Dans cette étude, nous avons tenté de décrypter les mécanismes reliant l’augmentation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) T CD8+ et un pronostic clinique défavorable dans le cancer du rein à cellules claires (ccRCC). Pour cela, nous avons déterminé 1) la relation entre le pronostic associé à l'expression d’immune checkpoints et l’infiltrat de cellules dendritiques (DC) et de LT CD8+ et 2) les caractéristiques phénotypiques des LIT T CD8+. L’expression des immune checkpoints a été déterminée par immunohistochimie dans une cohorte de 135 ccRCC. Nous avons constaté que les densités des cellules exprimant CD8, PD-1 et LAG-3 sont corrélées, et associées à une diminution de PFS et OS. Egalement, les patients dont les tumeurs présentent des densités élevées de cellules PD-1+ et PD-L1 et/ou PD-L2 +, ont le taux de survie le plus faible. Des densités élevées de DC immatures isolées dans le stroma tumoral sont associées à une forte expression d’immune checkpoints et à un faible taux de survie chez ces patients. En revanche, les patients présentant un taux de survie prolongé ont une densité élevée de lymphocytes CD8+, des DC matures au sein de structures lymphoïdes tertiaires, ainsi qu’une faible expression d’immune checkpoints. Nous avons analysé les LIT T CD8+ chez 21 patients ccRCC par Cytométrie de Flux. On a trouvé un groupe de patients (8/21) dont les tumeurs sont caractérisées par la surexpression de marqueurs inhibiteurs (PD1 et TIM3) et de d'activation (CD69 et CD38), par l'expansion des cellules T CD8 + mémoires effectrices et un plus grand potentiel d’agressivité. En résumé, nous avons démontré qu’une densité élevée de LIT T CD8+ dans les ccRCC est accompagnée d’une forte expression d’immune checkpoints et d’une réponse immunitaire mal coordonnée dans un sous-groupe de tumeurs agressives. / To decipher the potential mechanisms linking increased CD8+ T cell infiltration with an adverse clinical outcome in ccRCC, in this study we determined: 1) the prognosis associated with the expression of immune checkpoints and its coordination with dendritic cell (DC) and CD8+ cell infiltration, and 2) the phenotypic traits of CD8+ tumor infiltrating lymphocytes. The prognosis associated with CD8+ and DC infiltrations, in addition to the expression of immune checkpoints were investigated in a cohort of 135 ccRCC by quantitative immunohistochemistry. We found that the densities of CD8+, PD-1+ and LAG-3+ cells were closely correlated, and independently associated with decreased PFS and OS. In addition, patients whose tumors presented both high densities of PD-1+ cells and PD-L1+ and/or L2+ tumor cells, displayed the worst clinical outcome. High densities of immature DC isolated in the tumour stroma were associated with high expression of immune checkpoints and patients’ poor clinical outcome. In contrast, the presence of mature DC within Tertiary Lymphoid Structures identified, among the tumours with high CD8+-TIL densities, those with low expression of immune checkpoints and prolonged survival. We also investigated the phenotype of freshly isolated CD8+TIL in 21 ccRCC by flow cytometry. We found a group tumors (8/21) characterised by the over-expression of inhibitory (PD-1 and TIM-3) and activation markers (CD69 and CD38), the expansion of the effector memory cell subpopulation (CCR7-CD45RA-), and a trend toward more aggressive features. In summary, we demonstrated that the infiltration with CD8+ TIL in ccRCC is accompanied by the enhanced expression of immune checkpoints and a poorly coordinated immune response in a subgroup of aggressive tumors.

