A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

As leishmanias são parasitas intracelulares obrigatórios que utilizam fagócitos (em especial os macrófagos), para sua sobrevivência e propagação. Estes parasitas são interiorizados via interação com diversos receptores da superfície celular, como o receptor CR3 (MAC-1; CD18/CD11b), componente da família das 2-integrinas. As B2-integrinas são importantes em diferentes mecanismos imunológicos, como a adesão e migração de células, fagocitose e modulação de vias de sinalização intracelulares. Estudos demonstram que a molécula CD18 (constituinte de todas as B2-integrinas) está envolvida na resposta imune na leishmaniose experimental, mas há controvérsias quanto a sua importância na defesa contra esta infecção. Leucotrienos e prostaglandinas são mediadores lipídicos envolvidos em diversos mecanismos da resposta imune inata e adaptativa. Na leishmaniose, os leucotrienos são considerados cruciais para a defesa do organismo por induzir mecanismos efetores celulares, como fagocitose e atividade microbicida. Por outro lado, as prostaglandinas (em especial PGE2) exercem efeito imunossupressor sobre estes mecanismos, podendo favorecer o desenvolvimento da doença. Entretanto, não há conhecimento sobre a relação entre a expressão das B2-integrinas e a produção destes mediadores lipídicos na leishmaniose e a importância destas moléculas na resposta imune contra esta infecção. Assim, o objetivo desta tese foi investigar o efeito da redução da expressão das B2-integrinas na produção de citocinas, quimiocinas e de medidores lipídicos, em modelo de infecção experimental por L. amazonensis. Para isso, camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens (WT) e com baixa expressão de CD18 (CD18 Low), foram infectados com promastigotas de L. amazonensis na pata posterior, e o desenvolvimento da infecção foi acompanhado por 5 e 8 semanas após a inoculação. Com base nos resultados obtidos, os animais CD18 Low apresentaram maior carga parasitária nas patas, em comparação com os camundongos selvagens. Além disso, a maior suscetibilidade dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de NO e de IL-10 e da redução de IL-12 mediada por IL-4. Estes animais também apresentaram reduzida produção de IFN-gama. Além disso, os camundongos CD18 Low tiveram alterações na produção de LTB4 e de PGE2 ,as quais podem ter reduzido as respostas efetoras das células no sítio da infecção. Também demonstramos que a migração de neutrófilos e de eosinófilos para o sítio de infecção ocorreu de modo independente da expressão de CD18. O maior edema e recrutamento de eosinófilos nas patas dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de MCP-1 e parcialmente dependente de RANTES. Entretanto, a produção de LTC4 pareceu ter sido o principal responsável por estes efeitos, em conjunto com PGD2. Deste modo, nossos resultados mostram que a baixa expressão de CD18 favorece o desenvolvimento da infecção por L. amazonensis. / Leishmania are obligate intracellular parasites that use phagocytes (especially macrophages) for their survival and propagation. These parasites are internalized through interaction with several receptors of cellular surface, such as the CR3 receptor (Mac-1; CD18/CD11b), component of the B2-integrins family. B2- integrins are involved in important immune mechanisms, such as cell adhesion, cell migration, phagocytosis and modulation of intracellular signaling pathways. Studies have shown that the CD18 molecule (component of all B2-integrins), is involved in the immune response in experimental leishmaniasis, but its importance in the host defense against this infection is still controversial. Leukotrienes and prostaglandins are lipid mediators involved in various mechanisms of innate and adaptive immune response. In leishmaniasis, leukotrienes are considered critical for the host defense, once it induces cellular effector mechanisms such as phagocytosis and microbicide activity. On the other hand, prostaglandins (in particular PGE2), lead to immunosuppressive effects on these mechanisms and may favor development of disease. However, it is unknown whether there is an interaction between the B2 integrins expression and the production of these mediators in leishmaniasis and the role of these molecules in host defense against this disease. Thus, the aim of this thesis was to verify the effect of reduced expression of B2-integrins in cytokines, chemokines and lipid mediators production, in experimental model of L. amazonensis infection. For this purpose, wild type mice (WT) and mice with reduced CD18 expression (CD18Low) from C57BL/6 strain were infected with L. amazonensis promastigotes in the hind footpad. The development of the infection was assessed for 5 and 8 weeks after inoculation. Our results showed that the CD18Low mice had higher parasite load in footpad, compared to wild-type mice. Moreover, the higher susceptibility of CD18Low mice was independent of NO and IL-10 production and independent of IL-12 reduction mediated by IL-4. These mice also showed reduced IFN- gamma production. CD18Low mice had alterations in LTB4 and PGE2 levels in site of infection, which may have altered the effector cell responses. We also demonstrated that the migration of neutrophils and eosinophils to the site of infection was CD18-independent. Moreover, the higher edema and eosinophils recruitment in CD18Low mice was MCP-1-independent and partially dependent of RANTES. However, LTC4 production seemed to be the main factor for edema and migration of eosinophils, together with PGD2. Thus, our results show that the reduction on CD18 expression favors the development of L. amazonensis infection.

