京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20267号 / 医博第4226号 / 新制||医||1021(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 坂井 義治, 教授 竹内 理 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21648号 / 医博第4454号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 小池 薫, 教授 Shohab YOUSSEFIAN / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

Evidências clínicas e experimentais mostram que a isquemia e reperfusão intestinal (I/R-intestinal) induz lesão pulmonar aguda (LPA) que, em casos mais graves, pode evoluir para a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A LPA se caracteriza pela liberação de amplo espectro de mediadores inflamatórios, infiltração de neutrófilos e aumento de permeabilidade vascular. Sabe-se que mediadores inflamatórios gerados no local da I/R-intestinal são transportados pelo sistema linfático mesentérico e, ao atingirem o pulmão, contribuem para a LPA. A enzima heme oxigenase 1 (HO-1), exerce importante função na homeostasia celular, devido à sua ação catabólica sobre o grupo heme das hemoproteínas, gerando como subprodutos ferro, biliverdina e monóxido de carbono. Esses subprodutos possuem ação antiinflamatória, antioxidante e antiapoptótica. Todavia, o papel da HO-1 no controle da LPA causada pela I/R-intestinal ainda não está totalmente esclarecido. No presente estudo investigamos a expressão da HO-1 e o efeito de sua indução sobre as repercussões pulmonares decorrentes da I/R-intestinal. Para tanto, ratos machos Wistar (220-250 g) foram submetidos a 45 min de isquemia intestinal pela obstrução da artéria mesentérica superior e a 2 h de reperfusão. O grupo controle consistiu de animais falsamente operados (Sham). Ainda, a indução da HO-1 foi realizada pelo tratamento dos animais com o composto Hemin (10 mg/kg) 48 e 24 h antes da indução da I/R-intestinal. A I/R-intestinal aumentou a atividade pulmonar da mieloperoxidase (MPO) e o extravasamento do corante azul de Evans (AE) no pulmão. Os níveis de IL-1<font face=\"Symbol\">b elevaram no explante pulmonar (24 h) enquanto os de IL-10 foram reduzidos após a I/R-intestinal. Ainda, a I/R-intestinal diminui a expressão pulmonar da SOD-1 e promoveu aumento da expressão da iNOS. Os resultados obtidos revelam que a I/R-intestinal por si só não induziu a expressão gênica da enzima HO-1, porém o tratamento dos animais com Hemin elevou a sua expressão, a qual foi acompanhada pela redução da atividade pulmonar de MPO e do extravasamento do corante AE. Os elevados níveis pulmonares de IL-1<font face=\"Symbol\">b foram reduzidos pelo tratamento dos animais com o Hemin e houve elevação da IL-10 e VEGF no mesmo tecidos. A indução da HO-1 preveniu o aumento dos níveis de IL-1<font face=\"Symbol\">b e IL-10 e promoveu aumento dos níveis de VEGF na linfa dos animais. Com respeito ao sistema antioxidante, nossos dados indicaram que a indução da HO-1, parece estar relacionada com a elevação da expressão de SOD-1, SOD-2 e redução da expressão de iNOS. Concluindo, os dados obtidos permitem sugerir que a indução prévia da expressão de HO-1 controla a magnitude da lesão pulmonar causada pela I/R-intestinal por mecanismos envolvendo o aumento da atividade de parcela do sistema antioxidante e regulação do balanço entre a geração de citocinas antiinflamatórias e pró-inflamatórias no pulmão. / Clinical and experimental evidences have reported that intestinal ischemia and reperfusion (I/R-intestinal) induces acute lung injury (ALI), which in severe cases can progress to acute respiratory distress syndrome (ARDS). The ALI is characterized by the release of a broad spectrum of inflammatory mediators, neutrophil infiltration and increased vascular permeability. It is known that inflammatory mediators generated at the site of I/R-intestinal are transported by the mesenteric lymphatic system and, on reaching the lung, contribute to the ALI. The enzyme heme oxygenase 1 (HO-1) plays an important role in cellular homeostasis, due to its catabolic action on heme group of hemoproteins, forming as by-products such as iron, biliverdin and carbon monoxide. It is known that these by-products have anti-inflammatory, antioxidant and antiapoptotic actions. However, the role of HO-1 in the control of ALI caused by I/R-intestinal is not yet fully understood. In the present study we investigated the expression of HO-1 and the effects of its induction on pulmonary complications resulting from I/R-intestinal. So, male Wistar rats (220-250 g) were subjected to 45 min of intestinal ischemia by occlusion of the superior mesenteric artery and 2 h of reperfusion. The control group consisted of animals falsely operated (Sham). Still, the induction of HO-1 was performed by treating animals with the compound Hemin (10 mg/kg) 48 and 24 h before the induction of I/R-intestinal. The