Orientador: Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T01:56:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morari_Joseane_M.pdf: 1671782 bytes, checksum: ebca1c2f8d19c88433316cd9134da3a3 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Insuficiência hepática causada por cirrose decorrente da progressão da esteato-hepatite não alcoólica é hoje uma das principais indicações para transplante hepático no mundo. A ingestão de dietas ricas em lípides é uma das principais causas de esteato-hepatite não alcoólica, e, uma vez estabelecida, poderá ou não evoluir para cirrose, dependendo da ativação de uma resposta inflamatória local. Nem todos os indivíduos que desenvolvem esteatose progridem para a esteato-hepatite. Acredita-se que, dentre os fatores que desempenham papel protetor na progressão para a esteato-hepatite e, por conseguinte, para a cirrose, encontra-se o equilíbrio entre a expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias no fígado. Níveis locais elevados da citocina anti-inflamatória IL-10 reduzem a resistência hepática à insulina e diminuem o risco de desenvolvimento de esteato-hepatite. Em estudos recentes observamos que a inibição da atividade da IL-10 em um modelo animal de esteato-hepatite induzida por dieta contribui para a piora da disfunção hepática. Por outro lado, a redução da expressão do co-ativador de transcrição gênica PGC-1a reverte a esteatose hepática induzida por dieta. Tal reversão é acompanhada pela modulação da expressão de IL-10 e de seu receptor, IL-10R. No presente estudo avaliamos se o PGC-1a?interage com dois fatores de transcrição que participam do controle da expressão de IL-10, c-Maf e NF?Bp50. Para tal utilizamos as técnicas de imunoblot, imunoprecipitação, imunocitoquímica, histologia convencional e imunoprecipitação de cromatina. Os nossos resultados revelam que o PGC-1a?se associa a ambos, c-Maf e p50, após estímulo por ácidos graxos saturados e insaturados. Tal associação ocorre em paralelo ao aumento da expressão de IL-10 e se acompanha da migração de todas as três proteínas de uma localização preferencialmente citosólica para o interior do núcleo de hepatócitos. Além disso, sob estímulo por ácidos graxos, as três proteínas se ligam ao DNA do promotor do gene da IL-10, numa região localizada entre as bases -493 e -254, antes do códon iniciador do gene. Pelo menos a associação de PGC-1a?com p-50 e a indução da expressão de IL-10 por ácidos graxos pode ser inibida pela pré-exposição de hepatócitos ao ácido acetil salicílico, um inibidor da enzima ativadora do NF?B. Portanto, PGC-1a?interage com dois fatores de transcrição e com o DNA da região promotora do gene da IL-10 e emerge como potencial regulador da expressão de IL-10 no fígado. / Abstract: Interleukin-10 (IL-10) is an endogenous factor that restrains hepatic insulin resistance in diet-induced steatosis. Reducing IL-10 expression increases pro-inflammatory activity in the steatotic liver and worsens insulin resistance. Because in diet-induced steatosis the transcriptional co-activator PGC-1a plays a central role in the dysfunctional hepatocytic activity, we hypothesized that at least part of PGC-1a activity could be mediated by its effect on the transcriptional control of IL-10 expression. Here, we used immunoblot, real-time PCR, immunocytochemistry and ChIP assay to investigate the role of PGC-1a in the control of IL-10 expression in hepatic cells. First, we show that in the intact steatotic liver, the expressions of IL-10 and PGC-1a are increased. Inhibiting PGC-1a expression by antisense oligonucleotide increases IL-10 expression and reduces the steatotic phenotype. In cultured hepatocytes the treatment with saturated and unsaturated fatty acids, increase IL-10 expression. This is accompanied by increased association of PGC-1a with c-Maf and p50-NF?B, two transcription factors known to modulate IL-10 expression. In addition, following fatty acid treatment PGC-1a, c-Maf and p50- NF?B migrate from the cytosol to the nuclei of hepatocytes and bind to the IL-10 promoter region. Inhibiting NF?B activation with salicylate reduces IL-10 expression and PGC-1a association with p50-NF?B. Thus, PGC-1a emerges as a potential transcriptional regulator of the inflammatory phenomenon taking place in the steatotic liver. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

