Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_TatianeCristinadeAraujo_M.pdf: 6446233 bytes, checksum: b7dca032457cdd61b13fb51d4cca6714 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2) desempenham importante papel no metabolismo de lipídios de membrana e estão intimamente relacionadas com a liberação de ácido araquidônico (AA), derivado dos lisofosfolípideos e estão presentes em diversos venenos extraídos de animais peçonhentos. A crotoxina é um composto extraído de venenos de cascavel e é constituída pela crotapotina e pela PLA2. A homologia das PLA2 de venenos com as dos mamíferos têm sido de grande utilidade no estudo de identificação de proteínas alvo, classificação de receptores de PLA2 endógenas e estudos funcionais de diferentes tecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da crotoxina-like, extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus collilineatus, e suas subunidades sobre a secreção de insulina por ilhotas de Langerhans, visando elucidar os mecanismos que estariam envolvidos na modulação da secreção de insulina em presença de diferentes agentes. Em experimentos realizados em ilhotas de Langerhans de ratos Wistar verificou-se que a crotoxina potencializa a secreção de insulina estimulada por 16.7 mM de glicose e este efeito é devido à subunidade PLA2 presente nesta toxina,uma vez que a crotapotina não afetou a secreção de insulina estimulada por glicose. Além disso, a PLA2 do veneno induziu aumento da secreção de insulina de maneira dose-dependente. A adição de glicose marcada na ausência de PLA2 induziu um aumento de liberação de 14CO2 de 30 ± 0.6 pmol/ilhota/90 min que foi similar aos valores obtidos na presença de PLA2 (32 ±1. 7 pmol/ilhota/min) Nifedipina (10 mM), um bloqueador de canais de cálcio, reduziu a secreção de insulina estimulada por potássio, mas não afetou a potencialização da secreção de insulina pela PLA2. O bloqueador de canais de sódio, tetrodotoxina (TTX) na concentração de 10 mM não alterou o aumento da secreção de insulina induzido pela PLA2. A quelação de cálcio extracelular por EGT A (0,5 mM) também não afetou a potencialização da secreção de insulina nas ilhotas de Langerhans de ratos estimulada pela PLA2. Estes resultados mostram que os mecanismos pelos quais a PLA2 eleva a secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos não envolvem o metabolismo da glicose, a ativação de canais de cálcio e sódio e a participação direta dos íons cálcio do meio extracelular. No entanto, a secreção de insulina potencializada pela PLA2 foi significativamente atenuada tanto pela incubação prévia das ilhotas de Langerhans com heparina (5 UI/m1) quanto pela adição de dexametasona (5 e 10 mM). Paralelo a potencialização da secreção de insulina, um aumento significativo do efluxo de ácido araquidônico foi observado em ilhotas de Langerhans de ratos em presença de PLA2. Assim, estes achados sugerem que a potencialização da secreção de insulina induzida pela PLA2 em baixa concentração ou concentração supralimiar de glicose está possivelmente relacionada com a mobilização de ácido araquidônico / Abstract: The crotoxin results from phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin interaction. The PLA: acts in the membrane phospholipids generating arachidonic acid (AA). Venom PLA2 has been used as a pharmacological tool to identify target protein, mammalian receptor, and physiological cellular function. Therefore, the aim of this work was to study the role of crotoxin-like from Crotalus durissus colfjfjneatus and its subunits on the insulin secretion of the isolated rat Langerhans islets. Also, we investigated the underlying mechanisms by which the venom PLA2 would evoke insulin secretion in the presence of insulinotropic agents. Our experiments demonstrated that insulin secretion was potentialized by crotoxin in a dose-dependent manner in presence of low and high glucose concentration and this effect is related to PLA2. Neither glucose metabolism nor ionic channels (Ca+2 and Na+ channels) are involved in the enhancement of insulin secretion induced by PLA2 in isolated Langerhans islets since label glucose, nifedipine (10 mM) and tetrodotoxin (10 mM) did not affect this response. EGT A also did not interfere with the potentiation of insulin secretion induced PLA2 showing that extracellular calcium is not directly involved in this phenomenon. However, heparin and dexametasone significantly attenuated the increase of insulin secretion in response to PLA2.Moreover, the efflux of AA was markedly increased in parallel to enhancement of insulin secretion in isolated rat Langerhans islets. In conclusion, these findings show that the potentiation of insulin secretion induced by PLA2 in presence of glucose may be related to AA mobilization of Langerhans islets from rats / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Elza Olga Ana Muscelli Berardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:01:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_IaraChavesPereirade_M.pdf: 857225 bytes, checksum: a62e9451f52f29778242e9e8b2d448db (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da terapia de reposição hormonal, em mulheres na pós-menopausa, sobre o metabolismo dos carboidratos, a composição corporal, o gasto energético e o perfil lipídico. Participaram do estudo 25 mulheres portadoras de sobrepeso ou obesidade, assintomáticas, não diabéticas ou hipertensas e que não faziam uso de medicações que sabidamente alteram o metabolismo da glicose. O grupo foi subdividido em: CASO ¿ formado pelas participantes que faziam uso de reposição hormonal combinada por via oral, na dose de 5 mg/d de acetato de alfamedroxiprogesterona e 0,625 mg/d de estrogênios conjugados continuamente (idade: 55,6 ± 4,3 anos; IMC: 28,9 ± 2,2 kg; n=15) e Controle (CT) - composto por voluntárias que não faziam uso de reposição hormonal (idade: 54,9 ± 3,1 