A encefalopatia neonatal causada pela hipóxia-isquemia (HI) é uma importante causa de morte tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento. Diversas estratégias neuroprotetoras vêm sendo desenvolvidas para o tratamento deste tipo de lesão. O ambiente enriquecido (AE) surge como uma destas estratégias, pois se sabe que a interação social, estímulos visuais e sensoriais e atividade física proporcionadas pelo AE induzem mudanças comportamentais e neurofisiológicas. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do AE sobre a ansiedade, memória emocional, locomoção e expressão de proteína fibrilar glial ácida (GFAP) no hipocampo de ratos Wistar jovens submetidos à HI encefálica neonatal. Ratos wistar machos e fêmeas, no 7º dia pós-natal (DPN), foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal, no qual a artéria carótida comum esquerda é ocluída permanentemente e, na seqüência, os animais foram mantidos em uma atmosfera hipóxica (90 min, 8%O2-92%N2).Os animais foram divididos em quatro grupos: CTAP (controle ambiente padrão), CTAE (controle ambiente enriquecido), HIAP (hipóxia-isquemia ambiente padrão) e HIAE (hipóxia-isquemia ambiente enriquecido). Os animais dos grupos AE permaneceram no enriquecimento ambiental mantido desde o 8º DPN. Após o desmame os animais foram divididos em grupos e estimulados em AE (1h/dia por 2 semanas). Foram avaliados os efeitos da HI e do AE sobre a ansiedade na primeira exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE) e a memória emocional através de duas exposições ao LCE; a locomoção foi avaliada através de filmagem e avaliação cinemétrica da altura e tamanho da passada; e, para análise da morfologia foi realizada a técnica de imunofluorescência para a GFAP na região de CA1 do hipocampo. Não houve alteração no nível de ansiedade dos animais, nem pela HI, nem pelo AE. Na análise do primeiro para o segundo dia de exposição ao LCE todos os animais apresentaram diminuição no número de entradas nos braços abertos (EBA). Ao avaliar a porcentagem de EBA, o grupo HIAP foi o único que não diminuiu este índice entre as exposições. Foi observada uma diminuição do percentual de EBA entre os grupos HIAP e HIAE na segunda exposição; também foi identificada uma diminuição do tempo e porcentagem de tempo em braços abertos do primeiro para o segundo dia para os grupos CTAE e HIAE. Na segunda exposição os animais HIAE quando comparados ao HIAP apresentaram menor de tempo e percentual de permanência nos braços abertos. Houve diminuição do número de entradas nos braços fechados (EBF) do primeiro para o segundo dia em todos os grupos, exceto no grupo HIAP. Em conjunto, esses achados indicam um prejuízo na formação da memória emocional nos animais submetidos à HI, sendo revertido pelo AE. A avaliação da cinemetria, observada através da caminhada em plataforma horizontal, indicou que não houve diferença entre o tamanho e altura das passadas nos quatro grupos estudados. Nas análises morfológicas, não foram encontradas diferenças significativas no hipocampo contralateral à lesão, porém do lado ipsilateral foi revelado um aumento da densidade de astrócitos apenas no grupo HIAP. Na porcentagem de área ocupada por astrócitos GFAP+ há um aumento do porcentual em ambos os lados somente no grupo HIAP. Sendo assim, nossos resultados indicam que o enriquecimento ambiental contribui para a recuperação e/ou reversão do déficit da memória emocional em animais com lesão hipóxico-isquêmica, assim como o AE reverte e/ou previne o aumento da densidade e porcentagem de área ocupada por astrócitos na região CA1 do hipocampo. / Encephalopathy caused by neonatal hypoxia-ischemia (HI) is a major cause of death in both developed and developing countries. Several neuroprotective strategies have been developed for the treatment of this type of injury. The enriched environment (AE) emerges as one of these strategies, because we know that social interaction, visual and sensory and physical activities offered by AE induce behavioral and neurophysiological changes. The objective of this study was to investigate the effects of enriched environment on anxiety, emotional memory, motor behavior and expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the hippocampus of young Wistar rats submitted to neonatal HI. Male and female Wistar rats, on the 7th day postnatal (DPN) were subjected to the Levine-Rice HI neonatal, in which the left common carotid artery is permanently occluded and, subsequently, animals were kept in an hypoxic atmosphere (90 min, 8% O2, 92% N2). The animals were divided into four groups: CTAP (control environmental standard), CTAE (control enriched environment), HIAP (hypoxia-ischemia environmental standard) and HIAE (hypoxia-ischemia enriched environment). The AE animals groups were maintained in environmental enrichment since the 8th DPN. After weaning, animals were divided into