Les biothérapies (anticorps monoclonaux, récepteurs solubles) ciblant les cytokines IL-6 etTNF-alpha pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques ont constitué un succèsmajeur de l’industrie pharmaceutique. Elles présentent néanmoins des inconvénientsimportants : résistances, mode d’administration contraignant, coût élevé.Notre équipe travaille sur l’identification de petites molécules inhibant directement cescytokines, afin d’élargir l’offre thérapeutique existante. Administrées par voie orale, ellesconstitueraient une alternative particluièrement favorable aux patients.Durant ma thèse, j’ai réalisé le criblage expérimental (tests cellulaires et tests biochimiquesde liaison) des meilleurs composés identifiés par criblage virtuel d’un grande chimiothèque dediversité, ainsi que de composés dérivés de pyridazine issus d’une chimiothèque médicinale. J’aiainsi pu identifier plusieurs inhibiteurs directs du TNF-alpha et de l’IL-6. De plus, mon travail apermis d’affiner les procédures de criblage du Laboratoire.Ces travaux ouvrent de nouvelles pistes pour le développement de médicaments anti-cytokines. / Anti-cytokine biologics (monoclonal antibodies, soluble receptors) targeting TNF-alpha and IL-6in chronic inflammatory diseases have been a major success for pharmaceutical industry.However, they exhibit several drawbacks : resistance, difficult administration, high costs.Our team works on the discovery of small molecule inhibitors of cytokines suck as TNF-alphaand IL-6, in order to widen the range of therapeutic drugs. Orally active drugs would represent ahighly beneficial alternative for patients.During my PhD, I have performed an experimental screening (using cellular and biochemicalbinding testings) of the best compounds identified through virtual screening of a large chemicallibrary, and on pyridazine compounds of a medicinal chemical library. I have been able toidentify several small molecules inhibiting the interaction of TNF-! and IL-6 with their receptor.Moreover, my work will have an impact on the laboratory screening strategies.Overall, this work opens new avenues for anti-cytokine drug discovery.

Les biothérapies (anticorps monoclonaux, récepteurs solubles) ciblant les cytokines IL-6 etTNF-alpha pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques ont constitué un succèsmajeur de l’industrie pharmaceutique. Elles présentent néanmoins des inconvénientsimportants : résistances, mode d’administration contraignant, coût élevé.Notre équipe travaille sur l’identification de petites molécules inhibant directement cescytokines, afin d’élargir l’offre thérapeutique existante. Administrées par voie orale, ellesconstitueraient une alternative particluièrement favorable aux patients.Durant ma thèse, j’ai réalisé le criblage expérimental (tests cellulaires et tests biochimiquesde liaison) des meilleurs composés identifiés par criblage virtuel d’un grande chimiothèque dediversité, ainsi que de composés dérivés de pyridazine issus d’une chimiothèque médicinale. J’aiainsi pu identifier plusieurs inhibiteurs directs du TNF-alpha et de l’IL-6. De plus, mon travail apermis d’affiner les procédures de criblage du Laboratoire.Ces travaux ouvrent de nouvelles pistes pour le développement de médicaments anti-cytokines. / Anti-cytokine biologics (monoclonal antibodies, soluble receptors) targeting TNF-alpha and IL-6in chronic inflammatory diseases have been a major success for pharmaceutical industry.However, they exhibit several drawbacks : resistance, difficult administration, high costs.Our team works on the discovery of small molecule inhibitors of cytokines suck as TNF-alphaand IL-6, in order to widen the range of therapeutic drugs. Orally active drugs would represent ahighly beneficial alternative for patients.During my PhD, I have performed an experimental screening (using cellular and biochemicalbinding testings) of the best compounds identified through virtual screening of a large chemicallibrary, and on pyridazine compounds of a medicinal chemical library. I have been able toidentify several small molecules inhibiting the interaction of TNF-! and IL-6 with their receptor.Moreover, my work will have an impact on the laboratory screening strategies.Overall, this work opens new avenues for anti-cytokine drug discovery.

