Limited information is available concerning the molecular and cellular mechanisms that regulate expression of insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-binding proteins (IGFBPs) genes in mammary epithelial cells. To test the hypothesis that IGF-I affects growth of bovine mammary epithelial cells through an autocrine and/or paracrine pathway, several cell lines were developed expressing an ovine exon-2 containing IGF-I cDNA under the control of the mouse mammary tumor virus-long terminal repeat (pMMTV-IGF-I), early simian virus (pSV40-IGF-I), and herpes simplex thymidine kinase (pTK-IGF-I) promoters. Stably transfected clones were generated by cotransfection of clonal MAC-T cells with the IGF-I expression vectors and a plasmid conferring resistance to hygromycin-B (HYG-B), using a calcium phosphate precipitation procedure. Induction of the MMTV-LTR with the glucocorticoid dexamethasone (DEX) was required for enhanced expression of IGF-I in MD-IGF-I (MD=Mammary Derived) cells, whereas SV40-IGF-I cells constitutively expressed the highest levels of IGF-I, followed by TK-IGF-I cells. Activity of the MMTV promoter in MD-IGF-I cells was coordinately regulated by lactogenic hormones and extracellular matrix. Acute secretion of DEX-induced recombinant IGF-I by MD-IGF-I cells stimulated cell proliferation through an autocrine/paracrine pathway and triggered the expression of IGFBP-3. Neither acute nor constitutive expression of IGF-I affected expression of type 1 IGF receptor mRNAs, but down-regulated cell surface receptor levels, in the order SV40-> TK- > MD-IGF-I. Secretion of IGF-I-induced IGFBP-3 potentiated the mitogenic actions of IGF-I as evidenced by enhancement of [³H]thymidine uptake into DNA of parental MAC-T cells. This study provides evidence that local production of IGF-I can stimulate cell proliferation of bovine mammary epithelial cells through an autocrine/paracrine mode of action. We suggest that secretion of IGF-I-induced IGFBP-3 by bovine mammary epithelial cells enhances cell responsiveness to IGF-I, but does not prevent down-regulation of the IGF-I receptor in cells constitutively expressing IGF-I. / Ph. D.

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

Growth hormone (GH) stimulates growth and metabolism but also displays profound effects on the central nervous system (CNS). GH affects neurogenesis and neuroprotection, and has been shown to counteract drug-induced apoptosis in the brain. Anabolic androgenic steroids (AAS), mainly abused for their anabolic and performance-enhancing properties, can cause several adverse effects, such as cardiovascular complications, sterility, depression, and aggression. GH and AAS are both believed to interact with several signaling systems in the CNS. The aim of this thesis was to further investigate the impact of GH and AAS on neurochemistry and cognitive functions. Recombinant human GH (rhGH) and the steroid nandrolone decanoate (ND) were administered, separately and in combination with each other, to male rats. The results demonstrated that administration of GH improved spatial memory, assessed in a water maze test. Furthermore, GH induced alterations of the GABAB receptor mRNA expression, density, and functionality in the brain, for example in regions associated with cognition. GH also altered the mu opioid peptide (MOP) receptor, but not the delta opioid peptide (DOP) receptor functionality in the brain. Thus, some of the GH effects on cognition may involve effects on the GABAB receptors and MOP receptors. ND, on the contrary, seemed to induce impairments of memory and also altered the GABAB receptor mRNA expression in the brain. Furthermore, ND lowered the IGF-1 plasma concentrations and attenuated the IGF-1, IGF-2, and GHR mRNA expression in the pituitary. In addition, significant effects of GH and ND were found on plasma steroid concentrations, organ weight, as well as body weight. In conclusion, this thesis contributes with further knowledge on the cognitive and neurochemical consequences of GH and ND use. The findings regarding ND are worrying considering the common use of AAS among adolescents. GH improves memory functions and affects signaling systems in the brain associated with cognition, hence the hypothesis that GH can reverse drug-induced impairments is further strengthened.

