Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T09:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_BeatrizZanchetta_M.pdf: 8346831 bytes, checksum: e0ef805cafa3599b49c6d357c8849853 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Atualmente, os lipossomas elásticos têm se destacado em relação aos lipossomas convencionais (LC), pela capacidade de atingir as camadas mais profundas da pele. Neste trabalho, lipossomas elásticos foram preparados e caracterizados quanto às suas propriedades físico-químicas, de permeação in vitro e ex vivo, e aplicados ao tratamento tópico da leishmaniose cutânea. Estes lipossomas foram compostos de lecitina de ovo, e tiveram a sua superfície modificada pela incorporação do tensoativo PEG:8L, formando os lipossomas peguilados (LP). O fármaco encapsulado foi uma chálcona sintética nitrogenada (CH8), que vem se destacando como substância antiprotozoária e apresenta dificuldade de permeação através da pele. Os resultados obtidos mostram que o PEG-8L é incorporado na bicamada lipídica dos LC, produzindo maior fluidez e elasticidade. A incorporação do PEG-8L também modifica a tensão superficial e o potencial zeta dos LC. A encapsulação da CH8 foi verificada em ambos os casos (LC e LP), com modificações na morfologia, diâmetro médio, tensão superficial e temperatura de transição de fase em relação aos LC vazios. Os estudos de permeação em membranas sintéticas de nanoporos (in vitro) mostraram que os LP possuem maior capacidade de permeação que os LC, e que a CH8 produz elasticidade aos LC aumentando sua capacidade de permeação em relação aos LP contendo CH8. Os estudos de permeação em pele de orelha de porco (ex vivo) mostraram que a CH8, em ambos os tipos de lipossomas, foi capaz de permear as camadas da pele e atingir a derme. Os resultados in vivo no tratamento da leishmaniose em camundongos mostraram que as formulações lipossomais foram mais eficientes que a CH8 livre, destacando-se a eficácia da CH8 em LC, cuja ação foi semelhante à aplicação da CH8 livre intralesional. Os resultados obtidos mostram o desenvolvimento tecnológico da preparação de LC e LP contendo CH8, e contribuem para o tratamento mais eficaz da leishmaniose cutânea. / Abstract: Nowadays, elastic liposome (EL), has gained attention when compared with conventional liposome (CL), by its capacity of reach the skin's deepest layers. In this work, elastic liposome were prepared and characterized by its physic-chemical properties, in vivo and ex vivo permeation, and its application for cutaneous leishimania topical treatment. The liposome was composed by egg lecithin, and had it surface modified by the incorporation of PEG-8L tensoactive, forming PEGylated liposome (PL). The encapsulated drug was a synthetic nitrogened chalcone (CH8), which has aroused as anti-protozoa substance and presents difficult permeation through the skin. Results obtained shows that PEG-8L was incorporated on LC's lipid bilayer, producing enhanced elasticity and fluidity. PEG- 8L incorporation also modifies the superficial tension and zeta's potencial of the CL. CH8's encapsulation was observed in both cases, presenting modification at morphology, mean diameter, superficial tension and phase transition's temperature when related with empty CL. The permeation studies in synthetic nanopores' membranes (in vitro) showed that PL has higher permeation capacity than CLf and CH8 produced some elasticity to CL increasing its permeation capacity even when related to PL containing CH8. The pig's ear skin permeation studies (ex vivo) showed that CH8 in both liposome types was capable of permeate the skin layers, reaching the dermis. Mice leishimania treatment in vivo results showed that the liposomal formulation was more efficient that free CH8, underling CH8's efficiency in CL, in which the action was similar to free CH8 intra-wound application. Results showed the technological development of CL and PL containing CH8 that contribute to a more efficiency treatment of coetaneous leishmania. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Yuji Takahata, Rogerio Custodio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_KesleyMoraesGodinhode_D.pdf: 5766531 bytes, checksum: 5d60e17b9a5062a054d9bb7de66054f4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objeto de estudo desta tese é a forma mais severa e letal de Leishmaniose: a Leishmaniose Visceral, LV, cujo principal agente etiológico é a espécie Leishmania donovani. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de modelos Quantitativos das Relações Estrutura-Atividade para duas séries de compostos com atividade antileishmaniose contra formas amastigotas de Leishmania donovani. A primeira série envolve vinte e um análogos de nucleosídeos pirazolo-pirimidínicos e a segunda série compreende oito antifúngicos. Para garantir a robustez dos modelos, além dos compostos que compõem as respectivas séries, foram selecionadas moléculas com conhecida atividade contra LV para compor um conjunto de teste e avaliar a capacidade de previsão dos respectivos modelos. Para a série dos nucleosídeos foram desenvolvidos modelos de regressão logística e árvore de classificação. Em ambas as abordagens os descritores Mor26v e o GAP(HOMO, HOMO-1) se mostraram relevantes para a explicação da atividade leishmanicida destes compostos. O modelo de regressão logística atingiu 90,5% para acurácia de classificação para o conjunto de trabalho e 58% para o conjunto de teste após a análise do domínio de aplicabilidade do modelo. O modelo para árvore de classificação alcançou 95% para acurácia de classificação para o conjunto de trabalho e 83% para o conjunto de teste. Para a série dos antifúngicos foi utilizado um modelo de regressão linear múltipla onde a energia eletrônica e a área da superfície