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Estudos da relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR) de adutos de Morita-Baylis-Hillman bioativos contra Leishmania amazonensis / Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) Studies of Morita-Baylis- Hillman Adducts bioactive against Leishmania amazonensis.Alencar Filho, Edilson Beserra de 14 December 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Morita-Baylis-Hillman Adducts (MBHA) is a class of molecules studied
by our research group on synthetic, theoretical and bioactivity aspects. In this work,
we present Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) models involving 32
aromatic MBHA. Initially, the most stable conformations of thirty-two MBHA were
investigated by theoretical methods, which were used to construct models. For this
study, were obtained potential energy curves using AM1 semi-empirical method,
considering rotational degrees of freedom (sigma bonds). From these curves, the
less energy conformation to each molecule was selected and optimized at B3LYP/6-
31+G(d) level, considering solvent effects through Polarizable Continuum Model
(PCM). Proton Nuclear Magnetic Ressonance data are in agreement with the
conformational study. Intramolecular Hydrogen Bonds (IHB) are presents in the most
of the studied compounds, according to structural characterization and QTAIM
calculations. Curiously, compounds that showed hydrogen bonds involving the nitro
and hydroxyl groups have the best values of biological activity (IC50). An explanation
is based on redox mechanism of action of nitrocompounds. NBO (Natural Bond
Orbital) charges and LUKO (Lowest Unoccupied Kohn-Sham Orbitals) analysis at the
ortho-nitro group are in agreement with these analyses. Considering quantum
calculations and structural observations, four descriptors were selected a priori and
submitted to a QSAR study using PLS (Partial Least Squares) and MLR (Multiple
Linear Regression) modeling. A second QSAR approach was made from the another
set of descriptors obtained through the online platform E-DRAGON, which were
submitted to a variable selection method. The quality parameters obtained for models
indicate that both are robust and predictive. / Os Adutos de Morita-Baylis-Hillman (AMBH) compreendem uma classe de
moléculas investigadas por nosso grupo de pesquisas nos aspectos sintéticos,
teóricos e de bioatividade. Neste trabalho, apresentamos modelos de Relação
Quantitativa entre a Estrutura Química e a Atividade Leishmanicida (QSAR)
envolvendo 32 AMBH aromáticos. Deste modo, inicialmente foram investigadas as
conformações mais estáveis de cada composto através de métodos teóricos, as
quais foram utilizadas na construção dos modelos. Foram obtidas curvas de energia
potencial utilizando o método semi-empírico AM1, considerando graus de liberdade
rotacionais (ligações sigma). A partir destas curvas, a conformação de menor
energia para cada molécula foi selecionada e otimizada ao nível B3LYP/6-31+G(d),
considerando os efeitos do solvente aquoso usando PCM ( Polarizable Continuum
Model ). Dados espectroscópicos de Ressonância Magnética Nuclear de prótons
corroboraram o estudo conformacional. Ligações de Hidrogênio Intramoleculares
(LHI) se mostraram presentes na maioria das moléculas estudadas, conforme
caracterização estrutural e cálculos QTAIM ( Quantum Theory Atoms in Molecules ).
Curiosamente, os compostos que apresentaram Ligações de Hidrogênio envolvendo
o grupo nitro (NO2) e a hidroxila (OH) possuem melhores valores de atividade
biológica (menor IC50). Uma explicação está baseada no mecanismo de ação redox
de nitrocompostos. Observação das cargas NBO ( Natural Bond Orbitals ) e análise
dos orbitais de fronteira LUKO ( Lowest Unoccupied Kohn-Sham Orbitals ) ao nível
do grupo orto-nitro estão de acordo com estas análises. Considerando os cálculos
quânticos, bem como observações estruturais, quatro descritores foram
selecionados a priori e submetidos a um estudo QSAR ( Quantitative Structure-
Activity Relationships ) utilizando modelagem PLS ( Partial Least Squares ) e MLR
( Multiple Linear Regression ). Uma segunda abordagem QSAR foi realizada a partir
de outro conjunto de descritores obtidos através da plataforma online E-DRAGON,
os quais foram submetidos ao método de seleção de variáveis OPS ( Ordered
Predictor Selection ). Os parâmetros de qualidade obtidos para os modelos indicam
que ambos são robustos e preditivos.
