Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:05:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330536.pdf: 3500374 bytes, checksum: 15992ed423b9beb5fa061d0b05f86e13 (MD5) Previous issue date: 2014 / As Leishmanioses afetam cerca de 15 milhões de pessoas e constiuem um importante problema de saúde pública mundial. O controle da parasitose baseia-se principalmente na quimioterapia, usando como medicamento de primeira escolha o antimonial pentavalente SbV (Glucantime®). O surgimento de resistência aos fármacos de uso clínico, a ausência de vacinas eficazes, a propagação de vetores resistentes aos inseticidas tornam o controle das Leishmanioses difícil e complexo. Para entender melhor o papel dos macrófagos na Leishmaniose humana e estabelecer estratégias para prevenir os efeitos nocivos da Leishmania, dados sobre os padrões de expressão de genes e proteínas, em Macrófagos Derivados de Monócitos de Humanos (MDM) infectados com Leishmania sob condições de tratamento, são essenciais. Neste estudo, foram analisadas as alterações nos níveis de expressão de genes e proteínas de macrófagos humanos, durante a infecção in vitro por Leishmania braziliensis e tratamento com Glucantime usando qPCR-arrays, ensaios de Western blot, microscopia confocal e ensaios de inibição usando siRNA. Os resultados indicam que a infecção com L. braziliensis e o tratamento SbV conjuntamente, modulam a expressão de genes em macrófagos, em particular aqueles envolvidos na via de biossíntese da glutationa. Análises de correlação permitiram determinar superexpressão dos marcadores GSTP1, GCLM, GSR, GSS, TRX e ABCB5 tanto nos níveis do mRNA quanto das proteínas, em MDM de humanos infectados e tratados quando comparados ao grupo controle. O estudo da localização subcelular mostrou que o transportador ABCB5 apresenta uma localização predominantemente fagolisossomal, indicando que essa proteína poderia estar envolvida no transporte de Glucantime. Nos ensaios de inibição selectiva o silenciamento dos genes gstp1, gss e abcb5 aumentaram o efeito leishmanicida in vitro do SbV induzindo uma redução da sobrevivência intracelular de L. brazilienisis em macrófagos THP-1. Essa resposta foi igualmente confirmada para o gene gstp1 onde os resultados de tempo e concentração dependente mostraram que a redução da sobrevivência intracelular era observada 24h após exposição ao SbV e a uma dose menor. Nossos resultados sugerem que há uma ativação de genes envolvidos na defesa antioxidante em macrófagos humanos como resposta a infecção com L. braziliensis e o tratamento com Glucantime, potencializando a detoxificação do fármaco. Conclui-se que as proteínas GSTP1, GSS e ABCB5 seriam potenciais alvos candidatos para intervenção terapêutica mediante a inibição seletiva destes marcadores. <br> / Abstract: Leishmaniasis affects millions of people worldwide and represents a major public health problem. Leishmaniasis control relies primarily on chemotherapy, with the mainstay being pentavalent antimony (SbV) complexed to carbohydrates in the form of sodium stibogluconate (Pentostam®) or meglumine antimoniate (Glucantime®). Due to the emergence of drug resistance, the absence of effective vaccines and the spread of insecticide-resistant vectors, Leishmaniasis control is becoming extremely difficult and complex. To better understand the role of macrophages in human Leishmaniasis and to advance in new strategies to prevent the harmful effects of Leishmania parasites, information about the protein expression patterns in the context of Leishmania-infected human monocyte-derived macrophages (MDM) under drug treatment conditions are essential. In this study, we analyzed the changes in the expression levels of human MDM proteins during in vitro infection by Leishmania braziliensis and treatment with Glucantime using qPCR arrays, Western blot, confocal microscopy and siRNA inhibition assays. The results indicate that L. braziliensis infection/SbV treatment modulated the host gene expression, particularly in the glutathione biosynthesis pathway. Comparing results from gene transcription and protein expression analysis, allowed to determine that GSTP1, GCLM, GSR, GSS, TXN, and ABCB5 were strongly up-regulated at both mRNA and protein levels when compared to the control group. Subcellular localization studies showed mostly fagolissosomal location of the ABCB5 transportes, indicating that this protein may be involved in the transport of Glucantime. Selective inhibition assays by gene silencing siRNA assays of gstp1, gss and abcb5 showed an increased in vitro leishmanicidal effect to Sb exposure inducing a decrease in intracellular survival of L. brazilienisis in THP-1 macrophages. This response was also confirmed for gstp1 gene in which the results showed a time and dose-dependent effect in the reduction of intracellular survival where even at 24 hours of exposure to SbV and a lower dose of 8 mg/mL significant intracellular leishmanicidal effects were found. These analyses suggest that, modulations of human MDM by L. braziliensis infection and Glucantime treatment raise the activation of genes participating in antioxidant defense enhancing the drug detoxification. Therefore we concluded that GSTP1, GSS and ABCB5 proteins could be potential targets for therapeutic interventions by selective inhibition of these markers.