A ozonioterapia consiste na aplicação de ozônio medicinal, uma mistura de ozônio e oxigênio, que através das espécies reativas de oxigênio e produtos de lipoperoxidação exercem diversos efeitos no organismo como, melhora da oxigenação e metabolismo dos tecidos, angiogênese, aumento dos mecanismos antioxidantes, melhora do sistema imune, efeito anti-inflamatório, entre outros. Esta modalidade terapêutica já é amplamente estudada na medicina humana e vem sendo aplicada na medicina esportiva equina no tratamento de osteoartrite, porém sem estudos expressivos que comprovem sua segurança e eficácia. O objetivo do presente estudo é analisar os efeitos inflamatório e oxidante do ozônio medicinal em articulações sinoviais de equinos hígidos. Para tanto foram utilizadas 24 articulações tibiotársicas distribuídas aleatoriamente em três grupos. Nos grupos tratados foram realizadas três aplicações semanais de 15 ml de ozônio medicinal na concentração de 20 (GA) e 40 µg/ml (GB), no total de 10 aplicações. Já no grupo controle, as articulações receberam três aplicações semanais de 15 ml de O2 (GC), também no total de dez aplicações. Foram realizados exames físico, de claudicação e ultrassonográfico, bem como análise do líquido sinovial, incluindo contagem total de células nucleadas e quantificação de proteína total, prostaglandina E2, Substância P, interleucina-1, interleucina-6, interleucina 10, fator de necrose tumoral-α, ácido hialurônico (concentração e peso molecular) e condroitim sulfato. Para avaliação antioxidante no líquido sinovial foi determinada a atividade da superóxido desmutase e o burst oxidativo. Houve aumento da temperatura em GA e GB, os animais de GB apresentaram maior claudicação comparado aos demais grupos e observou-se aumento em todos os grupos dos escores ultrassonográficos. Na análise do líquido sinovial observou-se aumento nas contagens celulares de GA e GB, acompanhado de polimorfonucleares em GB, aumento da concentração de proteína no GA e GB, da atividade da superóxido desmutase e do índice de ativação em GA e diminuição da concentração de ácido hialurônico em todos os grupos e condroitim sulfato em GB e GC. Não houve diferença nas concentrações de PGE2, substância P, IL-1, IL-6, IL-10 e TNF-α. A aplicação consecutiva do ozônio medicinal intra-articular provocou alterações ultrassonográficas e no exame de claudicação, mais perceptível na dose de 40 ug/mL. Estas alterações estão mais relacionadas à distensão articular causada pela infusão de gases do que aos efeitos inflamatórios provindos do O3, uma vez que as análises de líquido sinovial não mostraram relevante inflamação. Conclui-se que a aplicação intra-articular de ozônio medicinal em equinos é segura em ambas as doses, e que experimentos devem ser realizados utilizando-se animais com diferentes doenças articulares, para que os benefícios da ozonioterapia sejam evidenciados e compreendidos. / Ozone therapy consists of the application of medicinal ozone, a mixture of ozone and oxygen, which through reactive oxygen species and products of lipoperoxidation exert various effects on the body, such as improvement of tissue oxygenation and metabolism, angiogenesis, increase of antioxidant mechanisms, improvement of the immune system, anti-inflammatory effect, among others. This therapeutic modality is already widely studied in human medicine and has been applied in equine sports medicine in the treatment of osteoarthritis, but without expressive studies that prove its safety and efficacy. The objective of the present study is to analyze the inflammatory and oxidizing effects of medicinal ozone on synovial joints of healthy horses. Twenty-four tibiotarsic joints were randomly distributed in three groups. In the treated groups three weekly applications of 15 ml of medicinal ozone in the concentration of 20 (GA) and 40µg / ml (GB) were carried out for a total of 10 applications. Already in the control group, the joints received three weekly applications of 15 ml of O2 (GC), also in the total of 10 applications. Physical, lameness and ultrasound examinations were performed, as well as synovial fluid analysis, including total nucleated cell count and quantification of total protein, prostaglandin E2, Substance P, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor-α, hyaluronic acid (concentration and molecular weight) and chondroitin sulfate. For the antioxidant evaluation in the synovial fluid, the activity of the superoxide dismutase and the oxidative burst was determined. There was an increase in temperature in GA and GB, GB animals presented greater lameness compared to the other groups and an increase was observed in all groups of ultrasound scores. In the synovial fluid analysis, GA and GB cell counts were observed, followed by polymorphonuclear cells in GB, increased protein concentration in GA and GB, superoxide desmutase activity and activation index in GA, and decrease in concentration of Hyaluronic acid in all groups and chondrocyte sulfate in GB and CG. There was no difference in the concentrations of PGE2, substance P, IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-α. The consecutive application of intra-articular medicinal ozone caused ultrasonography changes and lameness, more noticeable at 40 ug / mL. These changes related more to joint distension caused by gas infusion than to inflammatory effects from O3, since synovial fluid analyzes did not show relevant inflammation. It is concluded that the intra-articular application of medical ozone in horses is safe in both doses, and that experiments must be performed using animals with different joint diseases, so that the benefits of ozonotherapy are evidenced and understood.