polar se mostraram importantes para a atividade leishmanicida da série. Os valores previstos exibem 98% de correlação com os valores experimentais. Os valores encontrados para o conjunto de teste também estão de acordo com a literatura. Finalmente, novos compostos foram propostos para síntese e avaliação da atividade leishmanicida. / Abstract: The object of study of this thesis is the most severe and lethal form of leishmaniasis: visceral leishmaniasis, LV, whose main etiological agent is the species Leishmania donovani. The goal of this work is the development of Quantitative Structure-Activity Relationship models for two series of compounds presenting antileishmanial activity against amastigotes of Leishmania donovani. The first series includes twenty-one analogues of pyrazolo-pyrimidine nucleosides and the second series comprises eight antifungals. To ensure the robustness of the models, in addition to the compounds that make up their series, molecules with known activity against LV were selected to compose a testset and evaluate the predictive power of their models. For the series of nucleosides logistic regression models and tree classification were developed. In both approaches, the Mor26v and GAP(HOMO, HOMO-1) descriptors were relevant to explain the leishmanicidal activity of these compounds. The logistic regression model reached 90.5% for classification accuracy to the workingset and 58% for testset after analysis of the domain of applicability of the model. The classification tree model reached 95% for classification accuracy of the workingset and 86% for the testset. A multiple linear regression model was applied to the series of antifungal agents. The electron energy and polar surface area were important for the leishmanicidal activity of this series. The predicted values showed 98% of correlation with the experimental values. The values found for the testset are also in agreement with the literature. Finally, new compounds were proposed for synthesis and evaluation of leishmanicidal activity. / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-22T16:09:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Final Dissertção.pdf: 2617689 bytes, checksum: c147bcfc357fc3a4030f61766ed9bad5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-22T16:09:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Final Dissertção.pdf: 2617689 bytes, checksum: c147bcfc357fc3a4030f61766ed9bad5 (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / CNPq / A abordagem mais promissora para um diagnóstico eficaz da Leishmaniose Visceral (LV) utiliza ensaios sorológicos com proteínas recombinantes, pois apresentam grande sensibilidade e especificidade, associados a baixo custo e fácil execução. Misturas de alguns antígenos geram resultados mais promissores, contudo, a produção destas aumenta os custos e dificulta a padronização. É ideal a produção de uma única proteína quimérica que apresente boa sensibilidade e seja eficiente no diagnóstico das formas humana e canina da LV. Este estudo objetivou avaliar as condições para expressão em Escherichia coli de genes sintéticos codificando proteínas quiméricas compostas por regiões selecionadas de antígenos previamente identificados de Leishmania infantum. Quatro genes, contendo os mesmos antígenos em diferentes combinações, foram otimizados para expressão em procariotos e sintetizados. Sítios internos de restrição foram incluídos nas sequências de forma a permitir a eliminação seletiva de segmentos específicos e se avaliar o efeito na expressão bacteriana da presença de diferentes regiões antigênicas, bem como de um peptídeo estimulador da tradução. A expressão das proteínas geradas foi então avaliada através de ensaios de Western Blot. Os resultados obtidos mostraram uma expressão equivalente, porém limitada, das diferentes proteínas quiméricas, independente da sua composição antigênica. Proteínas menores tiveram resultados mais promissores na expressão e o peptídeo estimulador da tradução foi essencial para otimizar essa expressão, porem ainda faz-se necessário mais estudos avaliando a sensibilidade e especificidade dessas proteínas para o diagnóstico da LV. / The most promising approach for effective diagnosis of Visceral Leishmaniasis (VL) uses serological assays with recombinant proteins, since they have high sensitivity and specificity associated with low cost and easy implementation. Mixtures of some antigens generate the most promising results, however, these increase production costs and impairs its standardization. The best option would be the production of a single chimeric protein showing good sensitivity and being effective for the diagnosis of the human and canine forms of VL. This study aimed to evaluate the conditions for expression in Escherichia coli of synthetic genes encoding chimeric proteins composed of selected regions of previously identified antigens of Leishmania infantum. Four genes, containing the same antigens in different combinations, were optimized for expression in prokaryotes and synthesized. Internal restriction sites were included in the sequences to allow selective removal of specific segments and to evaluate the effect on the bacterial expression of the presence of different antigenic regions, as well as a translational enhancer peptide. The expression of proteins generated was then evaluated by Western blot assays. The results showed equivalent expression, however limited, of the different chimeric proteins, regardless of their antigenic composition. Smaller proteins produced more promising results in the expression and the translation enhancer peptide was important to optimize this expression, however further studies are still necessary to evaluate the sensitivity and specificity of these proteins for the diagnosis of VL.