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Identificação e isolamento de proteinas que se ligam aos telomeros de Leishmania (L.) amazonensis / Identification and purification of Leishmania (L.) amazonensis telomeric proteinsLira, Cristina Braga de Brito 22 June 2007 (has links)
Orientadores: Maria Isabel Nogueira Cano, Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:46:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária que foi considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma doença de Categoria 1, pois para a mesma não existem formas de controle, diagnóstico ou terapia eficientes. Os parasitas do gênero Leishmania (família Trypanosomatidae) são agentes etiológicos da leishmaniose e possuem cromossomos lineares com extremidades teloméricas. Os telômeros são complexos nucleoproteicos essenciais para manuntenção da estabilidade do genoma e viabilidade celular. Devido à importância das proteínas teloméricas na manutenção dessas estruturas, elas têm sido considerados bons alvos para a terapia anticâncer e antiparasitária. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas que se associam aos telômeros de Leishmania amazonensis. Três metodologias diferentes foram utilizadas para antigir este objetivo: (i) purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos de L. amazonensis, (ii) busca no banco de dados de Leishmania por proteínas homólogas que apresentassem domínios de ligação ao DNA do tipo Myb, e (iii) seleção genética em levedura (sistema mono-híbrido). A purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos nucleares de L. amazonensis resultou no isolamento da proteína LaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA e ensaios in vivo (imunoprecipitação de cromatina) comprovaram a interação de LaRbp38 com DNA telomérico, DNA rico em GT e DNA do cinetoplasto. LaRbp38 pode ser considerada um bom alvo para a terapia antiparasitária pois é uma proteína exclusiva de tripanosomatídeos e seu homólogo em T. brucei é essencial para a sobrevivência do parasita. Para dar início a experimentos de caracterização da estrutura dessa proteína, LaRbp38 foi expressa em bactérias. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel, experimentos preliminares de renovelamento foram feitos mostrando que a proteína necessita da presença de DNA, ou de moléculas análogas, para se renovelar in vitro. As buscas no banco de dados de L. major resultaram no descobrimento de uma lista de proteínas que apresentam domínio de ligação ao DNA do tipo Myb. Uma proteína foi escolhida e sua homóloga em L. amazonensis foi denominada LaTBP1. O domínio Myb de LaTBP1 se localiza na porção central da proteína e apresenta alta similaridade de seqüência com domínios Myb encontrados em fatores de transcrição to tipo TFIIIB, proto-oncogene c-MYB e membros da família de proteínas teloméricas Rap1p. Ensaios de interação proteína-DNA e de imunoprecipitação de cromatina confirmaram que LaTBP1 interage tanto com o DNA telomérico quanto com DNAs ricos em GT. Prefências por estes dois tipos de DNAs são apresentadas pelas proteínas teloméricas Rap1, Taz1 e TEBP1, descritas em leveduras e eucariotos superiores. A utilização do sistema mono-híbrido para identificação de proteínas teloméricas de Leishmania resultou em uma lista de proteínas candidatas. A possível função telomérica das mesmas foi inferida com base na homologia de seqüência com proteínas já descritas e em testes de interação proteína-DNA in vitro utilizando-se extratos das leveduras recombinantes. Apesar desses resultados serem promissores, análises mais detalhadas são necessárias para confirmar estas interações. Concluindo, as três metodologias se mostraram eficazes para a identificação de proteínas teloméricas e a utilização das mesmas resultou na identificação de diversas proteínas teloméricas, algumas delas ainda hipotéticas / Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease that was classified by World Health Organization as a Category 1 disease because there are no effective control programs or therapeutics to this disease. Parasites from the Leishmania genus are the ethiologic agents of leishmaniasis and they possess linear chromosomes with telomeric ends. Telomeres are nucleoprotein specialized nucleoprotein complexes essential for maintaining chromosomal stability and cell viability. Since telomeric proteins are essential for the maintenance of telomeres, they could be considered good targets for anticancer and antiparasitic drugs. Therefore, the goal of this work was to identify Leishmania amazonensis proteins that interact with the telomeric DNA. Three methodologies were used the achive this goal: (i) purification of telomeric proteins from nuclear extracts of L. amazonensis, (ii) Leishmania genome database mining for protein containing a Myb-like domain, and (iii) use of One-hybrid system (Clontech). The search for telomeric proteins in nuclear extracts of L. amazonensis resulted in the identification