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-05-02T18:25:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-03T11:56:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T11:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is caused by protozoa of the genus Leishmania. The parasite is hosted by macrophages in cutaneous or mucosal lesions. Monocytes are precursors of macrophages, but there is little information about monocyte activation during ATL. The present study aimed to evaluate cytokine profile of monocytes from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL) in whole blood cultures stimulated with toll-like receptor (TLRs) and NOD2 receptor agonists. Peripheral blood from patients with active lesions and no treatment, and from healthy blood donors paired by sex and age, was diluted into culture medium and incubated with lipopolysaccharide (LPS), TLR4 agonist; lipopeptide Pam3Cys (Pam), TLR2 agonist; muramyldipeptide (MDP), NOD2 agonist or Leishmania (V.) braziliensis antigen (Ag). After incubation, supernatants were collected to measure IL-6 and TNF (6 h) and IL-10 (24 h) by ELISA. There was production of IL-6, TNF and IL-10 in cultures from patients and controls after stimulation with all agonists and Ag (p < 0.05, medium vs stimulus, n = 29). No differences were detected between concentrations of TNF and IL-10, but IL-6 was higher produced in non-stimulated cultures from patients than controls (p < 0.05, n = 29) or when the stimulus was MDP (p < 0.05, n = 19). The combination Pam/MDP increased the production of IL-6, TNF and IL-10 in cultures from patients and controls when compared with each stimulus isolated (p < 0.05, n = 13 - 14); similarly, Ag and MDP together induced higher concentrations of IL-6, TNF and IL-10 (IL-6 and IL-10, especially in cultures from patients) in comparison with each stimulus (p < 0.05, n = 11 - 14). There was no correlation between the number, size or time of lesions and levels of IL-6, TNF or IL-10. Patients with more than one cycle of treatment to obtain clinical cure showed higher levels of MDP-induced IL-6 than those cured with one cycle of treatment (p < 0.05, n = 17 cured with one cycle vs 8 cured with more than one cycle). Data suggest that LCL patient monocytes can be activated via TLR2, TLR4 or NOD2 to produce pro-inflammatory (IL-6, TNF) and anti-inflammatory (IL-10) cytokines and IL-6 can be associated with tissue lesion and delay of lesion healing indicating an immunopathogenic role in LCL. / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários do gênero Leishmania, que acomete a pele e/ou mucosas. Os monócitos são precursores de macrófagos, células hospedeiras do parasito, e pouco se sabe sobre seu nível de ativação durante a LTA. O presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil de resposta de citocinas produzidas por monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) em hemoculturas, após ativação com agonistas de receptores similares a toll (TLRs) e de receptor NOD2. O sangue periférico de pacientes com LCL, com lesões ativas e sem tratamento, e de indivíduos controles, pareados por sexo e idade, foi diluído em meio de cultura e incubado com lipopolissacarídeo (LPS), agonista de TLR4; lipopeptídeo Pam3Cys (Pam), agonista de TLR2; muramildipeptídeo (MDP), agonista de NOD2 ou antígenos de Leishmania (V.) braziliensis (Ag). Após incubação, os sobrenadantes foram colhidos para dosagem de IL6 e TNF (6 h) e IL-10 (24 h), por ELISA. Nas hemoculturas dos pacientes e dos controles, houve produção de IL-6, TNF e IL-10, após incubação com todos os estímulos (p < 0,05, Meio vs estímulos, n = 29). Ao comparar pacientes e controles, não houve diferença quanto à produção de TNF e IL-10, mas a produção de IL-6 foi maior nas hemoculturas não estimuladas dos pacientes (p < 0,05, n = 29) e na presença do MDP (p < 0,05, n = 19). A combinação Pam/MDP aumentou a produção de IL-6, TNF e IL-10 nas hemoculturas dos pacientes e controles, em relação a cada estímulo sozinho (p < 0,05, n = 13 - 14); de maneira similar, Ag e MDP juntos aumentaram a concentração de IL-6, TNF e IL-10 (IL-6 e IL-10, especialmente nas hemoculturas dos pacientes) (p < 0,05, n = 11 - 14). Não houve correlação significante entre o número, o tamanho e o tempo das lesões dos pacientes com LCL e as concentrações de IL-6, TNF e IL-10 nas hemoculturas dos mesmos. Quando comparados os pacientes clinicamente curados após um ciclo de medicamento e aqueles clinicamente curados após mais de um ciclo de medicamento em relação às concentrações de TNF e IL-10 não foram detectadas diferenças significantes entre os grupos, porém, em relação à produção de IL-6, foi observado que esta foi mais elevada nos pacientes curados com mais de um ciclo de medicamento, após o estímulo MDP (p < 0,05, n = 17 curados com 1 ciclo vs 8 xv curados com mais de 1 ciclo). Os dados sugerem que os monócitos de pacientes com LCL podem ser ativados via TLR2, TLR4 e NOD2, induzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF) e anti-inflamatória (IL-10) e a IL-6 pode estar associada ao dano tecidual e a demora na cura dos pacientes, possuindo um papel imunopatogênico na LCL humana.