La thérapie par cellules T à récepteur d'antigène chimérique (CAR) a produit d'incroyables réponses cliniques contre plusieurs tumeurs malignes, mais elle laisse une marge de manœuvre pour l'échappement de l'antigène. Une nouvelle approche pour surmonter ce problème consisterait à combiner la capacité des CAR à cibler les tumeurs avec la capacité des cellules dendritiques (CD) à amorcer les cellules T afin de générer une thérapie cellulaire qui favorise la propagation de l'épitope plutôt que la destruction directe de la cible. J'ai donc émis l'hypothèse que les cellules dendritiques exprimant les CAR (CAR-CD) peuvent renforcer l'amorçage des cellules T contre les cibles tumorales afin de produire un contrôle adaptatif des tumeurs médié par les cellules T. En utilisant des CD dérivées de la moelle osseuse murine, j'ai d'abord développé un nouveau protocole pour générer des CD. En ajoutant de l'IFNα aux cultures de DC GM-CSF, j'ai généré des CD qui expriment des niveaux plus élevés de molécules stimulant les cellules T et qui induisent une plus forte prolifération des cellules T CD8+ in-vitro par rapport aux CD générées avec le GM-CSF seul. In vivo, ces CD favorisent des réponses effectrices plus fortes, les cellules T CD8+ résultantes exprimant des niveaux plus élevés de marqueurs effectrices, notamment KLRG1 et TIM3, mais des niveaux plus faibles de molécules inhibitrices, notamment PD-1 et CD73. L'expression d'un CAR dans ces DC leur permet de tuer directement des cibles tumorales et d'acquérir des antigènes tumoraux. Plus important encore, ces CAR-CD sont en synergie avec les cellules T CD8+ pour contrôler les cellules tumorales in-vitro, en améliorant la prolifération et la capacité de destruction des cellules T. Chez la souris, les CAR-CD agissent comme un vaccin in vivo en favorisant la génération de réponses de cellules T spécifiques de la tumeur lorsqu'elles sont injectées par voie intratumorale, ce qui permet d'améliorer le contrôle de la tumeur. / Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cell therapy has produced unbelievable clinical responses against several malignancies however, this therapy leaves room for antigen escape. One novel approach to overcome this would be to combine the tumor targeting ability of CARs with the T cell priming capacity of dendritic cells (DCs) to generate a cell therapy that provokes endogenous adaptive immunity through epitope spreading rather than just direct target killing. Therefore, I hypothesized that CAR expressing DCs (CAR-DCs) can enhance T cell priming against tumor targets to produce adaptive T cell mediated tumor control. Using murine bone marrow derived DCs, I first developed a new protocol for generating DCs using IFNα. The addition of IFNα to GM-CSF DC cultures generated DCs that express higher levels of T cell stimulatory molecules and induce stronger CD8+ T cell proliferation in-vitro compared to DCs generated with GM-CSF alone. In-vivo, these DCs promote stronger effector responses with the resulting CD8+ T cells expressing higher levels of effector markers including KLRG1 and TIM3 but lower levels of inhibitory molecules including PD-1 and CD73. The expression of a CAR in these DCs allowed them to directly kill tumor targets and acquire tumor antigens. More importantly, these CAR-DCs synergized with CD8+ T cells to control tumor cells in-vitro, enhancing the proliferation and killing capacity of the T cells. In mice, CAR-DCs act as an in-vivo vaccine promoting the generation of tumor specific T cell responses when injected intratumorally, producing enhanced tumor control.

Les anthracyclines, comme la doxorubicine (DOX) ou la daunorubicine (DNR), sont utilisées dans le traitement d’une grande variété de cancers allant des lymphomes, au cancer du sein, en passant par certaines leucémies. Encore aujourd’hui, beaucoup pensent que les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive, toutefois, la plupart de ces mêmes personnes sont d’accord pour dire que la p-glycoprotéine est responsable d’exporter ces molécules hors de la cellule. Mais pourquoi une molécule aurait besoin d’un transporteur pour sortir de la cellule, et pas pour y entrer ? Qu’est-ce qui ferait que la diffusion passive fonctionnerait dans un sens, mais pas dans l’autre, d’autant que l’entrée des anthracyclines dans les cellules est très rapide ? Nous pensons qu’il existe bel et bien un transporteur responsable de faire passer les anthracyclines du milieu extracellulaire au cytoplasme, et nous voulons développer un modèle de levure qui permettrait de déterminer si une protéine, un transporteur, issue d’un autre organisme eucaryote est en mesure de transporter la DOX à l’intérieur de la cellule. Pour ce faire, nous avons rassemblé un groupe de mutants présentant une déficience dans l’absorption d’autres molécules chargées positivement telles que la bléomycine ou le NaD1 et avons déterminé le taux d’absorption de DOX de chacun de ces mutants. Les simples mutants sam3Δ ou dur3Δ n’ont montré qu’une faible réduction de l’absorption de DOX, voire, aucune, par rapport à la souche parentale. Si le double mutant sam3Δdur3Δ a montré une réduction relativement importante de l’absorption de DOX, c’est le mutant agp2Δ qui présentait la plus grande réduction d’absorption de DOX, ainsi qu’une résistance notable à son effet létal. Nous avons utilisé, par la suite, ce mutant pour exprimer, à l’aide d’un vecteur d’expression, une protéine du ver Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). Les résultats ont montré que cette protéine était en mesure de restaurer l’absorption de DOX, compromise chez le mutant agp2Δ ainsi que d’augmenter la sensibilité de la souche parentale à son effet létal, lorsqu’exprimée chez celle-ci. Cela suggère que CeOCT-1 est un transporteur fonctionnel de DOX et contredit également le dogme selon lequel les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive. / Anthracyclines such as doxorubicin (DOX) or daunorubicin (DNR) are used for treatment of a wide variety of cancers from lymphomas to breast cancer going through some leukemia. Still today, several people think that anthracyclines enter cells through passive diffusion, but these same people believe that the p-glycoprotein is involved in efflux of anthracyclines. We think that there is a transporter responsible for uptake of anthracyclines by cells and we want to develop a yeast model that would allow us to determine if protein from another eukaryote organism could be able to transport DOX into yeast cells. In order to do that, we gathered a group of mutants that are already known to be resistant to other positively charged molecules such as bleomycin and NaD1 and determined their ability to take up DOX. The simple mutants sam3Δ or dur3Δ showed no or slight decrease of DOX compared to parent. If the double mutant sam3Δdur3Δ showed rather significant uptake decrease, it is the agp2Δ that showed the grater decrease in DOX uptake as a resistance to its lethal effect. We used that mutant to express a protein from the worm Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). The results showed that this protein was able restore back the uptake of DOX that was compromised in agp2Δ and was also able to increase the sensitivity of the parent to its lethal effect. This leads us to believe that CeOCT-1 is functional transporter for DOX and goes against the dogma wherein anthracyclines enter the cells through passive diffusion.