I/R-intestinal increased the pulmonary activity of the myeloperoxidase (MPO) and the extravasation of Evans blue dye (EB) in the lung. Levels of IL-1<font face=\"Symbol\">b increased in lung explant (24 h) while the IL-10 were reduced after I/R-intestinal. Further, the I/R-intestinal reduces pulmonary expression of SOD-1 and promoted the increase of iNOS expression. The results indicate that the I/R-intestinal alone did not induce gene expression of HO-1 enzyme, but the treatment of animals with Hemin increased its expression which was accompanied by reduction of pulmonary activity of MPO and extravasation of the dye EB. The high pulmonary levels of IL-1 were reduced by treatment of animals with Hemin and there was an increase of IL-10 and VEGF in the same tissue. The Induction of HO-1 prevented the increased levels of IL-<font face=\"Symbol\">b 1 and IL-10 and promoted increasing of the VEGF levels in the animals lymph. With respect to the antioxidant system, our data indicate that induction of HO-1, seems to be related to the elevation of expression of SOD-1, SOD-2 and reduction of iNOS expression. In conclusion, our data may suggest that prior induction of HO-1 expression controls the magnitude of lung injury caused by I/R-intestinal by mechanisms involving increased activity of a portion of the antioxidant system and regulation of the balance between generation anti-inflammatory cytokines and pro-inflammatory in the lung.

Evidências clínicas e experimentais mostram que a isquemia e reperfusão intestinal (I/R-intestinal) induz lesão pulmonar aguda (LPA) que, em casos mais graves, pode evoluir para a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A LPA se caracteriza pela liberação de amplo espectro de mediadores inflamatórios, infiltração de neutrófilos e aumento de permeabilidade vascular. Sabe-se que mediadores inflamatórios gerados no local da I/R-intestinal são transportados pelo sistema linfático mesentérico e, ao atingirem o pulmão, contribuem para a LPA. A enzima heme oxigenase 1 (HO-1), exerce importante função na homeostasia celular, devido à sua ação catabólica sobre o grupo heme das hemoproteínas, gerando como subprodutos ferro, biliverdina e monóxido de carbono. Esses subprodutos possuem ação antiinflamatória, antioxidante e antiapoptótica. Todavia, o papel da HO-1 no controle da LPA causada pela I/R-intestinal ainda não está totalmente esclarecido. No presente estudo investigamos a expressão da HO-1 e o efeito de sua indução sobre as repercussões pulmonares decorrentes da I/R-intestinal. Para tanto, ratos machos Wistar (220-250 g) foram submetidos a 45 min de isquemia intestinal pela obstrução da artéria mesentérica superior e a 2 h de reperfusão. O grupo controle consistiu de animais falsamente operados (Sham). Ainda, a indução da HO-1 foi realizada pelo tratamento dos animais com o composto Hemin (10 mg/kg) 48 e 24 h antes da indução da I/R-intestinal. A I/R-intestinal aumentou a atividade pulmonar da mieloperoxidase (MPO) e o extravasamento do corante azul de Evans (AE) no pulmão. Os níveis de IL-1<font face=\"Symbol\">b elevaram no explante pulmonar (24 h) enquanto os de IL-10 foram reduzidos após a I/R-intestinal. Ainda, a I/R-intestinal diminui a expressão pulmonar da SOD-1 e promoveu aumento da expressão da iNOS. Os resultados obtidos revelam que a I/R-intestinal por si só não induziu a expressão gênica da enzima HO-1, porém o tratamento dos animais com Hemin elevou a sua expressão, a qual foi acompanhada pela redução da atividade pulmonar de MPO e do extravasamento do corante AE. Os elevados níveis pulmonares de IL-1<font face=\"Symbol\">b foram reduzidos pelo tratamento dos animais com o Hemin e houve elevação da IL-10 e VEGF no mesmo tecidos. A indução da HO-1 preveniu o aumento dos níveis de IL-1<font face=\"Symbol\">b e IL-10 e promoveu aumento dos níveis de VEGF na linfa dos animais. Com respeito ao sistema antioxidante, nossos dados indicaram que a indução da HO-1, parece estar relacionada com a elevação da expressão de SOD-1, SOD-2 e redução da expressão de iNOS. Concluindo, os dados obtidos permitem sugerir que a indução prévia da expressão de HO-1 controla a magnitude da lesão pulmonar causada pela I/R-intestinal por mecanismos envolvendo o aumento da atividade de parcela do sistema antioxidante e regulação do balanço entre a geração de citocinas antiinflamatórias e pró-inflamatórias no pulmão. / Clinical and experimental evidences have reported that intestinal ischemia and reperfusion (I/R-intestinal) induces acute lung injury (ALI), which in severe cases can progress to acute respiratory distress syndrome (ARDS). The ALI is characterized by the release of a broad spectrum of inflammatory mediators, neutrophil infiltration and increased vascular permeability. It is known that inflammatory mediators