Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-10T18:42:14Z No. of bitstreams: 1 Tese - Luanda de Paula Figueira.pdf: 3791426 bytes, checksum: 6f2542b45b7f04f417269be63181b507 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T19:16:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Luanda de Paula Figueira.pdf: 3791426 bytes, checksum: 6f2542b45b7f04f417269be63181b507 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T19:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Luanda de Paula Figueira.pdf: 3791426 bytes, checksum: 6f2542b45b7f04f417269be63181b507 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-10T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Luanda de Paula Figueira.pdf: 3791426 bytes, checksum: 6f2542b45b7f04f417269be63181b507 (MD5) Previous issue date: 2013-08-22 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The American Cutaneous Leishmaniasis is a group of diseases with clinical, immunological and pathological distinct, whose expression depends on factors related to the host and the parasite, including the nature of the infecting Leishmania species and host genetic factors. The state of Amazonas is an endemic region for cutaneous leishmaniasis (CL). In this study, we analyzed the clinical and epidemiological aspects of 90 patients with CL in Rio Preto da Eva, third in number of cases in the state, which were identified three species circulating by isoenzyme electrophoresis: Leishmania (Viannia) guyanensis (89 %), L. (V.) naiffi (3.33%) and L. (Leishmania) amazonensis (7.77%). 12 new cases were also described as L. (V.) naiffi, especially the cases occurred in experimental stations of the National Institute for Amazon Research. By combining the technique of two-dimensional electrophoresis with ESI-QTof mass spectrometry, we analyzed the differentially expressed proteins in plasma of patients infected by L. (V.) guyanensis before and after treatment with pentavalent antimony, volunteer donors not infected by this pathogen that is prevalent in the region. It was found that patients infected by this species showed higher expression in the disease of acute phase proteins of infection, such as Factor B and H of the alternative Complement pathway, Haptoglobin protein related (HPR), Fibrinogen alpha chain and a lower expression of Serotrasferrina. These proteins are involved in the inflammatory process of the disease, being necessary to the body's homeostasis. The involvement of these proteins in infection by L. (V.) guyanensis needs to be further investigated. / A Leishmaniose Tegumentar Americana representa um conjunto de doenças com características clínicas, imunológicas e patológicas distintas, cuja expressão depende de fatores relacionados ao hospedeiro e ao parasito, incluindo a natureza da espécie de Leishmania infectante e fatores genéticos do hospedeiro. O estado do Amazonas é uma região endêmica para a Leishmaniose cutânea (LC). Neste estudo, foram analisados os aspectos clínicos e epidemiológicos de 90 pacientes com LC no município de Rio Preto da Eva, terceiro em número de casos no estado, onde foram identificadas por eletroforese de isoenzimas três espécies circulantes: Leishmania (Viannia) guyanensis (89%), L. (V.) naiffi (3,33%) e L. (Leishmania) amazonensis (7,77%). Também foram descritos 12 novos casos de L. (V.) naiffi, com destaque para os casos ocorridos em Estações Experimentais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Através da combinação da técnica de eletroforese bidimensional com espectrometria de massas ESI-QTof, foram analisadas as proteínas expressas diferencialmente em plasmas de pacientes infectados por L. (V.) guyanensis antes e pós tratamento com antimonial pentavalente e de doadores voluntários não infectados por esta espécie de patógeno, que é predominante na região. Verificou-se que pacientes infectados por esta espécie, apresentaram durante a doença maior expressão de proteínas da fase aguda de infecção, tais como fator B e H da via alternativa do Complemento, Proteína relacionada à Haptoglobina (HPR), Cadeia alfa do Fibrinogênio e uma menor expressão de Serotrasferrina. Essas proteínas estão envolvidas no processo inflamatório da doença, sendo necessárias para a homeostase do organismo. O envolvimento destas proteínas na infecção por L. (V.) guyanensis necessita ser mais bem investigado.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thais tibery.pdf: 4504254 bytes, checksum: a80d65e77dee7ec1a7763c37d5698623 (MD5) Previous issue date: 2013-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The installation process of leishmaniasis in the host is determined by a complex association between factors related to virulence of the parasite and the host immune response. Factors such as parasite species, its virulence and tropism, besides the genetic condition and host immune trigger different clinical forms in American cutaneous leishmaniasis (ACL). As a result, it is of paramount importance to understand the mechanisms of the immune response against the parasite, cell types, cytokines and response profile involved in this process, since these factors may confer some resistance to the parasite and/or prevent the development reinfection. 