Le Cancer Colo Rectal (CCR) est la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde. Le risque de récidive après traitement curatif atteint 45% pour les stades 3. Une des hypothèses à l’heure actuelle pouvant expliciter le processus métastatique et les récidives est la présence en son sein de cellules « souches », pouvant « initier » le cancer. Notre réflexion s’inscrit dans la continuité des travaux réalisés au sein de notre Laboratoire, intitulés «Stratégies d’isolement et de caractérisation des cellules initiatrices de cancer colorectal», (Mélin et al, 2012). Dans une première partie, notre travail a porté sur l’analyse in vitro de la sensibilité des fractions enrichies en CIC aux différentes molécules de chimiothérapie les plus couramment utilisées en cancérologie colorectale.Puis, dans une deuxième partie, l’analyse des tumeurs obtenues après greffe a été faite ex ovo sur la Membrane Chorio-Allantoïdienne d’embryon de poulet (CAM), modèle facilement manipulable, peu onéreux et très rapide. Ce modèle étant naturellement immunodéprimé, il permet d’obtenir des informations concernant les phénomènes clés de la tumorigénèse et de la néoangiogénèse. Des analyses de la croissance tumorale, de l’histologie (prolifération, apoptose et vascularisation) et des analyses protéiques ont été menées en parallèle. De cette dernière étude, un marqueur particulier la E cadhérine, a été mis en évidence comme témoin indirect d’agressivité. En effet, au sein des tumeurs obtenues à partir de F1 HCT116, fraction himiosensible, l’expression de la E cadhérine est augmentée contrairement aux tumeurs obtenues à partir de F3 WiDr, fraction chimiorésistante, montrant une diminution d’expression de la E cadhérine.Ainsi, dans une troisième partie, sachant qu’un lien entre cellules initiant le cancer et E cadhérine a été mis en évidence, nous nous sommes focalisés sur son expression. Nous avons alors étudié son expression in vitro sur des cellules résistantes au 5 Fluorouracile. Puis, son expression a été étudiée ex vivo au sein de tissus et de sérums de patients opérés de cancer colorectal. / The ColoRectal Cancer (CCR) is the second leading cause of cancer mortality in the world. The risk of recurrence after curative treatment reaches 45% for stages 3. One of the hypotheses currently able to explain the metastatic process and the recurrences is the presence within it of "stem" cells, which can "initiate" the cancer. Our reflection is in line with the work carried out in our Laboratory, entitled "Strategies for the isolation and characterization of cells that initiate colorectal cancer" (Mélin et al, 2012).In the first part, our work focused on in vitro analysis of the sensitivity of fractions enriched in CIC to different chemotherapy molecules most commonly used in colorectal cancer (CRC). Then, in a second part, the analysis of the tumors obtained after transplantation was made ex ovo on Chicken Embryo Chorio-Allantoid Membrane (CAM), an easily manipulated model, inexpensive and very fast. This model provides information on the key phenomena of tumorigenesis and neoangiogenesis. Analyzes of tumor growth, histology (proliferation, apoptosis and vascularization) and protein analyzes were carried out in parallel. From this last study, a particular marker, E cadherin, was highlighted as an indirect link with witness of aggressiveness. Indeed, within the tumors obtained from F1 HCT116, the chemosensitive fraction, the expression of cadherin E was increased in contrast to the tumors obtained from F3 WiDr, chemoresistant fraction, showing a decrease in expression of E cadherin.Thus, in a third part, knowing that a link between cells initiating cancer and E cadherin was highlighted, we focused on its expression. We first studied its expression in vitro on 5 Fluorouracilresistant cells. Its expression was then studied ex vivo in tissues and sera of operated patients of CRC.