Afin d’améliorer au mieux le greffon placentaire, nous suggérons de réaliser sa culture d’expansion ex vivo dans des conditions proches de l’environnement des cellules souches hématopoïétiques in vivo. Ainsi, nous proposons que la co-culture de cellules CD34+ placentaires avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) à basses concentrations d’O2 (BC-O2) pourrait contribuer à équilibrer les processus d’autorenouvellement et de différenciation afin d’obtenir un greffon optimisé. Sur le plan fonctionnel, nos résultats confirment un effet bénéfique de notre modèle expérimental par rapport aux conditions où figure la culture simple et/ou l’oxygénation atmosphérique (20%) en termes du maintien de progéniteurs (PH) primitifs (pré-CFC) et de cellules souches Scid-Repopulating Cells (SRC). Sur le plan quantitatif, l’amplification des cellules CD34+ et des PH engagés, bien qu’elle soit en retrait dans nos conditions de référence par rapport à la condition de 20% d’O2, elle demeure néanmoins importante. Par ailleurs, le rôle de l’IL-3 exogène se montre crucial à BC-O2 notamment en co-culture à 1,5% d’O2 où elle permet non seulement de préserver mais aussi d’amplifier le taux de SRC par rapport au témoin de cellules CD34+ de J0. Enfin, l’étude de la sécrétion des facteurs solubles et l’expression des marqueurs phénotypiques sur les CSM montre que l’IL-6, le VEGF et l’IL-8 sont plus sécrétés et les CD146, CD49a, CD54, CD200 et CD105 sont plus exprimés après incubation à 5% d’O2. Cependant, l’implication réelle de ces facteurs et antigènes dans l’effet paracrine et/ou de contact cellulaire direct menés par les CSM dans notre protocole requiert de nouvelles investigations / To optimize at best the hematopoietic engraftment, we suggest in this work to improve the ex vivo expansion conditions by moving them closer to physiology. Indeed, we propose to culture placental CD34+ (HSC/PH) on MSC layer in combination with LO2-C to ensure the amplification of HP together with the maintenance/expansion of HSC. Compared to the single culture and/or atmospheric oxygenation, our experimental model allows a better maintenance of primitive HP (Pre-CFC) and HSC together with a quite good amplification of total cells, CD34+ cells and committed HP despite of lower than control condition. Moreover, exogenous IL-3 shows crucial effect in co-culture at LO2-C (1.5% O2) since its addition better preserves and even increases the number of HSC compared to the CD34+ cells control from D0. We then studied the secretion of soluble factors in culture supernatants and found that IL-6, VEGF and IL-8 were present in larger quantities at LO2-C in both co-culture and MSC culture. Finally, the CD146, CD49a, CD54, CD200 and CD105 membrane antigens appear to be up-regulated in MSCs when incubated at 5% O2. However, the involvement of these factors and antigens in paracrine effect and/or direct cell to cell contact mechanisms at LO2-C requires further investigations. In conclusion, the combination of LO2-C and MSC would be promising in the field of HSC/PH grafts expansion to achieve its main objective of reducing the post-transplant cytopenia period together with maintaining the long-term graft potential

Chez les patients infectés par le VIH, les traitements antirétroviraux empêchent la réplicationvirale, ce qui est suivi, dans la plupart des cas, par une restauration de la population des lymphocytesT CD4+ (CD4). Néanmoins ce n’est pas le cas pour certains patients appelés patients àfaible réponse immunitaire. Des injections d’interleukine-7 (IL7) exogène, une cytokine impliquéedans l’homéostasie des CD4, sont considérées afin de maintenir les taux de CD4 au-dessus de500 cellules par μL, taux au-dessus duquel les patients ont une espérance de vie comparable auxpersonnes non infectées par le VIH. Les essais INSPIRE ont évalué l’effet d’injections répétéesd’IL7 chez les patients à faible réponse immunologique.Nous présentons plusieurs modèles mécanistes de l’effet des injections d’IL7 sur les CD4, quiincluent des effets aléatoires afin de tenir compte de la variabilité inter-individuelle. En utilisantces modèles avec une approche Bayésienne, les paramètres individuels d’un nouveau patient sontéchantillonnés, ce qui nous permet de faire des prédictions sur sa dynamique de CD4 et donc depersonnaliser le traitement. Nous proposons quatre protocoles adaptatifs permettant de limiter letemps passé sous 500 CD4 par μL, sans pour autant augmenter le nombre d’injections. Ces protocolesont été implémentés dans une application Shiny présentant une interface facile d’utilisation,et pourront être testés lors d’essais cliniques.Le réservoir viral, principalement constitué de CD4 quiescentes infectées, est la première barrièreà l’éradication du VIH. Les injections d’IL7 entrainent une augmentation du nombre deCD4 et donc du réservoir viral ; la question est alors de savoir si les injections provoquent denouvelles infections cellulaires ou si le réservoir augmente de la même façon que les CD4. Nousconcluons que si quelques patients ont présenté des dynamiques de marqueurs compatibles avecla survenue de nouvelles infections de cellules, ce n’est pas le cas de la majorité des