groups and stimulated in another enriched environment (1 h per day, for 2 weeks). The animal´s behavior was observed on elevated plus maze (EPM); locomotion was evaluated by the walking behavior and for morphology analysis was performed by immunofluorescence for GFAP in the hippocampal CA1 region. There was no change in anxiety level of the animals, either by HI or by AE. When analyzing the first to the second day of exposure to EPM all animals showed a reduction in the number of entries into open arms (EOA). HIAP was the only group which did not show a reduction in the percentage of OAE in the first EPM exposure. In the second exposure, HIAE group reduced the percentage of EOA, when compared to HIAP. Considering TOA and percentage of TOA, AE groups showed a decrease from the first to the second day. In the second exposure there was a decrease in percentage of TOA and TOA in HIAE group when compared to the HIAP. There was a decrease in the number of closed arm entries (ECA) from first to second day in all groups except the group HIAP. Taking together, these findings indicate impairment in emotional memory in animals subjected to HI, being reversed by AE. The evaluation of the walking behavior showed no difference between the size and height of the steps in the four groups. In morphological analysis, no significant differences were found in the hippocampus contralateral to the lesion, but the ipsilateral side revealed an increased density of astrocytes only in the group HIAP. The percentage of area occupied by GFAP+ astrocytes increased on both sides in the HIAP group. Thus, our results indicate that environmental enrichment contributes to the recovery and / or reversal of the emotional memory deficit in animals with hypoxic-ischemic injury, as well as the enriched environment reverses and / or prevents the increase in density and percentage of area occupied by astrocytes in the hippocampal CA1 region.

Estudos com resveratrol (RSV) tiveram um crescimento exponencial nos últimos anos, especialmente focando seu efeito benéfico na saúde humana. Recentemente, foram publicados trabalhos mostrando um forte efeito neuroprotetor, não somente reduzindo lesões cerebrais, mas também promovendo a recuperação funcional após a isquemia cerebral. Entretanto, as bases moleculares para a neuroproteção ainda são desconhecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pelo resveratrol em modelos experimentais de isquemia cerebral. Inicialmente, demonstramos que o tratamento com RSV, administrado durante 7 dias antes da indução da lesão isquêmica, diminuiu a morte neuronal em hipocampo e córtex cerebral de ratos submetidos a isquemia cerebral global. Em paralelo, reduziu a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Este efeito foi associado com o aumento de antioxidantes endógenos, além da prevenção do aumento da peroxidação lipídica e da diminuição da atividade da Na+K+-ATPase induzidos pela isquemia cerebral global. Tendo em vista que o insulto isquêmico aumentou rapidamente os níveis de espécies reativas de oxigênio, investigamos o efeito do resveratrol sobre o perfil lipídico, e demonstramos que ele foi capaz de prevenir a diminuição de gangliosídeos, fosfolipídios e colesterol observada em hipocampo e córtex de ratos isquêmicos. A análise de vias de sinalização possivelmente envolvidas, mostrou que o efeito neuroprotetor do resveratrol envolve a modulação da via de sobrevivência PI3- K/Akt através da ativação de seus substratos GSK-3β e CREB. Adicionalmente, vias que controlam a neuroinflamação foram moduladas por resveratrol, o qual diminuiu a ativação glial, reduziu a fosforilação da JNK, diminuiu a translocação nuclear de NF- κB, reduzindo sua ativação e seus possíveis substratos iNOS e COX-2. A seguir avaliamos o efeito do resveratrol em promover a angiogênese em células endoteliais cerebrais e demonstramos que ele foi capaz de promover a proliferação, migração e indução da formação de tubo vascular in vitro. Além da função da célula, o RSV mostrou mudar o aspecto morfológico de células endoteliais do cérebro associadas com o rearranjo do citoesqueleto e relocalização de β-catenina e VE-caderina. A avaliação de vias de sinalização associadas com a angiogênese promovida pelo resveratrol, mostrou o envolvimento das vias PI3-K/Akt e MAPK/ERK, que regularam eNOS modulando os níveis de VEGF e metaloproteinases. Considerando que angiogênese e neurogênese são processos acoplados, investigamos o efeito do RSV no aumento de fatores tróficos e na plasticidade neuronal. Demonstramos que o RSV promoveu a recuperação funcional e está intimamente relacionada com o aumento da angiogênese e neurogênese após a isquemia cerebral focal. Em conjunto, nossos resultados abrem a perspectiva para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da isquemia cerebral. / Recent studies with resveratrol (RSV) have been growing