Aedes aegypti é importante vetor de patógeno causador de doença como dengue, febre amarela, febre Chikungunya e Zika. A fêmea realiza repasto sanguíneo a fim de adquirir nutriente para o desenvolvimento dos ovos. Neste contexto, a saliva possui papel fundamental, representando o elo entre o artrópode hematófago, seu hospedeiro vertebrado e o potencial patógeno a ser transmitido. Nessa saliva encontra-se um coquetel farmacológico com diversas atividades biológicas, como a presença de peptídeos antimicrobianos e moléculas com funções imunomoduladoras sobre células do hospedeiro vertebrado, com especial atenção aos macrófagos. Como os macrófagos também estão envolvidos nos mecanismos efetores da resposta contra protozoários do gênero Leishmania e a leishmaniose apresenta-se como uma doença de caráter zoonótico de grande relevância em saúde pública, o objetivo deste trabalho foi de avaliar o efeito do extrato de glândula salivar (EGS) de A. aegypti em infecções por Leishmania. Nossos resultados mostraram aumento da infecção in vivo e in vitro na presença do EGS, sugerindo fortemente que o EGS de A. aegypti é capaz de aumentar a infecção por Leishmania. / Aedes aegypti is an important vector of disease-causing pathogens such as dengue, yellow fever, Chikungunya and Zika fever. The mosquito female takes a blood meal in order to develop the eggs. In this context, a saliva plays a key role, representing the link between the hematophagous arthropod, its vertebrate host and the potential pathogen to be transmitted. During the evolutionary process, these insects developed a salivary cocktail with an arsenal of molecules presenting several immunomodulatory properties in host cells, such as macrophages. As macrophages are also involved in the mechanisms of response against protozoa of the genus Leishmania and leishmaniasis is a zoonotic disease of great relevance in public health, the aim of this work is to evaluate the effect of salivary gland extract (SGE) of A. aegypti in Leishmania infections. Our results showed increased infection, in vivo and in vitro, in the presence of SGE, strongly suggesting that A. aegypti EGS is able to increase infection by Leishmania.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2069742 bytes, checksum: 30969d68a1c51eddd37190cde04e71ac (MD5) Previous issue date: 2014-06-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis is a complex of inserted parasitic diseases in the group of neglected tropical diseases. The drugs used primarily in the treatment of leishmaniasis are pentavalent antimonials and amphotericin B. However, these drugs are associated with serious side effects. Therefore, it is necessary to search for new antileishmanial drugs. In this context natural products are a source of new active molecules. This study, it was investigated the antileishmanial activity of the ethanol extract of Phyllanthus acuminatus and Justicidin B, lignan obtained from this plant and the ethanol extract, the dichloromethane phase and Hyptenolide obtained from Hyptis macrostachys in vitro experimental models. All samples assessed showed antileishmanial activity, initially demonstrated by inhibition of growth of L. amazonensis promastigotes in logarithmic growth phase. The concentration that inhibits 50% of growth (IC50) for the tested substances was 35.58 μg /mL for the ethanolic extract of P. acuminatus, 12.51 μg/mL for Justicidin B; 280.69 μg/mL for the ethanol extract of H. macrostachys, 55.3 μg/mL for dichloromethane phase of H. macrostachys and 22.67 μg/mL for Hyptenolide. These samples were also evaluated for cytotoxicity in murine peritoneal macrophages of swiss mice, which resulted in the measurement of the cytotoxic concentration for 50% macrophages (CC50), which were 39.62 μg/mL for the ethanolic extract of P. acuminatus, 58.56 μg/ml for Justicidin B; 121,36 μg/mL for the ethanol extract of H. macrostachys, 40.45 μg/mL for dichloromethane phase of H. macrostachys and 61.78 μg/ml for Hyptenolide. These data resulted in IC50 and CC50 resulted in a selectivity index of 1.11 for the ethanol extract of P. acuminatus; 4.68 for Justicidin B; 0.43 for the ethanol extract of H. macrostachys; 0.73 to dichloromethane phase of H. macrostachys and 2.72 to Hyptenolide. Given these results, we selected the lignan Justicidina B for further study of antileishmanial activity against L. amazonensis. In the evaluation of the DNA fragmentation pattern of L. amazonensis promastigotes, it was observed in higher concentration evaluated of Justicidin B (4x IC50) induction of DNA fragmentation similar to that observed in the positive control H2O2 (4mM). In infection