de proteínas en fase crónica con peso molecular de 15, 18, 19, 21, 22,22.5,23, 50 y 145 kDa, estos dos últimos con alta sensibilidad. Las bandas correspondientes a estas proteínas se observaron a los 36 días después de la infección (fase crónica), posteriormente sus intensidades aumentaron progresivamente. La detección de estas proteínas por la técnica de Western blot podría ser útil para estimar la etapa y el desarrollo de la infección en el diagnóstico de la enfermedad de toxoplasmosis. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Estandariza dos pruebas de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos IgM e IgG4 anti Fasciola hepatica y aplica las pruebas en sueros de pobladores de la comunidad andina de Pamparomás, Ancash. Desarrolla un estudio observacional, descriptivo y transversal. Las principales medidas de resultados son anticuerpos contra F. hepatica detectados mediante las pruebas de ELISA IgM e IgG4 anti F. hepatica. Encuentra que las condiciones de reacción de la prueba de ELISA IgM fueron concentración de antígeno excretado-secretado (E/S) de F. hepatica 5 µg/100 µL y dilución del suero 1/10, dilución del conjugado anti IgM 1/500. Las condiciones de reacción de la prueba de ELISA IgG4 anti F. hepatica fueron concentración de antígeno E/S de F. hepatica 2,5 µg/100 µL, dilución del suero 1/200, dilución del conjugado anti IgG4 biotinilado 1/2 000 y conjugado estreptavidina-peroxidasa 1/1 000. La prueba de ELISA IgG4 anti F. hepatica determinó una frecuencia de 14,5% (16/110) de reactividad en sueros humanos. La sensibilidad y especificidad para la prueba de ELISA IgG4 anti F. hepatica fue de 100% y 93,1%. Los valores de sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA IgM anti F. hepatica resultaron no concluyentes. Determina que la prueba de ELISA IgG4 anti F. hepatica es útil como prueba de tamizaje para el diagnóstico de la fasciolosis en pobladores infectados de zonas endémicas. / Tesis

Determina la asociación de la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Herpes Equino tipo 1 (VHE-1) / virus Herpes Equino tipo 4 y problemas reproductivos en yeguas de tres criaderos de caballo peruano de paso del distrito de Cieneguilla. Se colectaron muestras de suero (n=60) de todas las yeguas mayores a 3 años de edad, para la detección de anticuerpos neutralizantes contra VHE-1/VHE-4 mediante la prueba de neutralización viral. Realiza el análisis de registro de los tres criaderos para identificar a las yeguas con presencia y ausencia de problemas reproductivos en sus últimos dos años (2013-2015). El 76.67% (46/60) de las muestras tuvieron anticuerpos contra VHE-1/VHE-4. Los resultados muestran que el 57% (34/60) de las yeguas presentaron problemas reproductivos. El porcentaje de seropositividad en el criadero A fue del 100% (11/11), en el criadero B fue de 66.67% (16/24) y en el criadero C fue de 76% (19/25). Los títulos de anticuerpos neutralizantes tuvieron un rango entre 1:2 a ≥1:256, siendo los títulos de 1:2 a 1:8 presentes en el 28.3% de las muestras, de 1:16 a 1:64 en 43.5% y 1:128 a ≥1:256 en 28.3% de las muestras. La prueba Chi-cuadrado no muestra resultados significativos (p>0.05) para determinar la asociación entre la presencia de anticuerpos neutralizantes contra VHE-1/VHE-4 y los problemas reproductivos en yeguas. / Tesis

Evalúa la respuesta inmune en cerdos, tras la administración de la vacuna recombinante desarrollada con el antígeno Tsol18 expresado en el virus de Newcastle (VNC). Para lo cual se usa 15 cerdos, divididos en 3 grupos de vacunación con 5 individuos cada uno: el grupo I por vía ocular, el grupo II por vía nasal y el grupo III (control), solo recibe suero fisiológico. Los tres grupos son vacunados en la semana 0, 1, 5 y 6. Los cerdos son sangrados cada semana por 8 semanas, para la obtención del suero. Los anticuerpos contra el Virus de Newcastle, son obtenidos mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). El ELISA indirecto estandarizado con el antígeno Tsol18, permite monitorear la presencia de anticuerpos circulantes contra la proteína Tso18 en cerdos inmunizados por vía oral y nasal. Todas las muestras resultan positivas a HI para VNC. Se concluye que no existe diferencia estadística entre la vía de inoculación y los títulos de anticuerpos producidos en los grupos de estudio. / Tesis