33 patients with ACL caused by Leishmania (Viannia) guyanensis, L. (V.) naiffi and L. (Leishmania) amazonensis. The predominant species found was L. (V.) guyanensis representing 73% of cases. The comparative analysis of the cellular and cytokine profile evaluated by the techniques of flow cytometry and ELISA in infected patients was significantly higher than in individuals without infection (control). Apparently, the infection caused by L. (V.) guyanensis induces a higher concentration of pro-inflammatory cytokines (IL-2 and INF-γ) than infection caused by L. (L.) amazonensis, what was not observed in infection by L. (V.) naiffi. There was variation in the concentration of cytokines and cell percentage in samples from infected patients before initiating treatment with pentavalent antimony compared to the control group and after treatment. The percentage of CD4+ T cells prior to treatment was greater than CD8+ T cells. Lower percentage of regulatory T cells was observed before treatment. These results indicate that there is influence of immune response modulation on Leishmania infection and infections caused by L. (V.) guyanensis have exacerbated the response to infection caused by the other species studied here. / O processo de instalação da leishmaniose no hospedeiro é determinado por uma complexa associação entre fatores relacionados à virulência do parasito e a resposta imune do hospedeiro. Fatores como a espécie parasitária, sua virulência e tropismo, além da condição genética e imunológica do hospedeiro desencadeiam diferentes formas clínicas na Leishmaniose tegumentar Americana (LTA). Em decorrência disso, é de suma importância compreender os mecanismos da resposta imune contra o protozoário, os tipos celulares, as citocinas e o perfil da resposta envolvida nesse processo, uma vez que, esses fatores podem conferir certa resistência ao parasito e/ou impedir o desenvolvimento de nova infecção. Foram avaliados 33 pacientes com LTA, causada por Leishmania (Viannia) guyanensis, L. (V.) naiffi e L. (Leishmania) amazonensis. A espécie predominante encontrada foi L. (V.) guyanensis representando 73% dos casos. A análise comparativa do perfil celular e das citocinas avaliadas pelas técnicas da Citometria de fluxo e ELISA nos pacientes infectados foi significativamente maior do que nos indivíduos sem infecção (controle). Aparentemente, a infecção causada por L. (V.) guyanensis, induz maior concentração de citocinas pró-inflamatórias (IL-2 e INF-γ) do que infecção causada por L. (L.) amazonensis, o mesmo não foi observado na infecção por L. (V.) naiffi. Verificou-se variação na concentração das citocinas e no percentual celular nas amostras dos pacientes infectados antes do início do tratamento com antimonial pentavalente quando comparado ao grupo controle e ao término do tratamento. O percentual de linfócitos T CD4+ antes do tratamento foi maior do que linfócitos T CD8+. Menor porcentagem de células T regulatórias foi observada antes do tratamento. Esses resultados indicam que existe influência da resposte imune na modulação da infecção por Leishmania e que infecções causadas por L. (V.) guyanensis apresentam resposta mais exacerbada do que a infecção causada pelas outras espécies aqui estudadas.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-05-02T18:25:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-03T11:56:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T11:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Carolina Vieira da Costa - 2017.pdf: 14344522 bytes, checksum: b31bb0d6ea37eec29c70d7d93855498f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is caused by protozoa of the genus Leishmania. The parasite is hosted by macrophages in cutaneous or mucosal lesions. Monocytes are precursors of macrophages, but there is little information about monocyte activation during ATL. The present study aimed to evaluate cytokine profile of monocytes from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL) in whole blood cultures stimulated with toll-like receptor (TLRs) and NOD2 receptor agonists. Peripheral blood from patients with active lesions and no treatment, and from healthy blood donors paired by sex and age, was diluted into culture medium and incubated with lipopolysaccharide (LPS), TLR4 agonist; lipopeptide Pam3Cys (Pam), TLR2 agonist; muramyldipeptide (MDP), NOD2 agonist or Leishmania (V.) braziliensis antigen (Ag). After incubation, supernatants were collected to measure IL-6 and TNF (6 h) and IL-10 (24 h) by ELISA. There was production of IL-6, TNF and IL-10 in cultures from patients and controls after stimulation with all agonists and Ag (p < 0.05, medium vs stimulus, n = 29). No differences were detected between concentrations of TNF and IL-10, but IL-6 was higher produced in non-stimulated cultures from patients than controls (p < 0.05, n = 29) or when the stimulus was MDP (p < 0.05, n = 19). The combination Pam/MDP increased the production of IL-6, TNF and IL-10 in cultures from patients and controls when compared with each stimulus isolated (p < 0.05, n = 13 - 14); similarly, Ag and MDP together induced higher concentrations of IL-6, TNF and IL-10 (IL-6 and IL-10, especially in cultures from patients) in comparison with each stimulus (p < 0.05, n = 11 - 14). There was no correlation between the number, size or time of lesions and levels of IL-6, TNF or IL-10. Patients with more than one cycle of treatment to obtain clinical cure showed higher levels of MDP-induced IL-6 than those cured with one cycle of treatment (p < 0.05, n = 17 cured with one cycle vs 8 cured with more than one cycle). Data suggest that LCL patient monocytes can be activated via TLR2, TLR4 or NOD2 to produce pro-inflammatory (IL-6, TNF) and anti-inflammatory (IL-10) cytokines and IL-6 can be associated with tissue lesion and delay of lesion healing indicating an immunopathogenic role in LCL. / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários do gênero Leishmania, que acomete a pele e/ou mucosas. Os monócitos são precursores de macrófagos, células hospedeiras do parasito, e pouco se sabe sobre seu nível de ativação durante a LTA. O presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil de resposta de citocinas produzidas por monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) em hemoculturas, após ativação com agonistas de receptores similares a toll (TLRs) e de receptor NOD2. O sangue periférico de pacientes com LCL, com lesões ativas e sem tratamento, e de indivíduos controles, pareados por sexo e idade, foi diluído em meio de cultura e incubado com lipopolissacarídeo (LPS), agonista de TLR4; lipopeptídeo Pam3Cys (Pam), agonista de TLR2; muramildipeptídeo (MDP), agonista de NOD2 ou antígenos de Leishmania (V.) braziliensis (Ag). Após incubação, os sobrenadantes foram colhidos para dosagem de IL6 e TNF (6 h) e IL-10 (24 h), por ELISA. Nas hemoculturas dos pacientes e dos controles, houve produção de IL-6, TNF e IL-10, após incubação com todos os estímulos (p < 0,05, Meio vs estímulos, n = 29). Ao comparar pacientes e controles, não houve diferença quanto à produção de TNF e IL-10, mas a produção de IL-6 foi maior nas hemoculturas não estimuladas dos pacientes (p < 0,05, n = 29) e na presença do MDP (p < 0,05, n = 19). A combinação Pam/MDP aumentou a produção de IL-6, TNF e IL-10 nas hemoculturas dos pacientes e controles, em relação a cada estímulo sozinho (p < 0,05, n = 13 - 14); de maneira similar, Ag e MDP juntos aumentaram a concentração de IL-6, TNF e IL-10 (IL-6 e IL-10, especialmente nas hemoculturas dos pacientes) (p < 0,05, n = 11 - 14). Não houve correlação significante entre o número, o tamanho e o tempo das lesões dos pacientes com LCL e as concentrações de IL-6, TNF e IL-10 nas hemoculturas dos mesmos. Quando comparados os pacientes clinicamente curados após um ciclo de medicamento e aqueles clinicamente curados após mais de um ciclo de medicamento em relação às concentrações de TNF e IL-10 não foram detectadas diferenças significantes entre os grupos, porém, em relação à produção de IL-6, foi observado que esta foi mais elevada nos pacientes curados com mais de um ciclo de medicamento, após o estímulo MDP (p < 0,05, n = 17 curados com 1 ciclo vs 8 xv curados com mais de 1 ciclo). Os dados sugerem que os monócitos de pacientes com LCL podem ser ativados via TLR2, TLR4 e NOD2, induzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF) e anti-inflamatória (IL-10) e a IL-6 pode estar associada ao dano tecidual e a demora na cura dos pacientes, possuindo um papel imunopatogênico na LCL humana.

Hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi são considerados um dos melhores modelos para estudo de fatores relacionados à imunossupressão que ocorre durante a leishmaniose visceral ativa, pois apresenta manifestações clínicas similares ao que ocorre no homem e não conseguem controlar a infecção. Neste estudo, hamsteres infectados intraperitonealmente com 2x107 parasitos foram utilizados para avaliação de possíveis fatores envolvidos na dinâmica da imunossupressão. Os parâmetros avaliados foram a produção de citocinas de padrão Th1 e Th2, produção de óxido nítrico por células esplênicas e detecção de apoptose em linfócitos esplênicos em tempos precoces (6, 20, 48 e 72 horas), intermediários (7 e 15 dias) e tardios (30 e 60 dias) de infecção. Inicialmente avaliamos a carga parasitária no baço e observamos aumento progressivo dependente do tempo de infecção, ratificando que hamster infectado é um bom modelo para desenvolvimento de doença. A resposta celular frente a mitógeno e antígeno de Leishmania foi o parâmetro utilizado para avaliação de imunossupressão. Observamos resposta preservada à concanavalina A em todos os tempos de infecção e resposta preservada ao antígeno de Leishmania nos tempos precoces, porém com ausência de resposta antígeno específica a partir do tempo de 7 dias de infecção. A quantificação de óxido nítrico foi determinada em sobrenadante de células esplênicas de cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania, pelo método de Griess. Observamos inicialmente baixo nível de produção de óxido nítrico em todos os tempos de infecção, no entanto quando as células foram estimuladas com antígeno de Leishmania observamos níveis ainda menores nos tempos de 48 e 72 horas de infecção. O perfil de citocinas produzido foi determinado pela reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa, sendo detectado RNA mensageiro tanto de citocinas Th1, quanto Th2 em todos os tempos de infecção (precoce, intermediária e tardia), em células ex-vivo e estimuladas; e também em animais controles não infectados; não havendo um padrão de dicotomização de produção de citocinas neste modelo experimental. Detecção de apoptose em células esplênicas não aderentes (prováveis linfócitos T) ex-vivo e em cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania foi avaliada pelos seguintes métodos: Anexina V, caspase 3 clivada e TUNEL por citometria de fluxo. Houve marcação da exposição de fosfatidil serina pelo método da anexina V, nos tempos de 6 horas de infecção, quando as células foram estimuladas com mitogeno ou antígeno de Leishmania; e com 48 horas e 60 dias de infecção somente quando estimuladas com antígeno de Leishmania. Em células esplênicas em cultura estimuladas com concanavalina não houve marcação de caspase 3 clivada, porém em células esplênicas ex-vivo nos tempos 20, 48 e 72 horas de infecção houve detecção de apoptose, definida por marcação de caspase 3 clivada. A marcação de células esplênicas não aderentes para quebra de DNA foi baixa em todos os tempos analisados, porém observamos aumento de marcação em células esplênicas não aderentes, estimuladas com antígeno nos tempos de 20 horas e posteriormente de 7 dias até 60 dias de infecção. Nossos resultados sugerem que a imunossupressão na leishmaniose visceral no modelo de hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi é antígeno dependente e instala-se nos tempos intermediários de infecção, a partir de 7 dias. Esta imunossupressão parece estar relacionada com aumento de apoptose em linfócitos já nos tempos precoces de infecção, que pode favorecer a progressão