Tese(doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:29:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319288.pdf: 2480441 bytes, checksum: 0e6312c8dd815f386ee3ee05e8b31b8a (MD5) Previous issue date: 2013 / Embora conhecida como uma doença de alta endemicidade na região Amazônica do Brasil, a presença de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) na parte subtropical do Sul do país tem recebido pouca atenção dos órgãos oficiais de saúde pública brasileira. Este estudo foi realizado para demonstrar que a LTA é uma zoonose emergente e endêmica no estado de Santa Catarina. Além de caracterizar o perfil epidemiológico, o presente estudo incorporou métodos moleculares para a identificação das espécies de Leishmania e a tipagem das cepas de Leishmania (Viannia) braziliensis do Estado. Para este estudo transversal retrospectivo, foram avaliados os dados de todos os casos de LTA em Santa Catarina notificados ao Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), no período entre 2001 e 2009, e o perfil epidemiologico foi comparado entre as duas regiões do Estado. Os resultados mostram que a LTA é recentemente endêmica na região Nordeste do estado de Santa Catarina, com o perfil epidemiológico variado entre as distintas regiões do Estado. A LTA do Estado é predominantemente uma doença de transmissão urbana. A PCR-RFLP de kDNA identificou 98,8% das amostras como sendo L. (V.) braziliensis (248/251), e 1,2% somente como sendo L. (Leishmania) amazonensis. A análise de sequências multilocus (MLSA) de seis loci gênicos de 33 isolados de Santa Catarina e 53 isolados de onze outros estados brasileiros de L. (V.) braziliensis, agrupou as cepas em três principais complexos clonais (CC). A maioria (84,8%, 28/33) das cepas de Santa Catarina pertencem ao CC1, mostrando elevada homogeneidade genética. O mesmo foi observado na análise da estrutura populacional, que identificou três populações com a maioria das cepas de Santa Catarina pertencentes a uma população principal. A MLSA foi capaz de distinguir padrões epidemiológicos entre as cepas, demonstrando o potencial da técnica como ferramenta epidemiológica. Esses dados sugerem que a emergência da LTA causada pela L. (V.) braziliensis na população humana em Santa Catarina é um fenômeno recente que requer o desenvolvimento urgente de medidas de controle. <br> / Abstract: Although known to be highly endemic in the Amazon regions of Brazil, the presence of American tegumentary leishmaniasis (ATL) in the s subtropical southern part of the country has received little attention by public health officials. This study was conducted to demonstrate ATL is an emerging zoonosis in the state of Santa Catarina. In addition to characterizing the epidemiological profile, the present study incorporated molecular methods for the identification of Leishmania species and evaluation of the genetic variability of isolates from the state. For this retrospective cross-sectional study, data from all cases of ATL in Santa Catarina notified to the Information System for Notifiable Diseases (SINAN) during the period from 2001 to 2009 were evaluated, and the epidemiological profile was compared between the two main geographical regions of the state. Results demonstrated ATL has become endemic recently in northeastern region of the state of Santa Catarina, with the epidemiological profile varying significantly by region of the state. The LTA of the state is predominantly a disease of urban transmission. Species characterization by kDNA PCR-RFLP identified 98.8% of the samples as L. (V.) braziliensis (248/251) and only 1.2% as L. (Leishmania) amazonensis (3/251). Among the 33 Santa Catarina L. (V.) braziliensis isolates and 53 L. (V.) braziliensis isolates from eleven other states which were subjected to multilocus sequence analysis (MLSA) of six loci, the strains were found to cluster into three clonal complexes (CC). The majority (84.8%, 28/33) of the Santa Catarina strains belonged to CC1, representing high genetic homogeneity. The same was observed in the analysis of population structure, in which three populations were identified with most of the Santa Catarina strains belonging to one main population. MLSA was able to distinguish epidemiological patterns among the strains, demonstrating the potential of the technique as an epidemiological tool. Data presented here suggests the emergence of LTA caused by L. (V.) braziliensis in the human population of Santa Catarina is a recent phenomena that urgently requires the development of control methods.