Doença de Chagas e Leishmaniose, são doenças causadas por protozoários da família Trypanosomatidae (Trypanosoma cruzi e Leishmania sp., respectivamente) e estão, ambas, no grupo das doenças consideradas tropicais negligenciadas (DTNs). Juntas, elas afetam cerca de 30 milhões de pessoas em 98 países no mundo. Embora tão epidemiologicamente importantes, essas doenças ainda carecem de um tratamento quimioterápico robusto e seguro, pois os medicamentos disponíveis apresentam, além de baixa eficácia terapêutica, baixas taxas de adesão, devido aos sérios efeitos colaterais gerados por serem extremamente tóxicos e acabando, por isso, sendo geradores de resistência. Nas últimas décadas, tem sido intenso o esforço dos grupos de pesquisa em desenvolver alternativas para o tratamento dessas doenças, especialmente explorando produtos de origem natural e através do emprego de tecnologia farmacêutica, gerando formulações mais viáveis clinicamente devido ao provimento de propriedades físico-químicas favoráveis à absorção e permeabilidade celular, com consequente maior biodisponibilidade e potencialização do efeito biológico. Em nosso presente trabalho, objetivamos propor novas estratégias de tratamento dessas doenças, utilizando como candidato, o ácido ursólico (AU), um triterpenoide de origem natural. Foram testados o AU isolado e associado com fármacos estabelecidos, assim como uma dispersão sólida contendo 10% do princípio ativo (DSAU). Em ensaios in vitro contra as várias formas evolutivas intra e extracelulares de Trypanosoma cruzi e Leishmania braziliensis, obtivemos muito bons resultados, como 99,8% de lise em 128 ?M sobre as formas tripomastigotas, com IC50 de 14,1 ?M para o AU. Em experimentos in vivo sobre doença de Chagas experimental, observamos uma redução de parasitemia de 60,2% e 61,6% em animais tratados com doses de 20 mg/Kg de AU e DSAU, respectivamente. Embora não tenham causado diminuição na carga parasitária nos tecidos analisados (coração e fígado) em relação ao controle negativo, a sobrevida dos animais tratados com AU e DSAU foi semelhante a dos animais tratados com benzonidazol na mesma dose. Sobre leishmaniose muco-cutânea experimental, observamos a diminuição do diâmetro médio das lesões em animais tratados com dose de 20 mg/Kg de nossos compostos avaliados. Esses resultados demonstram que o ácido ursólico é um potente candidato a quimioterápico para o tratamento de tripanosomíases. Além disso, a associação a fármacos existentes, e a utilização de tecnologia farmacêutica podem ser boas estratégias para o tratamento dessas doenças. / Chagas disease and Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the family Trypanosomatidae (Trypanosoma cruzi and Leishmania sp., Respectively) and both are in the group of diseases considered neglected tropical (NTDs). All together, they affect about 30 million people in 98 countries worldwide. Although so very epidemiologically important, these diseases still lack a safe and robust chemotherapeutic treatment seeing that the available drugs present besides low therapeutic efficacy, low compliance rates, since they are extremely toxic and cause serious side effects ending up, therefore, being resistance generators. In recent decades, there have been intense efforts of research groups to develop alternatives for treating these diseases, especially exploring natural products and by applying pharmaceutical technology, generating more clinically viable formulations due to providing favorable physicochemical properties to the cell absorption and permeability, thus resulting in increased bioavailability and enhancement of biological effect. In our present study, we aimed to propose new treatment strategies for these diseases by using as a candidate, the ursolic acid (UA), a naturally occurring triterpenoid. Isolated UA and associated with established drugs have been tested, as well as a solid dispersion containing 10% of the active ingredient (SDUA). In the in vitro tests against several extracellular and intracellular evolving forms of Trypanosoma cruzi and Leishmania braziliensis, we have obtained very good results, such as 99.8 of lysis at 128 ?M on trypomastigotes, with IC50 of 14.1 ?M for the UA. In the in vivo experiments about experimental Chagas disease, a decrease of parasitaemi of 60.2% and 61.6% has been observed in animals treated with doses of 20 mg / kg of UA and SDUA respectively. Although not having caused a decrease in the parasite load in the tissues analyzed (heart and liver) compared to the negative control, the PFS of animals treated with UA and SDUA was similar to that of the animals treated with the same dose of benznidazole. About the experimental skin mucus leishmaniasis, we have observed a decrease of the average diameter of lesions in animals treated with 20 mg / kg of our evaluated compounds. These results demonstrate that the ursolic acid is a potent candidate for chemotherapy for the treatment of trypanosomiasis. Furthermore, the association of existing drugs, and the use of pharmaceutical technology can be good strategies to treat these diseases