Na infecção por Leishmania a resposta imune se inicia logo após a inoculação de promastigotas no indivíduo. Nesse contexto vai haver a participação de diversos fatores da resposta imune inata que vai direcionar para uma resposta imune adaptativa responsável pela evolução da doença. Um desses fatores que participa dessa interação parasito-hospedeiro é o fator de crescimento insulina-símile I (IGF-I). Foi demonstrado que o IGF-I extrínseco favorece a proliferação do parasito e progressão da infecção. No entanto, IGF-I está presente constitutivamente em macrófagos. Neste trabalho avaliamos a expressão do IGF-I, o parasitismo e a produção de óxido nítrico em macrófagos murinos infectado por Leishmania (L.) amazonensis e o efeito da inibição de IGF-I no parasitismo após o silenciamento do IGF-I por RNA de interferência. Macrófagos peritoneiais foram infectados por 2 e 4 horas com promastigotas de L. (L.) amazonensis na presença de soro fetal bovino (SFB) 5% e Albumina de Soro Bovino 0,5% (BSA) na presença ou ausência de small-interfering RNA (siRNA) de IGF-I e lipossoma (Lipo). As células foram lavadas e mantidas depois em meio de cultura por 24, 48 e 72 h. Quando o recombinante para IGF-I foi adicionado separadamente durante a incubação inicial o parasitismo aumentou em relação ao controle. Quando o siRNA foi adicionado houve diminuição na expressão de IGF-I e consequentemente diminuição no parasitismo em relação ao controle. Os resultados obtidos sugerem um papel importante de IGF-I na infecção de macrófagos peritoneais de camundongos murinos por Leishmania (l.) amazonensis. / In Leishmania infection the immune response begins soon after the inoculation of promastigotes in the individual. In this context will be the participation of several factors of the innate immune response that will direct to an adaptive immune response responsible for the evolution of the disease. One of these factors that participates in this parasite-host interaction is the insulin-like growth factor I (IGF-I). It has been shown that extrinsic IGF-I favors parasite proliferation and infection progression. However, IGF-I is constitutively present in macrophages. In this work we evaluated the expression of IGF-I, parasitism and nitric oxide production in murine macrophages infected with Leishmania (L.) amazonensis and the effect of IGF-I inhibition on parasitism after IGF-I silencing by RNA from interference. Peritoneal macrophages were infected for 2 and 4 hours with L. (L.) amazonensis promastigotes in the presence of 5% fetal bovine serum (FBS) and 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA) in the presence or absence of IGF-I small-interfering RNA (siRNA) and liposome (Lipo). Cells were washed and then maintained in culture medium for 24, 48 and 72 h. When the recombinant IGF-I was added separately during the initial incubation the parasitism increased relative to the control. When the siRNA was added there was a decrease in IGF-I expression and consequently a decrease in parasitism in relation to the control. The results obtained suggest an important role of IGF-I in the infection of murine mouse peritoneal macrophages by Leishmania (L.) amazonensis.

Nas leishmanioses, sabe-se que tanto na resistência quanto na suscetibilidade à infecção, a resposta imune celular é considerada a mais importante. No entanto, na fase inicial, fatores inespecíficos estão sendo considerados fundamentais na determinação do curso da doença, como o fator de crescimento insulina-símile I (\"insulin-like growth factor\"-IGF-I). Em trabalhos anteriores realizados no grupo de pesquisa da Profa. Dra. Hiro Goto mostraram que IGF-I extrínseco favorece a proliferação do parasito e progressão da infecção, com diminuição na produção de óxido nítrico e ativação da arginase de macrófagos e do parasito. Sabendo que os macrófagos produzem intrinsecamente IGF-I, avaliamos o efeito do fator intrínseco no parasitismo em macrófagos de camundongos BALB/c infectados por L. (L.) infantum silenciando a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de IGF-I na célula pela técnica de RNA de interferência (siRNA). Iniciamos avaliando a expressão do mRNA de IGF-I e do seu receptor (IGF-IR). Foi observado uma diminuição de 1,4 vezes da expressão do mRNA de IGF-I em 24 horas e um aumento de 1,5 vezes em 48 horas quando comparado com o grupo controle. Também foi observado um aumento na expressão de mRNA do receptor de IGF-I em 24 como em 48 horas nos grupos infectados quando comparado com o grupo controle. Com o silenciamento do IGF-I por siRNA, houve diminuição da expressão de mRNA do IGF-I no macrófago em torno de 71% em 24 horas e de 51% em 48 hora. Na ausência ou diminuição do IGF-I no macrófago, observou-se uma diminuição do parasitismo na infecção com promastigotas, sendo o parasitismo recuperado com a reposição de IGF-I extrínseco no sistema, atestando a importância de IGF-I na proliferação do parasito. Esses resultados reforçam a importância do IGF-I na infecção por L. infantum, sugerindo que o IGF-I está diretamente relacionado ao parasitismo. / In leishmaniasis, it is known that in both resistance and susceptibility