model macrophage with L. amazonensis and treated with lignan Justicidin B showed reduction in both the percentage of infected macrophages as the number of amastigotes per infected macrophage, resulting in a reduction in the rate of infection compared to control, resulting decrease in the effective concentration for 50% of infection (EC50) of 9.14 and 3.58 for 24 hours and 72 hours after treatment. This result was correlated with an immunomodulatory activity of this lignan, associated with decreased levels of interleukin (IL) -10, and increased levels of nitric oxide (NO). It can be concluded that the lignan Justicidin B has significant activity antipromastigote and antiamastigote and presents immunomodulatory properties in models of infection in vitro. / As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias inseridas no grupo de doenças tropicais negligenciadas. Os principais medicamentos utilizados na terapêutica das leishmanioses são antimoniais pentavalentes e anfotericina B. Contudo, esses medicamentos estão associados a sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessária a busca de novas drogas leishmanicidas. Nesse contexto, os produtos naturais são uma fonte de novas moléculas ativas. Neste trabalho, investigou-se a atividade antileishmania do extrato etanólico de Phyllanthus acuminatus e Justicidina B, lignana obtida dessa planta, bem como o extrato etanólico, a fase diclorometano e o Hiptenolideo, obtidos de Hyptis macrostachys em modelos experimentais in vitro. Todas as amostras avaliadas apresentaram atividade antileishmania, demonstrada inicialmente pela inibição de crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis em fase logarítmica de crescimento. A concentração que inibe 50% do crescimento (CI50) para as substâncias avaliadas foi de 35,58μg/mL para o extrato etanólico de P. acuminatus, 12,51μg/mL para Justicidina B; 280,69μg/mL para o extrato etanólico de H. macrostachys, 55,3μg/mL para fase diclorometano de H. macrostachys e 22,67μg/mL para o Hiptenolideo. Essas amostras também foram avaliadas quanto à citotoxicidade em macrófagos peritoneais murinos de camundongos suíços, o que resultou na medida da concentração citotóxica para 50% dos macrófagos (CC50), que foram de 39,62μg/mL para o extrato etanólico de P. acuminatus, 58,56μg/mL para Justicidina B; 121,36μg/mL para o extrato etanólico de H. macrostachys, 40,45μg/mL para fase diclorometano de H. macrostachys e 61,78μg/mL para o Hiptenolideo. Esses dados de CI50 e CC50 resultaram no Índice de Seletividade que foram de 1,11 para o extrato etanólico de P. acuminatus; 4,68 para Justicidina B; 0,43 para o extrato etanólico de H. macrostachys; 0,73 para fase diclorometano de H. macrostachys e 2,72 para o Hiptenolideo. Diante desses resultados, foi selecionada a lignana Justicidina B para aprofundar os estudos de atividade antileishmania sobre L. amazonensis. Na avaliação do padrão de fragmentação do DNA de formas promastigotas de L. amazonensis observou-se que a Justicidina B na maior concentração avaliada (4x IC50) foi capaz de induzir a fragmentação do DNA semelhante ao observado no controle positivo H2O2 (4mM). Em modelo de infecção de macrófagos com L. amazonensis e tratados com a lignana Justicidina B observou-se redução tanto da porcentagem de macrófagos infectados quanto do número de amastigotas por macrófago infectado, resultando em uma redução no índice de infecção quando comparados ao controle, resultando em concentração efetiva para diminuir 50% da infecção (EC50) de 9,14 e 3,58 para 24 horas e 72 horas de tratamento. Esse resultado foi correlacionado com uma atividade imunomoduladora dessa lignana, associada à diminuição nos níveis de interleucina (IL)-10, e a um aumento nos níveis de óxido nítrico (NO). Pode-se concluir que a lignana Justicidina B possui significativa atividade antipromastigota e antiamastigota e apresenta propriedades imunomodulatórias em modelos de infecção in vitro