La cycline A2 est un régulateur essentiel du cycle cellulaire qui, en association avec des kinases dépendantes des cyclines (CDK) régule la réplication de l'ADN et l’entré des cellules en mitose. Dans de nombreux types de cancers humains, la cycline A2 a été considérée comme un facteur de prolifération contribuant à la cancérogenèse de par ses fonctions dans la régulation du cycle cellulaire. Récemment, la complexité des fonctions de cycline A2 a été révélée. Certaines études in vitro ont démontré que l'inactivation de la cycline A2 induit une augmentation de la motilité cellulaire et de l'invasion dans les fibroblastes consécutive à une activation défective de RhoA. De plus, il a été montré que l'inactivation de la cycline A2 induit la EMT par l’intermédiaire d’une augmentation de l'activité transcriptionnelle de la β-caténine, mais aussi via la voie TGFβ/Prefoldin. Ces études suggèrent que des niveaux réduits de cycline A2 sont liés à une invasion accrue et à l’apparition de métastases dans certains types de cancer. A l’aide d’un modèle de souris mutante pour la cycline A2, une étude récente a établi une fonction de cette dernière, indépendante des CDK, dans la réparation des cassures double brin de l'ADN et a montré que la perte de la cycline A2 favorise l’apparition de cancers de la peau et du poumon. L’ensemble de ces études met en évidence l’existence de multiples fonctions pour la cycline A2. Mon travail de thèse a consisté à explorer le rôle de la cycline A2 dans l'homéostasie du colon et le développement du Le cancer colorectal.Pour évaluer la valeur pronostique de la cycline A2 dans le CCR, nous avons analysé l'expression de la cycline A2 par IHC sur un grand nombre d'échantillons tumoraux dérivés de patients atteints de CCR de différents stades. Nous avons trouvé que les niveaux élevés de la cycline A2 sont corrélés avec un mauvais pronostic et une survie plus faible chez les patients atteints de CCR de stade I et II. Cependant, une diminution de l'expression de la cycline A2 a été détectée aux stades III et IV par comparaison aux biopsies de CCR de stade I et II. Il est tentant de proposer que le profil d'expression de la cycline A2 reflète ses rôles distincts au cours de la cancérogenèse du côlon, comme la prolifération cellulaire au stade précoce, lorsqu'elle est fortement exprimée, mais favorise l'invasion et l'agressivité à des stades plus avancés, lorsque ses niveaux d’expression sont réduits.En complément de cette étude clinique, nous avons généré des modèles murins porteurs d’une mutation constitutive ou inductible de la cycline A2 dans l’épithélium intestinal. Nous avons montré que la déplétion de la cycline A2 dans l'épithélium intestinal de la souris provoque une rupture de la crypte colique, une inflammation, une augmentation de la prolifération des cellules épithéliales et l’apparition de dysplasies de bas et haut grade, reconnues comme lésions précancéreuses dans le CCR. Ces observations suggèrent un rôle majeur pour la cycline A2 dans la régulation de l'homéostasie du côlon et l'initiation de la tumorigénèse. Une analyse plus poussée a révélé une proportion accrue de lésions au niveau de l'ADN et une activation aberrante de la β-caténine, anomalies couramment détectées chez les patients humains atteints de CCR et considérées comme les premières altérations de cette pathologie. En outre, nous avons détecté une expression élevée de NFkB et YAP1 chez les souris mutantes pour la cycline A2, voies qui jouent un rôle critique dans la régénération tissulaire et peuvent conduire la dédifférenciation des cellules épithéliales du côlon contribuant ainsi à la tumorigenèse. Finalement, les souris mutantes cycline A2 ont été soumises à un protocole de colite associé au cancer et ont développé une proportion accrue d'inflammation, mais aussi de dysplasies et d'adénocarcinomes, en taille et en nombre, suggérant que la perte de la cycline A2 participe à la carcinogenèse colorectale chez la souris. / Cyclin A2 is an essential cell cycle regulator required for accurate DNA replication and mitotic entry in association with cyclin-dependent kinases (CDKs). In multiple types of human cancers, cyclin A2 was considered as a proliferation driver contributing to carcinogenesis based on its function to promote cell cycle.Recently, the complexity of cyclin A2 functions has been revealed. Some in vitro studies demonstrated that cyclin A2 inactivation induces increased cell motility and invasiveness of mouse fibroblasts due to defective RhoA activation. Moreover, cyclin A2 inactivation has been shown to induce EMT through the upregulation of β-catenin transcriptional activity, but also via the TGFβ/Prefoldin pathway. These studies suggest that reduced levels of cyclin A2 are linked to increased invasiveness and metastasis in some cancer types. Using a cyclin A2 mutant mouse