patients. Laconfirmation de ces phénomènes et la caractérisation de potentiels patients à risque nécessite desdonnées supplémentaires mesurables dans un essai clinique. / In HIV infected patients, antiretroviral therapy suppresses the viral replication which is followedin most patients by a restoration of the CD4+ T cells (CD4) pool. However, it is not the case forsome patients called low immunological responders. Injections of interleukin-7 (IL7), a cytokineinvolved in the CD4 homeostasis, are considered in order to maintain the CD4 levels above 500cells per μL, the level at which life expectancy is similar to that of the non-infected. INSPIREtrials evaluated the effect of repeated injections of IL7 on low immunological responders.We present a few mechanistic models of the effect of IL7 injections on CD4, which includerandom effects to account for inter-individual variability. Using these models with a Bayesianapproach, the individual parameters of a new patient are sampled, which allows us to makepredictions about its CD4 dynamics and thus to personalize the treatment. We propose fouradaptive protocols that limit the time spent under 500 CD4 per μL, without increasing thenumber of injections. Those protocols are implemented into a Shiny app with an easy to useinterface, and they could be tested during clinical trials.The viral reservoir, mainly made up of quiescent infected CD4, is the main obstacle to HIVeradication. IL7 injections induce an increase of the level of CD4, hence of the viral reservoir ; thequestion is then to determine if the injections induce new cell infections or if the reservoir increasesin the same way as CD4. We conclude that while some patients presented marker dynamicsconsistent with the occurrence of new cell infections, this is not the case for the majority ofpatients. Confirmation of these events and characterization of potential at-risk patients requiresadditional measurable data in a clinical trial.

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques. / The Module X approach was conceived to generate small allosteric peptides that do not (by definition) compete with the natural ligand to inhibit or modulate signalling. Orthosteric inhibition blocks the entire signalling pathways while allosteric modulators will bind to another site on the target and show functional selectivity. By reproducing parts of the flexible regions (loops) of two receptors, the IL-1 and vasopressin receptors, we generated small peptides that showed allosteric properties. To prove our concept we started with a pro-inflammatory target: IL-1 receptor. Interleukin (IL)-1 is a major pro-inflammatory cytokine which interacts with the IL-1 receptor I (IL-1RI) complex, composed of IL-1RI and IL-1R accessory protein (IL-1RacP) subunits. Presently, there are no small antagonists of the IL-1RI complex. Given this void, we derived 15 peptides from loops of IL-1RacP, which are putative interactive sites with the IL-1RI subunit. Here we substantiate the merits of one of these peptides, rytvela (we termed, 101.10), as an inhibitor of IL-1R and describe its properties consistent with those of an allosteric negative modulator. 101.10 (IC50  1 nM) blocked human thymocyte proliferation in vitro, and demonstrated robust in vivo effects in models of hyperthermia and inflammatory bowel disease as well as topically in contact dermatitis, superior to corticosteroids and IL-1ra; 101.10 did not bind to IL-1RI deficient cells and was ineffective in vivo in IL-1RI knockout mice. Importantly, characterization of 101.10, revealed non-competitive antagonist actions and functional selectivity by blocking certain IL-1R pathways while not affecting others. The second study involved a representative of the biggest family of membrane proteins: G-protein coupled receptors. Vasopressin type 2 receptor (V2R) exhibits mostly important properties for hydro-osmotic equilibrium and to a lesser extent on vasomotricity. Drugs currently acting on this receptor are analogs of the natural neuropeptide, vasopressin (AVP), and hence are competitive ligands. Six peptides reproducing juxtamembranous regions of V2R were designed and screened; the most effective peptide, CRAVKY (labelled VRQ397), was characterized. VRQ397 was potent (IC50 = 0.69 ± 0.25 nM) and fully effective in inhibiting V2R-dependent physiological function (specifically DDAVP-induced cremasteric vasorelaxation; this physiological functional assay was utilized to avoid overlooking interference of specific signaling events). Dose-response profile revealed non-competitive property of VRQ397; correspondingly, VRQ397 bound specifically to V2R-expressing cells, could not displace its natural ligand, AVP, but modulated AVP binding kinetics (dissociation rate). VRQ397 exhibited pharmacological permissiveness on V2R-induced signals as it inhibited DDAVP-induced PGI2 generation, but not that of cAMP or recruitment of — arrestin2. Consistent with in vitro and ex vivo effects as a V2R antagonist, VRQ397 displayed anticipated in vivo aquaretic efficacy. Findings describe the discovery of potent and specific small (peptide) antagonists of IL-1RI and V2R with properties in line with an allosteric negative modulator.