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2018-07-09T18:58:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Paula Lopes Lima - 2018.pdf: 2335802 bytes, checksum: 2f6ce764d8628ef3ceadc17fda527b72 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-10T11:27:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Paula Lopes Lima - 2018.pdf: 2335802 bytes, checksum: 2f6ce764d8628ef3ceadc17fda527b72 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T11:27:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Paula Lopes Lima - 2018.pdf: 2335802 bytes, checksum: 2f6ce764d8628ef3ceadc17fda527b72 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-06-22 / Leishmaniasis is a disease transmitted by protozoan-infected sandflies of the genus Leishmania, whose cutaneous form is the most common with 50 to 75% of new cases reported. It is a non-contagious disease of chronic evolution, considered stigmatizing and neglected, affecting about 500,000 people in the world. Most drugs used in pharmacological treatment are potentially toxic and require patient hospitalization for administration, which raises costs and discourages the needy population from adhering to treatment. In this scenario, herbal medicines are inserted as an alternative because of their proven efficacy and because they cause fewer undesirable effects. The objective of the present study was to evaluate the leishmanicidal potential and the in vitro cell viability of Siparuna guianensis (SG) and α- Bisabolol (AB) isolated essential oils of Siparuna guianensis (SG) on Vero cells and Leishmania amazonensis promastigotes using the method colorimetric resazurin salt (Alamar Blue®) as an indicator of cellular metabolism. Cell invasion was also performed with the parasites previously treated with the IC50 obtained for AB and SG obtained in the cell viability test, in order to test the effect of the compounds on the infection capacity of the parasites. The results were analyzed using the program GraphPad Prism version 6.01. For analysis of the IC50, the non-linear regression tests were used. The tested compounds demonstrated viability on Vero basal cells and leishmanicidal activity: SG IC50 131.5 μg/mL and 2.59 μg/mL respectively. For α-Bisabolol the concentrations obtained were 103.8 μg/mL and 6.394 μg/mL and for SG were 94.61 μg/mL and 7.84 μg/mL, respectively. This is the first report of a cell invasion assay made with S. guianensis and α-Bisabolol alone, in which inhibition of 98.4% infective capacity of L. amazonensis promastigotes treated with SG at 131,5 μg/mL and inhibition of 95.4% of the infective capacity of the same AB-treated parasite at a concentration of 95.4 μg/mL, which are close to the value obtained by the conventional drug in a similar in vitro assay. which suggests a refinement of the technique and in vivo assays to determine the action of S. guianensis and α-Bisabolol from the concentrations obtained in this research. / A leishmaniose é uma doença transmitida por insetos do tipo flebotomíneos infectados por protozoários do gênero Leishmania, cuja forma cutânea é a mais comum com 50 a 75% de casos novos relatados. É uma doença não contagiosa, de evolução crônica, considerada estigmatizante e negligenciada, afetando cerca de 500.000 pessoas no mundo. A maioria das drogas utilizadas no tratamento farmacológico é potencialmente tóxica e requer hospitalização do paciente para sua administração, o que eleva os custos e desestimula a população carente a aderir ao tratamento. Neste cenário, os medicamentos fitoterápicos inserem-se como uma alternativa devido a sua eficácia comprovada e por causarem menos efeitos indesejáveis. O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial leishmanicida e a viabilidade celular in vitro do óleo essencial de Siparuna guianensis (SG) e do α-Bisabolol (AB) isolado de S. guianensis sobre células Vero e promastigotas de Leishmania amazonensis, utilizando o método colorimétrico sal de resazurina (Alamar Blue®) como indicador de metabolismo celular. Foi realizado também ensaio de invasão celular com os parasitos previamente tratados com o IC50 obtido para AB e SG obtido no teste de viabilidade celular, afim de testar o efeito dos compostos na capacidade de infecção dos parasitos. Os resultados foram analisados utilizando o programa GraphPad Prism versão 6.01. Para análise do IC50 foi utilizado os testes de regressão não linear. Os compostos testados demonstraram viabilidade sobre células basais Vero e atividade leishmanicida: SG IC50 131,5 µg/mL e 2,59 µg/mL respectivamente. Para α-Bisabolol as concentrações obtidas foram 103,8 µg/mL e 6,394 µg/mL e para SG foram 94,61 µg/mL e 7,84 µg/mL, respectivamente. Este é o primeiro relato de um ensaio de invasão celular feito com S. guianensis e α-Bisabolol isolado, no qual pode ser observado a inibição de 98,4% de capacidade infectiva de promastigotas de L. amazonensis tratadas com SG na concentração de 131,5 µg/mL e inibição de 95,4 % da capacidade infectiva do mesmo parasito tratado com AB na concentração de 95,4 µg/mL, resultados estes que se aproximam do valor obtido pelo medicamento convencional em um ensaio semelhante in vitro, o que sugere um refinamento da técnica e ensaios in vivo para determinar a ação da S. guianensis e do α-Bisabolol a partir das concentrações obtidas nesta pesquisa.