da infecção, por ocorrer principalmente em células esplênicas antígenos reativas. Nossos dados sugerem ainda, que a imunossupressão não é decorrente da dicotomização da produção de citocinas Th1 e Th2 / Hamsters infected by Leishmania (L.) chagasi are considered one of the most remarkable models to study several characteristics related to immunosuppression, raised during active visceral leishmaniasis especially because hamsters show similar clinical manifestations as it is found in humans without surmounting the infection. In this study, hamsters infected intraperitoneally with 2x107 parasites were used to evaluate the possible factors involved in the dynamic of immunosuppression that occurs during the disease development. The evaluated parameters were the production of Th1 and Th2 cytokines profile, nitric oxide production of splenic cells and detection of apoptosis in splenic lymphocytes at early (6,20, 48 e 72 hours), intermediate (7 e 15 days) and late times (30 e 60 days) of infection. Initially, we evaluate the parasite load in the spleen and observed a progressive increase dependent on the time of infection, ratifying that infected hamsters are good models to set up the disease development. Cellular response upon mitogen or Leishmania antigen was the parameter used to evaluate the immunosuppression showing a preserved response to concanavalin A at all period of infection and a preserved response to the Leishmania antigen at all early phases however with no specific antigen response from 7 day of infection until the late phase of infection. Nitric oxide quantification was determined in the splenic cells supernatant in culture stimulated upon concanavalin A and Leishmania antigen and we observed initially low level of nitric oxide production, measured by the Griess method. Nonetheless, when the cells were stimulated upon Leishmania antigen we observed a lower level nitric oxide production at 48 and 72 hours of infection. mRNA of Th1 e Th2 cytokines profile was determined by RT-PCR at all period of infection studied in infected or non infected hamsters showing no difference at the cytokine profile in this experimental model. Detection of apoptosis in the non adherent splenic cells (probably T lymphocytes) ex-vivo and in the stimulated culture with concanavalin A and Leishmania antigen was evaluated by the following methods: annexin V-FITC, cleaved caspase 3 and TUNEL by flow cytometry analysis. There was phosphatidilserine staining by annexin method, at 6 hour of infection when cells were stimulated by mitogen or Leishmania antigen at 48 hours and 60 days of infection only when stimulated by Leishmania antigen. Splenic cells in culture stimulated by concanavalin A showed no cleaved caspase 3 staining in all period of infection studied. Otherwise, apoptosis was detected in the ex-vivo splenic cells at 20, 48 and 72 hours of infection by cleaved caspase 3 staining. We observed a low DNA break staining of non adherent splenic cells in all period analyzed, although this staining was increased in non adherent cells stimulated upon Leishmania antigen at 20 hours from 7 day of infection until 60 day of infection. Our results suggest that a visceral leishmaniasis immunosuppression in the hamsters model infected by Leishmania (L.) chagasi is antigen dependent and sets up in the intermediate phases of infection from 7 days on. This immunosuppression seems to be related to the apoptosis increase in lymphocytes already in the early period of infection probably favoring its progression especially because of its occurrence in reactive splenic antigen. Our data also suggest that the immunosuppression is not provided by dichotomization in the Th1 and Th2 cytokines profile

A Leishmaniose é uma infecção causada pelo protozoário do gênero Leishmania e transmitida pela picada de insetos. Os tratamentos atuais são caros e demorados, envolvendo compostos baseados em Sb(V), anfotericina B lipídica e miltefosina. Estudos recentes sugerem que a enzima tripanotiona redutase (TR) poderia ser um alvo específico no desenvolvimento de novos fármacos, pois ela é essencial e exclusiva dos tripanossomatídeos. Desta forma, este trabalho apresenta a síntese de novos compostos derivados da iminodibenzila com estrutura similar à clomipramina, um conhecido inibidor da TR. Tais compostos são conjugados de iminodibenzila com etilenodiamina, etanolamina e dietilenotriamina através de epicloridrina (dado-en, dado-ea e dado-dien , respectivamente). Foram obtidos com rendimentos superiores a 94% e caracterizados através de LC_MS e espectroscopia no infravermelho. Também se fez a avaliação da afinidade relativa dos novos ligantes por cobre através do teste de recuperação da fluorescência da calceína, concluindo-se que o ligante dado-dien possui uma afinidade maior com Cu (II) quando comparado com os outros ligantes sintetizados. Foram formados complexos metálicos através da adição de sulfato de cobre (II), acompanhando-se através de espectroscopia ultravioleta-visível para se obter uma estimativa da relação metal: ligante, concluindo-se que os complexos formados eram [Cu(dado-ea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ e [Cu(dado-dien)2]2+. A lipofolicidade foi estimada através de simulação computacional, constatando-se que os complexos formados são todos muito lipofílicos, sendo que o logP descreve na seguinte: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Ensaios de atividade pró-oxidante através da oxidação da sonda fluorimétrica DHR revelaram que o complexo [Cu(dado-ea)]2+ apresentou a maior taxa de atividade pró-oxidante, sendo independente da concentração de peróxido de hidrogênio no meio reacional e alcançando seu limiar quando presente em concentração aproximada de 10 µM. Por fim, os compostos sintetizados foram