Orientadora : Iara Taborda de Messias Reason / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2005 / Inclui bibliografia / Área de concentraçao: Análises clínicas / Resumo: A Leishmania (Viannia) braziliensis, é o agente causador da leishmaniose cutânea mucosa, doença endêmica em algumas regiões do Brasil, que representa um grande problema de saúde pública para o país. A ativação do complemento na superfície de promastigotas de Leishmania é um importante fator para a infectividade do parasita em hospedeiros mamíferos, permitindo o seu ataque e invasão de macrófagos via receptores do complemento. A Lectina Ligante da Manose (MBL), possui a capacidade de ativar o complemento e também atua como uma eficiente opsonina. Neste estudo investigou-se a interação de MBL purificada com a superfície de promastigotas da L. braziliensis e a deposição de MBL, C1q, C4 e C3 na superfície do parasita após interação com soro humano normal (SHN), não imune. Foi também avaliada a influência das vias clássica, alternativa e das lectinas no efeito lítico do complemento sobre os parasitas. Observou-se que tanto a MBL do soro como o complexo MBL-MASP purificado ligam-se à superfície da L. braziliensis, através de ensaios de imunofluorescência e de inibição utilizando-se anticorpo monoclonal anti-MBL humana e microscopia confocal. A ligação da MBL demonstrou ser específica para manose presente na superfície do parasita. Foi também observado que a deposição da MBL na superfície da L. braziliensis não alterou o efeito lítico do complemento sobre os parasitas. Deposição de C1q, C4 e C3 foi observada após incubação do parasita com SHN. Ácido etilenodiamino tetraacetico (EDTA), mas não ácido etileno glicol-bis ?-aminoetileter N,N,N,N-tetraacético (EGTA) inibiram a deposição de C3 na superfície do parasita, indicando o envolvimento da via alternativa neste processo. Esses resultados indicam que a MBL pode ligar-se a L. braziliensis através de carboidrato específico na superfície do parasita e fornece evidências para um mecanismo de ativação do complemento independente de anticorpo. Palavras Chave: Leishmania (Viannia) braziliensis, MBL, complemento, lectina-ligante da manose, via clássica, via alternativa. / Abstract: Leishmania (Viannia) braziliensis (L.braziliensis) is the causative agent of mucocutaneous leishmaniasis, a disease that presents high endemicity in some regions of Brazil that represents a major public health problem for the country. Activation of complement on the surface of Leishmania promastigotes appears to be an important factor for parasite infectivity in the mammalian host, allowing their attachment and invasion of macrophages via complement receptors. Mannan-binding lectin (MBL) is a well-known complement activator and an efficient opsonine. In this study, we have investigated whether serum and purified MBL bind to live promastigotes of L. braziliensis and evaluated the deposition of MBL, C1q, C4 and C3 on the parasite surface after interaction with non-immune human serum (NHS). Using immunofluorescence assays we have observed that both serum MBL and purified MBL-MASP complex bind to the surface of L. braziliensis using a mouse monoclonal anti-human MBL antibody and confocal microscopy. MBL binding to parasite surface was shown to be specific for mannose present on the surface of parasites, by inhibition assays. It was observed that the presence of MBL doesn't modify the lytic effect of complement on the parasites. Deposition of C1q, C4 and C3 was observed after parasite incubation with NHS. Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) but not ethylene glicol-bis ?-aminoethylether N, N, N, N-tetra acetic acid (EGTA) abolished C3 deposition on parasite surface, indicating the involvement of the alternative pathway in this process. Our results indicate that L. braziliensis binds MBL and that this is mediated by specific carbohydrate on the surface of parasites and provide evidences for antibody-independent mechanisms complement activation on parasite surface. Keywords: Leishmania (Viannia) braziliensis; mannose-binding lectin; complement; MBL; alternative pathway; classic pathway.

Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos da leishmaniose cutânea e visceral. A infecção é transmitida por insetos hematófagos, nos quais os parasitos se desenvolvem sob a forma promastigota. Nos hospedeiros mamíferos, incluindo a espécie humana, as formas encontradas são as amastigotas que proliferam nos macrófagos; estas células podem controlar a infecção produzindo radicais derivados do oxigênio e do nitrogênio. O óxido nítrico (NO) é um dos mais potentes radicais com atividade leishmanicida. Existem várias moléculas já descritas que liberam NO em meio aquoso ou quando adicionadas a suspensões celulares. São chamadas de doadoras de NO. Algumas destas vêm sendo estudadas pelo seu potencial terapêutico no tratamento das leishmanioses cutâneas. A molécula S-nitrosoglutationa (GSNO) pertence a um grupo de moléculas conhecido com S-nitroso-tióis e é um doador de NO relativamente estável. A GSNO havia sido previamente testada em culturas de formas promastigotas de L. amazonensis e causou a morte do parasito. O possível uso da GSNO na terapia das leishmanioses cutâneas demanda o conhecimento de suas ações sobre as formas amastigotas encontradas nos hospedeiros mamíferos. Terapias complementares aos antimoniais usados no tratamento da leishmaniose cutânea são necessárias porque estes são apenas injetáveis, têm efeitos colaterais e ocorrem altos índices de desistência do tratamento. O objetivo do trabalho foi analisar o efeito da molécula GSNO nas culturas de células THP-1 (linhagem de monócitos humanos leucêmicos) infectadas com L.major e o efeito da sua administração tópica diretamente na lesão ulcerada leishmaniótica de camundongos infectados. Os experimentos com células THP-1 infectadas com L. major e tratadas com GSNO, mostram marcada redução do parasitismo intracelular, dose dependente, em comparação às culturas sem tratamento. O tratamento com GSNO foi testado em camundongos Balb/c 8 infectados com L. major e em camundongos C57BL/6 desprovidos do gene de IFN<font face=\"symbol\">g- (Knockout de IFN ou IFN-<font face=\"symbol\">g KO) infectados com L. braziliensis. Grupos de animais foram infectados no dorso e após 60 dias iniciou-se o tratamento tópico com GSNO diluída em PBS, em GEL F127 ou com os respectivos veículos, como controles; ainda, outros grupos foram tratados sistemicamente (via endovenosa) com o antibiótico com ação leishmanicida, anfotericina B, ou com anfotericina B associada à aplicação tópica de GSNO. Foram feitas duas medições semanais das lesões. Decorridos aproximadamente 60 dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados e retirados o linfonodo drenante (inguinal superficial) e a lesão para fazer a quantificação parasitária. O tratamento tópico da infecção por L.major com a molécula GSNO reduziu o tamanho da lesão cutânea, chegando a se observar fechamento da úlcera em alguns animais; a carga parasitária no linfonodo drenante e/ou na lesão também sofreu redução. Nos camundongos IFN-<font face=\"symbol\">g KO infectados por L. braziliensis, também ocorreu inibição da progressão da lesão pelo tratamento local com GSNO em comparação ao grupo não tratado. Como conclusão, conseguimos demonstrar que GSNO apresenta efeito leishmanicida sobre formas amastigotas de L. major em cultura celular e reduz a lesão cutânea causada por L.major ou por L. braziliensis em comparação aos grupos controle. / Protozoa of the genus Leishmania are the etiological agents of cutaneous and visceral leishmaniasis. The infection is transmitted by hematophagous insects in which the parasite multiplies and differentiates as promastigotes. In the mammalian hosts, including man, the parasite proliferates as amastigotes inside macrophages; production of reactive oxygen or nitrogen intermediates (ROI and RNI) by these cells can control the infection. Nitric oxide (NO) is a very toxic RNI active against leishmania. The are many molecules that liberate NO in solution or when added to cellular suspensions. They are collectively called NO donors. A few of them have been studied because of their potential therapeutic use in cutaneous leishmaniasis. The molecule S-nitrosoglutathione (GSNO) belongs to the S-nitroso-thiols and is a relatively stable NO donor. GSNO has been previously tested and caused the death of L. amazonensis promastigotes in liquid culture. A putative application of GSNO in the treatment of cutaneous leishmaniasis requires the understanding of its activities on amastigote forms which are the parasite forms found in the mammalian host. Because the classical leishmaniasis treatment relies on injectable antimonial drugs which have many side effects, many patients abandon the treatment. Therefore, additional therapy to accelerate the cure is needed as well as new drugs are much needed. The aim of the present work is to analyze the effect of the molecule GSNO in cultures of THP-1 cells (a leukemia human monocyte cell line) infected with Leishmania major as well as the effect of administering it topically into the lesion of infected mice. The experiments done on L. major-infected THP-1 cells showed marked dose-dependent reduction of parasitism when compared to untreated infected cells. The topical treatment with GSNO was done in BALB/c mice infected with L. major and in C57BL/6 mice deprived of the IFN-<font face=\"symbol\">g gene (IFN- <font face=\"symbol\">g KO) infected with L. braziliensis. Groups of mice were infected in the shaven dorsal skin and 60 days later the topical treatment with GSNO dissolved in PBS, in GEL F127 was started. Still other groups were treated systemically (i.v.) with Amphotericin B which is leishmanicidal or with Amphotericin B associated to topically applied GSNO. The lesions were measured twice a week. After 60 days the mice were killed and the draining lymph node and the lesion were removed for quantifying the parasite numbers. The topical treatment of L. major-induced ulcer with GSNO reduced the size of the ulcer leading in some mice to complete healing; the parasitic loads in the draining lymph node or in the lesion were also reduced. In L. braziliensis-infected IFN-<font face=\"symbol\">g KO mice, inhibition of lesion growth also occurred in the mice topically treated with GSNO in comparison to the untreated control group. In conclusion we showed that GSNO is leishmanicidal to L. major intracellular amastigotes and that the topical treatment reduces the size of the lesion caused in mice by L. major or by L. braziliensis in comparison to the control groups.

Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos da leishmaniose cutânea e visceral. A infecção é transmitida por insetos hematófagos, nos quais os parasitos se desenvolvem sob a forma promastigota. Nos hospedeiros mamíferos, incluindo a espécie humana, as formas encontradas são as amastigotas que proliferam nos macrófagos; estas células podem controlar a infecção produzindo radicais derivados do oxigênio e do nitrogênio. O óxido nítrico (NO) é um dos mais potentes radicais com atividade leishmanicida. Existem várias moléculas já descritas que liberam NO em meio aquoso ou quando adicionadas a suspensões celulares. São chamadas de doadoras de NO. Algumas destas vêm sendo estudadas pelo seu potencial terapêutico no tratamento das leishmanioses cutâneas. A molécula S-nitrosoglutationa (GSNO) pertence a um grupo de moléculas conhecido com S-nitroso-tióis e é um doador de NO relativamente estável. A GSNO havia sido previamente testada em culturas de formas promastigotas de L. amazonensis e causou a morte do parasito. O possível uso da GSNO na terapia das leishmanioses cutâneas demanda o conhecimento de suas ações sobre as formas amastigotas encontradas nos hospedeiros mamíferos. Terapias complementares aos antimoniais usados no tratamento da leishmaniose cutânea são necessárias porque estes são apenas injetáveis, têm efeitos colaterais e ocorrem altos índices de desistência do tratamento. O objetivo do trabalho foi analisar o efeito da molécula GSNO nas culturas de células THP-1 (linhagem de monócitos humanos leucêmicos) infectadas com L.major e o efeito da sua administração tópica diretamente na lesão ulcerada leishmaniótica de camundongos infectados. Os experimentos com células THP-1 infectadas com L. major e tratadas com GSNO, mostram marcada redução do parasitismo intracelular, dose dependente, em comparação às culturas sem tratamento. O tratamento com GSNO foi testado em camundongos Balb/c 8 infectados com L. major e em camundongos C57BL/6 desprovidos do gene de IFN<font face=\"symbol\">g- (Knockout de IFN ou IFN-<font face=\"symbol\">g KO) infectados com L. braziliensis. Grupos de animais foram infectados no dorso e após 60 dias iniciou-se o tratamento tópico com GSNO diluída em PBS, em GEL F127 ou com os respectivos veículos, como controles; ainda, outros grupos foram tratados sistemicamente (via endovenosa) com o antibiótico com ação leishmanicida, anfotericina B, ou com anfotericina B associada à aplicação tópica de GSNO. Foram feitas duas medições semanais das lesões. Decorridos aproximadamente 60 dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados e retirados o linfonodo drenante (inguinal superficial) e a lesão para fazer a quantificação parasitária. O tratamento tópico da infecção por L.major com a molécula GSNO reduziu o tamanho da lesão cutânea, chegando a se observar fechamento da úlcera em alguns animais; a carga parasitária no linfonodo drenante e/ou na lesão também sofreu redução. Nos camundongos IFN-<font face=\"symbol\">g KO infectados por L. braziliensis, também ocorreu inibição da progressão da lesão pelo tratamento local com GSNO em comparação ao grupo não tratado. Como conclusão, conseguimos demonstrar que GSNO apresenta efeito leishmanicida sobre formas amastigotas de L. major em cultura celular e reduz a lesão cutânea causada por L.major ou por L. braziliensis em comparação aos grupos controle. / Protozoa of the genus Leishmania are the etiological agents of cutaneous and visceral leishmaniasis. The infection is transmitted by hematophagous insects in which the parasite multiplies and differentiates as promastigotes. In the mammalian hosts, including man, the parasite proliferates as amastigotes inside macrophages; production of reactive oxygen or nitrogen intermediates (ROI and RNI) by these cells can control the infection. Nitric oxide (NO) is a very toxic RNI active against leishmania. The are many molecules that liberate NO in solution or when added to cellular suspensions. They are collectively called NO donors. A few of them have been studied because of their potential therapeutic use in cutaneous leishmaniasis. The molecule S-nitrosoglutathione (GSNO) belongs to the S-nitroso-thiols and is a relatively stable NO donor. GSNO has been previously tested and caused the death of L. amazonensis promastigotes in liquid culture. A putative application of GSNO in the treatment of cutaneous leishmaniasis requires the understanding of its activities on amastigote forms which are the parasite forms found in the mammalian host. Because the classical leishmaniasis treatment relies on injectable antimonial drugs which have many side effects, many patients abandon the treatment. Therefore, additional therapy to accelerate the cure is needed as well as new drugs are much needed. The aim of the present work is to analyze the effect of the molecule GSNO in cultures of THP-1 cells (a leukemia human monocyte cell line) infected with Leishmania major as well as the effect of administering it topically into the lesion of infected mice. The experiments done on L. major-infected THP-1 cells showed marked dose-dependent reduction of parasitism when compared to