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

As leishmanias são parasitas intracelulares obrigatórios que utilizam fagócitos (em especial os macrófagos), para sua sobrevivência e propagação. Estes parasitas são interiorizados via interação com diversos receptores da superfície celular, como o receptor CR3 (MAC-1; CD18/CD11b), componente da família das 2-integrinas. As B2-integrinas são importantes em diferentes mecanismos imunológicos, como a adesão e migração de células, fagocitose e modulação de vias de sinalização intracelulares. Estudos demonstram que a molécula CD18 (constituinte de todas as B2-integrinas) está envolvida na resposta imune na leishmaniose experimental, mas há controvérsias quanto a sua importância na defesa contra esta infecção. Leucotrienos e prostaglandinas são mediadores lipídicos envolvidos em diversos mecanismos da resposta imune inata e adaptativa. Na leishmaniose, os leucotrienos são considerados cruciais para a defesa do organismo por induzir mecanismos efetores celulares, como fagocitose e atividade microbicida. Por outro lado, as prostaglandinas (em especial PGE2) exercem efeito imunossupressor sobre estes mecanismos, podendo favorecer o desenvolvimento da doença. Entretanto, não há conhecimento sobre a relação entre a expressão das B2-integrinas e a produção destes mediadores lipídicos na leishmaniose e a importância destas moléculas na resposta imune contra esta infecção. Assim, o objetivo desta tese foi investigar o efeito da redução da expressão das B2-integrinas na produção de citocinas, quimiocinas e de medidores lipídicos, em modelo de infecção experimental por L. amazonensis. Para isso, camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens (WT) e com baixa expressão de CD18 (CD18 Low), foram infectados com promastigotas de L. amazonensis na pata posterior, e o desenvolvimento da infecção foi acompanhado por 5 e 8 semanas após a inoculação. Com base nos resultados obtidos, os animais CD18 Low apresentaram maior carga parasitária nas patas, em comparação com os camundongos selvagens. Além disso, a maior suscetibilidade dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de NO e de IL-10 e da redução de IL-12 mediada por IL-4. Estes animais também apresentaram reduzida produção de IFN-gama. Além disso, os camundongos CD18 Low tiveram alterações na produção de LTB4 e de PGE2 ,as quais podem ter reduzido as respostas efetoras das células no sítio da infecção. Também demonstramos que a migração de neutrófilos e de eosinófilos para o sítio de infecção ocorreu de modo independente da expressão de CD18. O maior edema e recrutamento de eosinófilos nas patas dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de MCP-1 e parcialmente dependente de RANTES. Entretanto, a produção de LTC4 pareceu ter sido o principal responsável por estes efeitos, em conjunto com PGD2. Deste modo, nossos resultados mostram que a baixa expressão de CD18 favorece o desenvolvimento da infecção por L. amazonensis. / Leishmania are obligate intracellular parasites that use phagocytes (especially macrophages) for their survival and propagation. These parasites are internalized through interaction with several receptors of cellular surface, such as the CR3 receptor (Mac-1; CD18/CD11b), component of the B2-integrins family. B2- integrins are involved in important immune mechanisms, such as cell adhesion, cell migration, phagocytosis and modulation of intracellular signaling pathways. Studies have shown that the CD18 molecule (component of all B2-integrins), is involved in the immune response in experimental leishmaniasis, but its importance in the host defense against this infection is still controversial. Leukotrienes and prostaglandins are lipid mediators involved in various mechanisms of innate and adaptive immune response. In leishmaniasis, leukotrienes are considered critical for the host defense, once it induces cellular effector mechanisms such as phagocytosis and microbicide activity. On the other hand, prostaglandins (in particular PGE2), lead to immunosuppressive effects on these mechanisms and may favor development of disease. However, it is unknown whether there is an interaction between the B2 integrins expression and the production of these mediators in leishmaniasis and the role of these molecules in host defense against this disease. Thus, the aim of this thesis was to verify the effect of reduced expression of B2-integrins in cytokines, chemokines and lipid mediators production, in experimental model of L. amazonensis infection. For this purpose, wild type mice (WT) and mice with reduced CD18 expression (CD18Low) from C57BL/6 strain were infected with L. amazonensis promastigotes in the hind footpad. The development of the infection was assessed for 5 and 8 weeks after inoculation. Our results showed that the CD18Low mice had higher parasite load in footpad, compared to wild-type mice. Moreover, the higher susceptibility of CD18Low mice was independent of NO and IL-10 production and independent of IL-12 reduction mediated by IL-4. These mice also showed reduced IFN- gamma production. CD18Low mice had alterations in LTB4 and PGE2 levels in site of infection, which may have altered the effector cell responses. We also demonstrated that the migration of neutrophils and eosinophils to the site of infection was CD18-independent. Moreover, the higher edema and eosinophils recruitment in CD18Low mice was MCP-1-independent and partially dependent of RANTES. However, LTC4 production seemed to be the main factor for edema and migration of eosinophils, together with PGD2. Thus, our results show that the reduction on CD18 expression favors the development of L. amazonensis infection.