anos; IMC: 29,7 ± 3,7 kg; n=10). A composição corporal foi avaliada através da bioimpedância elétrica e a tolerância à glicose pelo teste de tolerância oral à glicose (75g). O clamp euglicêmico hiperinsulinêmico, com infusão contínua de insulina a 40mU/m2 de superfície corporal, foi usado para investigar a sensibilidade à insulina. Calorimetria indireta foi realizada em jejum e associada ao clamp. Foram ainda avaliados o perfil lipídico, uricemia e leptina sérica em todas as participantes. A composição corporal (massa magra/massa adiposa) foi semelhante nos grupos e observou-se uma tendência a maior circunferência da cintura, usada como índice de centralização da gordura, no grupo CT. Não foram evidenciadas diferenças no perfil lipídico entre os grupos e a uricemia tendeu a ser maior no grupo CT. A leptina, com valores séricos similares nos grupos, foi principalmente relacionada ao IMC e à percentagem de gordura corporal. A resposta glicêmica foi maior no grupo CT do que no CASO (1083 ± 115 vs. 971 ± 120 mmol/l.2h; p=0.04), embora a glicemia de jejum fosse semelhante. Apesar dos valores da insulinemia em jejum e após estímulo com glicose serem mais elevados no grupo controle, a diferença não alcançou significância estatística (p=0,08). Observamos que não houve diferença de sensibilidade à insulina entre os grupos, que comparativamente a estudos prévios foram resistentes à ação insulínica (M value -µmol/kg.min = 21.8 ± 8.4 e 21.1 ± 8.5 em CASO e CT, respectivamente). O gasto energético basal, corrigido pelo peso corporal ou pela massa magra não diferiu entre os grupos e aumentou durante a infusão de insulina, de forma não significativa. O aumento do quociente respiratório durante o período steady state do clamp vs. Período basal foi significativo e similar entre os grupos, assim como a oxidação de glicose. A oxidação protêica não se modificou durante a infusão de insulina, enquanto a redução da oxidação lipídica foi significativa em ambos os grupos. Ocorreram reduções, similares nos 2 grupos, da pressão arterial diastólica e do potássio sérico durante a infusão de insulina. Em regressão linear stepwise verificou-se que a cintura foi o principal determinante da sensibilidade à insulina, que por sua vez foi o principal determinante da insulinemia de jejum e após sobrecarga oral de glicose. Concluímos que, apesar de não haver diferenças significativas entre os grupos em relação à sensibilidade à insulina, verificou-se nas participantes do grupo CT maiores níveis de glicemia em resposta à ingestão de glicose. Desta forma, a reposição hormonal exerceria um papel benéfico no metabolismo da glicose e na distribuição da gordura corporal. Há, no entanto, necessidade de novos estudos, com um maior número de participantes, para confirmar esta hipótese / Abstract: To examine the relationship between insulin sensitivity and hormone replacement therapy in postmenopausal women, twenty-five overweight or obese volunteers were evaluated. Of them, 15 (55.6 ± 4.3 years; BMI: 28.9 ± 2.2 kg.m2) were under hormone replacement therapy (HRT) and 10 (54.9 ± 3.1 years; BMI: 29.7 ± 3.7 kg.m2) were not (CT). None of them was under other therapy known to affect insulin action or secretion and, diabetic and hypertensive patients were excluded. Body composition was measured using bioelectrical impedance. All participants were submitted to an oral glucose tolerance test (75g of glucose) and to evaluation of the lipid profile, leptin and uric acid serum levels. Indirect calorimetry was performed to assess energy expenditure, oxidative and non-oxidative glucose disposal and lipid and protein utilization during insulin clamp. Insulin sensitivity was evaluated in 18 of these women using the euglycemic hyperinsulinemic clamp ¿ insulin infusion of 40mU/ min.m2 for 2 hour. Body composition (fat/free fat mass) was similar, while waist tended to be higher in the control group. Hormone replacement did not influence leptin levels, plasma lipids or fasting plasma glucose while there was a trend to lower serum uric acid levels in the HRT group. Glucose area under the curve in the oral glucose tolerance test was higher in the control group (1083 ± 115 vs. 971 ± 120 mmol/l.2h; p=0.04), while fasting plasma insulin and insulin area under the curve tended to be higher in this group (p=0.08). Insulin sensitivity was similar in both groups: M value (µmol/kg.min) = 21.8 ± 8.4 (HRT) and 21.1 ± 8.5 (CT), as well the oxidative and non-oxidative glucose disposal, lipid oxidation reduction and protein oxidation. M value was inversely associated to BMI, % body fat and mainly to waist. In addition, it was the main determinant of insulin levels at fasting state or after oral glucose load. Energy expenditure normalized to body weight or to free fat mass, in the fasting state and under insulin infusion, was similar in the groups. The glucose induced thermogenesis was not significant, while the respiratory quotient increased significantly during the steady state period of the clamp in both groups. It was observed a decrease in diastolic blood pressure and an increase in the heart rate during the OGTT and during the insulin clamp similar to the groups. Concluding, it is possible that HRT acts on glucose metabolism improving the response to a glucose load, even though it does not improve insulin sensitivity in obese and overweight postmenopausal women. And a high frequency of glucose intolerance with normal fasting plasma glucose was observed in these women. The results suggest that obesity and body fat distribution are the main factors influencing insulin action in the studied group, blunting any possible HRT effect / Mestrado / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Aloisio Jose Bedone / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T07:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grassiotto_OswaldodaRocha_D.pdf: 499727 bytes, checksum: ff9ab0f41ebec5d1a767199ee2ecdef7 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado

Orientadores: Maria Beatriz Puzzi Taube, Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T14:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pires_FernandaEspinosa_M.pdf: 2161075 bytes, checksum: 364c4c8044d9ce8ac17ea12e73f17c02 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A Acantose Nigricante (AN) benigna está associada a diversas endocrinopatias e alterações metabólioa., particularmente a resistencia insulinica. A dermatose " encontrada mais freqüentemente nos pacientes obesos, e obesidade é uma condição de resistência insulínica. Alguns trabalhos têm mostrado associação de resistência insulínica com presença de depósito de mucopolissacárides na derme papilar em cortes histológicos de AN. Este estudo foi realizado com o objetivo de se avaliar a resposta insulínica após o teste oral de tolerância à glicose (TaTO) em obesos com AN e comparar com grupos controle, além de correlacionar com os aspectos histopatológicos e histoquímicos. Para tanto, foram avaliados 33 pacientes: 14 Obesos com AN (Grupo 1), 9 Obesos Normais (Grupo 2), e um grupo controle de 10 pacientes com peso normal. Para o estudo histológico, foi possível obter análise de 13 pacientes obesos com AN, 8 pacientes obesos sem AN e 9 pacientes de peso normal. Foram avaliados os níveis de insulina ao jejum, aos 120', a área sob a curva de insulina e os índices insulinogênicos (O', 120' e área). Biópsias de pele foram analisadas pela coloração pelo ferro coloidal para pesquisa de mucopolissacárides na lesão cutânea e nos grupos controle, na mesma região anatômica. Os resultados mostraram diferença significativa na insulina aos 120' do TaTG entre os grupos 1 e 2 (p<0,05), e o índice insulinogênico aos 120' mostrou valores muito próximos do limite da significância estatística (p=0,053). Ao estudo de correlação, quando analisados os 3 grupos em conjunto, foi observado correlação linear positiva entre níveis de insulina (120', índice insulinogênico aos 120', área de insulina e índice de área de insulina) e espessura da epiderme e camada córnea(p<0,05) e entre medidas da papila e índice de área de insulina (p<0,05). Não houve diferenças à coloração pelo ferro coloidal na área da AN, comparada com os grupos controle. Pacientes obesos sem AN apresentaram maior área de insulina (p<O,05) quando comparados com pacientes magros sem AN, a despeito das medidas do epitélio e papila serem próximas, o que sugere que níveis altos de insulina isoladamente não justificam a lesão dermatológica.Conclui-se que obesos com AN apresentam resistência insulínica maior que obesos sem AN, que a resistência insulínica não está associada à maior presença de mucopolissacárides na derme e que níveis sangüíneos de insulina estão associados à espessura da epiderme e camada córnea. Em contrapartida, níveis altos de insulina isoladamente não justificam a lesão dermatológica. A presença de mucopolissacárides na derme papilar na região da axila mostrou ser esse um achado normal. O presente trabalho sugere influência da insulina no crescimento epitelial. Palavras-chave: Acantose Nigricante, Resistência Insulínica, Obesidade, Ferro Coloidal, Mucopolissacárides / Abstract: Benign Acanthosis Nigricans (AN) is associated to many endocrinopathies and metabolic disturbs, specially insulin resistance. The dermatosis is more ftequently found in obese patients, and obesity is a condition of insulin resistance. Some papers have shown allociatiôn ôf inlulin reli'tanoê e:rtd preliênoe of muoopolyaacoharidês in detmiíl on histological slides of AN. This study was performed to. evaluate the insulin response to the oral test of glucose tolerance in obese patientes with AN comparing with control groups, and to correlate it with histopathological and histochemical findings. For this purpose, 33 patientes were studied in 3 groups: 14 obese with AN (Group 1),9 normal obese (Group 2) and 10 nomallean (qt"oup 3). For histological analyzes, 13 patients were studied in group I,' 8 patients in group 2 and 9 patients in group 3. Insulin levels at O', 120', insulin area, insulinogen index'(at O', 120' and area) were evaluated. Skin biopsies were performed by the colloidal iron method to evaluate mucopolysaccharide presence in skin lesions of AN and incontrol. groups, in the same anatomic site. There was statistically difference on insulin of 2 hours after glucose overload between groups 1 and 2 (p<0,05), and the insulinogen index of 2 hours after glucose overload were near the significance limit (p<0,053). When the 3 groups were analysed together, there was positive linearcorrelation between insulin levels (at 120', insulinogen index at 120', insulin area and insulinogen index of area) and epitheliuÍn and homy layer thickness (p<0,05), and between papilla measurement and area insulinogen index. There wasn't difference at colloidal iron staining in AN slides, comparing with control groups. Obese patients without AN shows higher instllin area, comparing with lean patients without AN (p<0,05) in spite of close epithelium and papilla measurements, wich is suggestive that only high insulin levels does not justify the dermatologic lesion. In conclusion, obese patients with AN shows more insulin resistance than obese patients without AN, insulin resistance is not associated to more amount of mucopolysaccharides in dermis and insulin levels are correlated to . epithelium and homy layer thickness. In counterpart, on1y lúgh insulin levels does not justify the dermatologic lesion. Mucopolysaccharides in dermal papilla ofaxilar region is a normal finding. Tlús work suggests insulin influence on epithelial growth. Keywords: Acanthosis Nigricans, Mucopolysaccharides, Insulin Resistance, Obesity, Colloidal Iron / Mestrado / Mestre em Medicina