testados quando à suas citotoxidades frente a promastigotas L. amazonenses e com macrófagos RAW 264,7. Quando o protozoário foi exposto a concentrações variadas dos compostos deste estudo, observou-se que os ligantes ea, en e dien tiveram os menores valores de IC50 (todos < 3µM), porém eles são muito tóxicos para serem utilizados como fármacos, Dentre os ligantes sintetizados, somente o dado-en apresentou um resultado numa faixa viável (IC50 19,9 ± 2,2 µM). Contra macrófagos RAW 264,7, dado-en apresentou IC50 > 50µM, ou seja, ele é mais tóxico para o protozoário do que para os macrófagos. A complexação com cobre não representou um aumento interessante na citotoxicidade dos compostos. O conjunto de resultados apresentados neste indica um potencial uso do composto dado-en no combate à leishmaniose. / Leishmaniasis is an infection caused by protozoa of the genus Leishmania. and transmitted by insects. Current treatments are expensive and time-consuming, involving Sb(V)-based compounds, lipossomal amphotericin B and miltefosine. Recent studies suggest that inhibition of trypanothione reductase (TR) could be a specific target in the development of new drugs, because it is essential and exclusive to trypanosomes. Thus, this work presents the synthesis of new compounds derived from iminodibenzyl with structures related to clomipramine, a known inhibitor of TR. These compounds were conjugates of iminodibenzyl with ethylenediamine, ethanolamine and diethylenetriamine, linked by epichlorohydrin. They were obtained with yields higher than 94% and their structures were confirmed by LC-MS and infrared spectroscopy. The relative affinity for copper of the new chelators was assessed by the recovery of calcein fluorescence, which showed that dado-dien has the highest affinity for Cu(II) among the new ligands. Metal complexes were synthesized by addition of copper(II) sulphate and studied by ultraviolet-visible spectroscopy, showing that the stoichiometries were [Cu(dadoea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ and [Cu(dado-dien)2]2+. Lipophilicity was assessed by computational methods, indicating that the complexes were all very lipophilic, with logP decreasing in the following order: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Pro-oxidant activity assays by oxidation of DHR fluorimetric probe showed that [Cu(dado-ea)]2+ has the highest rate of oxidation, independent of hydrogen peroxide concentration, reaching its highest value when at ~ 10 &#181;M. Finally, the compounds were tested for citotoxicity to L. amazonensis promastigotes and RAW 264,7 macrophages. When the protozoa was exposed to varying concentrations of the compounds, it was observed that chelators ea, en and dien had the lowest values of IC50 (< 3 &#181;M). but they are too citotoxic to be used as drugs. Among the synthesized chelators, only dado-en presented a result in a pharmaceutically interesting range (IC50 19.9 ± 2.2 &#181;M). Against RAW 264,7 macrophages dado-en IC50 > 50 &#181;M. Complexation to copper did not enhance the citotoxicity of the compounds. Overall, the results in this study indicate a potential use of dado-en in combating leishmaniasis.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:48:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Quinalia_MarianaBeatriz_M.pdf: 3702329 bytes, checksum: 7ed3bbb46f028abad9a9d677dbda482d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Processos de alto cisalhamento têm sido utilizados para redução e homogeneização da distribuição de tamanhos de lipossomas em sua produção escalonável. No entanto, a aplicação do cisalhamento pode modificar estruturalmente essas nanopartículas, influenciando a incorporação de fármacos hidrofóbicos. Neste estudo, a chalcona sintética 3-nitro-2-hidroxi- 4,6-dimetoxichalcona (CH8), fármaco altamente hidrofóbico indicado para tratamento de leishmaniose cutânea, foi incorporada em lipossomas convencionais produzidos por processos escalonáveis de alto cisalhamento. Os lipossomas foram compostos por fosfatidilcolina de ovo e produzidos por injeção de etanol. Foram utilizados agitador mecânico com impelidor Cowles, Ultra Turrax® e microfluidizador para reduzir e homogeneizar o tamanho das partículas. A influência da taxa de cisalhamento foi controlada pelo método de Bangham seguido por extrusão em membranas. Espectros de espalhamento de raios-X a baixo ângulo mostraram que o cisalhamento leva a uma redução na distância interlamelar dos lipossomas, quando comparados ao controle. A distância interlamelar não variou com a intensidade do cisalhamento na faixa de agitação obtida com o impelidor Cowles, mas diminuiu com o aumento do cisalhamento provocado pelo Ultra Turrax®. A constante elástica, relacionada com a rigidez da bicamada e dependente da estrutura dos lipossomas, aumentou proporcionalmente com a taxa de cisalhamento para os dois agitadores. O cisalhamento também diminuiu o diâmetro médio dos lipossomas e a distribuição de tamanhos. Inicialmente, CH8 foi incorporada em lipossomas pré-formados. Os resultados mostraram que a expulsão e precipitação do fármaco incorporado foram proporcionais à intensidade do cisalhamento aplicado. Essa limitação foi contornada pela incorporação de uma baixa concentração de CH8 durante a formação dos lipossomas. A taxa de cisalhamento produzida pelo impelidor Cowles favoreceu a elasticidade da bicamada lipossomal, proporcionando alta eficiência de incorporação e capacidade de carregamento da CH8. Assim, a elasticidade da bicamada é fator determinante para a capacidade de incorporação de fármacos hidrofóbicos em lipossomas. Estas descobertas constituem uma melhoria nos processos de alto cisalhamento utilizados para carreamento de CH8 e contribuem para o desenvolvimento de formas farmacêuticas mais eficazes