of LaRbp38. EMSA and immunoprecipitation assays were used to attest LaRbp38 binding to telomeric, GT-rich and kinetoplast DNAs, both in vitro and in vivo. LaRbp38 could be considered a good drug target for antiparasitic therapy since it is exclusive of trypanosomatids and itshomologue in T. brucei is essential for parasite survival. In order to characterize structurally this protein, LaRbp38 was expressed in bacteria. The protein was present in the insoluble fraction of the bacterial lysate. Therefore, preliminary experiments of refolding were done. LaRbp38 seems to need DNA, or analog molecules, in order to correctly refold in vitro. Data-mining in the L. major genome resulted on a list of proteins bearing a Myb-like domain. One protein was chosen and its L. amazonensis homologue was termed LaTBP1. LaTBP1 Myb-like domain is centrally localized and shares sequence similarities with Myb-like domains found on transcription factors TFIIIB and c-MYB, and with the RAP1 telomeric proteins. Competition and chromatin immunoprecipitation assays confirmed the specificity of LaTBP1 for telomeric and GT-rich DNAs. This binding specifities are also found on the telomeric proteins Rap1, Taz1 and TEBP1, described in yeast and higher eukaryotes. A list of proteins with a putative telomeric function was generated after the use of the Onehybrid system. Sequence analysis (search for homologues in other organisms) and EMSA, done with protein extract of recombinant yeast, were used to infer a telomeric function for the proteins found by this methodology. Although the results are encouraging, detailed analysis are necessary to validate the interactions. In conclusion, the three methodologies were usefull for the identification of telomeric proteins. This work resulted in the identification of several telomeric candidate proteins / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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Estudo do ciclo de vida, fonte alimentar e capacidade vetorial de Lutzomyia whitmani no Maranhão, Brasil / Study the life cycle, food source and vectorial capacity of Lutzomyia whitmani in Maranhao, BrazilFonteles, Raquel Silva 12 February 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-02-12 / In this study we examined, whether L. whitmani is susceptible to experimental infection
by L. brasiliensis, causing Cutaneous and Mucocutaneous Leishmaniasis, and L.
amazonensis, causing Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. L. whitmani individuals were
collected to establish a colony free from these parasites. Mice were experimentally
infected with L. brasiliensis or L. amazonensis parasites. Female of this L. whitmani
colony were permitted to feed on mice exhibiting clinical signs of the disease.
Phlebotominae infected with parasites were detected by amplifying a Leishmania 120
bp specific kinetoblast DNA by means of PCR. The L. whitmani infection rate for
Leishmania brasiliensis and Leishmania amazonensis was 65.2% and 47.4%,
respectively and confirmed that the vector is susceptible to experimental L. brasiliensis
and L. amazonensis infection. Comparison of the infection rates revealed statistically
significant differences. The high L. whitmani infection rate together with
epidemiological and entomological studies, verified that L. whitmani is responsible for
L. brasiliensis infection. Remarkably, here we report for the first time that L. whitmani
is vulnerable to experimental L. amazonensis infection and may be a vector of this
pathogen and the distributor for Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. / Este estudo teve como objetivo a análise da suscetibilidade experimental de Lutzomyia
whitmani para infecção com Leishmania brasiliensis causadora da Leishmaniose
Cutânea e Cutâneo-Mucosa e Leishmania amazonensis causadora da Leishmaniose
Cutânea Difusa. Para isso, uma colônia de L. whitmani foi estabelecida com a finalidade
de fornecer espécimes livres destes parasitas que foram submetidos à alimentação em
camundongos experimentalmente infectados com L. brasiliensis e L. amazonensis. A
infecção com parasita foi detectada a partir da amplificação por PCR de fragmentos de
120 pb de DNA cinetoplasto do gênero Leishmania sp. As taxas de infecção
encontradas foram de 65,2% e 47,4% para L. brasiliensis e L. amazonensis,
respectivamente, sendo, portanto, L. whitmani suscetível à infecção experimental por
estas espécies de Leishmania. A comparação entre as taxas de infecção mostrou
diferenças significativas. Assim, concluímos que a alta taxa de infecção desse vetor com
L. brasiliensis associados à estudos epidemiológicos e entomológicos podem
responsabilizá-lo pela transmissão da Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-Mucosa.
Notavelmente, pela primeira vez foi detectado que este flebotomíneo é suscetível à
infecção experimental por L. amazonensis podendo ser um vetor para transmissão desse
patógeno e dispersor da Leishmaniose Cutânea Difusa.