to infection, the cellular immune response is considered the most important. However, in the initial phase, nonspecific factors are being considered as fundamental in determining the course of the disease, such as insulin-like growth factor I (IGF-I). Studies carried out in the research group of Profa. Dr. Hiro Goto showed that extrinsic IGF-I favors parasite proliferation and infection progression, with decrease in nitric oxide production and activation of arginase of macrophages and parasite. It is known that macrophages produced IGF-I (intrinsic IGF-I), thus, in the present study we have investigated the effect of the intrinsic factor in the parasitism on macrophages of BALB/c mice infected with L. (L.) infantum by silencing the expression of messenger RNA (IGF-I mRNA) in the cell by the interference RNA technique (siRNA). We started evaluating the expression of IGF-I mRNA and its receptor (IGF-IR). A 1.4-fold decrease in IGF-I mRNA expression was observed in 24 hours and a 1.5-fold increase in 48 hours as compared to the control group. An increase in mRNA expression of the IGF-IR was also observed in 24 as well as in 48 hours in the infected groups as compared to the control group. With IGF-I silencing by siRNA, there was a decrease in IGF-I mRNA expression in the macrophage around 71% in 24 hours and 51% in 48 hours. In the absence or decrease of IGF-I in the macrophage, a decrease in the parasitism in the infection with promastigotes was observed, and the parasitism recovered with the replacement of extrinsic IGF-I in the system, confirming the importance of IGF-I in the proliferation of the parasite. These results reinforce the importance of IGF-I in L. infantum infection, suggesting that IGF-I is directly related to the parasitism.

O tecido reparativo de alvéolos de extração foi proposto como material de enxerto no tratamento de defeitos periodontais e a adição de fatores de crescimento aos alvéolos de extração melhoraria o potencial regenerativo deste tecido quando utilizado como enxerto. O objetivo deste trabalho foi avaliar qualitativamente, por meio de análise imuno-histoquímica, a reparação de defeitos agudos de furca classe II após o enxerto deste tecido. Foram extraídos os segundos e terceiros pré-molares superiores de 4 cães. Nos alvéolos resultantes foram aplicados fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) e fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), na concentração de 6 !g/ml cada. Após cinco dias, 24 defeitos agudos (12 controles e 12 testes) foram criados nos segundos, terceiros e quartos pré-molares inferiores. Apenas os sítios teste receberam o enxerto. Os retalhos foram posicionados coronariamente em ambos os lados e suturados. Após 45 dias, os espécimes foram analisados, em um plano vestíbulo-lingual, por meio de técnica imuno-histoquímica para osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP) e osteonectina (ONC). Nos tecidos periodontais originais, a marcação para os anticorpos testados foi fracamente positiva para a matriz extracelular (MEC), caracterizando a presença de tecidos maduros. Já no interior dos defeitos, houve diferença na marcação entre grupos, com marcação mais pronunciada para BSP e OPN no grupo controle, evidenciando uma maior atividade metabólica neste grupo, sugerindo que os tecidos reparativos do grupo teste já se encontravam em uma fase mais avançada do processo de reparação. / The tissue from healing extraction sockets is considered an excellent bone grafting material in the therapy of periodontal defects and the association of growth factors to the extraction sockets would increase the regenerative potential of this tissue when utilized as a bone graft. The aim of this investigation was to evaluate qualitatively the healing of acute class II furcation defects when grafted with granulation tissue from healing extraction sockets previously treated with an association of platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) and insulin-like growth factor-I (IGF-I), both in a concentration of 6 !g/ml. The second an third upper premolars of four dogs were extracted and the growth factors were applied into the sockets. After a healing period of five days, 24 class II furcation defects (12 tests and 12 controls) were surgically created at the buccal surface of the second, third and fourth mandibular premolars. The 12 experimental sites were grafted with the tissue from the healing sockets, while the 12 control sites healed without any graft. The flaps were coronally positioned and sutured. After 45 days, tissues were analyzed by immunohistochemistry for osteopontina (OPN), bone sialoprotein (BSP) and osteonectina (ONC), in a buccal-lingual plane. Histologically, healing occurred similarly in both groups. Pristine periodontal tissues extracellular matrix stained faintly for the tested antibodies, which characterized the presence of mature tissues. The staining of test and control healing tissues showed a more intense metabolic activity of the control group. This fact suggests that the tissues in the treated defect of test group were already in a more advanced phase of the repair process.