para o tratamento de leishmaniose cutânea / Abstract: High shear processes have been used to reduce the size and homogenize the size distribution of liposomes in their scalable production. However, high shear rates modify the liposome structure which may affect the loading of hydrophobic drugs. In this study, synthetic chalcone 3-nitro-2-hydroxy-4,6-dimethoxychalcone (CH8), a highly hydrophobic drug indicated to treat cutaneous leishmaniasis, was incorporated in conventional liposomes produced by scalable high shear processes. Liposomes were composed by egg phosphatidylcholine and produced by ethanol injection. Cowles impeller, Ultra Turrax® stirrers and microchannel microfluidizer were used to reduce and homogenize the size of the liposomes. The shear rate was controlled by Bangham's method followed by membrane extrusion. Small angle X-ray scattering spectra showed that the shearing reduced the interlamellar distance of the liposomes compared to the control. The interlamellar distance did not change with the shearing intensity in the range of Cowles stirring, but it decreased for higher shearing provided by the Ultra Turrax®. The elastic constant, which is related to the stiffness and depends on the structure of the liposomes, increased with increasing shearing intensity for both stirrers. The shearing also reduced the mean diameter of the liposomes and the size distributions. Initially, CH8 was incorporated into pre-formed liposomes. The results showed the expulsion and precipitation of loaded CH8 was proportional to the intensity of the applied shear rate. This limitation was circumvented by incorporating a low concentration of CH8 (0.2 mol/m³) during the formation of liposomes. The shear rate provided by the Cowles stirrer favored the elasticity of the bilayer and yielded high incorporation efficiency and CH8-loading. Therefore, the elasticity of the bilayer is a determining factor for the loading of hydrophobic drugs in liposomes. These findings constitute an improvement in the high shear process used to load CH8 and to the development of most effective pharmaceutical forms for the treatment of cutaneous leishmaniasis / Mestrado / Engenharia Química / Mestra em Engenharia Química

Orientador: Sérgio de Albuquerque / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mamede_KarinaPontin_D.pdf: 5876498 bytes, checksum: 9b5c5457f2756a9ea58558ebd4bc90d2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, a prevalência das diferentes formas de leishmaniose (tegumentar e visceral) ultrapassou 12 milhões de casos. A leishmaniose constitui um importante problema de saúde pública especialmente na América Latina e Central, África e esporadicamente na Europa e América do Norte. No Brasil, a leishmaniose cutânea é causada principalmente por Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis, a mucocutânea por Leishmania (Viannia) braziliensis e a visceral por Leishmania (Leishmania) chagasi. O principal tratamento das infecções causadas por esse parasito é baseado principalmente no uso de antimoniais pentavalentes que, apesar da relativa eficácia, essas drogas são altamente tóxicas, provocando efeitos colaterais graves, além de determinar certa resistência parasitária. Diante disso, faz-se necessário o estudo de novas drogas eficazes para o tratamento da leishmaniose com menos efeitos colaterais. Objetivou-se com o presente trabalho avaliar a eficácia de diversos tipos de Bioterápicos homeopáticos nas escalas Centesimal (CH) e Decimal (DH), utilizando diferentes processos de preparação, com o intuito de proporcionar uma melhor eficácia no tratamento a leishmaniose, com menores taxas de efeitos colaterais. Para tal, foram utilizados Mus musculus, machos, infectados experimentalmente com 2,0x 104 formas promastigotas de L. (V) braziliensis. Os animais foram divididos em: grupo controle positivo, tratados com Glucantime; controle negativo, tratados com solução fisiológica; grupos infectados e não infectados tratados com o Bioterápico 1 (obtidos por formas promastigotas inativados pelo método do ultra-som), Bioterápico 2 (obtidos de formas amastigotas inativados por álcool 70%), Bioterápico 3 (obtidos por formas promastigotas inativados por álcool 70%), Bioterápico 4 (obtidos de formas amastigotas mais sangue de camundongos infectados) e Bioterápico 5 (obtidos de formas amastigotas mais sangue de animais infectados e mix homeopático. Os Bioterápicos 2, 3 e 4 foram preparados nas escalas centesimal e decimal. O tratamento ocorreu por um período de 60 dias, com exceção do controle positivo que foi administrado conforme o padrão terapêutico do medicamento. Após o tratamento, realizou-se provas hematológicas em todos os animais, a fim de verificar possíveis efeitos dos Bioterápicos em relação ao desenvolvimento de suas células sanguíneas. Os resultados demonstraram que os animais tratados com o Bioterápico 2 na escala decimal (DH) apresentaram uma maior redução na lesão leishmaniótica em relação aos outros grupos, porém não o suficiente para alcançar a cura parasitológica. Em relação às provas hematológicas, os resultados mais significativos observados foram aumento de monócitos nos grupos infectados e tratados com os Bioterápicos, aumento do número de macrófagos, principalmente para os grupos tratados com os Bioterápicos 2 e 3 na escala decimal, o que leva a pensar em uma possível estimulação do sistema imunológico pelos Bioterápicos utilizados / Abstract: According to the last estimative of the Wold Health Organization, the prevalence of the distinct forms of leishmaniosis (tegumentar and visceral) exceeded 12 million people. Leishmaniosis is considered an important health problem in Central and south America, Africa ·., and seldom in Europe and North America. In Brazil, cutaneous leishmaniosis is caused mainly by Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonens1s, the mucocutaneous by Leishmania (Viannia) braziliensis and the visceral by Leishmania (Leishmania) chagasi. The main clinical treatment for these infections is based in the use of pentavalente antimonials, which presents a partial efficacy, being extremely toxic and triggering serious side effects, besides the fact of causing parasitic resistance to drug. So the use of alternative drugs with less collateral side effects for the treatment of leishmaniosis has been the goal of several researchers. This work has as objectives to evaluate the effectiveness of homeopathic biotherapics in the Centesimal (CH) and Decimal (DH) scales, using different processes of manufacturing in the attempt to induce a better efficiency for leishmaniosis. For this purpose it was used male Mus musculus experimentally infected with 2,0 x 104 promastigote forms of L. braziliensis. Animals were divided in groups: positive control group, Glucantine treated animals, negative control, treated with saline solution; infected and uninfected animals treated with Biotherapic 1 (manufactured using promastigote forms inactivated by ultra-sound). Biotherapic 2 (manufactured using promastigote forms inactivated by ultra-sound), Biotherapic 2 (manufactured using amastigote forms inactivate with alcohol 70%), Biotherapic 3 (manufactured using promastigote forms inactivated with alcohol 70%), Biotherapic 4 (manufactured from amastigote forms added with blood of infected mice) and Biothepapic 5 (manufactured from amastigote forms added with blood infected animals and homeopathic mix). The biotherapics 2, 3 e 4 were prepared in the centesimal and decimal scales. Treatment was applied for a period of 60 days, with exception of the positive control, which was administered according to the directions of the drug. After fmished the therapeutic treatment, hemogram of all animals was done in order to verify possible harmfull effects on the blood red and white cells. Our data revealed that treated with biotherapic 2 in the decimal (DH) scale displayed a more effective reduction in the leishmaniotic lesion as compared to other groups, although not sufficient to induce the parasitological cure. Concerning to the hemogram, a monocytosis was observed for infected animals treated with distinct biothepapics. It was also found enhanced number of macrophages mainly for groups treated with Biotherapics 2 and 3 in the decimal scale. These data points in the direction of a possible stimulation of the host's immune response, triggered by these biotherapics / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-01T08:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_CamilaGambini_M.pdf: 26915917 bytes, checksum: 7a23f1040f564aa55e407738cf58ab8f (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O resumo podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6314_1.pdf: 1402240 bytes, checksum: 3a6b521eb7d3cff5b8fb4e3b2347a3ec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protozoários flagelados do gênero Leishmania são transmitidos para mamíferos através da picada de insetos flebotomíneos e são os agentes etiológicos das quatro formas clínicas de leishmanioses: leishmaniose visceral que é fatal quando não tratada, leishmaniose mucocutânea, leishmaniose cutânea e a leishmaniose cutânea difusa. A leishmaniose visceral é comum em países em desenvolvimento, com uma estimativa de 500.000 novos casos a cada ano. A Leishmania chagasi é o agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas e outras espécies são responsáveis pela forma visceral da doença no Velho Mundo. Devido sua importância, o desenvolvimento de drogas e vacinas usando antígenos do parasito têm sido o alvo de muitos estudos. Entre os maiores antígenos do parasito estão as proteínas de choque térmico (HSP), a maior classe de proteínas conservadas, classificadas como chaperonas. Elas são essenciais no controle do ciclo celular e estão envolvidas na assistência ao dobramento e prevenção de reações irreversíveis tais como agregações inespecificas de proteíans celulares. As HSP possuem um papel importante com agente imunoregulatório com potente uso terapeutico; ademais elas foram identificadas como os maiores imunógenos em várias doenças infecciosas e que estimulam uma resposta específica protetora. A HSP83, ortóloga a HSP90 de mamíferos, é uma das proteínas de Leishmania mais abundantes e é reconhecida pela resposta imune humoral e celular em humanos e em cães com leishmaniose visceral. Neste estudo, baseado em alinhamentos, a estrutura primária da HSP83 de Leishmania chagasi foi comparada a HSP90 de outros organismos, para investigação de suas relações filogenéticas. Quando a seqüência de aminoácidos foi alinhada às seqüências depositadas no banco de genes públicos, ficou evidente que a proteína é extremamente conservada mesmo em organismos pertencentes a diferentes reinos. Quando a seqüência codificante foi comparada, foi possível mapear rigorosamente os exons do gene humano, exceto pela presença de três gaps. O primeiro gap corresponde a uma alça flexível entre duas folhas beta, o segundo tem 57aa (o maior gap), compreende o domínio N-terminal correspondendo ao sítio de ligação de ATP e o último gap, que corresponde também a uma alça flexível entre o domínio central e o domínio carboxi. O aumento da divergência na seqüência é coincidente com as regiões equivalentes as junções dos exons na proteína ortóloga de mamíferos. Nossos resultados sugerem que o gene da HSP83 dos organismos ancestrais aos Kinetoplastida tinha introns, e que foram perdidos durante a evolução.