model, a recent study established the CDK-independent function of cyclin A2 in the repair of double-stranded DNA breaks and showed that loss of cyclin A2 promotes tumorigenesis in skin and lung due to deficient DSBs repair.Altogether, these studies highlight the multiple functions cyclin A2 can execute. The aim of my thesis was to explore the role of cyclin A2 in colon homeostasis and colorectal cancer development.To evaluate the prognostic value of cyclin A2 in CRC, we analyzed cyclin A2 expression by IHC on tumor samples derived from CRC patients of different stages. We found that high levels of cyclin A2 correlate with bad prognosis and lower survival in patients with stage I and II CRC. However, decreased cyclin A2 expression was detected in stage III and IV by comparison to stage I and II CRC biopsies. Complementary to the clinical study, we generated tissue-specific mutant mouse models bearing either a constitutive or inducible cyclin A2 deletion in the intestinal epithelium. We showed that depletion of cyclin A2 in mouse intestinal epithelium causes colonic crypt disruption, inflammation, increased proliferation of epithelial cells and occurrence of low- and high-grade dysplasia, recognized as precancerous lesions of CRC. These observations suggest a major role for cyclin A2 in the regulation of normal colon homeostasis and tumor initiation. Further analysis revealed an increased proportion of DNA damage and aberrant activation of β-catenin, commonly detected in human patients with CRC and which are considered as the first occurring alterations in this pathology. Furthermore, we detected elevated expression of NFkB and YAP1 in the colons of cyclin A2 mutant mice, pathways that have been previously shown to play critical roles for tissue regeneration after tissue damage and to drive dedifferentiation of colonic epithelial cells thus contributing to tumorigenesis. Finally, cyclin A2 mutant mice were subjected to a modified colitis-associated CRC model and developed increased proportion of inflammation, but also dysplasia and adenocarcinomas, in size and numbers, suggesting that loss of cyclin A2 contributes to inflammation-associated colorectal carcinogenesis in mice.

Les peptides pénétrants sont de petits peptides capables de se rentrer dans les cellules sans endommager la membrane, présentant un grand potentiel dans la délivrance de diverses cargaisons, y compris des peptides, pour le traitement du cancer ainsi que d'autres maladies. Les peptides comme médicaments, bénéficient d'être spécifiques, relativement sûrs, faciles à produire et faciles à modifier. Cependant, des défis significatifs demeurent concernant l'application de peptides en tant qu'agents thérapeutiques. L'identification des motifs de liaison des peptides est difficile et les peptides se comportent généralement avec une perméabilité cellulaire faible et une sensibilité à l'hydrolyse des proteases. Dans le présent travail, nous avons caractérisé deux interactions protéine-protéine Ras/Raf et PP2A/SET qui sont impliqués dans la régulation de la transformation tumorale et de l'apoptose. Nous avons identifié le site de liaison parmi ces protéines (peptides interférents). Ces peptides interférents ont été associés à une navette optimisée pour générer des peptides chimériques capables de dissocier ces interactions protéine/protéine. Les peptides chimeriques ont été testés in vitro et in vivo, montrant un effet anti-tumor. Ces peptides pourraient être considérés comme des candidats prometteurs pour des applications futures en tant que vecteurs pour la délivrance de médicaments intracellulaires. / Cell penetrating peptides are small peptides which are able to translocate into cells without causing membrane damage, presenting a great potential in the delivery of various cargos including peptides, for the treatment of cancer as well as other diseases. Peptides as drugs, benefit from being specific, relative safe, easy to produce and easy to modify. However, significant challenges remain regarding the application of peptides as therapeutic agents. Identification of the binding motifs of the peptides is difficult, and peptides generally behave low-cellular permeability and sensitivity to proteases hydrolysis. In the present work, we characterized two protein-protein interactions Ras/Raf and PP2A/SET that are involved in the regulation of tumor transformation and apoptosis. We have identified the binding site among these proteins (interfering peptides). These interfering peptides were associated to an optimized shuttle to generate chimeric peptides able to dissociate these protein/protein interactions. The chimeric peptides were tested in vitro an in vivo, showing an anti-tumor effect. These peptides could be considered as promising candidates for future applications as vectors for intracellular drugs delivery.