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-03-12T14:24:25Z No. of bitstreams: 2 Renan_Melo2014.pdf: 1848176 bytes, checksum: 102deb99625acf4c43610c22cb0234f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-12T14:24:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Renan_Melo2014.pdf: 1848176 bytes, checksum: 102deb99625acf4c43610c22cb0234f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Ganoderma australe is a Basidiomycete species responsible for the delignification process of the organic matter known to cause "white rot" in certain species of trees. Cytochemical studies have shown that the cell wall of fungi polysaccharides has (13)- β-glucans, (16)-β-glucans type and other complex polysaccharides. Currently, it has been highlighted that the β-glucans are polysaccharides that produce higher effects as modulators of biological functions. In previous studies, the fungus G. australe has been studied regarding the composition of the cell wall polysaccharide. SK5 polysaccharide fraction was obtained after freeze-thawing of the aqueous extraction with KOH 5%. Monosaccharide composition of SK5 fraction revealed by Gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) showed glucose is predominant (81.3%), with presence of other sugars (mannose, arabinose, xylose, rhamnose, fucose and galactose) at concentration of less than about 3% each. The nuclear magnetic resonance of this fraction proved to be a β-glucan with glycosidic links (1→3)-β type and probably replaced in 4-O. In this study, the biological effect of SK5 polysaccharide fraction extracted from the fungus G. australe has been evaluated in vitro cell culture of peritoneal macrophages isolated from Swiss mice. The biological effect was assessed for toxicity and cell activation, nitric oxide, cytokines (TNF-α, IL-6), superoxide anion (production and scavenging capacity) and the ability to stimulate phagocytic activity. Cell viability was affected, with approximately 29% reduction with 1.0 mg / mL and 35.5% reduction with 2.5 μg/ml SK5. There was no change in nitric oxide production, TNF-α or superoxide anion concentrations between 0.1 μg/mL and 1.0 μg/mL. The scavenging ability of superoxide anion was also not detected. There was an increase in IL-6 by about 111% with 1.0 μg/mL. In regarding to phagocyte activity was increased in all concentrations examined obtaining 52.3% with 0.25 μg/mL of polysaccharide. The results indicate that (13)-β- glucan isolated from G.australe can be classified as biological response modifier (BRM). / Ganoderma australe é uma das espécies de basidiomicetos responsáveis pelo processo de deslignificação da matéria orgânica, conhecido por causar a “podridão branca” em algumas espécies de árvores. Estudos citoquímicos demostraram que a parede celular dos fungos possui polissacarídeos do tipo β (13)-glucanas, β (16)-glucanas e outros polissacarídeos complexos. Atualmente, tem-se destacado que as β-glucanas são os polissacarídeos que produzem efeitos mais intensos como moduladores das funções biológicas. Em estudos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório, o fungo G. australe foi estudado quanto à composição polissacarídica da parede celular. A fração polissacarídica SK5 foi obtida após gelo-degelo da extração aquosa com KOH 5%. A composição monossacarídica da fração SK5 revelada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (GC-MS) mostrou que glicose é predominante (81,3%), com a presença de outros açúcares (manose, arabinose, xilose, ramnose, fucose e galactose) em concentração inferior a cerca de 3% cada um. A ressonância magnética nuclear desta fração comprovou ser uma β-glucana, com ligações glicosídicas do tipo β- 1→3 e provavelmente substituídas em 4-O. Neste trabalho, o efeito biológico da fração polissacarídica SK5 extraída do fungo G. australe foi avaliado in vitro em cultura de células de macrófagos peritoneais isoladas de camundongos Swiss. Foi analisado o efeito biológico quanto à toxicidade e ativação celular, a produção de óxido nítrico, citocinas (TNF-α, IL-6), ânion superóxido (produção e capacidade sequestradora) e a capacidade de estimular a atividade fagocítica. A viabilidade celular foi significativamente afetada, com cerca de 29% de redução com 1,0 μg/mL e 35,5% de redução com 2,5 μg/mL de SK5. Não houve alteração na produção de óxido nítrico, TNF-α ou de ânion superóxido nas concentrações entre 0,1 μg/mL e 1,0 μg/mL. A capacidade sequestradora de ânion superóxido também não foi constatada. Houve aumento na produção de IL-6 em cerca de 111% com 1,0 μg/mL. Em relação à atividade fagocítica houve aumento em todas as concentrações analisadas, chegando a 52,3% com 0,25 μg/mL do polissacarídeo. Os resultados obtidos indicam que a β (13)-glucana isolada de Ganoderma australe pode ser classificada como modificadora de resposta biológica (MRB).