Orientadores: Carla Roberta O. Carvalho, Debora de Queiroz Tavares / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-25T16:35:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bezerra_RosangelaMariaNeves_D.pdf: 3623488 bytes, checksum: d3f1edf07d469480dc4fd305aa42682f (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A interação da insulina com o seu receptor, estimula a porção tiro sina quinase do receptor, levando à autofosforilação e a fosforilação de substratos citossólicos, substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) e substrato 2 do receptor de insulina (IRS-2). Estes substratos fosforilados associam-se a proteínas com domínio SH2. Ratos alimentados com dieta rica em frutose são um modelo experimental já descrito de resistência à insulina, hipertriacilgliceridemia, hiperinsulinemia e hipertensão. Entretanto, o mecanismo molecular envolvido na resistência à insulina ainda não foi totalmente esclarecido. Neste estudo, utilizando da técnica de imunoprecipitação e "im.munoblotting", avaliamos a quantidade protéica e o grau de fosforilação, após estimulo insulínico, do receptor de insulina (IR) e do IRS-l, bem como a associação do IRS-1 com a PI 3-quinase e IRS-1 com a fosfotirosina fostatase (SHP2) em figado e músculo de ratos alimentados com dieta rica em frutose. Não houve mudanças na concentração do receptor de insulina e do IRS-l em figado e músculo dos animais alimentados com dieta rica em frutose. Entretanto, o grau de fosforilação do receptor de insulina foi reduzido para 71 ± 2% (P<0,05) nas amostras de figado do grupo fru.tose. Nas amostras imunoprecipitadas com anticorpo anti-IRS-1 e incubadas com anticorpo antifosfotirosina, houve diminuição do grau de fosforilação para 70 ± 6% (P<0,05) e 76 ± 5% (P<0,05) respectivamente, em figado e músculo dos ratos com dieta rica em frutose. A associação IRS-1 /PI 3-quinase reduziu para 84 ± 3% (P<0,05) no figado e para 84 ± 4% (P<0,05) no músculo do grupo frutose. A associação IRS-1jSHP2, foi reduzida para 79 ± 5% (P<0,05) no figado dos animais alimentados com frutose. Esses dados sugerem que alterações nas etapas iniciais da via de sinalização da insulina podem ter significado importante no mecanismo de resistência à insulina encontrada neste modelo. Os animais alimentados por 28 dias com dieta rica em frutose apresentaram moderada resistência à insulina, demonstrada pela diminuição da velocidade de redução da glicose, e um aumento significativo da concentração de triacilglicerol sérico. Entretanto, diferentemente da maioria dos estudos, não houve alteração na concentração de insulina nem na pressão arterial destes animais comparados ao grupo controle. Como existe uma heterogeneidade na composição de gordura e sódio destas dietas, foi avaliada a influência da adição de sódio na dieta rica em frutose, na sensibilidade à insulina, na pressão arterial e no grau de fosforilação do IRS-1 no figado destes animais. A adição de sódio não teve efeito na sensibilidade à insulina medida pelo teste de tolerância à insulina curto, nem na fosforilação induzida pela insulina do IRS-l, como demonstrada pela técnica de "immunoblotting". Entretanto, a adição de sódio promoveu um aumento significativo na pressão arterial indireta dos animais controle e com dieta rica em frutose (C: 117±3 mmHg x C-Na: 141± 4 mmHg, P O,05 e F: 118 ± 3 mmHg x F-Na: 132 ± 4 mmHg, P<0,05). Esses resultados demonstram que a alimentação por 28 dias com dieta rica em frutose, não induz a hiperinsulinemia, nem a hipertensão. Essas observações sugerem que a gordura saturada e a quantidade de sódio na dieta podem agir sinergisticamente com as alterações metabólicas induzidas pela frutose, favorecendo a elevação da insulina sérica e da pressão arterial neste modelo animal. / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Doutor em Ciência da Nutrição

Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:39:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amaral_MariaEsmeriaCorezolado_M.pdf: 6060382 bytes, checksum: 26507a0b7ecf94e0eb2f7df7d7937947 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Neste trabalho, estudamos a homeostasia da glicose e a secreção de insulina em camundongos transgênicos que superexpressam a apolipoproteína CIII humana ( apo cm tg). Esses animais possuem altos níveis de ácidos graxos livres (AGL), de colesterol e de triglicérides plasmáticos em relação aos controles. Peso corporal, concentração de glicose e insulina plasmáticas, taxa de desaparecimento da glicose, após sobrecarga de insulina (Kitt), e área sob a curva glicêmica, após o Teste de Tolerância à Glicose (GTT), não diferiram entre os grupos transgênicos e controles. Contudo, animais transgênicos, que tiveram aumento adicional de AGL plasmático induzido pelo tratamento com heparina, apresentaram menor Kitt durante o Teste de Tolerância à Insulina (ITT) e maior área sob a curva glicêmica durante o GTT, quando comparados aos controles. A secreção de insulina por ilhotas isoladas de animais transgênicos e controles, expostas a concentrações basais ou estimulatórias de glicose, foi semelhante. Contudo, a secreção de insulina por ilhotas isoladas de animais transgênicos tratados com heparina, incubadas durante lSmin em presença de baixas ou altas concentrações de glicose, foi menor que em ilhotas de controles heparinizados. Após 60min de incubação, a redução da secreção da insulina das ilhotas dos transgênicos heparinizados só foi observada em presença de altas concentrações de glicose. Concluindo, a hipertrigliceridemia, per se, mesmo com moderado aumento da concentração de AGL plasmático, não modifica a homeostasia da glicose nos camundongos transgênicos para apolipoproteína CIn humana. No entanto, incremento adicional da concentração de AGL plasmático por administração de heparina, que, sabidamente, aumenta a atividade da lipoproteína lipase, alterou a homeostasia da glicose nos transgênicos. Esse efeito parece ser decorrente de uma