untreated infected cells. The topical treatment with GSNO was done in BALB/c mice infected with L. major and in C57BL/6 mice deprived of the IFN-<font face=\"symbol\">g gene (IFN- <font face=\"symbol\">g KO) infected with L. braziliensis. Groups of mice were infected in the shaven dorsal skin and 60 days later the topical treatment with GSNO dissolved in PBS, in GEL F127 was started. Still other groups were treated systemically (i.v.) with Amphotericin B which is leishmanicidal or with Amphotericin B associated to topically applied GSNO. The lesions were measured twice a week. After 60 days the mice were killed and the draining lymph node and the lesion were removed for quantifying the parasite numbers. The topical treatment of L. major-induced ulcer with GSNO reduced the size of the ulcer leading in some mice to complete healing; the parasitic loads in the draining lymph node or in the lesion were also reduced. In L. braziliensis-infected IFN-<font face=\"symbol\">g KO mice, inhibition of lesion growth also occurred in the mice topically treated with GSNO in comparison to the untreated control group. In conclusion we showed that GSNO is leishmanicidal to L. major intracellular amastigotes and that the topical treatment reduces the size of the lesion caused in mice by L. major or by L. braziliensis in comparison to the control groups.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Newton Goulart Madeira / Resumo: Leishmania infantum (syn. L. chagasi) é o agente causador da Leishmaniose Visceral (LV) no Novo Mundo, com áreas endêmicas que se estendem do Sul dos EUA ao norte da Argentina. As leishmanioses assumem grande importância em saúde pública por sua natureza zoonótica e, atualmente, vêm apresentando crescente disseminação nas diferentes regiões do Brasil, em especial no Estado de São Paulo. No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar (LT) tem sido assinalada em praticamente todos os Estados e vem crescendo progressivamente nos últimos 20 anos, ocorrendo surtos em todas as regiões do país. Apesar dos registros de ocorrências de infecções esporádicas de leishmaniose felina (LF), são necessários mais estudos para se considerar os felinos como reservatórios importantes nas leishmanioses. Estes animais quase não apresentam sinais clínicos, mesmo estando infectados, constituindo-se em importantes fontes de infecção para outros animais domésticos, o homem ou vice-versa. Coletaram-se amostras de sangue de 50 gatos procedentes do Bosque Municipal de Marília, área de grande concentração de transeuntes e já detectado flebotomíneos no local. Armadilhas do tipo CDC luminosas foram instaladas em dez diferentes pontos do bosque, nos meses de julho a dezembro/2012, tendo-se capturado um total de quatro espécies de Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) sendo dois machos e duas fêmeas e quatro espécies fêmeas do gênero Brumptomyia spp. A análise parasitológica do conteúdo intestinal das duas fêmeas da espécie Lu. longipalpis foi negativa. Realizou-se a prova de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum, tendo-se quatro (8%) animais reagentes. Todos os animais foram não reagentes à prova de RIFI para Leishmania(Viannia) braziliensis. Em relação ao teste de ELISA indireto para Leishmania infantum, 42% dos animais (21/50) foram reagentes. Para L. braziliensis, 18% dos animais (9/50) foram reagentes ... / Abstract: Leishmania infantum (syn. L. chagasi) is the causative agent of visceral leishmaniasis (VL) in the New World, with endemic areas that spreads from the south of United States until the north of Argentina. Leishmaniasis represents a great importance in public health due to the zoonotic nature, and currently have been presented a great dissemination in different regions of Brazil, specially in Sao Paulo State. In Brazil, cutaneous leishmaniasis has been occurred in almost all States, and have been growing up progressively in the last twenty years, occurring outbreaks in all regions of the country. Even though the sporadic reports of feline leishmaniasis, more studies are necessary to consider cats as the great importance as reservoirs in the feline leishmaniasis. These animals almost do not represent any clinical symptoms, even infected, representing important source of infection to another domestic animals, humans and vice-versa. Blood samples were collected from fifty cats habiting the Municipal Grove from Marília-SP, an area with high number of visitors and already detected sandflies. Traps CDC were installed in ten different points of the Municipal Grove from Marília-SP, since July to December/2012. Four specimens of Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) were captured (two males and two females) and four females specimens of the Brumptomyia genre. The parasitological analysis of gut contents of two females of Lu. longipalpis was negative. The Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) for Leishmania infantum was performed, resulting in four (8%) reagent animals. All cats were non-reagent to Leishmania braziliensis by IFAT. Regarding to Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test for Leishmania infantum, 42% of the animals (21/50) were reagent. For L. braziliensis, 18% of the animals (9/50) were reagent to ELISA test. The Polimerase Chain Reaction (PCR) for Leishmania infantum and for Leishmania braziliensis from ... / Mestre