O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1A) é uma doença autoimune caracterizada pela infiltração pancreática de linfócitos T e B, macrófagos e células dendríticas, levando à perda progressiva da capacidade de secreção de insulina pelas células beta pancreáticas. A homeostase das células T, ou seja, o desenvolvimento e manutenção apropriados dos números e funções das células T são essenciais para a integridade do sistema imune. Classicamente acreditava-se que as células T CD4+ poderiam se subdividir em duas populações efetoras distintas, T helper 1 e T helper 2. Recentemente, foram descritas duas novas vias de ativação de linfócitos T CD4+: a via Th17, que tem papel fundamental na autoimunidade; a via T regulatória, onde células T CD4+CD25+ high são essenciais na tolerância periférica e proteção contra autoimunidade. As Interleucinas (IL) de cadeia gama comum agem em várias etapas desta diferenciação linfocítica. A IL-21 é o membro mais recente desta família de citocinas, que inclui também: IL-2, IL-4, IL-7 , IL-9 e IL-15. A IL-21 atua através da interação com seu receptor, o IL-21R, apresentando ações pleiotrópicas e, como regra, pró-inflamatórias. Em estudos com modelos animais de diabetes autoimune verificou-se que a IL-21 e seu receptor são essenciais para o desenvolvimento da doença, porém ainda não há estudos sobre a ação desta interleucina no DM1 em humanos. O objetivo de nosso estudo foi avaliar o papel dos receptores das interleucinas de cadeia gama comum na patogênese do DM1A através da determinação da expressão da proteína de superfície e do RNA mensageiro destes receptores em pacientes com DM1A de início recente, em comparação com indivíduos controles normais, e da correlação destes valores com títulos de autoanticorpos pancreáticos. Estudamos a expressão da proteína de superfície do IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) e IL-7R (CD127) em linfócitos T periféricos de 35 pacientes com DM1 e 25 controles sadios utilizando citometria de fluxo. O tempo médio de diagnóstico do DM1 foi de 3 meses, e todos os pacientes estavam em uso de insulina no momento da coleta de sangue. Auto-anticorpos pancreáticos (anti-GAD65 e anti-IA2) foram dosados através de radioimunoensaio. A expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R foi quantificada por PCR em tempo real em 23 dos pacientes portadores de DM1A. Detectamos, pela primeira vez, diminuição significativa na expressão proporcional de IL-21R, CD25 e CD122 em linfócitos TCD3+ e TCD4+, além de diminuição na expressão de CD124 em linfócitos T CD4+ e CD127 em linfócitos T CD3+. Verificamos também redução significativa na quantidade de células TCD4+CD25+high (T regulatórias) nos pacientes DM1A. Não houve correlação entre expressão dos receptores de superfície das interleucinas de cadeia gama comum e títulos de autoanticorpos pancreáticos. Realizamos o PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum, e avaliar se esta correspondia à expressão das proteínas de superfície obtida através de citometria de fluxo. Comparamos a expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R nos pacientes DM1A dividindo-os em tercis de acordo com os valores de expressão de proteína de superfície obtidos por citometria de fluxo em linfócitos T CD3+, e verificamos que não houve diferença entre os 3 grupos na expressão relativa dos genes estudados. Portanto, em nossa casuística a redução da expressão da proteína de superfície dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum possivelmente decorreu de alterações posteriores à transcrição do RNA mensageiro / Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disease characterized by pancreatic infiltration of T and B lymphocytes, macrophages and dendritic cells, leading to a progressive destruction of the insulin-producing -cells. Homeostasis of T cells can be defined as the ability of the immune system to maintain normal T-cell counts and to restore T-cell numbers following T-cell depletion or expansion. It was classically believed that the CD4+ T cells could be activated into two distinct effector populations, T helper1 and T helper2. It was recently described two new pathways of CD4+ T lymphocytes activation: the Th17 pathway, that plays a fundamental role in autoimmunity and the regulatory pathway (Treg), where CD4+CD25+high T cells are essential to maintain peripheral tolerance and therefore protect against autoimmunity. The common gamma chain cytokines interfere with several steps of the CD4+ T lymphocytes differentiation. Interleukin-21 (IL-21) is the most recent member of this family, that also includes IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 and IL-15, and has pleiotropic effects on the immune system. Interleukin-21 acts through interaction with its receptor, the IL-21R, which is expressed in a great variety of immune cells. Various studies with animal models of autoimmune diabetes demonstrated that IL-21 and its receptor are essential for the development of the disease, but there are no studies evaluating the role of this interleukin and its receptor in T1DM in humans. The aim of our study was to assess the role of common gamma chain-dependent cytokine receptors in the pathogenesis of T1D, by determining the expression of the surface protein and mRNA of these receptors in recent-onset T1D patients and correlating these values with titles of pancreatic autoantibodies. We studied the surface protein expression of IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) and IL-7R (CD127) in peripheral T lymphocytes of 35 patients with T1D and 25 healthy controls using flow cytometry. Mean T1D duration was 3 months