Tesis por compendio / [ES] La producción en acuicultura se ha visto menguada por aparición de enfermedades en los sistemas de cría de peces. En concreto, en la dorada (Sparus aurata), hay dos parásitos destacados: Enteromyxum leei (Myxozoa) y Enterospora nucleophila (Microsporidia). Hasta la fecha, para ninguno de los dos se ha establecido un cultivo in vitro, y solo para E. leei se ha conseguido establecer un modelo de mantenimiento de la infección in vivo. La presente tesis pretende incrementar el conocimiento sobre estos parásitos y sus relaciones con el hospedador, sentando las bases para generar soluciones que puedan ser aplicadas en la acuicultura. El objetivo con E. leei fue estudiar la inmunidad adquirida inducida en la dorada y la posibilidad de generar herramientas de diagnóstico y vacunas frente a esta enfermedad. Para ello, primero se demostró la resistencia del pez al parásito tras una segunda exposición, la cual duró hasta 16 meses. Además, la resistencia parece estar correlacionada con altos niveles de inmunoglobulina (Ig) M específica en sangre, y una alta expresión de Igs, incluso antes de la re-exposición al parásito. El siguiente paso fue afinar el protocolo de infección con E. leei. Los resultados mostraron que una semana es suficiente para transmitir la infección de E. leei por efluente, independientemente de la temperatura. Tras la demostración de la respuesta adaptativa eficaz frente a E. leei, y al disponer de un modelo de infección refinado, se realizó un ensayo de inmunización pasiva. Aquí, los resultados mostraron que los anticuerpos especi'ficos efectivamente consigue ralentizar la invasión del intestino por el parásito y disminuir los síntomas de la enfermedad. Paralelamente, el resultado del análisis del repertorio de las regiones variables de la IgM e IgT del intestino peces resistentes mostró la inducción de una respuesta policlonal en las ce'lulas B. En base a estos resultados, se realizó una búsqueda de antígenos de E. leei que pudieran ser utilizados como candidatos para la producción de vacunas (análisis proteómico) o herramientas de diagnóstico (análisis in silico). Para ello, se ensambló un transcriptoma de novo utilizando una muestra mixta de intestino de dorada y parásito. Los resultados dieron lugar a 7 y 12 candidatos en la búsqueda in silico y proteómica, respectivamente. En los estudios de E. nucleophila, debido a que fue descrita muy recientemente, el punto de partida fue más básico. Las muestras de este parásito solo se pueden obtener de brotes naturales en piscifactorias. Por ello, primero se realizó un estudio de caracterización de la patología de la infección a partir de peces infectados naturalmente. En etapas tempranas de la infección, el parásito se localiza principalmente en el intestino, pero meses después, la prevalencia en intestino baja e incrementa en los órganos hematopoyéticos y el esto'mago. Los signos clínicos de la infección consistieron en una reducción significativa del crecimiento, emaciación, y palidez de las paredes intestinales. A nivel celular, en los casos ma's graves se observó hipercelularidad en el epitelio intestinal y proliferación de ce'lulas rodlet, un elevado número de linfocitos en la base del epitelio e infiltración de granulocitos acidófilos en el epitelio intestinal. Finalmente se probaron varias formas de transmisión horizontal de E. nucleophila (cohabitación, efluente, intubación oral y anal) con para desarrollar un modelo de mantenimiento in vivo. Se consiguió la transmisión el parásito por todas las vías, pero con una disminución de prevalencia a lo largo del tiempo. Variables como la temperatura, la dosis, y el estado de los peces donantes parecen ser más determinantes que la ruta seleccionada para la transmisión. Entre las rutas probadas, la intubación anal parece ser la más prometedora, pero ninguna de ellas fue capaz de reproducir los signos clínicos observados en las infecciones naturales. / [CA] La producció en aqüicultura s'ha vist minvada per aparició de malalties en els sistemes de cria de peixos. En concret, en l'orada (Sparus aurata), hi ha dos paràsits destacats: Enteromyxum leei (Myxozoa) i Enterospora nucleophila (Microsporidia). Fins avui, per a cap dels dos s'ha establert un cultiu in vitro, i només per a E. leei s'ha aconseguit establir un model de manteniment de la