exponentially throughout the years, especially focusing on its beneficial effect on human health. Recently published studies, showing strong neuroprotective effects of RSV, not only reduce brain damage, but also promotes functional recovery after stroke. However, the molecular basis for neuroprotection is still unknown. In this study, we evaluated various mechanisms that are modulated by RSV in experimental models of cerebral ischemia. Initially, we demonstrated that by administering RSV, for 7 days prior to global cerebral ischemia, decreased neuronal cell death in the cerebral cortex and hippocampus of rats as well as reducing the generation of oxygen and nitrogen reactive species. The observed neuroprotection was associated with increased endogenous antioxidants, a decrease of Na+ K+ ATPase, and the prevention of lipid peroxidation. With an ischemic insult, levels of ROS rapidly increase which may lead to a decrease in lipids. However, we investigated the effects of RSV on lipid profiles and it showed that it was able to prevent a decrease in the amount of gangliosides, phospholipids, and cholesterol observed in the hippocampus and cortex of ischemic rats. There are several possible signaling pathways of RSV. Analysis of these pathways reveals that the neuroprotective effects of RSV involve the modulation of PI3-K/Akt survival pathway by activating its substrates GSK-3β and CREB. Furthermore, RSV modulates pathways involved in neuroinflammation, decreasing glial activation, phosphorylation of JNK, nuclear translocation and activation of NF- κB and its possible substrates of iNOS and COX-2. Additionally, we also investigated the effects of RSV on angiogenesis in brain endothelial cells. Results showed that RSV was able to promote proliferation, migration and vascular tube formation in vitro. Signaling pathways associated with angiogenesis by RSV, involves PI3-K/Akt and MAPK/ERK pathways which both regulate eNOS in the modulation of VEGF and metalloproteinase levels. Furthermore, RSV showed that the morphological change of brain endothelial cells was associated with cytoskeletal rearrangement and relocation of β-catenin and VE-cadherin. Considering that angiogenesis and neurogenesis are coupled processes, we investigated the effects of RSV on the increase of trophic factors and neuronal plasticity. We demonstrate that RSV increased functional recovery as well as intimately related to the increase of angiogenesis and neurogenesis after focal cerebral ischemia. Therefore, our results open the perspective for the development of a new therapeutics for the treatment of stroke.

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O cérebro é altamente dependente de um fluxo sanguíneo contínuo para suprimento de oxigênio e glicose, e por esta razão, eventos isquêmicos resultam em grande degeneração celular. O resveratrol é um antioxidante natural encontrado nas uvas e no vinho tinto que possui efeitos antitumoral e antiinflamatório, bem como propriedades cardioprotetoras. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito neuroprotetor do resveratrol em um modelo in vitro de isquemia cerebral. Além disso, nós investigamos se este efeito estava correlacionado com as vias de sinalização da fosfoinositol3-quinase (PI3-k) e da proteína quinase ativada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase-MAPK), ambas envolvidas na regulação da proliferação e sobrevivência celular. Para isto, nós usamos cultura organotípica de hipocampo exposta à privação de oxigênio e glicose (POG) como modelo de isquemia cerebral. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de células mortas. Nas culturas expostas à POG na presença do veículo, aproximadamente 46% do hipocampo foi marcado com IP, indicando uma alta porcentagem de morte celular. Quando as culturas foram tratadas com resveratrol 10, 25 e 50µM, a morte celular foi reduzida para 22, 20 e 13%, respectivamente. Para elucidar o mecanismo pelo qual o resveratrol exerce seu efeito neuroprotetor nós investigamos a via PI3-k usando o inibidor LY294002 (5µM) e a via MAPK usando o inibidor PD98059 (20µM). A neuroproteção mediada pelo resveratrol (50µM) foi prevenida pelo LY294002, mas não pelo PD98059. A análise por immunoblotting revelou que o resveratrol 50µM induziu a fosforilação/ativação da Akt, a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β) 1, 6 e 24 h após a POG e a fosforilação/ativação da quinase regulada por sinais extracelulares (extracellular signal-regulated kinase-1 and -2-ERK1/2) 6 e 24 h após a POG. Juntos, o aumento da fosforilação da Akt e GSK-3β induzida pelo resveratrol após a POG e o efeito da inibição da PI3-k pelo LY294002 levando a diminuição da neuroproteção mediada pelo resveratrol, sugerem que a via PI3-k/Akt, associada à GSK-3β , estão envolvidas no mecanismo pelo qual o resveratrol protege as culturas organotípicas da morte celular.