generated at the site of I/R-intestinal are transported by the mesenteric lymphatic system and, on reaching the lung, contribute to the ALI. The enzyme heme oxygenase 1 (HO-1) plays an important role in cellular homeostasis, due to its catabolic action on heme group of hemoproteins, forming as by-products such as iron, biliverdin and carbon monoxide. It is known that these by-products have anti-inflammatory, antioxidant and antiapoptotic actions. However, the role of HO-1 in the control of ALI caused by I/R-intestinal is not yet fully understood. In the present study we investigated the expression of HO-1 and the effects of its induction on pulmonary complications resulting from I/R-intestinal. So, male Wistar rats (220-250 g) were subjected to 45 min of intestinal ischemia by occlusion of the superior mesenteric artery and 2 h of reperfusion. The control group consisted of animals falsely operated (Sham). Still, the induction of HO-1 was performed by treating animals with the compound Hemin (10 mg/kg) 48 and 24 h before the induction of I/R-intestinal. The I/R-intestinal increased the pulmonary activity of the myeloperoxidase (MPO) and the extravasation of Evans blue dye (EB) in the lung. Levels of IL-1<font face=\"Symbol\">b increased in lung explant (24 h) while the IL-10 were reduced after I/R-intestinal. Further, the I/R-intestinal reduces pulmonary expression of SOD-1 and promoted the increase of iNOS expression. The results indicate that the I/R-intestinal alone did not induce gene expression of HO-1 enzyme, but the treatment of animals with Hemin increased its expression which was accompanied by reduction of pulmonary activity of MPO and extravasation of the dye EB. The high pulmonary levels of IL-1 were reduced by treatment of animals with Hemin and there was an increase of IL-10 and VEGF in the same tissue. The Induction of HO-1 prevented the increased levels of IL-<font face=\"Symbol\">b 1 and IL-10 and promoted increasing of the VEGF levels in the animals lymph. With respect to the antioxidant system, our data indicate that induction of HO-1, seems to be related to the elevation of expression of SOD-1, SOD-2 and reduction of iNOS expression. In conclusion, our data may suggest that prior induction of HO-1 expression controls the magnitude of lung injury caused by I/R-intestinal by mechanisms involving increased activity of a portion of the antioxidant system and regulation of the balance between generation anti-inflammatory cytokines and pro-inflammatory in the lung.

A lesão de isquemia e reperfusão (IR) é um evento que pode elevar o risco de morte após o transplante pulmonar, por ativar o sistema imune inato a induzir a inflamação. Em situação de isquemia, a oferta de oxigênio se encontra abaixo das necessidades metabólicas, resultando na depleção das reservas celulares de ATP e no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). Adicionalmente, a IR desencadeia um processo inflamatório intenso, caracterizado principalmente pela presença de neutrófilos e macrófagos ativados, os quais liberam inúmeros mediadores inflamatórios, perpetuando a inflamação. Nossa hipótese inicial era que a suplementação com creatina (Cr) poderia atenuar a lesão de IR pelo aumento dos níveis de fosfocreatina (PCr) nas células, o que facilitaria a formação de adenosina trifosfato (ATP), promovendo a manutenção dos níveis de Ca2+ intracelular, desestimulando assim a formação de EROs e, consequentemente, diminuindo o processo inflamatório. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da suplementação com creatina na atenuação da lesão de IR em ratos submetidos ao transplante pulmonar, segundo aspectos inflamatórios, estruturais e funcionais do tecido pulmonar. Foram utilizados 64 ratos machos da raça Sprague Dawley distribuídos em quatro grupos: A90, controle/água + 90 minutos de isquemia; Cr90, creatina + 90 minutos de isquemia; A180, controle/água + 180 minutos de isquemia; Cr180, creatina + 180 minutos de isquemia. Os animais doadores receberam creatina (0,5g/kg/dia) diariamente durante cinco dias antes do transplante pulmonar. Os animais do grupo controle receberam apenas o veículo. Após a extração, os pulmões permaneceram em isquemia fria por 90 ou 180 minutos sendo, a seguir, implantados e reperfundidos por 120 minutos. Ao final da reperfusão, foram coletados os dados de mecânica respiratória, além de amostras de ar exalado, sangue arterial e periférico, lavado broncoalveolar e tecido pulmonar. Os parâmetros avaliados foram: resistência das vias aéreas, resistência e elastância do tecido pulmonar, óxido nítrico exalado, pressão parcial de oxigênio e de dióxido de carbono, creatinina sérica, células inflamatórias, índice de edema, PCNA, Caspase-3, TLR 4 e 7, IL1-beta, IL6, TNF-alfa, IL10 e CINC1. Os animais tratados com