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+. Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV. L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.

Le paludisme constitue la première maladie parasitaire au monde, responsable d’environ 800 000 morts chaque année. Il peut entraîner plusieurs complications sévères aggravant le pronostique vital, et pouvant conduire à la mort. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été d'étudier, pour une majeur partie, la pathologie cérébrale et dans une moindre mesure la forme pulmonaire. Cette étude a plus particulièrement porté sur le rôle de certaines voies d’activation des lymphocytes T. Mes résultats ont mis en évidence la fonction primordiale, dans le développement du neuropaludisme, de trois molécules impliquées dans l’activation des cellules T : le récepteur LTβR, la protéine PKC-θ et la sous unité β2 du récepteur à l’IL-12. Grâce à l’utilisation d’un modèle murin délété en ces gènes, nous avons pu déterminer par des techniques non invasives (IRM, ARM) ou invasives (test de perméabilité vasculaire, cytométrie en flux) que ces souris étaient résistantes à la forme cérébrale. En revanche elles ne sont pas essentielles à la pathologie pulmonaire. / The malaria is the first parasitic pathology, responsible of 800 000 death a year. It can cause several severe complications which might deteriorating vital forecast and lead to the death. In this context, my thesis objective was to study, for major point, the cerebral pathology and in a lesser measure the lung pathology. This study concernes the role of some signaling pathways of T cells activation. My results show the involvement of three molecules in cerebral malaria development LTβR receptor, PKC-θ kinase and IL-12Rβ2 receptor subunit. With the use of knockout mice for these genes, we proved by non invasive approaches (MRI and MRA) or invasive approaches (vascular permeability test, flow cytometry) that these mice are resistant to cerebral malaria. By contrast they are not protected against lung pathology.

L'homéostasie chlorure (HC) est un acteur essentiel dans la transmission nerveuse. Le GABA, via son récepteur GABAA, permet les mouvements d'ions chlorures en fonction de leur potentiel électrochimique. Dans les neurones sensitifs de ganglions rachidiens dorsaux (GRD), le co-transporteur cation-chlorure NKCC1 est responsable de l'accumulation intracellulaire des ions Cl- et de l'effet dépolarisant du GABA. Suite à une lésion, l'augmentation de la concentration intracellulaire en ions Cl- ([Cl-]i) permet une amélioration des capacités régénératives neuronales. Au cours de ma thèse, je me suis en premier lieu intéressé à la régulation de l'HC par interleukine 6 (IL6) en réponse à une lésion nerveuse. L'axotomie du nerf sciatique induit l'expression de l'IL6 et son récepteur IL6-Rα dans les neurones sensitifs des GRD lombaires L4-L5. Des mesures par patch perforé sur des neurones sensitifs en culture ont montré une augmentation de la [Cl-]i dépendante de l'IL6 dans une sous-population de neurones mécano- et proprioceptifs en réponse à l'axotomie. Cette régulation est permise par la phosphorylation à la membrane plasmique neuronale de NKCC1. Le co-transporteur KCC3 est impliqué dans une maladie génétique conduisant dès la naissance à une perte sensorimotrice, ce qui m'a conduit à étudier son rôle dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte. Nos données ont démontré l'existence d'un « switch chlorure » développemental, diminuant la [Cl-]i. Ce switch est altéré chez la souris KCC3-/-, dans laquelle une partie des neurones a déjà diminué sa [Cl-]i. Au stade adulte, nous avons également observé un doublement de la [Cl-]i dans 30% des neurones sensitifs de souris KCC3-/-, pourcentage corrélé à la proportion de neurones WT exprimant KCC3. Ces données prouvent que KCC3 est impliqué, de manière directe ou non, dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte. / Chloride homeostasis (CH) is a major component of nerve transmission. Interaction between the neurotransmitter GABA and his receptor, GABAA, allows chloride movements depending on electrochemical potential. In dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons, the cation-chloride cotransporter NKCC1 is responsible