L'efficacité de la réponse antitumorale repose sur l'activité des cellules T cytotoxiques, qui peut être stimulée par des vaccins contenant des antigènes spécifiques aux tumeurs. Malgré le fait d'être les principales cellules présentatrices d'antigènes (CPA) responsables de l'activation des cellules TCD8, les cellules dendritiques (CD) ont rencontré des défis dans le développement de vaccins contre le cancer, notamment en ce qui concerne leur fabrication et efficacité. Pour combler ces problèmes, cette étude propose d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) comme plateforme de vaccination alternative, en exploitant les avantages des CSMs en matière de fabrication, de sécurité et de plasticité. La plasticité remarquable des CSMs leur permet d'acquérir une capacité de présentation croisée sous des stimuli spécifiques. Étant donné que la présentation croisée est essentielle pour induire l'activation des cellules T contre les antigènes tumoraux, cette étude vise à convertir les CSMs en cellules présentatrice d‘antigènes en améliorant l'exportation des antigènes des endosomes vers le cytosol - une étape critique du processus. Dans cette démarche, nous avons examiné une librairie de molécules dérivés de l’Accum, une molécule initialement conçue pour favoriser la destruction de la membrane endosomale. Après avoir évalué leur potentiel à induire la présentation croisée, nous avons sélectionné la molécule A1 pour des investigations subséquentes. Les études mécanistiques ont démontré qu'A1 déclenchait des processus cellulaires essentiels favorisant une présentation croisée efficace, notamment une augmentation de la capture, dégradation et évasion des antigènes des endosomes ainsi que la production de d’espèces oxygénés réactifs. L'efficacité thérapeutique des CSMs reprogrammées par A1 (ARM) en tant que vaccin anticancéreux a été évaluée chez des souris ayant des tumeurs, en monothérapie et en combinaison avec l’anti-PD-1. La thérapie combinée ARM a induit une régression tumorale et a augmenté les taux de survie dans les modèles de tumeurs solides. En conclusion, cette étude présente une stratégie innovante pour transformer les CSM en cellules à présentation croisée en déclenchant l'échappement endosomal de l'antigène. Les cellules ARMs en association avec des inhibiteurs des points de contrôle immunitaire présentent un potentiel en tant que plateforme de vaccination contre les tumeurs solides. De plus, ces résultats soulignent l'importance de l'évasion des endosomes dans la présentation croisée d‘antigènes et ouvrent la voie à de nouvelles plateformes de vaccins contre le cancer. / The effectiveness of antitumoral response relies on cytotoxic T-cell activity, which can be stimulated through vaccines carrying tumor-specific antigens. Despite being the primary antigen-presenting cells (APCs) responsible for CD8 T-cell activation, dendritic cells (DCs) have encountered challenges in cancer vaccine development, particularly in manufacturing and efficiency. To address this gap, this study proposes mesenchymal stromal cells (MSCs) as an alternative vaccine platform, leveraging the advantages in manufacturing, safety profile, and plasticity of MSCs. The remarkable plasticity of MSCs enables them to acquire cross-presentation capacity under specific stimuli. Given that cross-presentation is pivotal for inducing T-cell activation against tumor antigens, this study aims to convert MSCs into antigen cross-presenting cells by enhancing the export of antigens from endosomes to the cytosol—a critical step in the process. In this pursuit, we screened a library of Accum and variant molecules designed to promote endosomal disruption. After evaluating their potential to induce cross-presentation, we selected the molecule A1 for further investigation. Mechanistic studies demonstrated that A1 triggers essential cellular processes supporting efficient cross-presentation, including enhanced antigen uptake, processing, endosomal escape, and reactive oxygen species production. The therapeutic efficacy of A1-reprogrammed MSCs (ARMs) as an anticancer vaccine was evaluated in tumor-bearing mice, as monotherapy and combined with anti-PD-1. In solid tumor models, ARMs combination therapy induced tumor regression and increased survival rates. In conclusion, this study presents an innovative strategy to transform MSCs into cross-presenting cells by triggering antigen endosomal escape. ARM cells in combination with immune checkpoint inhibitors hold potential as a vaccination platform against solid tumors. These findings underscore the importance of endosomal escape on antigen cross-presentation and pave the way for new cancer vaccine platforms.