infecció in vivo. La present tesi pretén incrementar el coneixement sobre aquests paràsits i les seves relacions amb l'hoste, establint les bases per a generar solucions que puguin ser aplicades en l'aqüicultura. L'objectiu amb E. leei va ser estudiar la immunitat adquirida induïda en l'orada i la possibilitat de generar eines de diagnòstic i vacunes enfront d'aquesta malaltia. Per a això, primer es va demostrar la resistència del peix al paràsit després d'una segona exposició, la qual va durar fins a 16 mesos. A més, la resistència sembla estar correlacionada amb alts nivells d'immunoglobulina (Ig) M específica en sang, i una alta expressió de Igs, fins i tot abans de la re-exposició al paràsit. El següent pas va ser afinar el protocol d'infecció amb E. leei. Els resultats van mostrar que una setmana és suficient per a transmetre la infecció de E. leei per efluent, independentment de la temperatura. Després de la demostració de la resposta adaptativa eficaç enfront de E. leei, i en disposar d'un model d'infecció refinat, es va realitzar un assaig d'immunització passiva. Aquí, els resultats van mostrar que els anticossos específics efectivament aconsegueix alentir la invasió de l'intestí pel paràsit i disminuir els símptomes de la malaltia. Paral·lelament, el resultat de l'anàlisi del repertori de les regions variables de la IgM i IgT de l'intestí peixos resistents va mostrar la inducció d'una resposta policlonal en les cèl·lules B. Sobre la base d'aquests resultats, es va realitzar una cerca d'antígens de E. leei que poguessin ser utilitzats com a candidats per a la producció de vacunes (anàlisis proteómico) o eines de diagnòstic (anàlisi in silico). Per a això, es va assemblar un transcriptoma de novo utilitzant una mostra mixta d'intestí d'orada i paràsit. Els resultats van donar lloc a 7 i 12 candidats en la cerca in silico i proteòmica, respectivament. En els estudis de E. nucleophila, pel fet que va ser descrita molt recentment, el punt de partida va ser més bàsic. Les mostres d'aquest paràsit només es poden obtenir de brots naturals en piscifactorias. Per això, primer es va realitzar un estudi de caracterització de la patologia de la infecció a partir de peixos infectats naturalment. En etapes primerenques de la infecció, el paràsit es localitza principalment en l'intestí, però mesos després, la prevalença en intestí baixa i incrementa en els òrgans hematopoètics i l'estómac. Els signes clínics de la infecció van consistir en una reducció significativa del creixement, emaciació, i pal·lidesa de les parets intestinals. A nivell cel·lular, en els casos més greus es va observar hipercelularidad en l'epiteli intestinal i proliferació de cèl·lules rodlet, un elevat nombre de limfòcits en la base de l'epiteli i infiltració de granulòcits acidòfils en l'epiteli intestinal. Finalment es van provar diverses formes de transmissió horitzontal de E. nucleophila (cohabitació, efluent, intubació oral i anal) amb per a desenvolupar un model de manteniment in vivo. Es va aconseguir la transmissió el paràsit per totes les vies, però amb una disminució de prevalença al llarg del temps. Variables com la temperatura, la dosi, i l'estat dels peixos donants semblen ser més determinants que la ruta seleccionada per a la transmissió. Entre les rutes provades, la intubació anal sembla ser la més prometedora, però cap d'elles va ser capaç de reproduir els signes clínics observats en les infeccions naturals. / [EN] Aquaculture production is hampered by the emergence of parasite diseases in fish farming systems. Among them, in Sparus aurata, there are two important enteric parasites described: Enteromyxum leei (Myxozoa) Enterospora nucleophila (Microsporidia). To date, no in vitro culture has been established for either parasite, and only for E. leei was it possible to establish a model for maintaining the infection in vivo. The aim of this thesis is to gain new knowledge about these parasites and their relationship with the host, also the basic foundations for generating solutions that can be applied in aquaculture. The general objective for E. leei was to study the acquired immunity induced in gilthead bream and the possibility of generating diagnostic tools and vaccines against this disease. To this end, resistance against the parasite was assessed with a second exposure against the