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-02T20:29:26Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Allana Souza Pereira - 2015.pdf: 1763326 bytes, checksum: 42ca3d39923194187444a08c3a9a330c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-03T12:46:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Allana Souza Pereira - 2015.pdf: 1763326 bytes, checksum: 42ca3d39923194187444a08c3a9a330c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T12:46:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Allana Souza Pereira - 2015.pdf: 1763326 bytes, checksum: 42ca3d39923194187444a08c3a9a330c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-11-13 / The use of plants is a bequest from popular culture and perpetuated from generation to the present day, the population uses plants with a possible activity in order to treat several infectious and metabolic diseases and it is dated since the Antiquity. The use of plants and natural products has been replaced by the use of synthetic sybstances through the years, but the use of natural products is returning daily with a use of plants in the form of teas and potions especially among the population with less access to terapeutic wherewithal. The Synadenium umbellatum is used in Brazil by the by the possible antitumor, antiinflammatory, antimicrobial, antiviral and antiparasitic activities from your latex. There are few studies to investigate the possible bioactivity from this plant, and no studies have investigate its compounds. The present study performed analysis by chromatographic methods in order to elucidate the composition of the S. umbellatum latex, by dividing it into Ethyl Acetate, Ethanolic, Chloroform and Hexanic fractions and evaluating the potential antiparasitic activity of this fractions in promastigotes and amastigotes of Leishmania amazonensis, and its interference the release of Nitric Oxide by infected macrophages infected in vitro. The latex was collected and referred to lyophilization to obtain drying and stabilization from the products to avoid enzymatic degradation. The lyophilized material was fractionated based on their polarity, obtaining the Ethyl Acetate, Etanolic, Chotoform and Hexanic fractions. The polar fractions weres analyzed by High Performance Liquid Chromatography and the apolar fractions were analyzed by Gas Chromatography with Mass Spectrometry. The chromatographic analyzes analyzed by software and compared to the available literature demonstrated unpublished profiles of the four fractions, suggesting the presence of novel compounds. In analyzing the antileishmanicidal activity, it was observed a ability in reduces the leishmanial’s viability at 48 hours at the 250; 125; 62.5; 31.25; 15.62; and 7,81μg / mL concentrations, standing out the leishmanicidal activity of the Ethyl Acetate fraction. When evaluating the leishmanicidal activity in amastigotes, only the polar fraction Ethyl Acetate showed antileishmanial activity at 250 and 125 μg/ml concentration, suggesting that Ethanol, Chloroform and Hexane fractions are not able to permeate into the macrophages. The Ethyl Acetate fraction activity is independent of NO’s release from infected macrophages, suggesting that it is ROS release’s dependent. In conclusion, the antiparasitic activity credited to S. umbellatum latex is from compounds presents in the polar fraction Ethyl Acetate. / O uso de plantas com possível bioatividade para tratamento ou cura de enfermidades metabólicas e infecciosas é datado desde a Antiguidade de modo que a cultura do uso de produtos naturais a fim de tratar doenças e/ou sintomas perpetuou dentre gerações até os dias atuais. Embora o uso de produtos naturais tenha sido substituído pelo uso de substâncias sintéticas, a cultura popular disseminou-se e o uso de plantas em forma de garrafadas ou chás está presente na atualidade principalmente dentre a população com menor acesso aos recursos terapêuticos. Dentre as plantas utilizadas no Brasil, destaca-se o uso do látex da planta Synadenium umbellatum pelas possíveis atividades antitumoral, antiinflamatória, antimicrobiana, antiviral e antiparasitária. Atualmente, há poucos estudos sobre este espécime, e apenas as partes aéreas são utilizadas como objeto de estudo, porém o uso popular é realizado com o látex exsudado do caule da planta. Esta pesquisa analisou por métodos cromatográficos a composição do látex da planta S. umbellatum, fracionando-o em frações Acetato de Etila, Etanólica, Clorofórmica e Hexânica e avaliando a possível atividade antiparasitária das frações em promastígotas e amastígotas de Leishmania amazonensis, bem como sua interferência na liberação de NO por macrófagos infectados in vitro. O látex foi liofilizado para estabilização e secagem, evitando degradações enzimáticas e oxidação, e fracionado. A frações Acetato de Etila e Etanólica foram analisadas pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, enquanto as frações Clorofórmica e Hexânica foram analisadas por Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas. As análises cromatográficas foram analisadas por softwares e comparadas à bibliografia disponível e demonstraram perfis inéditos das quatro frações, sugerindo a presença de compostos inéditos. A análise de atividade leishmanicida em 48h revelou a capacidade de as quatro frações agirem de maneira tóxica nas concentrações de 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; e 7,81μg/mL, onde destacou-se a atividade leishmanicida da fração Acetato de Etila. Na análise de atividade leishmanicida sobre amastígotas, apenas a fração Acetato de Etila demonstrou atividade leishmanicida nas concentrações de 250 e 125μg/mL, sugerindo que as frações Etanólica, Clorofórmica e Hexânica não são capazes de adentrar aos macrófagos. A atividade da fração Acetato de Etila é independente da liberação de NO, sugerindo que seja dependente de mecanismos de liberação de ROS. Conclui-se que a atividade antiparasitária creditada ao látex da planta S.umbellatum seja de compostos inéditos presentes na fração Acetato de Etila.