Introdução - O achatamento da curva do pulso de oxigênio durante o teste de esforço cardiopulmonar com cargas progressivas tem sido proposto para melhorar a acurácia diagnóstica da isquemia miocárdica induzida pelo esforço. Entretanto, este critério não foi formalmente avaliado em pacientes de baixo risco, para os quais a melhora da acurácia diagnóstica pode ser clinicamente mais relevante. Objetivo - Testar a hipótese de que o achatamento da curva do pulso de oxigênio durante o teste de esforço cardiopulmonar pode detectar isquemia miocárdica extensa, mas não detectar isquemia miocárdica leve, usando como padrão ouro a cintilografia de perfusão miocárdica. Métodos - Oitenta e sete pacientes (idade média ± DP de 57 ± 11 anos, 64% do sexo masculino) referidos para cintilografia de perfusão miocárdica com exercício para diagnóstico de isquemia miocárdica foram também avaliados com teste de esforço cardiopulmonar. Um investigador identificou prospectivamente os pacientes que apresentaram defeito transitório de perfusão induzido pelo exercício na cintilografia miocárdica com 99mTcsestamibi. Outro investigador avaliou a resposta do pulso de oxigênio durante o exercício de cargas progressivas, sem o conhecimento da resposta eletrocardiográfica ou dos achados da cintilografia. Resultados - A cintilografia de perfusão miocárdica com exercício detectou defeitos transitórios de perfusão em 36% dos pacientes. Comparados com os pacientes com estudos de perfusão normal, os pacientes com isquemia vii induzida pelo exercício apresentaram duplo produto máximo (Isquemia: 33060±5489; Sem Isquemia: 31826±5343; p=0,17), consumo de oxigênio de pico (VO2 pico) (Isquemia: 29±8 mL/kg.min; Sem Isquemia: 30±8 mL/kg.min; p=0,59) e consumo de oxigênio do limiar anaeróbio (Isquemia: 64±12%; Sem Isquemia: 61±13%; p=0,15) similares. O pulso de oxigênio analisado a 25% (9,7±2 vs 9,3±2 ml/b), 50% (11,2±3 vs 10,8±3 ml/b), 75% (12,5±3 vs 11,9±3 ml/b) do VO2 pico, e no pico do exercício (15±4 vs 14±4 ml/b), não foram diferentes no grupo com Isquemia e Sem Isquemia, respectivamente. Entretanto, os pacientes com defeitos perfusionais transitórios extensos durante o exercício apresentaram um pulso de oxigênio no pico menor (12,8±3,8 vs 16,4±4,6 mL/b; p=0,035) e demonstraram um achatamento detectável na curva de pulso de oxigênio. Conclusão - A análise da resposta do pulso de oxigênio ao teste de esforço com cargas progressivas não identifica isquemia miocárdica leve. O achatamento do pulso de oxigênio no teste de esforço de cargas progressivas está presente apenas nos pacientes com isquemia miocárdica extensa.