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Infecção experimental de camundongos C57BL/6 por L.(L.) amazonensis na presença de saliva de Lu. longipalpis: estudo da relação parasito-hospedeiro com ênfase a parâmetros da imunidade / Experimental infection in C57BL/6 mice by L. (L.) amazonensis in the presence of Lu. longipalpis saliva: study of parasite host interaction with emphasis to the immunity parametersTadeu Pernichelli 08 April 2009 (has links)
Nós investigamos os efeitos da saliva de Lutzomyia longipalpis capturados no campo e colonizados em laboratório, na evolução da lesão e imunomodulação da infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, uma espécie que é endêmica na América do Sul, onde causa Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutânea Disseminada Bordeline e Leishmaniose Cutânea Difusa Anérgica, com conseqüências graves aos pacientes. Com o intuito de comparar o efeito dos dois tipos de extrato de glândula salivar, camundongos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar das patas traseiras e nas orelhas com 106 formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na presença de extrato de glândula salivar de vetores de captura e de colônia. O tamanho da lesão foi significantemente menor nos camundongos infectados com extrato de glândula salivar de vetores capturados, o que também determinou uma infiltração menos proeminente de macrófagos nas lesões e uma resposta Th2 mais branda quando comparada com aqueles inoculados com extrato de glândula salivar de vetores colonizados. Recentemente, foi mostradas diferenças nos compostos protéicos das glândulas salivares que poderiam parcialmente justificar a expressão da lesão. Portanto, nossos achados ressaltam que a extrato de glândula salivar de flebótomos provavelmente não desempenha um papel importante na exacerbação da infecção por Leishmania já que a transmissão natural do parasito ocorre através de vetores selvagens e não através de vetores colonizados em laboratório / We investigated the effects of Lutzomyia longipalpis saliva of vectors captured in the field and colonized in laboratory on the lesion evolution and immunomodulation of the infection by Leishmania (Leishmania) amazonensis, a species that is endemic in South America where it causes cutaneous leishmaniasis, borderline disseminated cutaneous leishmaniasis and anergic diffuse cutaneous leishmaniasis, with devastating consequences to the patients. In order to compare the effect of both salivas, C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously into the hind footpads or into the ear dermis with 106 promastigotes in the presence of salivary gland homogenate from wildcaught and lab-colonized vectors. Lesion size was significantly lower in the mice infected with saliva from wild-caught sandflies that also determined a less prominent infiltration of macrophages in the lesions and a weaker Th2 response in comparison with those co-inoculated with colonized saliva. Recently, differences were shown in the protein compounds in the salivary glands that could partially account for the lesion size outcome. In conclusion, our findings highlight that phlebotomine saliva probably does not play an important role in the exacerbation of Leishmania infection as the natural parasite transmission occurs through wild and not laboratory colonized vectors.
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Correlação do perfil das células dendríticas com a resposta imune celular T CD4+ e T CD8+ na infecção experimental do camundongo BALB/c por Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis / Correlation to the profile of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cellular immune response in experimental infection of BALB/c mice by Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensisAna Kely de Carvalho 30 November 2012 (has links)
L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection
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Diagnóstico molecular de Leishmaniose Tegumentar Americana: identificação de espécies de Leishmania por SSUrDNA PCR e G6PD PCR / Molecular diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis: identification of Leishmania species by SSUrDNA PCR and G6PD PCRAna Carolina Stocco de Lima 17 August 2010 (has links)
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR
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Estresse oxidativo em Leishmania amazonensis = do encurtamento dos telômeros ao deslocamento de LaRPA-1 do complexo telomérico = Oxidative stress in Leishmania amazonensis : from telomere shortening to displacement of LaRPA-1 from telomeric complex / Oxidative stress in Leishmania amazonensis : from telomere shortening to displacement of LaRPA-1 from telomeric complexDa Silva, Marcelo Santos, 1982- 26 August 2018 (has links)
Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Resumo: A leishmaniose é um espectro de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Durante a infecção, os parasitos usam diferentes estratégias para sobreviver as defesas do hospedeiro, incluindo superar a exposição intensa a espécies reativas de oxigênio (ROS), principais responsáveis por causar danos no DNA, sobretudo nos telômeros, induzindo instabilidade genômica, senescência e morte celular. Telômeros são estruturas nos terminais dos cromossomos compostos por sequências de DNA repetitivas e proteínas, cuja função é proteger as extremidades dos cromossomos, evitando fusões terminais e degradação nucleolítica. Neste trabalho nós induzimos estresse oxidativo agudo em formas promastigotas de L. amazonensis através do tratamento com 2 mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 1h, o qual foi capaz de aumentar os níveis de ROS intracelular, como demonstrado pela reação utilizando CM-H2DCFDA. Além disso, o estresse oxidativo induziu danos no DNA, como mostrado por análise quantitativa de 8-oxodG e núcleos positivos para o ensaio TUNEL. Observamos também, através de parâmetros qualitativos e quantitativos (Southern blot, telomere-PCR e flow-FISH), que o estresse oxidativo, assim como em mamíferos, induziu encurtamento dos telômeros. Analisando a co-localização e interação proteína:DNA por FISH-IIF e ensaios ChIP, foi possível demostrar que o estresse oxidativo causou erosão da extremidade 3¿G overhang, fazendo com que a proteína LaRPA-1 perdesse seu sítio de interação nos telômeros. Além disso, pudemos observar uma maior afinidade de LaRPA-1 para com a fita telomérica rica em C, nesse caso uma região de simples-fita gerada dentro da dupla fita telomérica, provavelmente como consequência do reparo de DNA, sugerindo a participação de LaRPA-1 na resposta a danos oxidativos. Por análise de curvas de crescimento e incorporação de EdU, foi possível observar que o estresse oxidativo induziu diminuição acentuada no número de parasitos em cultura, enquanto os sobreviventes continuaram proliferando e replicando DNA. Observamos também que o estresse oxidativo agudo provocou arrest de ciclo celular na fase G2/M em parte da população em crescimento exponencial. Em conjunto, esses resultados sugerem a presença de um sistema muito eficiente de resposta a danos oxidativos no DNA telomérico, que permite que os parasitos sobrevivam e repliquem DNA mesmo após um estresse agudo / Abstract: Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites of the genus Leishmania that affects million people around the world. During infection, parasites use different strategies to survive host defenses including overcoming exposure to Reactive Oxygen Species (ROS), mainly responsible for causing DNA damage, especially at telomeres which frequently results in genome instability, senescence and cell death. Telomeres are chromosomes end termini structures composed by repetitive DNA coupled with proteins whose function is to protect chromosome ends and avoid end-fusion and nucleolytic degradation. In this work, we induced acute oxidative stress in promastigote forms of Leishmania amazonensis by treating parasites with 2mM hydrogen peroxide (H2O2) for 1 hour, which was able to increase intracellular ROS levels, as demonstrated by CM-H2DCFDA reaction. In addition, oxidative stress induced DNA damage, as confirmed by quantitative analysis of 8-oxodG and TUNEL-positive nuclei. We have also observed using qualitative and quantitative parameters (Southern blot, telomere-PCR and flow-FISH) that oxidative stress, as in mammals, induced telomere shortening. Analysing the protein:DNA co-localization and interaction by FISH-IIF and ChIP assays, it was possible to show that oxidative stress is able to induce erosion of the 3¿G overhang, inducing a displacement of LaRPA-1 from its telomeric interaction site. In addition, we observed an increase in the affinity between LaRPA-1 and the telomeric C-rich strand, in this case, a single-strand region inside the double-strand telomeric DNA generated probably as a consequence of DNA repair, suggesting the participation of LaRPA-1 in oxidative DNA damage response. Analysis of growth curves and EdU incorporation showed that oxidative stress induced a decrease in the number of parasites in culture, while the survivors continued proliferating and replicating DNA. Moreover, as result of acute oxidative stress, part of the parasites in exponential growth shows a G2/M cell cycle arrest. Taken together, these results suggest the presence of a very efficient oxidative damage response in the telomeres that allows parasites to survive and to replicate DNA even after acute stress / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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Atividade leishmanicida do extrato da raiz de