IGF-I induz proliferação e diferenciação celular. Neste estudo visamos sua participação na imunidade específica na leishmaniose. Estudamos efeito de citocinas Th1 (IFN-g) e Th2 (IL- 4 mais IL-13) na modulação da produção de IGF-I e seu reflexo no parasitismo de macrófago (MØ) de camundongos BALB/c e C57BL/6, infectados por amastigotas e promastigotas de Leishmania (L.) major. Iniciamos avaliando os efeitos de IGF-I no modelo, onde no desenvolvimento da lesão IGF-I induziu aumento maior de lesão em camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 o efeito foi marcante com evolução progressiva da lesão enquanto que sem o fator, a lesão se controlava. Como a produção de IGF-I por MØ é modulada por citocinas, onde IFN-g diminui e IL-4 e IL-13 aumentam a sua expressão, fomos estudar seus efeitos no modelo proposto onde MØ foram infectados com amastigotas ou promastigotas de L.(L.) major (parasitos/célula = 2:1) e incubados com IFN-g (200U/mL) ou IL-4 (2ng/mL) mais IL-13 (5ng/mL). IFN-g induziu aumento significante na produção de NO nos dois modelos estudados. O efeito de citocinas Th1 e Th2 sobre o parasitismo em MØ foi distinto em BALB/c e C57BL/6. Quando infectados por amastigotas, o parasitismo aumentou sob estímulo com IL-4 mais IL-13 e diminuiu com IFN-g como era esperado. No entanto, quando infectado por promastigota, o parasitismo aumentou com IL-4 mais IL-13 somente em células BALB/c. Por outro lado, o parasitismo diminuiu com IFN- g somente em células C57BL/6. Mesmo na ausência do estímulo por citocinas, observou-se aumento na expressão de RNA de IGF-I nos MØ de animais BALB/c infectados por formas amastigotas ou promastigotas e de C57BL/6 infectados por promastigotas. Um resultado destoante foi à diminuição da expressão de IGF-I em MØ de C57BL/6 infectados por amastigotas. Em células BALB/c, essa expressão aumentada de IGF-I ocorrida em função da infecção, somente se alterou com IL-4 mais IL-13 quando infectadas por amastigotas. Em células C57BL/6, a expressão aumentada de IGF-I com a infecção por prormastigota, sofreu diminuição sob estímulo com IFN-g, não se alterando com citocinas Th2. A expressão diminuída de IGF-I com a infecção por amastigotas diminuiu ainda mais com IFN-g e aumentou com citocinas TH2. Os dados sugerem a possibilidade de modulação do efeito de citocinas pela expressão diferenciada de IGF-I em macrófagos infectados por L. (L.) major / Insulin-like growth factor (IGF)-I induces cell proliferation and differentiation. In this study, we focused on its participation on specific immunity. We studied the effect of Th1 (IFN-g) and Th2 (IL-4 plus IL-13) cytokines on the modulation of the production of IGF-I and its influence on BALB/c and C57BL/6 macrophage (MØ) parasitism using Leishmania (L.) major amastigote and promastigote. IGF-I expression was increased in infected macrophages. Initially, we substantiated the effect of IGF-I on in vitro growth of Leishmania (L.) major promastigote, on cutaneous lesion development in vivo and diminished production of nitric oxide in MØ. On development of the lesion, IGF-I induced greater increase of the lesion in BALB/c mice. In C5BL/6 mice, its effect was more pronounced with progression of the lesion whilst without the factor it was controlled. Since IGF-I production by MØ is modulated by cytokines where IFN-g decreases and IL-4 plus IL-13 increase its expression, we studied their effects in BALB/c and C57BL/6 MØ. Macrophages were infected with L.(L.) major amastigotes or promastigotes (parasites/cell = 2:1) and incubated with IFN-g (200U/mL) or IL-4 (2ng/mL) plus IL-13 (5ng/mL). IFN-g induced a significant increase of NO production by MØ from both models. The effect of Th1 and Th2 cytokines on parasitism was distinct when MØ infected with amastigotes, the parasitism increased upon IL-4 plus IL-13 stimuli and diminished with IFN-g as expected. However, when infected with promastigotes, the parasitism increased with IL-4 plus IL-13 only in BALB/c cells. Conversely, the parasitism diminished with IFN-g only in C57BL/6. Even in the absence of cytokine stimuli, an increase of the expression of IGF-I mRNA