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-03T14:21:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Muriel Vilela Teodoro Silva - 2016.pdf: 1776615 bytes, checksum: bc5d7dd181834fb9ecdb5584e16756a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-03T14:21:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Muriel Vilela Teodoro Silva - 2016.pdf: 1776615 bytes, checksum: bc5d7dd181834fb9ecdb5584e16756a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T14:21:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Muriel Vilela Teodoro Silva - 2016.pdf: 1776615 bytes, checksum: bc5d7dd181834fb9ecdb5584e16756a9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-08-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / IL-32 is a proinflammatory cytokine which has different isoforms. IL-32γ isoform is the most powerful and was detected in lesions of patients with cutaneous leishmaniasis. Murine cells respond to IL-32, however mice lack the gene for this cytokine. To understand the role of IL- 32 in Leishmania (L.) amazonensis, we used transgenic mice for human IL-32γ (IL-32γTg). C57BL/6 mice (WT) and C57BL/6 IL-32γTg were infected with L. amazonensis promastigotes in the ear. The lesion development was followed weekly with a digital caliper (measured in mm of injury). After 3, 6 and 9 weeks, the animals were euthanized for tissue parasitism analysis by the limiting dilution technique, in infected ears, draining lymph node and spleen of mice. The draining lymph node cells were incubated (48 h) in the presence or absence of L. amazonensis antigen (Ag) for analysis of cytokines by ELISA. IL-32γTg mice present IL-32 production in spleen, liver, lymph node and ear. IL-32γTg mice have a lower injury than the WT mice during the third week of infection. From the 5th to the 9th week of infection, the two groups had similar lesion development profiles. Interestingly, in the 3rd week of infection, the parasitic load in the lesion of IL-32γTg mice was 100 times greater than that of WT mice. After three weeks, IL-32γTg mice maintained the same parasitic load up to nine weeks. In WT mice, however, the number of parasites increased exponentially during weeks evaluated. The parasite load in the spleen and lymph node was lower in IL-32γTg mice when compared with WT mice. There was no difference in histological sections of the lesions in WT and IL-32γTg mice infected with L. amazonensis. We did not observe differences between WT and IL-32γTg groups on the product -10) by lymph node cells stimulated with Ag, in the 3rd, 6th and 9th week of infection. Our data suggest that IL-32γ favors infection by L. amazonensis in the early stages, allowing the growth of the parasites. However, this cytokine seems to limit the growth and spread of parasites in the later stages of infection. In vitro analyzes show the similar percentage of infected cells and the number of parasites per infected cell in WT macrophages and IL-32γTg after 3 and 48h of infection with L. amazonensis. However, the production of NO by macrophages seems to be lower in IL- 32γTg mouse cells during infection with L. amazonensis. Understanding the mechanisms by which IL-32γ modulates Leishmania amazonensis infection in mice is essential to define the components that control cutaneous leishmaniasis caused by this specie in humans. / A IL-32 é uma citocina pró-inflamatória que apresenta diferentes isoformas. A isoforma IL- 32γ é a mais potente e foi detectada em lesões de pacientes com leishmaniose tegumentar americana. Células murinas respondem à IL-32, no entanto, camundongos não têm o gene para essa citocina. Para entender o papel da IL-32 na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, foram utilizados camundongos transgênicos para a IL-32γ humana (IL-32γTg). Camundongos C57BL/6 (WT) e C57BL/6 IL-32γTg foram infectados com formas promastigotas de L. amazonensis na orelha. O desenvolvimento da lesão foi acompanhado semanalmente com paquímetro digital (medida em mm de lesão). Após 3, 6 e 9 semanas, os animais foram eutanasiados para análise de parasitismo tecidual, pela técnica de diluição limitante, nas orelhas infectadas, no linfonodo drenante e no baço dos camundongos. As células do linfonodo drenante foram incubadas (48 h), na presença ou ausência de antígeno de L. amazonensis (Ag), para análise de citocinas pela técnica de ELISA. Camundongos IL- 32γTg apresentam produção de IL-32 no baço, fígado, linfonodo e orelha. Camundongos IL- 32γTg apresentam uma lesão menor do que a lesão dos camundongos WT, na terceira semana de infecção. Da 5ª até a 9a semana de infecção, os dois grupos apresentaram perfis semelhantes de desenvolvimento da lesão. Curiosamente, na 3ª semana de infecção, a carga parasitária na lesão do camundongo IL-32γTg era 100 vezes maior do que a dos camundongos WT. Após três semanas, os camundongos IL-32γTg mantiveram a mesma carga parasitária até nove semanas. Em camundongos WT, no entanto, o número de parasitos aumentou exponencialmente durante as semanas avaliadas. A carga parasitária do linfonodo e no baço foi menor nos camundongos IL-32γTg, quando comparado com camundongos WT. Não foi observada diferença nos perfis histológicos das lesões nos camundongos WT e IL-32γTg infectados por L. amazonensis. Não foi observada nenhuma diferença entre os grupos WT e IL-32γTg em relação à produção de citocinas (IFNγ, TNFα e IL-10), pelas células dos linfonodos estimuladas com Ag, na 3a, 6a e 9a semana de infecção. Os nossos dados sugerem que a IL-32γ favorece a infecção por L. amazonensis nas fases iniciais, permitindo o crescimento do parasito; no entanto, essa citocina parece limitar o crescimento e a disseminação dos parasitos nas fases mais tardias da infecção. As análises in vitro mostraram porcentagem de células infectadas e número de parasitas por célula infectada semelhantes nos macrófagos dos WT e IL-32γTg com 3 e 48h de infecção por L. amazonensis. Entretanto, a produção de NO por macrófagos parece ser menor nas células de camundongos IL-32γTg durante a infecção por L. amazonensis. Compreender os mecanismos pelos quais a IL-32γ modula a infecção por L. amazonensis nos camundongos é fundamental para a definição dos componentes que controlam a leishmaniose tegumentar causada por esta espécie em seres humanos.