parasite, which showed a resistance for at least 16 months. Besides resistance seemed to be correlated with high levels of specific immunoglobulin (Ig) M in blood, and a high expression of Igs, in particular, the soluble forms, even before re-exposure to the parasite. The next step was refining the protocol for effluent infection with E. leei by studying infection at different exposure time points, temperatures and population densities. The results showed that one week of exposure is sufficient to spread E. leei infection by effluent, regardless of temperature. After demonstrating the resistance against E. leei, and with a refined infection model, a passive immunization assay was performed. The results showed that the serum with specific antibodies effectively slows down the invasion of the gut by the parasite and reduces the symptoms of the disease. At the same time, the analysis of the repertoire of the variable regions of intestinal IgM and IgT showed an induction of a polyclonal response in B cells. On the basis of these results, a research was carried out for E. leei antigens that could have use as candidates for the production of vaccines (proteomic study) or diagnostic tools (in silico study) using the parasite transcriptomic data. To do this, a de novo transcriptome was assembled using a mixed sample of gilthead sea bream and parasite, with a posterior filtrate of the sequences. The In silico and proteomic analysis search resulted in 7 and 12 transcripts, respectively, which are being used for diagnostic and vaccine production. The starting point was more basic in E. nucleophila studies, since this is a recently described disease. The samples of this parasite can only be obtained from natural outbreaks in fish farms. Therefore, first study was carried out to characterize the pathology of the infection of naturally infected fish. In the early stages of the infection, the parasite is mainly located in the intestine, but months later, the prevalence is lower in the intestine and increases in the hematopoietic organs and the stomach. Clinical signs of infection were significant reduction in growth, wasting, and intestinal walls paleness. At the cellular level, in the most severe cases hypercellularity in the intestinal epithelium, proliferation of rodlet cells, high number of lymphocytes at the base of the epithelium and infiltration of acidophilic granulocytes in the intestinal epithelium were observed. Finally, horizontal transmission of E. nucleophila was tried using different transmission methods: cohabitation, effluent, and oral and anal intubation. Transmission of the parasite was achieved with all routes, but there was a decrease in prevalence over time in all cases except for the anal route. Variables such as temperature, dose, and the status of the donor fish appear to be more important than the selected route. Among the routes tested, anal intubation seemed to be the most promising, as it was sustained over a longer period of time, but none of them was able to reproduce the same clinical signs of infection observed in natural infections. / The authors kindly acknowledge the collaboration of anonymous fish farming companies allowing access to the animals during the disease outbreaks. We thank J. Monfort and L. Rodríguez (IATS-CSIC) for the technical assistance on histological processing.This work has been carried out with financial support from the European Union and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) under grant projects ParaFishControl (H2020-634429) and AGL2013-R-48560-C2-2-R, respectively. APS was contracted under ParaFishControl project. Primer sequences and access to the gilthead sea bream transcriptomic database were kindly provided by Prof. J. Pérez-Sánchez of the IATS- Nutrigenomics group. The authors thank I. Vicente for fish maintenance and technical assistance during samplings. The authors thank P. Boudinot (INRAE) for his help in designing and interpreting the immunoglobulin repertoire study and results, J. Pérez-Sánchez (IATS-CSIC) for providing access to the gilthead sea bream genome sequences to perform the repertoire analysis.This work was funded by the European Research Council (ERC Consolidator Grant 2016 725061 TEMUBLYM). / Picard Sánchez, MA. (2021). Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167035 / Compendio