Le carcinome séreux de haut grade (CSHG) est le sous-type histologique le plus courant du cancer de l'ovaire et demeure le cancer le plus meurtrier de l'appareil reproducteur féminin. Les récents progrès de l'immunothérapie contre le cancer ont mis en évidence un énorme potentiel thérapeutique pour les patientes confrontées à des besoins non satisfaits de soins de santé pour le traitement des CSHG. Une étape cruciale pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques consiste à identifier les antigènes spécifiques des tumeurs (TSA), c’est-à-dire des antigènes majeurs d'histocompatibilité de classe I présents à la surface des cellules cancéreuses mais absents des cellules normales. Ces TSA peuvent être reconnus par les cellules T et sont des éléments essentiels dans la conception de vaccins destinés à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses. Les travaux menés dans le cadre de mon programme de doctorat ont porté sur l'identification et la caractérisation des TSAs dans les CSHG. Les premières études sur les TSAs ont été dirigées uniquement vers l’identification de TSAs dérivés de mutations dans les régions codantes, menant à l’identification d’antigènes très rares et privés dans les CSHG. Dans notre première étude, nous avons analysé 23 échantillons de cancer de l'ovaire en utilisant une approche protéogénomique nous permettant d'étudier à la fois les régions génomiques codantes et non codantes. Ce faisant, nous avons identifié un total de 103 TSAs, dont 91 qui ne portaient pas de mutations et dérivaient de séquences présumées non-codantes. Nous appelons ces antigènes « TSAs exprimés de manière aberrante (aeTSAs) » puisqu’ils sont exprimés de manière aberrante dans les échantillons de cancer mais absents dans les tissus normaux. Contrairement aux TSAs mutés, qui sont davantage patient- spécifiques, l’ARN codant pour les aeTSAs est exprimé par plusieurs patientes atteints d’un CSHG, celles-ci exprimant individuellement une médiane de 5 aeTSAs. De par leur nombre élevé et du fait que leur expression soit partagée dans une large population de patientes atteints de CSHG, les aeTSAs représentent des cibles intéressantes pour l'immunothérapie du cancer. En raison de leur origine principalement non codante, la nature et la régulation des aeTSAs sont peu connues. Notre seconde étude a donc porté sur la régulation de la biogenèse des aeTSAs. L’analyse de données de séquençage de l'ARN de CSHG en cellule unique a montré une expression enrichie et spécifique des gènes sources des aeTSAs dans les cellules cancéreuses. Grâce à une analyse transcriptomique plus poussée, nous avons identifié de nouveaux transcrits récurrents codant pour les aeTSAs et avons déterminé que ces transcrits sont largement surexprimés dans les CSHG. De plus, nous avons déterminé que les aeTSAs issus d'événements de traduction non canonique sont codés préférentiellement par des cadres de lecture ouverts courts et générés à partir de régions près de l'extrémité C-terminale. Finalement, nos analyses sur l'accessibilité de la chromatine et les modifications des histones supportent l’hypothèse que les transcrits codant pour les aeTSAs ont recourt à des promoteurs alternatifs, ce qui suggère un rôle important de l'épigénome du cancer dans la genèse du paysage antigénique. Nos travaux représentent la première analyse complète des antigènes provenant des régions codantes et non codantes dans les tumeurs ovariennes. Nous avons pu dresser une liste exhaustive de cibles thérapeutiques potentielles et mieux comprendre leur biogenèse. Nos travaux portant sur la découverte et la caractérisation des aeTSAs favoriseront la conception de nouvelles immunothérapies ciblant ces antigènes et ce qui sera bénéfique pour un plus grand nombre de patientes atteintes de CSHG. / High-grade serous carcinoma (HGSC) is the most common histologic subtype of ovarian cancer and the most lethal cancer in the female reproductive system. Recent advances in cancer immunotherapy have highlighted enormous therapeutical potential for patients facing unmet clinical needs in HGSC treatment. A crucial step for developing new therapeutic strategies is identifying targetable tumor-specific antigens (TSAs), namely the major histocompatibility class I antigens presented on the cancer cell surface but absent from normal cells. These TSAs can be recognized by T cells and are essential elements in designing vaccines to stimulate anti-cancer immune responses. The goal of my Ph.D. thesis was to identify and characterize TSAs in HGSC. In early studies of TSAs, most groups focused solely on TSAs derived from mutations in coding regions, which reported very rare and private antigens in HGSCs. In our first study, we used a proteogenomic workflow that enabled us to survey both coding and noncoding sequences to analyse 23 ovarian cancer samples. We uncovered 103 TSAs, 91 of which were not mutated and derived mainly from allegedly noncoding sequences. We call these antigens aberrantly expressed TSAs (aeTSAs), for their lack of expression in normal tissues while being aberrantly expressed in cancer samples. Unlike the mutated TSAs unique to individual tumors, the aeTSAs have shared RNA expression in HGSC tumors, with an estimated median presentation of five per patient. Because of their number and shared expression in a large population, we consider aeTSAs attractive targets for immunotherapy. Due to their primarily noncoding origin, little is known about the nature and regulation of aeTSAs. In our second study, we explored the biogenesis of the aeTSAs. HGSC single-cell RNA sequencing data showed a malignant cell-specific/enriched expression of aeTSA source genes. Further transcriptomic profiling identified novel recurrent transcripts coding for aeTSAs and revealed broad overexpression of aeTSA-coding transcripts in HGSC. Moreover, we showed that aeTSAs derived from noncanonical translation events are coded preferably by short open reading frames and generated from regions close to the C-terminus. Our analysis of chromatin accessibility and histone modifications support a differential promoter activity for aeTSA-coding transcripts, suggesting an important role of cancer epigenome in shaping the antigen landscape. Our work is the first comprehensive analysis of ovarian tumor antigens derived from both coding and noncoding regions. We reported an extensive list of potential therapeutic targets and provided insights into their biogenesis. Our work on discovering and characterizing shared TSAs shall promote the design of new antigen-targeting immunotherapy that benefits more HGSC patients.