Physalis angulata e sua ação na célula hospedeiraSILVA, Raquel Raick Pereira da 23 May 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / INCT/BEB - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem / A Leishmaniose é uma doença infecciosa causada por várias espécies de parasitas do gênero Leishmania. A quimioterapia é o único tratamento efetivo para a doença, mas essas drogas são, em geral, tóxicas e requer um longo período de tratamento. Produtos naturais provenientes de plantas oferecem novas perspectivas e representam uma importante fonte de novos agentes leishmanicidas. Assim, é de grande importância avaliar os efeitos do extrato aquoso da raiz de Physalis angulata, planta amplamente utilizada pela medicina popular, em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e sua ação sobre a célula hospedeira. As fisalinas D, E, F e G foram demonstradas pela primeira vez na raiz de P. angulata pela análise cromatográfica. Uma atividade antiproliferativa e uma inibição dose dependente de promastigotas 74,1% e 99,8 % (IC50 35,5 μg/mL) e amastigotas 70,6% e 70,9% (IC50 32.0 μg/mL) foram observadas quando os parasitas foram tratados com 50 e 100 μg/mL do extrato, respectivamente. A análise da atividade microbicida da célula hospedeira infectada com L. amazonensis mostrou que extrato foi capaz de reverter o efeito causado pelo parasito de inibir a produção de espécies reativas de oxigênio. O tratamento com o extrato também induziu alterações morfológicas importantes em formas promastigotas avaliadas por microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Foram observadas alterações na morfologia, na divisão celular, principalmente na fase de citocinese, na membrana flagelar, na bolsa flagelar e alterações em organelas importantes, como o cinetoplasto, onde ocorreu duplicação irregular e alteração do seu tamanho. Já por citometria de fluxo foi possível confirmar que o tratamento induziu uma exposição de fosfatidilserina e diminuição no volume celular de promastigotas tratadas. Com relação à célula hospedeira, o extrato promoveu alterações no citoesqueleto, o aumento número de projeções citoplasmáticas, do volume celular e de vacúolos e da habilidade de espraiamento sem causar efeito citotóxico ou alteração ultraestrutural em macrófagos tratados com o extrato. Assim, estes resultados demonstram que o extrato aquoso da raiz de P. angulata foi eficaz na ativação da célula hospedeira e na inibição do crescimento do protozoário, o que representa uma fonte alternativa e promissora de agente leishmanicida. / Leishmaniasis is an infectious disease caused by various species of the protozoan parasites of the Leishmania genus. The chemotherapy is the only effective treatment for the disease, but these drugs are, in general, toxics and requires a longer treatment period. Natural products have been used as traditional medicine and offer new perspectives and represent an important source of new antileishmanial agents. Thus, it is of great importance to assess the effects of the aqueous extract of the root of Physalis angulata, a plant widely used in popular medicine, in promastigotes and amastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis and its effect on the host cell. Physalins D, E, F and G were found present, for the first time, in the P. angulata roots using liquid chromatography/mass spectrometry analysis. Antiproliferative activity and a dose-dependent inhibition of promastigote growth 74.1% and 99.8 % (IC50 35.5 μg/mL), and intracellular amastigotes 70.6% and 70.8% (IC50 32.2 μg/mL) was observed when parasites were treated with 50 and 100 μg/ mL of extract, respectively. The analysis of the microbicidal activity of host cell infected, with L. amazonensis demonstrated that extract is able to reverse the effect caused by the parasite to inhibit the production of reactive oxygen species. This growth inhibition was associated with several morphological alterations assessed by optical microscopy, transmission electron microscopy and scanning such as alteration on cell division, especially in the phase of cytokinesis, alteration in flagellar membrane, in flagellar pocket and duplication of kinetoplast DNA. Already by flow cytometry was possible to confirm that the treatment induced a phosphatidylserine exposure and decreased cell volume of promastigotes treated. In the host cell were observed cytoskeleton alterations, high number of cytoplasmatic projections, increase of cytoplasm, vacuoles and spreading ability. No cytotoxicity towards macrophages was observed. We have demonstrated that aqueous extract effectively promotes antileishmanial activity and clearly demonstrate the induction of apoptosis and ultrastructural alterations in Leishmania parasites. Thus, aqueous extract may represent a promising natural alternative source for a new antileishmanial agent.