was observed in L (L.) major amastigote- and promastigote- infected BALB/c MØ and in promastigoteinfected C57BL/6 MØ. A dissonant result was a diminished IGF-I expression in amastigoteinfected C57BL/6 MØ. In BALB/c this increased IGF-I expression with infection only altered with IL-4 plus IL-13 in amastigote-infected cells. In C57BL/6 cells, the increased IGF-I expression upon prormastigote infection diminished under IFN-g stimulus that was not altered with Th2 cytokines. A decreased IGF-I expression with amastigote-infection diminished even more with IFN-g and increased with Th2 cytokines. These data suggest a possibility of modulation of the effect of cytokines on distinct expression of IGF-I in L. (L.) major-infected MØ

Os acrocórdones (AC) são fibromas cutâneos pedunculados, de 2 a 6mm, encontrados, mais frequentemente, nas áreas de dobras de pele. Aventa-se que a insulina ou fatores de crescimento de insulina símile (IGF-1) sejam implicados na etiopatogenia dos AC. Sendo assim, foi sugerida a associação dessas lesões com a resistência à insulina (RI). O peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) é uma incretina com ação insulinotrópica e mostrou-se aumentado em pacientes obesos e diabéticos, porém nunca foi demonstrado na pele de pacientes com AC. O estudo da expressão tecidual de fatores de crescimento e incretinas na pele de pacientes com AC, confrontando com parâmetros de RI no sangue periférico, poderão vir a se tornar importantes ferramentas de investigação de em quais cenários clínicos os achados dermatológicos poderiam ou não implicar na necessidade de uma propedêutica laboratorial na detecção da RI. Os objetivos do estudo foram: Identificar a expressão do GIP e IGF-1 nas lesões de AC e na pele sã (sem lesões) dos mesmos pacientes, bem como na pele de pacientes sem acrocórdones (indivíduos controles) por meio de análises imunoistoquímicas, correlacionando esta expressão com o fenômeno de resistência a insulina. Foram estudados 57 pacientes com AC e comparou-se os resultados bioquímicos com grupo controle composto por 16 pacientes sem AC. Realizaram-se as reações imunoistoquímicas para o GIP e IGF-1 na pele de AC, na pele dos pacientes com AC em área não acometida por lesões e na pele controle remanescente de cirurgia plástica. Os resultados mostraram que os exames bioquímicos como glicemia, insulina, triglicerídeos e gama glutil aminotransferase (GGT) estavam aumentados no grupo com AC, bem como o índice HOMA-IR. A imunomarcação pelo IGF-1 não diferiu na pele dos 3 grupos, enquanto a imunomarcação do GIP na pele com AC foi maior que nor outros 2 grupos (controle e normal), com p<0.05. Quando o grupo de AC foi dividido em indivíduos com RI e sem RI, não houve diferença estatística na marcação do IGF-1, mas a marcação do GIP na epiderme foi menor nos pacientes que apresentavam RI / Acrochordons (AC) are pedunculated fibromas of the skin, 2 to 6mm found more often in areas of skin folds. It is suspected that insulin or insulin growth factor (IGF-1) are implicated in the pathogenesis of AC. Therefore, it was suggested that these lesions are associated with insulin resistance (IR). The glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP) is an incretin with insulinotropic action and was increased in obese and diabetic patients, but has never been demonstrated in the skin of patients with AC. The study of tissue growth factors and incretins in the skin of patients with AC, confronting with IR parameters in peripheral blood, are likely to become important research tools for in wich clinical scenarios the dermatological findings might or might not result in the need of laboratory methods for the detection of IR. The study objectives were: to identify the expression of IGF-1 and GIP in AC lesions and healthy skin (no injuries) from the same patients as well as in the skin of patients without acrochordons (control subjects) by immunohistochemical analysis, correlating this expression with the phenomenon of insulin resistance. We studied 57 patients with AC and compared the biochemical results with the control group consisted of 16 patients without