Orientador: Mara Cristina Pinto / Coorientador: Danilo Ciccone Miguel / Banca: Anderson de Sá Nunes / Banca: André Gonzaga dos Santos / Resumo: As leishmanioses são zoonoses causadas por protozoários flagelados do gênero Leishmania, transmitidos por insetos hematófagos denominados flebotomíneos. Dentre as espécies de flebotomíneos, Nyssomyia neivai está entre os principais transmissores do agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no estado de São Paulo, sendo incriminado como vetor da LTA também em outras áreas da América do Sul. Para localização dos hospedeiros e realização do repasto sanguíneo, os insetos hematófagos utilizam compostos voláteis emanados pelos mesmos, denominados cairomônios. Embora existam evidências de que a Leishmania possa influenciar a quantidade de sangue ingerida e a frequência de alimentação sanguínea dos flebotomíneos, aumentando a taxa de transmissão, não se sabe ao certo como o parasita pode afetar o comportamento dos insetos frente a hospedeiros infectados. O objetivo deste estudo foi investigar se camundongos BALB/c não infectados e infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis apresentam diferença na atratividade para Ny. neivai, e nos voláteis emitidos; além disso, buscou-se avaliar o volume de sangue ingerido por Ny. neivai nos camundongos infectados e não infectados. Para avaliação de uma possível diferença de atratividade dos flebotomíneos frente a hospedeiros infectados ou não, foram realizados três modelos de teste: (a) preferência alimentar dos flebotomíneos quando colocados dois camundongos na mesma gaiola e com auxílio do corante azul de Evans como marca... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniasis are zoonosis caused by flagellated protozoa of Leishmania genus, transmitted by hematophagous insects called sand flies. Among sand flies species, Nyssomyia neivai is one of the main vectors or etiological agent of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) in the state of São Paulo, being incriminated as vector of ACL also in other areas of South America. For location of hosts and blood meal, hematophagous insects use volatiles compounds released by the hosts, called kairomones. Although there are evidences that Leishmania may influence the quantity of blood ingested and the frequency of blood meal of the sand flies, increasing transmission rate, it is not known how the parasite can affect the behaviour of these insects against infected hosts. The aim of this study was to investigate if uninfected and Leishmania (Viannia) braziliensis infected BALB/C mice presents any difference of attractiveness to Ny. neivai, and in the released volatiles; besides that, was evaluated the blood volume ingested by Ny. neivai on infected and uninfected mice. To evaluate the attractiveness of sand flies to infected and not infected hosts, three types of trials were performed: (a) food preference of sand flies when placed two anesthetized mice in the same cage and Evans blue dye as a marker to help identification of the blood meal source of each sand fly; (b) mice as odour source in wind tunnel and (c) in Y-tube olfactometer. For the trials in the cages, feed females were individualized in micro tubes, macerated and homogenized for absorbance reading at 540 and 620 nm. Such reading allowed estimate the blood volume ingested for each feed female, from standard curves of absorbance versus blood volume previously obtained after... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330550.pdf: 3803484 bytes, checksum: e196fb8cfcc644e6109788e03268875f (MD5) Previous issue date: 2014 / Leishmania (Viannia) braziliensis, Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi são parasitos hemoflagelados pertencentes à Ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, capazes de infectar insetos, animais silvestres e domésticos, assim como o homem. Durante seu ciclo de vida, estes parasitos são expostos a uma grande quantidade de espécies reativas do oxigênio (ERO) e do nitrogênio (ERN), o que promove sua eliminação dentro dos hospedeiros. Por sua vez, os parasitos adotam diferentes mecanismos de defesa para lidar com essas condições de estresse, dentre dos quais, encontram-se um elaborado sistema antioxidante composto de moléculas e enzimas responsáveis pela eliminação das ERO e/ou das ERN. Nesse sentido, em tripanosomátidos a tripanotiona T[SH]2 é a molécula que eficientemente regula a homeostase redox, sendo chave no mecanismo de defesa antioxidante. A síntese da T[SH]2 depende da disponibilidade de seus precursores como a cisteína, um aminoácido sulfurado implicado em diversos processos celulares como a estabilidade, a estrutura e a regulação da atividade catalítica de várias proteínas. Duas vias diferentes para a biossíntese de cisteína têm sido descritas, a via de síntese de novo, catalisada principalmente pela Cisteína Sintase (CS), e a via de transulfuração reversa (RTS), catalisada pela