O estrogênio, principal hormônio sexual feminino, tem importante papel na regulação da contratilidade miocárdica e função vascular. A escassez estrogênica esta associada ao aumento do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares em mulheres. Uma vez que o estrogênio tem capacidade antioxidante e age estimulando tanto a síntese, quanto a liberação do óxido nítrico (NO), um potente vasodilatador, buscou-se verificar qual a influência dessas propriedades do estrogênio na contratilidade cardíaca e na função coronariana. Para isso foram utilizadas 29 ratas Wistar (± 200g) divididas em 3 grupos: SHAM, o qual foi submetido à cirurgia fictícia (sham operation) de ovariectomia bilateral; OVX, que foi ovariectomizado e OVX+RH, que foi ovariectomizado e recebeu reposição estrogênica. Os grupos foram subdivididos em 2 sub-grupos para o procedimento de perfusão do coração isolado, de acordo com a solução utilizada (TYRODE ou TYRODE+LNAME). Sete dias após cirurgia de ovariectomia ou simulação da mesma, foi iniciada a reposição hormonal com a implantação de cápsulas preenchidas com 17β-estradiol (5%(p:v)) ou apenas óleo de girassol (grupos SHAM e OVX). A reposição persistiu por 21 dias e, ao término desse período, foi iniciada a determinação do ciclo estral nas ratas não submetidas à OVX. Foram utilizadas no experimento as ratas que se encontravam na fase do diesto. Feito isso, foi coletado sangue pelo plexo retrorbital, sob anestesia etérea, de todos os animais e, em seguida, eles foram mortos por deslocamento cervical e iniciado protocolo de isquemia-reperfusão. Esse protocolo consistiu de estabilização por 20 minutos, seguida de isquemia global normotérmica por 30 minutos e reperfusão por 20 minutos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: freqüência cardíaca (FC), pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), índice de contratilidade (+dP/dt), índice de relaxamento (-dP/dt) e pressão de perfusão (PP). Ao término do protocolo, os corações foram pesados e preparados para análise das concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) e nitratos totais (NO3 -), além da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). A concentração plasmática de 17β-estradiol no grupo SHAM foi de 30,7 ± 5,6 pg/ml. A OVX bilateral diminuiu em 53% a concentração estrogênica e a reposição hormonal aumentou 343% em relação ao grupo OVX as concentrações desse hormônio, comprovando a eficácia da reposição hormonal. A PP mostrou variação semelhante a atividade da CAT e oposta as concentrações de NO3 - e H2O2. Ao ser perfundido com TYRODE, o grupo OVX apresentou PP e atividade da CAT elevadas (28% e 20%, respectivamente) e menores concentrações de NO3 - e H2O2 (ambos 35%) em relação ao SHAM. Nos animais que receberam reposição hormonal, esses parâmetros foram parcialmente restabelecidos. Quando perfundidos com LNAME, foi observado, nos animais SHAM e OVX+RH, concentrações de NO3 - (22% e 18%, respectivamente) e H2O2 (36% e 30%, respectivamente) diminuídas e aumento na PP (54% e 22%, respectivamente) e CAT (19% e 31%, respectivamente) em relação aos mesmos grupos perfundidos com TYRODE. OVX-LNAME apresentaram menor contratura cardíaca isquêmica que os demais grupos. Não foram observadas diferenças significativas nos outros parâmetros hemodinâmicos, assim como na atividade da SOD, entre os demais grupos experimentais. Na ausência de estrogênio parece não haver uma dependência do NO na modulação do tônus vascular coronariano. Além do mais, parece haver uma influência desse vasodilatador no desenvolvimento da contratura cardíaca isquêmica nos animais ovariectomizados. Possivelmente o balanço desregulado entre pró e antioxidantes promova adaptações que alterem as respostas cardiovasculares à isquemia-reperfusão.

Objetivos: avaliar a eficiência da transfecção do brônquio isquêmico com phVEGF 165 e investigar a presença de revascularização sistêmica, no brônquio isquêmico, após três dias da aplicação deste plasmídio. Metodologia: cães submetidos a broncotomia e dissecção circunferencial hilar foram distribuídos aleatoriamente para receber a aplicação de terapia gênica com 50 μg de phVEGF 165 (grupo VEGF, n = 9) ou de solução fisiológica 0,9% (grupo controle, n = 9) no brônquio isquêmico. Após três dias, em 10 animais sobreviventes, coletamos amostras do brônquio isquêmico para extração do RNAm total e nos outros 7 cães, injetamos corante microvascular na aorta canina. Analisamos, nos segmentos de brônquio isquêmico, a expressão gênica (RT-PCR) e a expressão protéica do VEGF (imunoistoquímica anti-VEGF), além de verificar a presença de vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular. Resultados: o grupo VEGF apresentou 100% dos brônquios com vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular, enquanto que, no grupo controle, não houve evidências de vasos corados. Também o grupo VEGF mostrou a expressão gênica (p = 0,000) e protéica (p = 0,015) mais intensa que o grupo controle. Conclusão: o sucesso na transfecção do brônquio isquêmico com plasmídio phVEGF 165 estimulou a revascularização sistêmica em três dias.