AC. Immunohistochemistry for GIP and IGF-1 was performed in the skin of AC, in the skin of patients with AC in the area not affected by the skin lesions and in control skin group remaining plastic surgery. The results showed that the biochemical tests as blood glucose, insulin, triglycerides and gamma glutil aminotransferase (GGT) were higher in the group with AC, and the HOMA-IR index too. The IGF-1 expression did not differ in the skin of the 3 groups, whereas GIP expression of skin with normal AC was higher than the other 2 groups (control and normal), with p <0.05. When the AC group was divided into individuals with and without IR, there was no difference in IGF-1 marking, but the marking on the skin of GIP was lower in patients with IR

O tecido reparativo de alvéolos de extração foi proposto como material de enxerto no tratamento de defeitos periodontais e a adição de fatores de crescimento aos alvéolos de extração melhoraria o potencial regenerativo deste tecido quando utilizado como enxerto. O objetivo deste trabalho foi avaliar qualitativamente, por meio de análise imuno-histoquímica, a reparação de defeitos agudos de furca classe II após o enxerto deste tecido. Foram extraídos os segundos e terceiros pré-molares superiores de 4 cães. Nos alvéolos resultantes foram aplicados fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) e fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), na concentração de 6 !g/ml cada. Após cinco dias, 24 defeitos agudos (12 controles e 12 testes) foram criados nos segundos, terceiros e quartos pré-molares inferiores. Apenas os sítios teste receberam o enxerto. Os retalhos foram posicionados coronariamente em ambos os lados e suturados. Após 45 dias, os espécimes foram analisados, em um plano vestíbulo-lingual, por meio de técnica imuno-histoquímica para osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP) e osteonectina (ONC). Nos tecidos periodontais originais, a marcação para os anticorpos testados foi fracamente positiva para a matriz extracelular (MEC), caracterizando a presença de tecidos maduros. Já no interior dos defeitos, houve diferença na marcação entre grupos, com marcação mais pronunciada para BSP e OPN no grupo controle, evidenciando uma maior atividade metabólica neste grupo, sugerindo que os tecidos reparativos do grupo teste já se encontravam em uma fase mais avançada do processo de reparação. / The tissue from healing extraction sockets is considered an excellent bone grafting material in the therapy of periodontal defects and the association of growth factors to the extraction sockets would increase the regenerative potential of this tissue when utilized as a bone graft. The aim of this investigation was to evaluate qualitatively the healing of acute class II furcation defects when grafted with granulation tissue from healing extraction sockets previously treated with an association of platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) and insulin-like growth factor-I (IGF-I), both in a concentration of 6 !g/ml. The second an third upper premolars of four dogs were extracted and the growth factors were applied into the sockets. After a healing period of five days, 24 class II furcation defects (12 tests and 12 controls) were surgically created at the buccal surface of the second, third and fourth mandibular premolars. The 12 experimental sites were grafted with the tissue from the healing sockets, while the 12 control sites healed without any graft. The flaps were coronally positioned and sutured. After 45 days, tissues were analyzed by immunohistochemistry for osteopontina (OPN), bone sialoprotein (BSP) and osteonectina (ONC), in a buccal-lingual plane. Histologically, healing occurred similarly in both groups. Pristine periodontal tissues extracellular matrix stained faintly for the tested antibodies, which characterized the presence of mature tissues. The staining of test and control healing tissues showed a more intense metabolic activity of the control group. This fact suggests that the tissues in the treated defect of test group were already in a more advanced phase of the repair process.