creatina apresentaram melhora da mecânica pulmonar, dos níveis de creatinina sérica, da gasometria arterial, além da diminuição da fração exalada de óxido nítrico e da inflamação verificada no sangue periférico, no lavado broncoalveolar e no parênquima pulmonar. Estes animais também apresentaram diminuição da proliferação e da apoptose de células inflamatórias, de TLR4, dos níveis de IL6 e CINC1, além de aumento de IL10. Concluímos que o prétratamento com creatina tem efeito protetor na lesão de IR após transplante pulmonar unilateral em ratos / Ischemia and reperfusion injury (IRI) is an event that can increase the risk of death after lung transplantation (LTx) by activating the innate immune system to induce inflammation. In ischemia events, oxygen supply is below metabolic requirements, resulting in depletion of ATP cellular reserves and increased production of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS). In addition, IRI triggers an intense inflammatory process characterized mainly by the presence of activated neutrophils and macrophages, which release innumerable inflammatory mediators, perpetuating the inflammation. Our initial hypothesis was that creatine supplementation (Cr) could attenuate IRI by increasing phosphocreatine (PCr) levels in cells, which would facilitate the formation of adenosine triphosphate (ATP), promoting the maintenance of intracellular Ca2+ levels, thus discouraging the formation of ROS and, consequently, decreasing the inflammatory process. Therefore, the objective of this study was to evaluate the role of Cr supplementation in the attenuation of IRI in rats underwent to LTx in according to inflammatory, structural and functional aspects of the lung tissue. Sixty Sprague Dawley male rats were distributed into four groups: A90, control / water + 90 minutes of ischemia; Cr90, creatine + 90 minutes of ischemia; A180, control / water + 180 minutes of ischemia; Cr180, creatine + 180 minutes of ischemia. Donor animals received creatine (0.5g/kg/day) daily for five days prior to LTx. Animals in the control group received only the vehicle. The donor`s lung remained in cold ischemia for 90 or 180 minutes and then, were implanted and reperfused during 120 minutes. After reperfusion, respiratory mechanics data were performed and collected samples of exhaled air, arterial and peripheral blood, bronchoalveolar lavage fluid and pulmonary tissue. The parameters evaluated were: airway resistance, resistance and elastance of the pulmonary tissue, exhaled nitric oxide, partial pressure of oxygen and carbon dioxide, serum creatinine, inflammatory cells, edema index, PCNA, Caspase-3, TLR 4 and 7, IL1-beta, IL6, TNF-alpha, IL10, and CINC1. The animals treated with Cr showed an improvement in pulmonary mechanics, serum creatinine levels, and arterial blood gases. In addition, there was a decrease in the exhaled fraction of nitric oxide and in the inflammation in the peripheral blood, BALF, and pulmonary parenchyma in creatine-treated animals. These rats also had a decrease in the proliferation and apoptosis of inflammatory cells, TLR4, IL6, and CINC1. Moreover, there was an increase in the IL10 levels after Cr treatment. We conclude that pre-treatment with Cr has a protective effect on IRI after LTx in rats

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A lesão de isquemia e reperfusão (IR) é um evento que pode elevar o risco de morte após o transplante pulmonar, por ativar o sistema imune inato a induzir a inflamação. Em situação de isquemia, a oferta de oxigênio se encontra abaixo das necessidades metabólicas, resultando na depleção das reservas celulares de ATP e no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). Adicionalmente, a IR desencadeia um processo inflamatório intenso, caracterizado principalmente pela presença de neutrófilos e macrófagos ativados, os quais liberam inúmeros mediadores inflamatórios, perpetuando a inflamação. Nossa hipótese inicial era que a suplementação com creatina (Cr) poderia atenuar a lesão de IR pelo aumento dos níveis de fosfocreatina (PCr) nas células, o que facilitaria a formação de adenosina trifosfato (ATP), promovendo a manutenção dos níveis de Ca2+ intracelular, desestimulando assim a formação de EROs e, consequentemente, diminuindo o processo inflamatório. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da suplementação com creatina na atenuação da lesão de IR em ratos submetidos ao transplante pulmonar, segundo aspectos inflamatórios, estruturais e funcionais do tecido pulmonar. Foram utilizados 64 ratos machos da raça Sprague Dawley distribuídos em quatro grupos: A90, controle/água + 90 minutos de isquemia; Cr90, creatina + 90 minutos de isquemia; A180, controle/água + 180 minutos de isquemia; Cr180, creatina + 180 minutos de isquemia. Os animais doadores receberam creatina (0,5g/kg/dia) diariamente durante cinco dias antes do transplante pulmonar. Os animais do grupo controle receberam apenas o veículo. Após a extração, os pulmões permaneceram em isquemia fria por 90 ou 180 minutos sendo, a seguir, implantados e reperfundidos por 120 minutos. Ao final da reperfusão, foram coletados os dados de mecânica respiratória, além de amostras de ar exalado, sangue arterial e periférico, lavado broncoalveolar e tecido pulmonar. Os parâmetros avaliados foram: resistência das vias aéreas, resistência e elastância do tecido pulmonar, óxido nítrico exalado, pressão parcial de oxigênio e de dióxido de carbono, creatinina sérica, células inflamatórias, índice de edema, PCNA, Caspase-3, TLR 4 e 7, IL1-beta, IL6, TNF-alfa, IL10 e CINC1. Os animais tratados com creatina apresentaram melhora da mecânica pulmonar, dos níveis de creatinina sérica, da gasometria arterial, além da diminuição da fração exalada de óxido nítrico e da inflamação verificada no sangue periférico, no lavado broncoalveolar e no parênquima pulmonar. Estes animais também apresentaram diminuição da proliferação e da apoptose de células inflamatórias, de TLR4, dos níveis de IL6 e CINC1, além de aumento de IL10. Concluímos que o prétratamento com creatina tem efeito protetor na lesão de IR após transplante pulmonar unilateral em ratos / Ischemia and reperfusion injury (IRI) is an event that can increase the risk of death after lung transplantation (LTx) by activating the innate immune system to induce inflammation. In ischemia events, oxygen supply is below metabolic requirements, resulting in depletion of ATP cellular reserves and increased production of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS). In addition, IRI triggers an intense inflammatory process characterized mainly by the presence of activated neutrophils and macrophages, which release innumerable inflammatory mediators, perpetuating the inflammation. Our initial hypothesis was that creatine supplementation (Cr) could attenuate IRI by increasing phosphocreatine (PCr) levels in cells, which would facilitate the formation of adenosine triphosphate (ATP), promoting the maintenance of intracellular Ca2+ levels, thus discouraging the formation of ROS and, consequently, decreasing the inflammatory process. Therefore, the objective of this study was to evaluate the role of Cr supplementation in the attenuation of IRI in rats underwent to LTx in according to inflammatory, structural and functional aspects of the lung tissue. Sixty Sprague Dawley male rats were distributed into four groups: A90, control / water + 90 minutes of ischemia; Cr90, creatine + 90 minutes of ischemia; A180, control / water + 180 minutes of ischemia; Cr180, creatine + 180 minutes of ischemia. Donor animals received creatine (0.5g/kg/day) daily for five days prior to LTx. Animals in the control group received only the vehicle. The donor`s lung remained in cold ischemia for 90 or 180 minutes and then, were implanted and reperfused during 120 minutes. After reperfusion, respiratory mechanics data were performed and collected samples of exhaled air, arterial and peripheral blood, bronchoalveolar lavage fluid and pulmonary tissue. The parameters evaluated were: airway resistance, resistance and elastance of the pulmonary tissue, exhaled nitric oxide, partial pressure of oxygen and carbon dioxide, serum creatinine, inflammatory cells, edema index, PCNA, Caspase-3, TLR 4 and 7, IL1-beta, IL6, TNF-alpha, IL10, and CINC1. The animals treated with Cr showed an improvement in pulmonary mechanics, serum creatinine levels, and arterial blood gases. In addition, there was a decrease in the exhaled fraction of nitric oxide and in the inflammation in the peripheral blood, BALF, and pulmonary parenchyma in creatine-treated animals. These rats also had a decrease in the proliferation and apoptosis of inflammatory cells, TLR4, IL6, and CINC1. Moreover, there was an increase in the IL10 levels after Cr treatment. We conclude that pre-treatment with Cr has a protective effect on IRI after LTx in rats

A isquemia e reperfusão intestinal (I/R-i) é relevante fator para o desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A lesão tecidual decorrente da I/R-i pode ser local e em órgãos distante do sitio isquêmico, notadamente o pulmão. Indivíduos submetidos à isquemia intestinal ao tornarem-se vulneráveis, desenvolvem resposta exacerbada a estímulos inflamatórios secundários constituindo assim a percepção de lesão decorrente de uma dupla agressão. Neste estudo desenvolvemos modelo murino de dupla agressão pulmonar ocasionada pela I/R-i seguida de estímulo da instilação nasal de LPS ou de suco gástrico (SG). A fase de caracterização do modelo de I/R-i revelou aumento de IL-6, G-CSF, KC, IP-10 e MCP-1, mas não de