Parmi les tumeurs cérébrales primaires, les gliomes sont les tumeurs les plus fréquemment rencontrées. Les glioblastomes (GBM) représentent 60 à 70% de ces tumeurs et malgré de récents progrès dans leur traitement, leur pronostic reste sombre. Les gliomes malins sont caractérisés par une prolifération cellulaire importante, un taux élevé de néo-angiogenèse et une migration diffuse des cellules tumorales gliales dans le parenchyme cérébral, ce qui rend impossible une résection chirurgicale complète. De plus, les cellules gliales tumorales migrantes opposent une résistance particulière aux traitements chimiothérapiques de type pro-apoptotique, causant une récidive quasi inévitable de ce type de tumeur. La compréhension des aspects moléculaires à la base de la prolifération, de la migration et de la chimiorésitance des cellules gliales tumorales est donc essentielle pour élaborer des approches ciblées capables d’entraver ces processus. La littérature mentionne plusieurs stratégies qui permettraient, en théorie, de court-circuiter la résistance à l’apoptose des cellules tumorales gliales migrantes. Il s’agirait entre autres :<p>- de réduire le taux d’activation des voies de signalisation contrôlées par PI3K /Akt /mTOR et NFkappaB, qui diminuerait le taux de croissance des gliomes malins, ainsi que le taux de migration des cellules tumorales isolées dans le parenchyme cérébral;<p>- de réduire le taux de migration des cellules tumorales gliales afin de restaurer un certain degré de sensibilité à des agents chimiothérapiques pro-apoptotiques;<p>- d’endiguer l’export des agents chimiothérapiques par les pompes à efflux surexprimées dans les gliomes <p>- d'induire d’autres processus de mort cellulaire que l’apoptose, car les cellules tumorales gliales migrantes sont plus sensibles à d’autres formes de mort cellulaire.<p>Ces besoins de nouvelles stratégies thérapeutiques ont motivé ce travail qui se focalisera sur le potentiel antitumoral des ligands du R-sigma1 dans les glioblastomes. Ainsi, nous montrerons que les ligands des Rs-sigma sont capables de produire certains des effets visés dans les stratégies ci-dessus, dont la réduction de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses avec une certaine potentialisation des chimiothérapies. Ces propriétés ouvrent de nouvelles perspectives en thérapie anticancéreuse pour cette famille de ligands, dont plusieurs membres sont déjà utilisés depuis de nombreuses années comme antipsychotique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les personnes touchées par le cancer (PTC) présentent des besoins de nature diverse. Les résultats de plusieurs études démontrent que la réponse à ces besoins n’est pas optimale et que des actions coordonnées et concertées entre les équipes spécialisées en cancérologie et les organismes du tiers secteur favoriseraient une complémentarité des soins et services offerts aux PTC et, ainsi, une meilleure réponse à leurs besoins. Dans ce contexte, cette étude s’intéresse au point de vue des PTC quant aux interactions entre les équipes spécialisées en cancérologie et les organismes du tiers secteur. Cette étude qualitative descriptive et interprétative a été réalisée auprès de dix femmes et un homme, touchés par le cancer. Les données ont été recueillies à l’aide d’entretiens individuels semi-dirigés. Les résultats obtenus à la suite de l’analyse thématique des données démontrent que les PTC perçoivent peu ou pas d’interactions entre les équipes spécialisées en cancérologie et les organismes du tiers secteur. L’insuffisance d’actions coordonnées, les informations offertes de manière passive ou informelle par les équipes spécialisées en cancérologie ainsi que les contraintes liées à l’accessibilité des services du tiers secteur expliquent l’invisibilité des interactions entre les secteurs, aux yeux des PTC. Des actions coordonnées entre les équipes spécialisées en cancérologie et les organismes du tiers secteur, des références personnalisées réalisées en fonction des besoins singuliers des PTC et un accompagnement personnalisé par un professionnel ou une autre PTC, sont souhaitées par les PTC. / People affected by cancer (PAC) have a variety of needs. The results of several studies show that the response to these needs is not optimal and that coordinated and concerted actions between specialized cancer teams and third-sector organizations would promote complementary care and services for PAC and thus better meet their needs. This study looks at the perspective of people affected by cancer regarding interactions between cancer teams and third sector organizations. This qualitative descriptive and interpretive study was conducted among ten women and one man affected by cancer. Data were collected using semi-structured individual interviews. The results obtained from the thematic analysis of data collected in individual interviews show that PAC perceive little or no interaction between cancer teams and organizations in the third sector. Insufficiency of coordinated action, information offered passively or informally by specialized cancer teams and constraints related to the accessibility of third sector services explain invisibleness of interactions between sectors in the eyes of PAC. Coordinated actions between specialized cancer teams and organizations in the third sector, personalized references made according to the unique needs of PAC, materialized by the presence of a "central" person or a pivotal nurse as well as support for professional navigation or another PAC, are desired by the PAC.