and all patients were using insulin at the time of blood withdraw. Pancreatic autoantibodies (anti-GAD65 and anti-IA2) were assessed by radioimmunoassay. The mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R was quantified by real time PCR in 23 of the T1D patients. We detected for the first time a statistically significant decrease in the proportional expression of IL-21R, CD25 and CD122 on CD3+ and CD4+ T lymphocytes, a decrease in the expression of CD124 on CD4+ T cells and CD127 on CD3+ T lymphocytes. We also observed a significant reduction in the amount of CD4+ CD25+high (T regulatory cells) in T1D patients. There was no correlation between the expression of the surface receptors of common gamma chain cytokines and titles of pancreatic autoantibodies. We performed real-time PCR to quantify RNA expression of common gamma-chain interleukin receptors, and evaluate if these values corresponded to those of surface proteins obtained using flow cytometry. We compared the mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R in T1D patients by dividing them into tertiles according to the expression values of surface protein obtained by flow cytometry in CD3+T lymphocytes. We observed that there was no difference in the relative expression of mRNA among the 3 groups of patients. Therefore, in our study, the reduction of surface protein expression of common gamma chain cytokines receptors was possibly due to alterations that occurred after the transcription of mRNA

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:56:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_RebecaPassarelli_M.pdf: 3691454 bytes, checksum: 62da767a8ae513cf2860f407c915aae6 (MD5) Previous issue date: 2018-08-18T22:55:56Z / Resumo: Fibrose cística (FC) é uma doença genética, autossômica recessiva, caracterizada por anormalidade no transporte eletrolítico. Achromobacter xylosoxidans é um bacilo Gram-negativo, não-fermentador e nos últimos anos tem sido encontrado em pacientes com FC, levando à doença pulmonar crônica. Neste estudo foram analisadas 17 amostras de A.xylosoxidans, isoladas de pacientes do Ambulatório de Fibrose Cística do Hospital das Clínicas (HC) da UNICAMP-SP. Os isolados foram analisados quanto as suas propriedades de virulência: atividade hemolítica, presença de hemaglutinação, atividade enzimática (caseinase, esterase, lecitina e hidrolise de elastina), adesão em célula, formação de biofilme e produção de atividade citotóxica. As amostras produziram hemolisinas, hemaglutininas e atividades enzimáticas. Catorze amostras de A.xylosoxidans (78%) formaram biofilme em microplacas, o que sugere o seu potencial em formar biofilme em cateteres e sondas. Entretanto essas bactérias não aderiram em células de pulmão NCI-H292 nas condições utilizadas. Os sobrenadantes de cultura de A.xylosoxindas apresentaram atividade citotóxica termoestável sobre célula NCI-H292, induzindo a formação de vacúolos, perda de contato celular, condensação da cromatina, núcleos picnoticos e morte celular. Foi verificado que a atividade citotóxica foi mantida mesmo após o tratamento dos sobrenadantes com polimixina B, sugerindo não ser uma endotoxina Ensaios de ELISA demonstraram significativa produção de IL-6 e IL-8 pelas células NCI-H292 após 24 horas de incubação com a fração >50kDa do sobrenadante de cultura da bacteria. Os resultados sugerem que o fator citotóxico produzido por A. xylosoxidans apresenta um importante papel na virulência, o qual provavelmente está associado à inflamação pulmonar crônica em pacientes com FC, levando a danos teciduais e declínio da função pulmonar / Abstract: Cystic fibrosis is a genetic disease, autosomal recessive, characterized by abnormal electrolyte transport. Achromobacter xylosoxidans is a Gram-negative non-fermenter and in recent years has been found in CF patients, leading to chronic lung disease. These studies were analyzed 17 samples of A.xylosoxidans isolated from patients in the Cystic Fibrosis Clinic, HC UNICAMP-SP. The isolates were analyzed for their virulence properties, such as haemolytic activity, the presence of hemagglutination, enzyme activity (caseinase, esterase, lecithin and hydrolysis of elastin), cell adhesion, biofilm formation and production of cytotoxic activity. The presence of hemolysins, hemagglutinins and enzymatic activities were not detected. Fourteen samples (78%) of A.xylosoxidans formed biofilms in microplates, suggesting the ability of bacteria to form biofilms on catheters and probes, but there was no adhesion in NCI-H292 cell lung. The culture supernatants of A.xylosoxindas isolated produced a heatstable cytotoxic factor in NCI-H292 cells, inducing the formation of vacuoles, loss of cell contact, chromatin condensation, pyknotic nuclei and cell death. ELISA assays to verify the release of IL-6 and IL-8, showed great production of these proinflammatory cytokines by NCI-H292 cells after 24 hours of incubation with the fraction> 50 kDa of culture supernatant of bacteria. It was also verified that the cytotoxic activity was maintained even after treatment with polymyxin B, suggesting may be not an endotoxin. Therefore, this cytotoxic factor produced by A. xylosoxidans may represent an important virulence factor, which is probably associated with chronic pulmonary inflammation in CF patients, leading to tissue damage and decline in lung function, decreasing the survival of these patients / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientadores: Lício Augusto Velloso, Marciane Milanski / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:36:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Biazzo_LiviaAparecidaD'AvilaBitencourtPascoal_M.pdf: 