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Leishmania (L.) amazonensis inibe a maturação e a função ativadora das células de Langerhans da pele tratadas com TNF-α e anti-CD40 in vitroCAMPELO, Simone Rodrigues 27 June 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos em um amplo espectro de formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana. De modo geral, a resistência frente às leishmanioses decorre do desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente, porém
muitos estudos têm demonstrado que citocinas específicas ou combinações de citocinas
podem ser fatores de resistência ou suscetibilidade à infecção por L. amazonensis. Estudos recentes sugerem a participação das células de Langerhans (LCs) nas resposta anti-Leishmania, porém os mecanismos envolvidos durante esta interação são ainda pouco estudados. Objetivos: Estudar o papel do TNF-α e anti-CD40 nas interações in vitro entre as LCs e L. amazonensis, observando o perfil de citocinas produzidas e a expressão de moléculas
de superfície, bem como verificar a capacidade destas células em ativar a produção de IFN-γ e
IL-4 por células do linfonodo. Metodologia: As LCs foram isoladas da epiderme de
camundongos BALB/c e incubadas com promastigotas de L. amazonensis, TNF-α e/ou anti-
CD40. Após 24h, as LCs foram co-cultivadas com células obtidas de linfonodos por 72h. As
citocinas IL-6, IL-12, IFN-γ e IL-4 foram dosadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) e as
moléculas de superfície foram analisadas por citometria de fluxo. Resultados: Os níveis de IL-
6 e IL-12p70 produzidos pela LCs foram significativamente reduzidos após interação com L.
amazonensis, mesmo após o tratamento das LCs com TNF-α ou anti-CD40. Em relação às
moléculas de superfície, não houve diferença na expressão de CD207 em nenhum dos grupos,
porém a presença de L. amazonensis promoveu uma redução significativa na expressão de
CD40 nas LCs tratadas com TNF-α ou anti-CD40, e aumentou a expressão de CD86 em todos
os grupos. Na presença de L. amazonensis, as células do linfonodo apresentaram uma
produção diminuída de IFN-γ e não houve alteração na produção de IL-4. Quando cocultivadas
com LCs estimuladas previamente com L. amazonensis, a produção de IFN-γ
também foi reduzida, mesmo na presença dos estímulos TNF-α e/ou anti-CD40. Não foram
observadas alterações significativas na produção de IL-4 pelas células do linfonodo cocultivadas
nas mesmas condições experimentais. Conclusão: L. (L.) amazonensis exerce um
efeito imunomodulador sobre a resposta imune mediada por LCs, inibindo a produção de IL-6
e IL-12p70 e expressão de CD40, além de impedir a ativação da produção de IFN-γ por
células do linfonodo co-cultivadas com LCs, mesmo após tratamento com TNF-α e anticorpo
anti-CD40. / Leishmania amazonensis is one of the agents in a wide spectrum of clinical forms of
cutaneous leishmaniasis. In general, the resistance against leishmaniasis depends on the
development of an efficient immune response, however many studies have demonstrated that
specific cytokines or combinations of cytokines may be factors of resistance or susceptibility
to infection by L. amazonensis. Recent studies suggest the involvement of Langerhans cells
(LCs) in the anti-Leishmania response, but the mechanisms involved in this interaction are
still poorly understood. In this study, we investigated the role of TNF-α and anti-CD40 in L.
amazonensis interaction with LCs in vitro, showing de profile of cytokines produced and the
expression of surface molecules, besides verifing their abilities to activate the production of
IFN-γ e IL-4 by lymph node cells. Methods: Fresh immature LCs, highly purified from
BALB/c mouse skin, were incubated with L. amazonensis promastigotes, TNF-α and/or anti-
CD40 mAb. After 24 h, LCs were co-cultured with lymph nodes cells of BALB/c mice for
additional 72h. Culture supernatants were tested for IL-6, IL-12p70, IFN-γ and IL-4 by
ELISA, while surface molecules were analyzed by FACS. Results: The levels of IL-6 and IL-
12p70 produced by LCs were significantly reduced after interaction with L. amazonensis,
even after treatment of LCs with TNF-α or anti-CD40. Regarding surface molecules, there
was no difference in the expression of CD207 in both groups, but the presence of L.
amazonensis promoted a significant reduction in the expression of CD40 on LCs treated with
TNF-α or anti-CD40, and increased expression CD86 in all groups. Lymph node cells showed
a decreased production of IFN-γ in the presence of L. amazonensis and no change in IL-4.
When co-cultured with LCs previously stimulated with L. amazonensis, the production of
IFN-γ was also reduced, even in the presence of TNF-α and/or anti-CD40. No significant
changes were observed in IL-4 by lymph cells co-cultured under the same experimental
conditions. Conclusion: L. (L.) amazonensis exert an immunomodulatory effect on the
immune response mediated by LCs by: 1) inhibiting the production of IL-6 and IL-12p70; 2)
decreasing CD40 expression and; 3) preventing the activation of IFN-γ production by lymph
node cells co-cultured with LCs, even after treatment with TNF-α and anti-CD40 antibody.