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A hipóxia-isquemia (HI) encefálica é uma das causas mais frequentes de lesões graves com comprometimento crônico das capacidades neurológicas e também de óbito neonatal do mundo. A HI cerebral resulta em alterações hemodinâmicas, bioquímicas e neurofisiológicas como uma consequência direta da falta de oxigênio e glicose. Esses processos podem levar a um dano cerebral por meio da ativação de mecanismos citotóxicos e apoptóticos, que causam prejuízo e morte à célula. Recentemente, alguns estudos mostraram que os danos gerados pela HI neonatal apresentam dimorfismo sexual. Na presente tese, foram avaliados os efeitos da HI neonatal sobre parâmetros de estresse oxidativo e de dano celular após a lesão encefálica em machos e fêmeas a fim de se detectar a contribuição do dimorfismo sexual para a lesão. Foi observado que a HI aumentou a produção de radicais livres causando peroxidação lipídica, e também aumentou a atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase (1h e 2h após a HI). Além disso, a HI inibiu a atividade da enzima Na+, K+-ATPase imediatamente após a lesão. Estes dados demonstram que a HI foi capaz de induzir o estresse oxidativo e levar à perda de homeostase celular através da alteração no controle da bomba de Na+ e K+ no encéfalo dos neonatos após a lesão. Tendo em vista que a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) na célula nós investigamos os efeitos da HI sobre a função mitocondrial. Machos e fêmeas expostos à HI apresentaram diminuição na atividade do complexo II da cadeia respiratória em hipocampo, além de diminuição da massa e do potencial de membrana (Δψ) mitocondrial tanto no córtex quanto no hipocampo, 2h após o insulto. Por outro lado, em 18h, a atividade dos complexos (I-III, II e IV) da cadeia respiratória mostrou uma inibição severa que foi acompanhada de diminuição de massa e Δψ mitocondrial em ambos os sexos, exceto pelo fato dos machos não apresentarem diminuição na massa mitocondrial. Esses dados mostram que a formação de espécies reativas bem como a peroxidação lipídica ocorre provavelmente devido à inibição da atividade dos complexos da cadeia respiratória. Tão importante quanto a disfunção mitocondrial induzida pela HI, os resultados apontam a presença de dimorfismo sexual neste parâmetro avaliado, uma vez que as fêmeas, além de apresentarem uma atividade dos complexos da cadeia respiratória per se maior quando comparadas aos machos, elas mostraram-se mais vulneráveis ao dano da HI. Com a finalidade de identificar a possível contribuição da autofagia para as diferentes alterações mitocondriais encontradas em machos e fêmeas, a atividade autofágica foi mensurada nos neonatos 18h após a lesão. Nós constatamos que as alterações encontradas – estresse oxidativo e disfunção mitocondrial – foram capazes de induzir a atividade autofágica. Entretanto esta se manifestou de forma distinta em córtex e hipocampo e também de maneira diferente em machos e fêmeas. No córtex, as fêmeas submetidas à HI tiveram aumento no número de autofagossomos (ativação da autofagia), porém diminuição dos autolisossomos, demonstrando uma possível inibição de algum passo final do processo. Já no hipocampo, os machos submetidos à HI tiveram indução da autofagia e as fêmeas apresentaram um aumento per se da atividade autofágica tanto nos animais controle quanto nos HI. É possível que o aumento das EROs pela cadeia respiratória e a perda de Δψ mitocondrial tenham induzido a autofagia após a lesão causada pela HI no encéfalo dos neonatos. Essas diferenças sexo-específicas são importantes não somente para entendermos o mecanismo de dano causado pelo insulto, mas também para direcionarmos os estudos sobre as estratégias terapêuticas de acordo com o sexo do indivíduo afetado. / Brain hypoxia-ischemia (HI) is one of the most common causes of severe chronic impairment of neurological abilities and also neonatal death in the world. Brain HI results in hemodynamic, biochemical and neurophysiological changes as a direct consequence of oxygen and glucose absence. These processes can lead to brain damage through activation of cytotoxic and apoptotic mechanisms, which cause injury and death to the cell. Recently, some studies have shown that the damage caused by neonatal HI presents sexual dimorphism. In this thesis, it was evaluated the effects of neonatal HI on oxidative stress parameters and cell damage after brain lesion in males and females to verify sexual dimorphism contribution to the lesion. It was observed that HI increased free radicals production leading to lipid peroxidation and also increased superoxide dismutase activity (1h and 2h after HI). Besides, HI