4154170 bytes, checksum: 19b0d87fbb38f934ea580317356be4bf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na obesidade experimental, mudanças na função hipotalâmica desempenham papel importante na regulação anômala da ingestão alimentar e do gasto energético. Estudos recentes mostram que a inflamação hipotalâmica sub-clínica é um importante fator que contribui para a disfunção hipotalâmica na obesidade. Citocinas, como TNF'alfa', IL6 e IL10 tem sido estudadas no hipotálamo de modelos animais de obesidade, entretanto, o papel da IL1? nesta condição não está claro. Neste trabalho, nós utilizamos a técnica de interferência de RNA conjugado com o peptídeo do vírus da raiva RVG-9R para direcionar a molécula antisense de IL1? ao sistema nervoso central. Essa manipulação levou a uma redução de 50% na expressão hipotalâmica de IL1 ? em ratos obesos e a um aumento do ganho de peso corporal sem afetar a ingestão alimentar e a atividade física espontânea. A redução da expressão da IL1? no sistema nervoso central foi acompanhada da redução da atividade da enzima citrato sintase da cadeia respiratória mitocondrial e ao aumento da expressão de PGC1'alfa' no tecido adiposo marrom desses animais. Assim, propomos que a expressão de IL1? no hipotálamo de ratos obesos leva ao aumento da termogênese no tecido adiposo marrom que protege contra o ganho de massa corporal excessiva / Abstract: In experimental obesity, changes in hypothalamic function play an important role in the anomalous regulation of food intake and energy expenditure. Recent studies have shown that a low-grade hypothalamic inflammation is an important factor contributing to hypothalamic dysfunction in this context. Cytokines such as TNF'alfa', IL6 and IL10 have been studied in the hypothalamus of experimental models of obesity, however, the role played by IL1? in this condition is unknown. Here we employed small-intereference RNA conjugated with the rabies virus RVG-9R peptide to deliver an IL1? antisense RNA to the central nervous system. This approach led to a 50% reduction of hypothalamic expression of IL1? in obese rats and produced an increase in body mass gain without affecting food intake and spontaneous physical activity. Upon central nervous system IL1? inhibition the brown adipose tissue activity of the respiratory chain mitochondria enzyme citrate synthase was reduced, while the expression of PGC1'alfa'? was increased. Thus, the expression of IL1? in the hypothalamus of obese rats provides a brown adipose tissue-dependent thermogenic mechanism that protects against excessive body mass gain / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Streptococcus uberis is an important cause of intramammary infection in dairy cattle. Strains of S. uberis appear to differ in their ability to cause disease based on previous epidemiological studies. We explored the pathogenicity of 2 strains of S. uberis, where one strain represented a putatively host-adapted type based on its ability to cause persistent infection and to spread from cow to cow in a lactating herd. This type was part of a clonal complex that is commonly associated with bovine mastitis. The other strain, which was isolated from a transient infection in a single animal in the same herd and did not belong to any known clonal complex, was selected as putatively non-adapted type. Cows (6 per strain) were experimentally challenged in a single hind quarter and the adjacent hind quarter was used as mock challenged control quarter. Both strains showed an equal ability grow in milk of challenge animals in vitro. All cows that were challenged with the putatively host-adapted strain developed clinical signs of mastitis, including fever and milk yield depression as well as elevated somatic cell count due to influx of polymorphonuclear leucocytes and lymphocytes. The cytokine response followed a specific order, with an increase in IL-1β, IL-6 and IL-8 levels at the time of first SCC elevation, followed by an increase in IL-10, IL-12p40 and TNF-α levels approximately 6 h later. In 4 of 6 animals, IL-17A was detected in milk between 57 and 168 h post challenge. The increase in IL-17A levels coincided with inversion of the pre-challenge CD4+:CD8+ T lymphocyte ratio, and was observed from 96 h post challenge. This was followed by normalisation of the CD4+:CD8+ ratio due to continued increase of the CD8+ concentration up to 312 h post challenge. Spontaneous resolution of infection was observed in 5 animals and coincided with a measurable IL-17A response in 4 animals, suggesting that IL-17 may be involved in the resolution of intramammary infection. To explore the mechanism of action of IL-17A we stimulated bovine PMN and bovine blood derived macrophages with recombinant IL-17A in vitro. IL-17A enhanced the killing ability of phagocyte toward the challenge strain. With the exception of minor elevation of IL-8 levels, no clinical, cytological or immunological response was detected in quarters challenged with the non-adapted strain. The observed strain specific pathogenicity was consistent across animals, implying that it is determined by pathogen factors rather than host factors. We further studied in vitro possible mechanisms involved in the differences observed between the two strains such as ability to adhere to the mammary epithelial cells, ability to resist to killing by phagocytes and ability to form biofilm. The adapted strain FSL Z1-048 showed an increased ability to adhere to the epithelial cells and an increase ability to resist to killing of monocyte derived macrophages. These mechanisms thus could potentially explain the in vivo observations.