Cistationina ß-Sintase (CßS). Uma vez que o metabolismo da cisteína é crucial para a biossíntese da tripanotiona, a presente proposta visou determinar a função que as proteinas CS e CßS desempenham na resposta antioxidante destes parasitos. Assim sendo, realizamos a caracterização molecular e bioquímica dos genes da CS e CßS em parasitos sob condições de estresse oxidativo e nitrosativo in vitro. Os resultados demonstram claras diferenças na biossíntese de cisteína entre estes parasitos. Enquanto L. braziliensis e T. cruzi possuem as rotas de novo e RTS ativas, o T. rangeli possui somente a via RTS funcional. A avaliação da expressão das proteínas CS e CßS nas diferentes formas evolutivas destes parasitos revelou uma expressão estágio-dependente das duas proteínas em L. braziliensis e em T. cruzi, sendo a CS mais expressa nas formas amastigotas e a CßS nas formas promastigotas e epimastigotas, respectivamente. Por sua vez, em T. rangeli a CS não foi detectada e nenhum tipo de modulação foi encontrado para CßS entre as formas epimastigota e tripomastigota. Os ensaios de dose-resposta ao estresse por H2O2 e SNAP in vitro revelaram diferenças nos perfis de sensibilidade dos parasitos. O T. rangeli mostrou-se como o parasito mais sensível ao H2O2, porém o mais resistente ao SNAP, enquanto L. braziliensis apresentou a maior resistência ao H2O2 e a maior sensibilidade ao SNAP. Para Leishmania houve uma associação entre o aumento da expressão e da atividade da CS e da CßS com o aumento da concentração de tióis totais em resposta à indução de estresse oxidativo e nitrosativo in vitro. Os resultados das análises funcionais mostraram que o aumento na expressão de CS e de CßS induz resistência dos parasitos mutantes ao estresse oxidativo em relação às cepas selvagens. Neste estudo demonstrou-se que alterações nos níveis de expressão e de atividade das proteínas CS e CßS em L. braziliensis e T. rangeli estão relacionadas com a sobrevivência destes parasitos sob condições de estresse oxidativo.<br> / Abstract: Leishmania (Viannia) braziliensis, Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, are hemoflagellates parasites belonging to the order Kinetoplastida, family Trypanosomatidae, can infect insects, and animals as well as humans. During their complex life cycle, they are exposed to a large amount of reactive oxygen species or reactive nitrogen species (ROS and RNS) generated by the host allowing their elimination. In turn, parasites adopt various defense mechanisms to cope with oxidative or nitrosative stress, they have developed an elaborate antioxidant system composed of molecules and enzymes to scavenge these ROS and RNS. In this sense, trypanothione T[SH]2 is which efficiently regulate the redox homeostasis on these parasites. The synthesis of trypanothione depends on the availability of cysteine, a sulfur-containing amino acid implicated in several processes, including the stability, structure, regulation of catalytic activity of various proteins. Two different routes for cysteine biosynthesis have been described: de novo or assimilatory where CS is regulated key enzyme and reverse-transsulfuration (RTS) pathways with a CßS as regulated key enzyme. Because the cysteine metabolism is considered crucial in maintaining the reducing environment for trypanosomatids due to its importance as a precursor for the biosynthesis of trypanothione, this proposal aimed to determine the role of the CS and CßS in the antioxidant response of these parasites by molecular and biochemical characterization of the genes encoding these proteins in the parasite under oxidative and nitrosative stress in vitro. Our results clearly demonstrated differences between these parasites in the cysteine biosynthesis. L. braziliensis and T. cruzi have active the two pathways (de novo and RTS), whereas T. rangeli only has the RTS pathway. The expression and activities analyses of CS and CßS in the different developmental forms of the parasites revealed that in L. braziliensis and T. cruzi there are a stage-specific association, where CS is more active and mostly expressed in amastigotes and CßS is associated with promastigotes and epimastigotes forms, respectively. Unlike in T. rangeli CS was not detected and no stage-specific association was found for CßS. The dose response assay to H2O2 and SNAP shown differences in susceptibility profiles for these parasites. T. rangeli was more susceptible to H2O2, but more resistant to SNAP, while L. braziliensis was more resistant to H2O2, but more sensitive to SNAP. Additionally, in Leishmania there was a clear association between the increased levels of protein expression and activity of LbrCS and LbrCßS with the elevated levels of total thiols concentration in response to oxidative and nitrosative stress in vitro. In the functional analyses, we found an enhanced ability of parasites overexpressing CS and CßS to resist oxidative stress when compared to the control parasites. In this study we clearly demonstrated that changes in the expression protein and activity levels of CS and CßS may be related to survival to oxidative stress conditions in L. braziliensis and T. rangeli.