TNF-a no soro e em homogeneizados de pulmão e intestino. Anticorpos anti TNF-a e o etanercepte falharam em inibir o aumento de MPO pulmonar e intestinal após a I/R-i. A instilação nasal de LPS após a I/R-i aumentou a atividade pulmonar de MPO e exacerbou a permeabilidade vascular pulmonar. Neste caso, aminoguanidina ou a vimblastina reverterem o aumento da permeabilidade vascular, sugerindo a participação conjunta de neutrófilos e óxido nítrico no processo lesivo causado pela dupla agressão. A instilação nasal de SG induziu aumento inicial (2h) de MPO pulmonar seguido de influxo de neutrófilos (24h) para o espaço alveolar. Tal processo foi acompanhado por expressão inicial e transiente de TNF-a no LBA e contrabalanceada por IL-10. A resposta inflamatória aumentada de camundongos IL-10 KO à instilação de suco gástrico mostra o papel fundamental desta citocina do controle da inflamação. O rolipram ou o composto PKF 241-466 (inibidores de TNF-a) reduziram a inflamação pulmonar induzida pelo SG. A instilação de SG após a I/R-i (I/R-i +SG) exacerbou o aumento da permeabilidade vascular pulmonar. Os dados apresentados sugerem que a exposição do organismo ao trauma intestinal torna o pulmão suscetível a um estímulo secundário como o LPS e o suco gástrico. Visto a gama de estímulos inflamatórios a que indivíduos internados em unidades de terapia intensiva podem ser submetidos, os resultados deste estudo podem contribuir para a compreensão dos mecanismos reguladores do recrutamento de neutrófilos e geração de mediadores inflamatórios na síndrome do desconforto respiratório agudo. / Intestinal ischemia and reperfusion (I/R) is implicated as a prime initiating event in the development of systemic inflammatory syndrome and Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). Several studies pointed the possibility of massive systemic inflammatory events rendering the lungs more susceptible to an exacerbated inflammatory response, the so called two-hit hypothesis. In this way, minor local inflammatory stimuli could be a trigger for ARDS. In this study we investigated the effects of low-dose LPS or gastric juice (GJ) administered by nasal instillation to mice previously submitted to intestinal I/R. Our data showed that i-I/R alone induced histological signs of edema in lung as well as an increase of lung MPO activity and IL-6, G-CSF, KC, IP-10 and MCP-1 levels. Nasal instillation of LPS following i-I/R increased lung MPO activity and exacerbated lung vascular permeability. In this case, aminoguanidine or vinblastine blocked the increase of vascular permeability, suggesting the role of neutrophils and nitric oxide in injury induced by the two-hit stimuli. Instillation of GJ induced an initial (2h) increase of lung MPO followed by the influx of neutrophils (24h) to the alveolar space. Such process was followed by the transient expression of TNF-a in BAL and balanced by IL-10. The exacerbated inflammatory response of IL-10 KO mice to GJ instillation shows the importance of this cytokine in the control of the inflammation in such model. Treatment with rolipram or PKF 241-466 compound (TNF-a inhibitors) reduced lung inflammation induced by GJ. Nasal instillation of GJ after i-I/R exacerbated the increase in lung vascular permeability. The data shown suggest that the exposition of the organism to mesenteric trauma primes the host organism to a secondary inflammatory stimulus such as LPS or gastric juice. Considering the possible multiple insults to lung to which patients in intensive care units are submitted, the results of this study might contribute to the understanding of the regulatory mechanisms of neutrophils and generation of inflammatory mediators in the context of ARDS.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-&#946; 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão. / &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors are present in several cells that participate in tissue repair such as fibroblasts, keratinocytes, inflammatory cells and endothelial cells. Several studies demonstrate that these receptors modulate cutaneous wound healing. However, neither study demonstrated if the blockade of theses receptors compromises the cutaneous wound healing of pressure ulcers. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors in wound healing of pressure ulcer in mice using a noninvasive model of lesion induced by ischemia and reperfusion. In this study, animals were also treated with propranolol (a nonselective antagonist of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors). Antagonism administration began one day before ischemia-reperfusion cycles and daily maintained until euthanasia. In order to develop a pressure ulcer, a shaved skin was placed between a pair of magnet disks. The period of magnet placement is characterized as ischemia period, whereas release period as reperfusion period. Two cycles of ischemia and reperfusion were performed, and after last cycle, two circular ulcers per animal were created in the animal dorsum. Animals were killed 3, 7, 14 and 21 days after wounding. After last ischemia cycle, blood flow of compressed area was nulled, 7 hours after compressed area underwent reperfusion during subsequent hours reaching blood flow 98% superior of normal skin. After 24 and 48 hours, blood flow of compressed area was again reduced when compared with normal skin. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the levels of lipid peroxydes 3 days after wounding, compromised keratinocyte migration leading to an increase epithelial proliferation and impairment in the re-epithelialization. The impairment in the neo-epidermis formation induced by &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade delayed the necrotic tissue loss. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the inflammatory cell number (macrophages and neutrophils), protein levels of neutrophil elastase 3 days after wounding and reduced protein levels of MCP-1 3 days after wounding and protein levels of MMP-12 7 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased cell proliferation and apoptosis in connective tissue 7 days after wounding and blood vessel density 14 and 21 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors impaired myofibroblastic differentiation and reduced protein levels of TGF-&#946; 1/2/3 3 days after wounding and lesion contraction. Twenty-one days after wounding, &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade increased neo-epidermis thickness and tenascin-C-positive fibroblast number and reduced collagen deposition. In conclusion, blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors delays cutaneous wound healing of pressure ulcers.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The musculoskeletal disorders are in the most common injuries observed in individuals in the primary care, occupational health, and in sports medicine. Among these disorders, the contusion is described as a direct traumatic lesion that impairs the functioning of the skeletal muscle system. An acute event of ischemia and reperfusion (I/R), on the other hand, could be considered as one of the main issue involved in the pathophysiology of a musculoskeletal disorder. Among the main strategies employed in the treatment of a lesion is the reduction of the temperature of the tissues with the therapeutic aim, this mechanism is defined as cryotherapy. Although the clinical efficacy of the cryotherapy is well established in the literature, the mechanisms involved in its therapeutic effects are unclear. The aim of this study was to analyze the effects of the cryotherapy in the treatment of a contusion and of an acute event of blood I/R in the gastrocnemius muscle of rats. Thus, we investigated the effects of cryotherapy under the biochemical and morphological changes related with a contusion (Article 1) and with an acute event of I/R (Manuscript 1), as well as the mechanisms involved in the genesis of its therapeutic effects. The treatment with cryotherapy determined a significant reduction in the oxidative damage since that limited the lipid peroxidation and the reactive oxygen species (ROS) formation, and also limited the lost of the cellular viability in the skeletal muscle tissue injured after a contusion (Article 1) and after an acute event of I/R (Manuscript 1). In this context, the levels of non enzymatic antioxidants, such as the levels of non protein thiols (-SH), and enzymatic antioxidants, such as the catalase enzyme (CAT), were also maintained similar to the observed in non injured muscles. The treatment with cryotherapy was effective in maintain the activities of enzymes sensitive to the oxidative stress, such as the lactate dehydrogenase (LDH) and the sodium/potassium (Na+/K+) and calcium (Ca2+) ATPases enzymes, similar to the observed in the tissues non injured both after a contusion (Article 1) and after as acute event of I/R (Manuscript 1). According to the histopathological analysis the cryotherapy treatment reduced the morphologic structure changes an also the presence of blood cells indicatives of hemorrhagic or inflammatory process in the skeletal muscle injured both after a contusion (Article 1) and after an acute event of I/R (Manuscript 1). In general, the results observed in this study indicate that an important mechanism by which the cryotherapy exerts its therapeutic effects is related with the reduction in the inflammatory response intensity in the site of the lesion. These results are indicated by the limited amount of inflammatory cells observed in the histopathological analysis and corroborated