Inflammation in the absence of infection (sterile inflammation) is a crucial host defence response to tissue injury, but is also considered to contribute to the pathogenesis of many diverse disease states, including stroke. Sterile inflammation is initiated by damage associated molecular patterns (DAMPs) which are endogenous molecules released from necrotic cells or that are modified during disease. The pro-inflammatory cytokines IL-1α and IL-1β are key mediators of inflammation. IL-1β release is controlled by caspase-1 which, in turn, is regulated by the inflammasome. The NOD-, LRR-, pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome is most typically associated with sterile inflammation and the recognition of DAMPs. Thus, understanding the mechanisms of NLRP3-activating DAMP-induced inflammation may lead to the identification of novel therapeutic targets with which to treat inflammatory diseases. This thesis sought to determine how NLRP3-activating DAMPs affect the pro-inflammatory response of glia, the immune cells of the brain. Experimental models in vitro typically use a pathogen associated molecular pattern (PAMP) such as LPS to prime cells before observing their response to NLRP3-activating DAMPs. As the brain is protected by the blood brain barrier (BBB), it is unlikely glia would be exposed to PAMP priming. However it remains unclear as to how glia respond to NLRP3-activating DAMPs in the absence of priming, or what the source of endogenous priming is. Therefore, the initial hypothesis was to investigate the pro-inflammatory response of mixed glia in vitro to NLRP3-activating DAMPs in the absence of PAMP priming. It is shown here for the first time that NLRP3-activating DAMPs can initiate an IL-1-NLRP3-independent inflammatory response in mixed glia in the absence of PAMP priming. Moreover, it is shown that the acute phase protein serum amyloid A is elevated in plasma after stroke and may act as an endogenous priming signal to allow IL-1β-dependent inflammation to contribute to the damage after breakdown of the BBB.Inflammation following acute sterile injury such as stroke is augmented by persisting cell death. It was therefore hypothesised that NLRP3-activating DAMPs released after the initial injury, may initiate a form of programmed cell death that continues to drive inflammation. Using inhibitors of specific types of cell death, it was identified that NLRP3-activating DAMP induced cell death is likely to be necrosis and not programmed cell death. Further investigation into the biological importance of DAMP-induced IL-1-independent inflammation and the specific contribution of acute phase proteins to brain pathology may aid the identification of new therapeutic targets.

Melioidosis is an important cause of community-acquired sepsis, endemic to Southeast Asia and Northern Australia. Melioidosis is caused by the soil saprophyte, Burkholderia pseudomallei, a motile Gram-negative bacillus, and is associated with a mortality rate that approaches 50% in Northeast Thailand. The most important risk factor for melioidosis is diabetes mellitus, and two-thirds of all adult patients with melioidosis have diabetes as a risk factor. It has been noted previously, however, that patients with diabetes have lower mortality than patients without diabetes. In this dissertation, we look at a cohort of 1160 consecutive adult melioidosis patients presenting to Sappasithiprasong Hospital in Ubon Ratchathani, Thailand, 410 (35%) of whom were diagnosed with diabetes prior to admission. We confirmed previous findings that diabetes protected from mortality in melioidosis, but also found that this protective effect was confined to a smaller subset of patients (208 patients) who were treated with glibenclamide prior to admission. Patients with hyperglycaemia (but no diagnosis of diabetes prior to admission) had the same mortality rate as patients without diabetes. In vitro experiments found no inhibitory effect of glibenclamide on bacterial growth, and we therefore looked for evidence of an effect of glibenclamide on the host. We conducted a gene expression study of circulating blood leukocytes in melioidosis patients and compared them to uninfected controls. In this study, we found that glibenclamide was associated with an anti-inflammatory effect on the host response to melioidosis. To further elucidate a mechanism for the action of glibenclamide, we studied the effect of glibenclamide therapy in a mouse model of melioidosis and found that the effect of glibenclamide was specific to interleukin-1β secretion. This reduction in interleukin-1β secretion was associated with reduced cellular influx into the lungs as well as lower bacterial loads in blood, liver and spleen.