for intracellular accumulation of chloride ions and depolarizing effects of GABA. After injury, an increase of intracellulaire chloride concentration ([Cl-]i) allows an improvement of neuronal regenerative capacities. In a first time, I worked on regulation of CH by interleukine 6 (IL6) in response to nerve injury. Axotomy of the sciatic nerve induces expression of IL6 and his receptor IL6-Rα in sensory neurons from lombar L4-L5 DRG. Perforated patch measurements of sensory neurons have demonstrated an increase of [Cl-]i depending on IL6 in a sub-population of mechano- and proprioceptors in response to lesion. This regulation is provided by phosphorylation at the neuronal plasma membrane of NKCC1. The cation-chloride cotransporter KCC3 is implicated in a hereditary syndrome leading after birth to sensorymotors defects. This is why I have studied his role in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood. Data have shown the existence of a peripheral developmental “chloride switch”. This switch is abolished in KCC3-/- sensory neurons, in which a part of neurons has already decreased [Cl-]i. In adulthood, we also observed an [Cl-]i twice as much as WT in 30% of sensory neurons from KCC3-/- mice. This percentage is correlated to the proportion of WT neurons expressing KCC3. These results demonstrate for the first time that KCC3 is implicated in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood.

Contexte : Les maladies pulmonaires comme l'asthme ou la mucoviscidose représentent des problèmes majeurs de santé publique. Elles se manifestent par une inflammation chronique avec une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et à terme une dégradation de la fonction respiratoire. Les efforts thérapeutiques tentent, d'un côté, de contrôler la réaction inflammatoire et aussi d'améliorer la biodisponibilité médicamenteuse. Objectif : Notre objectif est d'explorer l'implication des phospholipases dans l'inflammation et le rôle des transporteurs peptidiques dans le transport des antibiotiques dans la mucoviscidose. Nous avons aussi cherché à comprendre l'effet d'une supplémentation en cobalamine sur l'efficacité de la dexaméthasone dans un contexte inflammatoire. Méthodes : Des techniques immunologiques, électrophorétiques, de culture cellulaire, d'immunoprécipitation et d'expression génique sont utilisées sur des lignées bronchiques humaines normales ou mucoviscidosiques. Résultats : 1) La PC-PLC est constitutivement suractivée dans les cellules mucoviscidosiques et conduit à une surproduction d'arachidonate, à une surexpression de Cox-2, une surproduction de PGE2, une surexpression d'interleukine-8, et au défaut de régulation beta-adrénergique de la sécrétion. L'inhibition de cette enzyme par le D609 permet de corriger tous ces défauts. 2) L'activité du transporteur peptidique, impliquée dans le transport d'antibiotiques, PEPT2, a été caractérisée dans les cellules bronchiques normales (Vm = 115 pmol/106 cellules/min ; Km = 15µM). Ce transporteur n'est pas influencé par un contexte inflammatoire. Ce transporteur est inactif dans les cellules CF. 3) La cobalamine potentialise l'effet de la déxaméthasone sur la sécrétion et l'expression des cytokines pro-inflammatoires induite par le TNFa et l'histamine. Conclusions/perspectives : Cette étude devrait permettre 1) de mettre en lumière l'importance de la PC-PLC comme cible pharmacologique potentielle dans la mucoviscidose. 2) de comprendre la relative faible efficacité de l'antibiothérapie dans cette maladie et 3) de mettre en évidence une possible participation du cycle de la méthionine dans le processus inflammatoire / Background: Lung diseases such as asthma or cystic fibrosis are major public health problems. They are manifested by chronic inflammation with increased production of proinflammatory cytokines leading to respiratory failure. Current therapeutic is aimed at controling the inflammatory response and also at improving drug bioavailability. Objective: The objective is to explore the involvement of phospholipases in inflammation and the role of peptide transporters in the transport of antibiotics in cystic fibrosis. We also sought to understand the effect of cobalamin supplementation on the effectiveness of dexamethasone in an inflammatory context. Methods: immunological techniques, electrophoresis, cell culture, immunoprecipitation and gene expression are used on normal or cystic fibrosis human bronchial cell lines. Results : 1) PC-PLC is constitutively overactivated in cystic fibrosis cells and leads to overproduction of arachidonate, to overexpression of Cox-2 , an overproduction of PGE2 , an interleukin -8 overexpression , and to alteration of beta-adrenergic secretion. Inhibition of this enzyme by D609 corrects these defects. 