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Ação do alcaloide (+)-filantidina sobre o protozoário Leishmania (Leishmania) amazonensis e a célula hospedeiraMORAES, Lienne Silveira de 14 August 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / INCT/BEB - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem / PROCAD - Programa Nacional de Cooperação Acadêmica / A leishmaniose é uma doença de caráter antropozoonótico causada por parasitas do gênero Leishmania. Estes parasitas proliferam principalmente dentro de macrófagos de mamíferos e são responsáveis por promover uma diversidade de manifestações clínicas como Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucocutânea (LMC). O único tratamento utilizado para a leishmaniose é a quimioterapia, onde geralmente são utilizadas drogas tóxicas e com longo período de tratamento. O estudo de produtos naturais obtidos de plantas como agente leishmanicida desempenha um papel importante na busca de novas drogas para o tratamento da leishmaniose. A (+)-filantidina é um alcaloide extraído do caule da planta Margaritaria nobilis, pertencente a família Phyllanthaceae. Desta forma, objetivo deste estudo é avaliar os efeitos da (+)-filantidina sobre formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a célula hospedeira. A atividade antiproliferativa de formas promastigotas foi avaliada quando os parasitas foram tratados com 50, 100 e 200 μg/ml do alcaloide por 96 horas, com redução de 73,75%, 82,50% e 88,75% no número de parasitas respectivamente, quando comparados ao grupo controle sem tratamento. No período de 96 horas, foi observado um valor IC<sub>50</sub> de 56,34 μg/ml. A anfotericina B foi utilizada como droga de referência na concentração de 0,1 μg/ml, sendo observada redução de 100% dos parasitas durante as 96 horas de tratamento. O tratamento com o alcaloide promoveu alterações importantes nas promastigotas, mostradas através de microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Foram observadas alterações no corpo celular, flagelo, cinetoplasto, mitocôndria, indução na formação de rosetas, presença de vesículas eletrodensas sugestivas de corpúsculos lipídicos e aumento no número de estruturas semelhantes a acidocalcisssomos. Com relação à célula hospedeira, não foi observado efeito citotóxico nos macrófagos tratados com alcaloide e análise por microscopia eletrônica de varredura mostrou que o alcaloide promoveu aumento no número de projeções citoplasmáticas, aumento do volume celular e espraiamento. Assim, estes resultados demonstram que a (+)-filantidina foi eficaz na redução do crescimento de formas promastigotas do protozoário, sendo eficaz na ativação de macrófagos sem causar efeito citotóxico para o mesmo, o que pode representar uma fonte alternativa para o tratamento da leishmaniose. / Leishmaniasis is an antropozoonotic disease caused by parasites of the genus Leishmania. These parasites proliferate primarily within macrophages of mammals and are responsible for promoting a variety of clinical manifestations, such as cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). The treatment available is chemotherapy, but is limited by toxicity and requires a long term treatment. The study of natural products from plants such as antileishmanial agent currently plays an important role in the search for new drugs for the treatment of leishmaniasis. (+)-phylantidine, is an alkaloid extracted from stem of Margaritaria nobilis of the family Phyllanthaceae. The aim of this study is evaluated the effects of (+)-phylantidine on promastigotes forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis and host cell. Antiproliferative activity of promastigotes forms was observed when parasites were treated with 50, 100 e 200 μg/mL of alkaloid for 96 hours, with reduction of 73.75%, 82.50% and 88.75%, respectively when compared with non-treated parasites. In the period of 96 hours it was observed an IC<sub>50</sub> of 56.34 μg/mL. Amphotericin B was used as reference drug and reduction of 100% in parasites treated with 0.1 μg/mL was observed after 96 hours. Treatment with the alkaloid promoted important changes in promastigotes that were observed by scanning and transmission electron microscopy. Alterations in cell body, flagellum, kinetoplast, mitochondria, rosette formation, presence of electrodense vesicles suggestive of lipid body and increase in structures like acidocalcisssomes were observed. In the host cell no cytotoxic effect was observed in the macrophages treated with the alkaloid and analysis by scanning electron microscopy showed that the alkaloid promoted an increase in the number of cytoplasmic projections, increased cell volume and spreading. Thus, these results demonstrate that (+)-phylantidine was effective in reducing the growth of the protozoa, without citotoxy effect which may represent a promising natural alternative source for the treatment of leishmaniasis.
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