inhibited Na+, K+-ATPase activity immediately after injury. These data demonstrated that HI was able to induce oxidative stress and lead to cell homeostase loss through modifications on Na+ and K+ pump control in neonatal brain after injury. Considering that mitochondria are the main source of reactive oxygen species (ROS) in cell we investigated the effects of HI on mitochondrial function. Males and females exposed to HI showed a decrease in complex II activity of hippocampal respiratory chain in addition to diminished mass and mitochondrial membrane potential (Δψ) in both cortex and hippocampus, 2h after insult. On the other hand, at 18h activity of respiratory chain complexes (I-III, II e IV) showed a severe inhibition that was accompanied by a decrease of mitochondrial mass and Δψ in both sexes, except that males do not show decrease in mitochondrial mass. These data demonstrated that reactive species formation and lipid peroxidation probably occur due to inhibition of respiratory chain complexes activities. Just as important as mitochondrial dysfunction induced by HI, results indicate the presence of sexual dimorphism on this parameter, since females, besides having a higher per se activity of respiratory chain complexes compared to males, they were more vulnerable to HI damage. In order to identify the possible contribution of autophagy to the distinct mitochondrial alterations found in males and females, autophagic activity was measured in neonates 18h after injury. We verify that changes found – namely oxidative stress and mitochondrial dysfunction - were able to induce autophagic activity. However, it manifested differently in cortex and hippocampus and also in males and females. In the cortex, females subjected to HI had an increase in autophagosomes (activation of autophagy), but decreased autolysosomes, showing a possible inhibition of a final step of the process. On hippocampus, males subjected to HI had autophagy induction and females showed a per se increase in autophagic activity in both control and HI animals. It is possible that ROS increased in respiratory chain and loss of mitochondrial Δψ had induced autophagy after lesion caused by HI in the neonatal brain. These sex-specific differences are important not only to understand the mechanism of damage caused by HI insult, but also to direct studies on the therapeutic strategies according to the sex of the affected subject.

Introdução: embora a lesão por isquemia e reperfusão (I/R) renal possa ser reduzida por resfriamento, nenhuma análise sistemática in vivo da influência da temperatura foi empregada até o momento para avaliar o efeito de diferentes temperaturas nos danos provocados pela I/R renal. Objetivos: desenvolver um modelo experimental em ratos para avaliar os efeitos da variação local de temperatura (hipotermia renal tópica) nos danos, ou na prevenção destes, provocados por I/R. Além do desenvolvimento do modelo experimental, outro objetivo foi medir o efeito do estresse-oxidativo em diferentes grupos de temperatura no modelo experimental desenvolvido por nós. Métodos: estudo randomizado com ratos Wistar, machos adultos, pesando cerca de 400g, foram randomizados para quatro grupos experimentais com 7 animais em cada grupo. No grupo 1 a temperatura renal tópica foi ambiental; no grupo 2 foi induzida hipotermia local leve (26ºC) através do gotejamento de solução fisiológica resfriada até o alcance da temperatura-alvo; no grupo 3 a hipotermia tópica foi moderada (15ºC); e no grupo 4 a hipotermia profunda (4ºC) foi atingida através da utilização de solução fisiológica congelada (gelo). A temperatura sistêmica foi medida por termômetro retal. Já a temperatura cortical renal foi medida por termômetro com sonda intraparenquimatosa. Após anestesia geral através de injeção intraperitoneal de Ketamina (75mg/Kg) e Xilazina (10mg/Kg), os ratos foram submetidos a canulação retrorbital para obtenção de amostra de sangue antes da laparotomia. A seguir procedeu-se com nefrectomia direita (rim controle, removido logo após a laparotomia e não submetido a I/R ou hipotermia). O rim esquerdo teve interrupção do fluxo arterial ao longo de 40 minutos (isquemia). De acordo com o grupo, o rim era ou não resfriado. O resfriamento era mantido na temperatura alvo até o término dos 40 minutos. O rim era então reperfundido e o abdome era suturado. Os animais permaneciam em gaiola aquecida com água a disposição, mas não alimentos. Após 240 minutos de reperfusão os animais eram reoperados sob nova anestesia geral. O rim esquerdo e o sangue eram coletados, e os ratos eram sacrificados. O rim direito foi considerado o grupo controle, assim como o sangue coletado antes da