redução na secreção de insulina, associada a um aumento de resistência periférica ao hormônio / Abstract: Glucose homeostasis and insulin secretion in transgenic mice overexpressing the human apolipoprotein CIII gene (apo cm tg) were studied. These mice have elevated plasma levels of triglycerides, ITee fatty acids (FF A) and cholesterol compared with control mice. The body weights, plasma glucose, and insulin levels, glucose disappearance rates and areas under the intraperitoneal Glucose Tolerance Test (ipGTT) curve for adult (4-8 month old) and aged (20-24 month old) apo cm tg mice were not different ITom those of control animals. However, an additional elevation of plasma FF A by treatment with heparin for 2-4 h impaired the ipGTT responses in transgenic mice compared to saline-treated mice (areas under the ipGTT curves; 18.7 :i: 1.0 mmol/L.120 min and 13.6 :i: 1.2 mmol/L.120 min for heparin- and saline-treated transgenic mice, respectively; n = 10 each; p < 0.01). The glucose disappearance rate in heparin-treated transgenic mice (2.88 :i: 0.49 %/min; n=ll) was slightly lower than in heparin-treated controls (4.12 :i: 0.46 %/min; n =10 ; P < 0.05). Glucose (22.2 mmol/L) stimulated insulin secretion in isolated islets to the same extent in saline-treated control and apo CIII tg mice. In islets ftom heparin-treated apo CIII tg mice, the insulin secretion at 2.8 and 22.2 mmol glucoseiL was lower than in heparin treated control mice. In conclusion, hypertriglyceridemia per se or a mild elevation in FF A did not affect insulin secretion or insulin resistance in adult or aged apo cm tg mice. Nonetheless, an additional elevation of FF A induced by heparin in hypertriglyceridemic mice impaired the ipGTT by reducing insulin secretion, and was probably associated with a marginal increase in insulin resistance / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / Las mitocondrias corresponden a una red organelar altamente dinámica e interconectada, mantenida por eventos frecuentes de fisión y fusión. A través de estos procesos, las mitocondrias adoptan diferentes formas en respuesta a señales internas y externas, así como también presentan diferencias de distribución y forma en los diferentes tejidos de los seres pluricelulares. En las células mamíferas, las principales reguladoras del proceso de fusión mitocondrial, corresponden a la GTPasa Mitofusina (Mfn) y la proteína de la atrofia óptica-1 (Opa-1). Aunque la disrupción de la expresión de cualquiera de ellas, disminuye la función mitocondrial, aún no está claro si la regulación fisiológica del metabolismo involucra directamente cambios en la dinámica de este organelo. Los cardiomiocitos corresponden a la unidad funcional básica del corazón, los cuales para funcionar adecuadamente necesitan del aporte continuo y elevado de sustratos metabólicos en la forma de ácidos grasos libres (AGL), glucosa y oxígeno. En el corazón, la insulina regula el ingreso de glucosa al compartimento intracelular, la velocidad de la glicólisis, la síntesis del glicógeno, así como el crecimiento, contractibilidad y sobrevida de los cardiomiocitos. Sus acciones metabólicas son mediadas por la activación del receptor de insulina (RI) y una serie de otras proteínas de señalización río abajo, entre las que se incluyen a la familia de las proteínas sustrato del receptor de insulina (IRS-1 e IRS-2), la proteína fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3-K) y la proteína serina/treonina kinasa Akt. Dado el papel crítico de insulina en el control metabólico y energético del corazón, el principal objetivo de este trabajo consistió en investigar si insulina modifica el metabolismo mitocondrial a través de la regulación de la dinámica. Trabajos recientes han mostrado alteraciones de la maquinaria proteica reguladora de estos procesos en pacientes obesos e insulino-resistentes, haciendo relevante el estudio de la señalización de insulina y su implicancia en la regulación de la morfología mitocondrial. Para probar esta hipótesis, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata se trataron con insulina 10 nM por 0 – 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Green en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microcopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número y volumen promedio de las mitoncondrias. Los resultados muestran que insulina indujo fusión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen mitocondrial promedio (+156%; p<0,001) y una disminución del número de mitocondrias por célula (-60%; p<0,001). Al mismo tiempo, estos cambios, se asociaron a un aumento en los niveles de la proteína Opa-1 (+3,7±1,5; p<0,05) y su colocalización efectiva con Mfn2. Por medio de microscopía electrónica también se observó la aparición de mitocondrias de gran tamaño en el mismo tiempo descrito anteriormente. Sin embargo, bajo estas mismas condiciones experimentales, tanto los niveles de Mfn2 y de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles. Con respecto a la regulación del metabolismo energético, insulina aumentó el potencial de la membrana mitocondrial (+21%; p<0,05), los niveles intracelulares de ATP (+28%; p<0,001) y la respiración celular (+19%; p<0,01). Paralelamente, la transducción de los cardiomiocitos con un adenovirus que codifica para un antisentido contra Mfn2 o un micro RNA dirigido a Opa-1 previno todos los incrementos metabólicos y morfológicos inducidos por insulina antes descritos. Para confirmar si estos resultados también ocurrían en un modelo in vivo, ratones silvestres C57BL6 se sometieron a un clamp euglicémico - hiperinsulinémico por 2 h, extrayéndose los corazones al término del experimento. Insulina aumentó los niveles totales de Opa-1 en el tejido cardiaco (1,8 veces; p<0,001) respecto a los controles así como la respiración (+38; p<0,05) y síntesis de ATP (+50%; p<0,05) en fibras cardiacas aisladas. Finalmente, el