by the reduced activity of the myeloperoxidase (MPO) enzyme activity in the injured skeletal muscle tissue that was treated with cryotherapy. Furthermore, the cryotherapy limited the mitochondrial changes in the injured skeletal muscle tissue since that decreased the reactive species formation and maintained the mitochondrial membrane functionality both after a contusion (Article 1) and after an acute event of I/R (Manuscript 1). This result was indicated by the reduced swelling and limited impairment in the membrane potential (Δψ) in mitochondria of the injured skeletal muscle, and by the maintenance of the antioxidant levels similar to the observed in mitochondria of non injured skeletal muscle. Finally, the results of this study indicate that an acute event of I/R could be considered as an important mechanism involved in the pathophysiology of a musculoskeletal disorder since that determined biochemical and morphological changes similar to the observed after a skeletal muscle contusion. / As lesões musculoesqueléticas estão entre as maiores causas de lesões observadas em indivíduos nas áreas de primeiros socorros, na saúde ocupacional e na medicina do esporte. Dentre estas, a contusão é descrita como uma lesão traumática direta que compromete o funcionamento do sistema musculoesquelético. Um evento agudo de isquemia e reperfusão (I/R), por sua vez, pode ser considerado como um dos fatores fundamentais envolvidos na fisiopatologia de uma lesão musculoesquelética. Dentre as principais estratégias empregadas no tratamento de uma lesão está a redução na temperatura dos tecidos com o objetivo terapêutico, mecanismo este definido como crioterapia. Apesar da eficácia clínica os mecanismos pelos quais a crioterapia exerce os seus efeitos terapêuticos são pouco elucidados. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da crioterapia no tratamento de uma contusão e de um evento agudo de I/R sanguínea no músculo gastrocnêmio de ratos. Desta forma, investigamos os efeitos da crioterapia sobre as alterações bioquímicas e morfológicas relacionadas a uma contusão (Artigo 1) e a um evento agudo de I/R (Manuscrito 1), bem como os mecanismos envolvidos na origem de seus efeitos terapêuticos. O tratamento com a crioterapia determinou uma redução significativa no dano oxidativo ao limitar a peroxidação lipídica e a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), e também por limitar a perda da viabilidade celular no tecido muscular lesado após uma contusão (Artigo 1) e após um evento agudo de I/R (Manuscrito 1). Neste contexto, os níveis de antioxidantes nãoenzimáticos, tais como os níveis de tióis não-protéicos (-SH), e enzimáticos, tais como a enzima catalase (CAT), também foram mantidos semelhantes aos observados em músculos não lesados. O tratamento com a crioterapia foi efetivo em manter as atividades de enzima sensíveis ao estresse oxidativo, tais como a lactato desidrogenase (LDH) e as enzimas sódio/potássio (Na+/K+) e cálcio (Ca2+) ATPases, semelhantes as observadas nos tecidos não lesados tanto após uma contusão (Artigo 1), quanto após um evento agudo de I/R (Manuscrito 1). De acordo com as análises histopatológicas o tratamento com a crioterapia reduziu as alterações na estrutura morfológica e também a presença de células sanguíneas indicativas de processo hemorrágico ou inflamatório do tecido muscular lesado tanto após uma contusão (Artigo 1), quanto após um evento agudo de I/R (Manuscrito 1). Em geral os resultados observados neste estudo indicam que um importante mecanismo pelo qual a crioterapia exerce os seus efeitos terapêuticos está relacionado à redução na intensidade da resposta inflamatória no local da lesão. Este resultado foi indicado pela limitada quantidade de células inflamatórias observada nas análises histopatológicas e corroborado pela reduzida atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no tecido muscular lesado e submetido ao tratamento com a crioterapia. Além de reduzir a intensidade da resposta inflamatória, a crioterapia limitou as alterações mitocondriais no tecido muscular lesado ao diminuir a formação de espécies reativas e ao manter a funcionalidade da membrana mitocondrial tanto após uma contusão (Artigo 1), quanto após um evento agudo de I/R (Manuscrito 1). Este resultado foi indicado pelo reduzido inchaço e pelo limitado comprometimento no potencial de membrana mitocondrial (Δψ), além da manutenção dos níveis de antioxidante semelhantes aos observados em mitocôndrias de músculos não-lesados. Por fim, os resultados deste estudo indicam que um evento agudo de I/R pode ser considerado como um importante mecanismo envolvido na fisiopatologia de uma lesão musculoesquelética uma vez que determinou alterações bioquímicas e morfológicas semelhantes às observadas após uma contusão muscular.