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-20T15:50:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1478810 bytes, checksum: be9e97e7629b09268a428ed4728be5c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-20T15:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1478810 bytes, checksum: be9e97e7629b09268a428ed4728be5c8 (MD5) Previous issue date: 2016-08-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada por protozoários parasitas intracelulares da espécie Leishmania infantum chagasi nas Américas. Esses parasitos possuem forte tropismo por órgãos viscerais, especialmente baço, fígado e medula óssea, onde se proliferam e provocam lesões podendo ser letal caso não sejam tratadas. O parasito possui moléculas consideradas fatores de virulência que vem sendo intensamente investigadas. Entre elas destacamos as proteínas ligante de heparina (PLH), glicoproteínas relacionadas em diversos trabalhos na literatura com o processo de adesão e internalização do parasito à célula hospedeira. Nesse trabalho utilizamos a PLH de L. infantum chagasi (PLHLc) em experimentos de imunização de camundongos BALB/c para avaliar a proteção conferida a esses animais após desafio com as formas promastigotas do parasito. Foram avaliadas a carga de parasitos no baço e no fígado, produção de citocinas (IFN- , TNF, IL-2, IL-17, IL-6, IL-10 e IL-4) e de óxido nítrico (NO) após imunização com PLHLc isolada ou associada ao Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) e Adjuvante Saponina (SAP), quatro semana após o desafio. Os camundongos foram imunizados por via intraperitoneal ou subcutânea, sendo submetidos a duas doses de reforço utilizando o mesmo protocolo da primeira imunização. Quinze dias após a última dose os camundongos foram infectados com 1 x 10 7 promastigotas de L. infantum chagasi em fase final logarítmica de crescimento. Quatro semanas após a infecção os animais foram eutanasiados e o baço e o fígado foram coletados para ensaio da quantificação da carga parasitária e avaliação da produção de citocinas e NO por citometria de fluxo e pelo método de Griess, respectivamente. Nossos resultados mostraram que o grupo imunizado apenas com PLHLc não apresentou redução da carga parasitária e os esplenócitos estimulados in vitro com antígeno particulado de L. infantum chagasi (AgLc) produziram citocinas IL-6 e IL-17, ambas de padrão de resposta imune Th17 e a citocina IL-10. O grupo imunizado com PLHLc + AIF apresentou redução da carga de parasitos apenas no baço e produziram citocinas IFN- e IL-2 (Th1), IL-6 e IL-17 (Th17) e IL-10. O grupo imunizado com PLHLc + SAP apresentou redução da carga parasitária no baço e no fígado. Os esplenócitos desse grupo estimulados in vitro com AgLc produziram maiores médias de citocinas de padrão de resposta imune Th1 e Th17 e a citocina reguladora IL-10 comparado com os grupos anteriores. Em relação a produção de NO por esplenócitos estimulados in vitro com AgLc níveis basais foram detectados pelo método de Griess em todos os grupos avaliados. Os resultados alcançados nos mostra que a PLHLc associada ao adjuvante Saponina representa uma forte candidata a vacina contra LV e nos direciona para uma nova etapa de investigação, a proteção conferida pela PLHLc recombinante. / Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the protozoan intracellular parasite Leishmania infantum chagasi specie in the Americas. These parasites exhibit a strong tendency to invade visceral organs, especially the spleen, liver and bone marrow, where they proliferate and cause injuries and can be lethal if not treated. The parasite exhibit molecules considered as virulence factors that have been intensively searched. Among then we highlight the heparin-binding proteins (HBP), glycoproteins related in several studies in the literature with the process of adhesion and internalization of the parasite to the host cell. In this work, we used L. infantum chagasi HBP (HBPLc) in immunization experiments using BALB/c mice to evaluate the protection given to the animals after challenge with promastigote forms of the parasite. Were evaluate the parasite load in the spleen and liver, cytokine production (IFN- , TNF, IL-2, IL-17, IL-6, IL-10 e IL-4) and nitric oxide (NO) after immunization with isolated HBPLc or associated with Incomplete Freund’s Adjvant (IFA) and Saponin Adjuvant (SAP), four weeks after challenge. The mice were immunized by intraperitoneal or subcutaneous route and submitted two times to booster doses using the same protocol of the first immunization. Fifteen days after the last dose the mice were infected with 1 x 10 7 L. infantum chagasi promastigotes end logarithmic phase of growth. Four weeks after infection the animals were euthanized and spleen and liver were collected for assay quantification of the parasite load and evaluation of the cytokine and NO production by flow cytometry and by Griess method, respectively. Our results showed that the group immunized with only HBPLc showed no reduction in parasite load and spleen cells stimulated in vitro with crude extract of L. infantum chagasi (AgLc) produced cytokines IL-6 and IL-17, both standard immune response Th17 and IL-10 cytokine. The group immunized with HBPLc + IFA decreased the parasite load only in the spleen and produced cytokines IFN- and IL-2 (Th1), IL-6 and IL-17 (Th17) and IL-10 cytokine. The group immunized with HBPLc + SAP decreased the parasite load in the spleen and liver. The spleen cells this group in vitro stimulated with AgLc generated pattern cytokines of Th1 and Th17 and regulatory cytokine IL-10 compared to previous groups. About NO production by spleen cells stimulated in vitro with AgLc baseline levels were detected by Griess method in all groups evaluated. The results achieved shows that the HBPLc associated with Saponin adjuvant is a strong candidate against VL vaccine and directs us to a new stage of research, the protection given by recombinant HBPLc.