laparotomia. A avaliação dos desfechos incluiu a medida de catalase (CAT), de superóxido dismutase (SOD), de ácido tiobarbicúrico (TBARS), de nitritos (NO2) e de nitratos (NO3) teciduais, além da medida de F2-isoprostanos (F2IP) plasmáticos. Também foi realizado exame histopatológico renal em hematoxilina-eosina (HE). Resultados: o exame histopatológico revelou que I/R (40’/240’) provocou lesão renal, independentemente da temperatura cortical renal, quando comparado com o grupo controle (P < 0,001). TBARS, um dos produtos da peroxidação lipídica, mostrou aumento em todos os grupos submetidos a I/R, independentemente da temperatura, em relação ao grupo controle. Catalase, enzima protetora contra o estresse oxidativo, mostrou aumento no grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) quando comparado ao grupo controle, indicando mobilização celular de mecanismos protetores intrínsecos. À medida que a temperatura era diminuída no grupo I/R, ocorreu diminuição da catalase em relação ao controle, mas sobretudo em relação ao I/R normotérmico, indicando que a hipotermia foi um mecanismo extrínseco de proteção, dispensando a mobilização da catalase. Foi detectada uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo I/R normotérmico (G1, 37ºC) e o grupo submetido à hipotermia profunda (G4, 4ºC), com um P < 0.03. A avaliação dos demais marcadores de desfecho não mostrou diferenças estatisticamente significativas. Conclusões: isquemia renal de 40 minutos seguida de reperfusão por 240 minutos provocou lesão renal com alterações histopatológicas e também em um marcador de estresse oxidativo (TBARS). A avaliação da catalase (CAT) demonstrou que a hipotermia profunda (4ºC) foi provavelmente protetora, embora não tenha havido tradução histopatológica dessa proteção, nesse experimento agudo (240 minutos de reperfusão pós-isquêmica). / Introduction: Hypothermia has been associated with prevention against ischemiareperfusion (I/R) damage, but there is no experimental analysis, in vivo, regarding the role that hypothermia plays on renal injury induced by I/R. Objectives: The aims of this study were to design an animal model and evaluate the impact of predetermined ranges of temperatures on markers of oxidative stress and renal histologic sections. Methods: 28 Wistar male rats, under general anesthesia, undergone laparatomy to collect the right kidney (control group in each animal). The vascular pedicle of the left kidney was clamped during 40 minutes (ischemia). Four temperatures groups were designed, with 7 animals randomized for each group: normothermic (around 37oC), mild local hypothermia (26oC), moderate local hypothermia (15oC) and deep hypothermia (4oC). The systemic body temperature was kept during the operation through the warming of the surgical table. The left kidney cortical temperature was assessed with an intra parenchymal probe connected to a thermometer. For the systemic temperature measurement it was applied a common electronic rectal thermometer. After 40 minutes of ischemia, the left kidney had the vascular clamp removed, and the abdominal wall had been closed in two layers. The animals were kept alive in an incubator for 240 minutes, so they were re-laparotomized, under new anesthesia, and the left kidney was removed. Afterwards it was performed heart puncture in order to collect blood sample for plasmatic f2-isoprostanes. Half of each kidney (right and left, of all animals) had been kept on formalin and sent to pathological evaluation. The tissues stored on the freezer were used to analyze oxidative stress markers: catalase, SOD, TBARS, NO3, and NO2. Results: Core body temperature had not differed significantly between the groups. According to the pathological evaluation, all kidneys that suffered ischemia were significantly more injured than the controls (p < 0.001). No injury was found on the control group (right kidney of each rat). TBARS showed quite similar findings, showing increased levels in all I/R groups compared with the control group (P < 0.001). Concerning the protective enzyme catalase, it was observed an increase of this enzyme on the ischemic normothermic kidney when compared to the control. As the temperature was decreasing, more the catalase was decreasing, reaching a significant statistical difference (P < 0.03) between the ischemic normothermic group (G1, 37ºC) and the deepest hypothermic group (G4, 4ºC). No difference was found on nitrites and nitrates, superoxide dismutase, or on the plasmatic isoprostanes. Conclusion: This model was efficient in produce oxidative stress by I/R. Deep hypothermia has offered protection in this acute experiment (40 min of ischemia followed by 240 min of reperfusion).