The objective of this study was to identify environmental and social parameters associated with the incidence of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) in the municipality of Ubatuba, Sao Paulo State, Brazil, in 2003, which can supply information to subsidy the Control Programs for ATL. Ubatuba is one of the cities in the north coastal area of the State, where the climate can be characterized as tropical humid. With an extensive area of natural vegetation, Lutzomyia intermedia is the predominant transmitting phlebotominae species. It was selected as study sample 60 cases of ATL, notified at 2003, and to prepare data about some environmental aspects related to the housing and work conditions of each case were observed; through domiciliary visits and application of a form is also collected data related to social and conditions of the subject of the investigation and their knowledge degree about the illness and its relation with the environment. The meteorological conditions related to rain fall and temperature were analyzed comparing to the historical series of the past 9 years before investigation, from 1994 to 2001. Global Positioning System (GPS) images were used as analysis tool to study the spatial distribution of the ATL. Rain fall and temperature data were analyzed, month to month. The annual temperature averages, during the studied period, varied from 21,5 to 22,5C, between 1994 and 2001; higher temperatures, with month averages ranging from 24 to 27C, were observed during the Summer months, between December and March, and lower temperatures, 18 to 21 C, between June and September. The annul rainfall precipitation averages varied from 147,5mm to 267,2mm. The occurrence of ATL does not seem to be associated to the history of recent occupation, specific age group or type of work activity, nor to the rainfall variations. It is discussed the hypothesis of the contribution of the temperature for higher number of cases of ATL in 2003. / O objetivo deste estudo foi identificar parâmetros ambientais e sociais e associá-los com a incidência de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), no município de Ubatuba, Estado de São Paulo, Brasil, entre os anos de 1994 e 2003, e fornecer informações que possam servir de subsídio ao programa de controle da LTA. Ubatuba está situado no litoral norte do Estado de São Paulo, onde o clima é caracterizado como tropical úmido, com uma extensa área de vegetação natural, sendo Lutzomyia intermedia a espécie predominante do flebotomíneo transmissor. Foi selecionada para o estudo uma amostra de 60 casos de LTA, notificados no ano de 2003, e levantados os dados relativos a aspectos ambientais, condições de moradias e ocupação de cada caso que foi notificado. Por meio de visitas domiciliares e aplicação de um formulário, foram também coletados dados sobre condições sociais dos sujeitos da pesquisa, grau de conhecimento sobre a doença e sua relação com meio ambiente. As variações climáticas de pluviometria e temperatura foram analisadas mês a mês e comparadas aos registrados na série histórica dos 09 anos anteriores à pesquisa, As imagens de geoposicionamento, foram utilizadas como ferramenta de estudo da distribuição da LTA nos bairros de ocorrência. A variação das médias anuais de temperatura, durante o período estudado, manteve-se entre 21,5 e 22,5C, entre 1994 e 2001, enquanto que em 2003, elevou-se a 22,9C e em 2003 retorna a 22,5C. As maiores médias mensais de temperatura, 24 a 27C, foram observadas durante os meses de verão, entre dezembro e março e as menores temperaturas, 18 a 21C entre os meses de junho e setembro. As médias anuais de pluviometria variaram de 147,5mm a 267,2mm. A ocorrência de LTA não parece estar associada a recente ocupação e a grupo específico, seja quanto à faixa etária ou ao tipo de atividade laborativa, nem a variações anuais de pluviometria. Discute-se a hipótese da contribuição da temperatura para o aumento de casos de LTA em 2003.