Submitted by Izabel Monteiro (izabel_22@hotmail.com) on 2016-08-03T14:05:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Flávia Chagas.pdf: 2651636 bytes, checksum: 31f422b87baf13b0e63decdbaeb0d66e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-08-17T15:30:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Flávia Chagas.pdf: 2651636 bytes, checksum: 31f422b87baf13b0e63decdbaeb0d66e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-08-17T15:34:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Flávia Chagas.pdf: 2651636 bytes, checksum: 31f422b87baf13b0e63decdbaeb0d66e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-17T15:34:29Z (GMT). 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The mucocutaneous form manifests as lesions in the mucosa, usually ulcerative and can produce disfiguring lesions. In Brazil leishmaniasis has become endemic, with notifications of cases of leishmaniasis in all states. The first-line drug used in Brazil is the pentavalent antimoniate N- methylglucamine ( Glucantime® ) and its management is done through daily injections. As second choice drugs are sodium stibogluconate (Pentostan®), pentamidine isethionate, amphotericin B, liposomal amphotericin B, miltefosine, among others. Although efficacy of these drugs usually present, some problems may be cited as the high toxicity which induces an array of side effects which often preclude treatment continuity and resistance of some species of Leishmania. In this context it is necessary to search for new compositions which have anti- Leishmania activity and low toxicity to the patient. Based on studies on the activity of metal complexes, especially with antitumor activity, we have seen the possibility of using such complexes for the treatment of cutaneous leishmaniasis. Studies have demonstrated the potential to cover the treatment of disorders showing promising activity antimicrobial, antitumor and anti- inflammatory. This study aimed to evaluate the leishmanicidal activity six copper complexes against promastigote forms and amastigote Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania ( Viannia) guyanensis , and the complexes [Cu(thp)4]PF6 and [Cu(PCN)(HBPz3] showed higher leishmanicidal activity, respectively. / A Leishmaniose Tegumentar Americana caracteriza-se como uma doença infecto-parasitária, não contagiosa, causada por parasitos do gênero Leishmania, que possui um ciclo de vida heteroxênico, alternando entre hospedeiros invertebrados e vertebrados. A leishmaniose é uma doença negligenciada e acomete 98 países, estimando 1,3 milhões de novos casos a cada ano. Os pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana podem apresentar quadro clínico diferenciado, sendo eles: a forma cutânea e mucocutânea. A forma cutânea é a mais frequente e mais amplamente distribuída, caracterizando-se por lesões localizadas na pele, podendo apresentar um quadro de cura espontânea, dependendo da resposta imune do hospedeiro e da espécie de Leishmania. A forma mucocutânea manifesta-se como lesões na mucosa, normalmente ulcerativas, podendo produzir lesões desfigurantes. No Brasil a leishmaniose apresenta-se endêmica, apresentando notificações de casos de leishmaniose em todos os estados. O medicamento de primeira escolha utilizado no Brasil é o antimoniato pentavalente de N-metilglucamina (Glucantime®) e sua administração é feita por meio de injeções diárias. Como drogas de segunda escolha estão estibogluconato de sódio (Pentostan®), isetionato de pentamidina, anfotericina B, anfotericina B lipossomal, miltefosina, entre outras. Apesar desses fármacos normalmente apresentarem eficácia, alguns problemas podem ser citados como a alta toxicidade que induz a uma gama de efeitos colaterais que muitas vezes impossibilitam a continuidade do tratamento e a resistência de algumas espécies de Leishmania. Nesse contexto faz-se necessário a busca por novas composições que apresentem atividade anti-Leishmania e com baixa toxicidade ao paciente. Com base em estudos sobre a atividade de complexos metálicos, principalmente com atividade antitumoral, tem-se visto a possibilidade de utilizar esses complexos para o tratamento de leishmaniose cutânea. Estudos tem demonstrado o potencial do cobre para o tratamento de patologias apresentando atividade promissora com ação antimicrobiana, antitumoral e anti-inflamatória. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de seis complexos de cobre contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) guyanensis, tendo os complexos [Cu(thp)4]PF6 e [Cu(PCN)(HBPz3] apresentado maior atividade leishmanicida, respectivamente.