2) The activity of the dipeptide carrier involved in the transport of antibiotics, PEPT2, was characterized in normal bronchial cells (Vm = 115 pmol/106 cells / min, Km = 15µM). This transporter is not affected by an inflammatory context. However, it was shown to be inactive in CF cells. 3) Cobalamin potentiates the effect of dexamethasone on the expression and secretion of pro-inflammatory cytokines induced by TNFa and histamine. Conclusions : This study should help 1) to highlight the importance of PC-PLC as a potential pharmacological target in cystic fibrosis. 2) to understand the relative ineffectiveness of antibiotics in this disease , and 3) to highlight a possible involvement of methionine cycle in the inflammatory process

Les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARs) sont des facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme lipidique et de la tolérance au glucose. Les PPARs contrôlent également l’inflammation associée à de multiples pathologies, dont la polyarthrite rhumatoide. Dans les travaux présentés dans ce manuscrit, nous avons comparé les potentialités anti-arthritiques, dans un modèle expérimental, de deux agonistes synthétiques de haute affinité pour deux isotypes de PPARs, PPARα et PPARγ. Nous avons démontré qu’un traitement avec un agoniste sélectif de PPARγ, la pioglitazone, en plus de diminuer la sévérité de l’arthrite expérimentale, réduisait la perte osseuse inflammatoire en préservant la micro-architecture osseuse. Nous avons mis en évidence que PPARγ, d’une part, régulait l’expression locale et systémique de l’interleukine-17 et de RANKL, et que, d’autre part, il inhibait l’expression du facteur de transcription RORγt, acteur majeur de la voie IL-17/Th17. Les animaux déficients pour PPARγ nous ont permis de confirmer son rôle majeur dans le développement du processus arthritique. En effet, ces animaux présentent tous et de façon spontanée une arthrite associée à une augmentation du nombre de mastocytes capables de produire l’IL-17 et leur propre facteur de différenciation, le SCF dans la synoviale inflammatoire. Enfin, nous avons discuté le lien possible entre l'arthrite inflammatoire et la mastocytose à la lumière de l’étude d’un cas clinique d’un patient atteint de polyarthrite rhumatoïde concomitante à une mastocytose systémique / Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are transcription factors implicated in lipid metabolism and glucose tolerance. Once activated by specific agonists, PPARs control inflammation associated with numerous diseases, notably Rheumatoid arthritis. The first study presented here aim to compare the anti-arthritic potency of two high-affinity synthetic agonists for PPARα and PPARγ in an experimental model. Then we focused on the effect of pioglitazone, a high-affinity synthetic agonists for PPARγ, and demonstrated that a per os treatment with this agonist not only reduced experimental arthritis but also inhibited partly inflammation-related bone loss by preserving bone microarchitecture. We pointed out that PPARγ, on one hand, regulated local and systemic expression of interleukine-17 (IL-17) and RANKL and on the other hand, inhibited expression of transcription factor RORγt, a main regulator of IL-17/Th17 pathway. Study of mice deficient for PPARγ confirmed its major role in the development of the arthritic process since these mice developed spontaneously arthritis. Of interest arthritis in these mice is associated with increased number of synovial mast cells able to produce IL-17 and their own differenciation factor, the SCF. Finally, we discussed the possible link between inflammatory arthritis and mastocytosis in a case report of a patient suffering from rheumatoid arthritis concomitant to systemic mastocytosis