tratamiento previo de cardiomiocitos con inhibidores generales de la vía transduccional RI/PI3-K/Akt y del inhibidor específico del complejo mTORc1, rapamicina, previno la fusión mitocondrial inducida por insulina, Este último inhibidor también previno los incrementos en el metabolismo energético y en los niveles de Opa-1, sugiriendo un papel clave del complejo mTORc1 en la señalización río abajo activada insulina, en el control de la dinámica mitocondrial. En conclusión, estos antecedentes colectivamente indican que insulina regula el metabolismo energético en el cardiomiocito a través de un mecanismo dependiente de la fusión mitocondrial y de la vía transduccional Akt/mTORc1. / Mitochondria exist as a dynamic network of interconnected organelles that undergo frequent fission and fusion events. Through these processes mitochondria may adopt different shapes in response to internal and external signals and also display particular morphologies and distributions in the many different cell types of higher eukaryotes. In mammalian cells, the main regulators of mitochondrial fusion are the dynamin-related GTPase mitofusin (Mfn) and optic atrophy protein 1 (Opa- 1). Although a disruption in the expression of these proteins impairs mitochondrial function, it is not clear if the physiological regulation of mitochondrial metabolism directly involves changes in mitochondrial dynamics. Cardiomyocytes are the basic functional unit of the heart and in order to function properly, they require a constantly high supply of metabolic substrates in the form of free fatty acids (FFA), glucose and oxygen. In the heart, insulin regulates glucose transport inside the cell, glycolysis rate, glycogen synthesis, growth, cardiomyocyte contractility and survival. The metabolic actions of insulin are mediated through the activation of the insulin receptor (IR) and a series of downstream associated proteins, including the insulin receptor substrate family proteins (IRS-1 and IRS-2), the phosphoinositide 3-kinase (PI3-K) and the serine/threonine kinase Akt. Given the critical role of insulin in the metabolic and energetic control of heart, the goal of this study was to determine if insulin regulates mitochondrial metabolism affecting mitochondrial dynamics. Previous work from other groups had shown that obese and insulin-resistant patients have alterations in the protein machinery of mitochondrial dynamics, further implying insulin signaling in the control of mitochondrial morphology. To prove our hypothesis, cultured rat neonatal ventricular cardiomyocytes were treated with 10 nM of insulin for 0 - 24 h and three-dimensional images of cells were obtained using the mitochondrial dye Mitotracker Green and confocal microscopy. Three hours of insulin treatment promoted mitochondrial fusion as evidenced by an increase in the mean mitochondrial volume (+156%; p<0.001) and a reduction in the mitochondrial number (-60%; p<0.001). These changes were associated with both an increase in the levels of Opa-1 protein (+3.7±1.5; p<0.05) and in its effective colocalization with the protein Mfn2. By means of electronic microscopy we also observed the apparition of giant mitochondria at 3 hours of treatment. However, at these same conditions, we did not find any change in the total levels of Mfn2 or in the constitutive mitochondrial protein, mtHsp70, ruling out mitochondrial biogenesis or degradative processes. Regarding the control of metabolism, the treatment with insulin increased mitochondrial membrane potential (+21%; p<0.05), intracellular levels of ATP (+28%; p<0.001) and oxygen consumption rate (+19%; p<0.01). Transduction of cardiomyocytes with an adenovirus harboring an antisense Mfn2 oligonucleotide or a micro RNA against Opa-1 prevented all the insulin-induced changes in mitochondrial morphology and function. To confirm that these changes also occur in an in vivo model, C57BL6 mice were subjected to hyperinsulinemic-euglycemic clamps for 2 h, at the end of which, hearts were harvested. Relative to controls, insulin increased the total levels of Opa-1 protein by 1.8±0.1- fold; (p<0.001), the ADP-stimulated respiration rate (+38; p<0.05) and ATP synthesis (+50%; p<0.05) evaluated in saponin-permeabilized fibers. Finally, the pre-treatment of cardiomyocytes with general inhibitors of the insulin transduction pathway RI/PI3- K/Akt avoided the insulin induced fusion, while rapamycin, a specific inhibitor of the mTORc1 protein, inhibited fusion and also also prevented the metabolic boost and the Opa-1 protein increase observed after insulin treatment, suggesting an active role for mTORc1, downstream the canonical insulin route in the control of mitochondrial dynamics. These data indicate for first time that insulin acutely regulates mitochondrial metabolism through a mechanism that is dependent upon increased mitochondrial fusion. / FONDAP; FONDECYT; MECESUP

Orientador : Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:10:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirata_AparecidaEmiko_D.pdf: 24088044 bytes, checksum: f4e0da5215ee7434aa533149f68fc1cb (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A PTP18 atua como efetor negativo do receptor da insulina, desfosforilando o receptor e o IRS-1 e parece estar correlacionada com a sensibilidade à insulina e desenvolvimento da obesidade. No presente estudo avaliamos a associação do receptor da insulina com a PTP18 sobre a regulação da transmissão do sinal da insulina em animais obesos MSG, animais submetidos a jejum por 72h e animais tratados agudamente com adrenalina....Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Insulin is the most potent anabolic hormone known and is essential for appropriate tissue development, growth, and maintenance of whole-body glucose homeostasis. Insulin signaling is initiated by binding of insulin to the insulin receptor (IR), stimulating its tyrosine kinase activity, which, in tum triggers downstream signaling events. These include tyrosil phosphorylation of IR substrates 1 and 2 (IRS-1, IRS-2) that activate other adapter molecules such as PI3-K, PDK1 and Akt, which combined actions mediate the biological effects of insulin....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:19:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delattre_Edson_D.pdf: 8025457 bytes, checksum: ce0a341bbc8af8368dc36028f49008fd (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Investigaram-se a secreção de insulina e os efluxos de K+ e Ca2+,em ilhotas pancreáticas de rato, isoladas em seis diferentes momentos do dia (0,4, 8, 12, 16 e 20 h) Para o estudo da secreção de insulina, utilizaram-se ilhotas de ratos, alimentados ou submetidos a jejum durante 48 horas, incubadas (60 min a 37°C) em condição estática, em tampão-Krebs contendo glicose (entre zero e 27,7 mM), após pré-incubação durante 30 minutos. Os efluxos de K+ e Ca2+ foram determinados pela medida das taxas de efluxo de 86Rb e 45Ca, respectivamente, em ilhotas previamente carregadas desses traçadores e perfundidas por Krebs contendo diferentes concentrações de glicose. Ritmo diário da secreção de insulina foi observado em G 5,6 (Krebs contendo glicose [5,6 mM]) e em G 8,3, concentrações nas quais a maior secreção ocorreu no período escuro. O grupo do período escuro apresentou deslocamento, para a esquerda, da curva de secreção de insulina em resposta a glicose, com menor limiar estimulatório que o grupo do período claro. Incremento da concentração extracelular de glicose (de 5,6 para 8,3 mM) provocou maior aumento da secreção de insulina, no período escuro. o ECso das curvas de secreção de insulina foi mínimo à O h e máximo às 8h. Verificou-se correlação negativa, ao longo do dia, entre o efeito da retirada de glicose do Krebs, sobre o efluxo fracional de 86Rb, e os valores da secreção de insulina em G O. Constatou-se variação diária do efeito da supressão de glicose do Krebs, sobre o efluxo de 86Rb, com valores máximo e mínimo às 16 e 4 h, respectivamente. Jejum durante 48 horas não impediu a ocorrência de variação diária do efluxo de 86Rb. Contudo, provocou redução, tanto dos valores de parâmetros que medem esse efluxo, quanto da amplitude de variação dos mesmos, nas 24 horas do dia. Provocou, também, aparente deslocamento de fase dos parâmetros que representam o efeito da retirada de glicose do meio de perfusão. o efeito máximo de glicose (8,3 mM), ao reduzir a taxa de efluxo de 86Rb, foi observado à O h, enquanto o mínimo foi registrado às 12 h. Verificou-se significativa correlação, ao longo do dia, entre os valores da secreção de insulina e a intensidade da inibição do efluxo de 86Rb, provocada por glicose (8,3 mM). Embora se tenha constatado variação diária do efluxo de 45Ca, em G 16,7, com valor máximo às 20 h, não se observou correlação entre este parâmetro e os valores da secreção de insulina, em presença de G 16,7. Diante desses resultados, conclui-se que, em células beta de ilhotas pancreáticas isoladas de rato: A sensibilidade a glicose está diminuída no período claro. A responsividade a glicose é máxima à O h e mínima às 8 h. A secreção de insulina, estimulada por concentrações fisiológicas de glicose, é maior durante o período de atividade dessa espécie, o que decorreria do maior efeito de glicose, ao reduzir a permeabilidade a potássio, no período escuro. A ativação de canais K+ATP provocada por glicopenia é, aparentemente, mais extensa ao final do período de repouso dessa espécie. o ciclo alimentação-jejum, aparentemente, exerce efeito mascarador sobre o ritmo diário do efluxo de potássio / Abstract: This thesis examines the insulin secretion and the t<" and Ca2+ effluxes in pancreatic islets at different times of the day. Insulin secretion was measured during a 60 min incubation (37°C) of islets from fed or 48 h-starved rats. The t<" and Ca2+ effluxes were determined by measuring the rate of Rb + and Ca2+ efflux, respectively, from islets preloaded with these tracers and incubated in Krebs solution containing different concentrations (O; 2.8; 5.6; 8.3; 11.1; 16.7 and 27.7 mM) of glucose. A diary rhythm was observed in insulin secretion, with the highest release occurring during the dark period in G 5.6 (Krebs containing 5.6 mM glucose) and G 8.3. The dark period insulin secretion curve in response to glucose was shifted to the left compared with the light period response and showed a lower stimulatory threshold. Thus, the lowest ECso for stimulation by glucose was observed at 12:00 a.m. (7.8 mM) and the highest at 8:00 a.m. (12.4 mM). During the day, a negative correlation was shown between the effect of the glucose withdraw from the Krebs, on the fractional efflux of the 86Rb and the levei of insulin secretion in G O. For the former, the maximum and minimum occurred at 4:00 p.m. and 4:00 a.m., respectively. Starvation for 48 h did not inhibit the occurrence of 86Rb efflux although there was a reduction in the absolute values and in the range of variation over a 24 h period. It also induced apparent shift of phase of the parameters that represents the effect of the glucose remova I from the perfusion medium. The maximum and minimum effects of 8.3 mM glucose in reducing the efflux rate were observed at 12:00 a.m. and 12:00 p.m., respectively. Over a 24 h period, there was a significant correlation between the levei of insulin secretion and the inhibition of 86Rb efflux induced by 8.3 mM glucose. Although the efflux of 45Ca in G 16.7 peaked at 8:00 p.m., there was no correlation between this parameter and the levei of insulin secretion in thisconcentration of glucose. These results indicate that in response to physiological concentrations of glucose, beta cells of the rar s isolated pancreatic islets release more insulin during the normal activity period of the species. This higher secretion may be related to an improved ability of glucose to reduce the permeability of these ceUs to potassium during the dark period. The glycopenia-mediated activation of t(" ATP channels in rat pancreatic beta ceUs is greater at the end of this species' rest period. The feeding-starvation cycle appears to mask the daily rhythm of potassium efflux from beta ceUs / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências

Orientador: Benedito de Oliveira Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T21:32:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_JoseAugustoFerrazde_D.pdf: 9723365 bytes, checksum: 7a7e5a81f0a1e933d7b4f6a5dcb3d1bb (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O pacu Piraractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Characiformes, Characidae, Serrasalminae) é um peixe teleósteo de água doce, que no seu habitat natural alimenta-se preferencialmente de frutas. Tal qual o tambaqui Colossoma macropomum, o pacu encontra-se classificado, junto com a carpa Cyprinus carpio e o bagre americano Ictalurus punctatus, na superordem Ostariophysi. O tecido pancreático do pacu, semelhante ao tambaqui, exibe uma ilhota principal e pequenos corpos de Brockman. As ilhotas pancreáticas do pacu foram analisadas histologicamente e mostraram os quatro tipos de células endócrinas encontradas nas ilhotas de Langerhans dos mamíferos. Hormônios polipeptídeos, de um extrato de ilhotas principais de pacu, foram purificados com elevado rendimento em fase reversa de HPLC e suas estruturas primárias foram determinadas por degradação automática de Edmann. A estrutura primária da insulina do pacu, foi determinada como - Cadeia A: GIVEQCCHKPCSIFDLQNYCN; Cadeia B: NAGAPQHLCGSHLVDALYLVCGPSGFFYNPK. Em comparação com a insulina da carpa a insulina do pacu contém apenas duas substituições (Glu -+ Asp em AiS e Thr -+ Ser em B24). Comparada com a insulina humana, ambas, contém uma. extensão dipeptídica no N terminal e uma deleção do resíduo C terminal. A insulina do pacu mostrou ser idêntica à insulina do tambaqui o pâncreas do pacu, também sintetiza glucagon e GLP-1. A estrutura primária do glucagon do pacu foi estabelecida como: SEGTFSNDYSKYLETQRAQDFVQWLMNS. O glucagon do pacu difere do glucagon humano, em 7 substituições de aminoácidos e do glucagon do bagre americano por uma simples substituição na posição 17{Arg _ Gln). Um resíduo Gln, nesta posição, nunca foi observado, préviamente, para nenhum glucagon de teleosteos ou de mamíferos. A estrutura primária do peptídeo "glucagon-like" GLP) do pacu foi determinada como: HADGTYTSDVSA YLQDQAAKDFITWLKSGQPKQE. O GLP do pacu contém 34 resíduos de amino ácidos e difere do GLP do bagre americano apenas na posição 12 (Ser - Ala) e 33 (Pro - Gln). Em comum com outras espécies de teleósteos, o pacu expressa dois genes para somatostatina. A somatostatin-14, derivada da preprosomatostatina-I (PSS-I), é idêntica à somatostatina-14 dos mamíferos e do bagre americano, Um fragmento de prosomatostatina-22 mostrou 67% de identidade seqüencial com os resíduos (1-58) da preprossomatostatina (PSS-II) do bagre americano. A comparação da estrutura primária dos hormônios das ilhotas sugere que a seqüência de aminoácidos tem sido mais conservada entre os Ostariophysi que entre os outros grupos, já estudados, do taxon Euteleostei / Abstract: The fruit-eating teleost fish, the pacu Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Characiformes, Characidae, Serrasalminae), similarly to tambaqui Colossoma macropomum, is classified with the carp and the catfish in the superorder Ostariophysi. The pacu and tambaqui have the pancreatic tissue exibiting both principal islet and small Brockmann bodies (Bbs). The pacu Bbs were analyzed histologically and shown to contain four kinds of endocrine cells (A. B, C, O) found in mammalian islets of Langerhans. Hormonal polypeptide in an extract of pacu Brockmann bodies were purified to homogeneity in high yeld by reversed phase HPLC and their primary structures determined by automated Edman degradation. The primary structure of pacu insulin was established as ¿ A chain: GIVEQCCHKPCSIFDLQNYCN, B-chain: NAGAPQHLCGSHLVDALYLVCGPSGFFYNPK. Pacu and tambaqui insulin are identical, they contain only two substitutions (Glu _ Asp at A15 and Thr _ Ser at B24) compared with carp insulin. The B-chains of both insulins contain a dipeptide extension in the N terminus and a deletion of the C terminal residue compared with human insulin. The pacu pancreas also synthesizes glucagon and GLP-1. The primary structure of pacu glucagon was established as: HSEGTFSNDYSKYLETQRAQDFVQWLMNS. Pacu glucagon differs from human glucagon by 7 amino acids and from catfish glucagon by a single substitution at position 17(Arg _ Gln). A Gln resídue at this position has not been observed previously in any teleostean or mammalían glucagon. The primary structure of pacu glucagon-Iíke peptide (GLP) was established as: ADGTYTSDVSAYLQDQAAKDFITWLKSGQPKQE. Pacu GLP contains 34 amino acid residues and differs from catfish GLP only at positions 12 (Ser - Ala) and 33 (pro - Gln). In common with other teleost species, the pacu expresses two somatostatin genes. Somatostatin-14, derived from preprosomatostatin-I (PSS-I), is identical to mammalían and catfish somatostatin-14. A fragment of prosomatostatin-22 showed 67% sequence identity with residues (1-58) of catfish preprosomatostatin-II (PSS-II). A comparison of the primary structures of the islets hormones suggest that amino acid sequences may have been more conserved within the Ostariophysi than in other groups of the taxon Euteleostei, that have been studied. Isolation of these hormones will now permit an investigation of their effect on lipide and carbohydrate metabolism in the serrasalminae fishes, pacu and tambaqui / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências Biológicas