Les maladies tropicales négligées, telle que la leishmaniose, constituent un problème majeur de santé publique, en particulier dans les pays à faible revenu où cette maladie sévit. Le nombre limité des médicaments disponibles, leurs coûts, leurs effets indésirables et l’émergence de résistances, exige la recherche de nouveaux agents thérapeutiques. Les champignons endophytes constituent une source prometteuse de nouvelles molécules bioactives. Dans ce contexte, une étude mycochimique a été menée sur une souche endophyte de Botryosphaeria mamane, un micromycète relativement peu étudié, isolée des feuilles de Bixa orellana. Cette souche a été sélectionnée suite à un criblage préliminaire mené contre un modèle d’amastigotes axéniques de Leishmania infantum. Les études chimiques sur ce champignon ont permis d’isoler 9 molécules pures (BM1-BM9), dont 6 de structures nouvelles (BM1-BM4, BM8, BM9) et deux mélanges BM10 et BM11. Les molécules BM1-BM4 appartiennent à la famille des cyclopeptides de type thiodicétopipérazines que nous avons nommés botryosulfuranols A-D. Ils possèdent un squelette original caractérisé par deux centres spirocycliques. BM5-BM7 se sont révélés être des isocoumarines dérivés de la mélleine (cis-4-hydroxymélleine, trans-4-hydroxymélleine et 5-hydroxymélleine). BM8 et BM9 sont deux polycétides de structure nouvelle. Enfin, BM10 et BM11, sont des mélanges de cyclopentapeptides. L’évaluation de leur activité biologique sur amastigotes axéniques de Leishmania infantum a révélé que les thiodicétopipérazines avaient les meilleures activités. Le composé BM4 est le plus actif (CI50 = 0.03 µM) mais également le plus sélectif (IS = 190) de L. infantum par comparaison avec sa cytotoxicité sur des macrophages. BM1 et BM3 sont aussi actifs mais peu sélectifs (CI50 = 0.69 et 0.44 µM, IS = 3 et 15, respectivement) en raison de leur toxicité sur macrophages, et BM2 (CI50 = 3.88 µM) n’a montré aucune sélectivité. Les composés BM8 et BM9, bien que non cytotoxiques sur macrophages, ont montré une activité plus modérée contre L. infantum. Les composés BM5-BM7, et les mélanges BM10, BM11 n’ont présenté aucune activité leishmanicide. L'ensemble de ce travail souligne ainsi l'intérêt des endophytes fongiques comme sources de nouveaux composés leishmanicides. / Neglected tropical diseases, such as leishmaniasis, are a major public health problem, especially in the poorest countries of the world. The limited number of drugs available, their costs, adverse effects and the emergence of resistances, require the search for new therapeutic agents. Endophytic fungi are a promising source of new bioactive molecules. In this context, a mycochemical study was carried out on an endophytic strain of Botryosphaeria mamane, a relatively poorly studied micromycete, isolated from Bixa orellana leaves. This strain was selected from a preliminary screening for its good activity against Leishmania infantum axenic amastigotes. Chemical investigations on this fungus led to the isolation of 9 pure molecules (BM1-BM9), 6 of which are new structures (BM1-BM4, and BM8, BM9) and two mixtures BM10 and BM11. BM1-BM4 belong to the family of cyclodipeptides and are thiodiketopiperazines derivatives that we called botryosulfuranols A-D. The latter possess an unprecedent skeleton characterized by two spirocyclic centers. BM5-BM7 are isocoumarins derived from mellein (cis-4-hydroxymellein, trans-4-hydroxymellein and 5-hydroxymellein). BM8 and BM9 are two new polyketides. Finally, BM10 and BM11 are mixtures of cyclopentapeptides. Evaluation of leishmanicidal activities of these 9 compounds and the two mixtures on axenic amastigotes of Leishmania infantum showed that thiodiketopiperazines possessed the highest activities. BM4 was the most active (IC50 = 0.03 μM) and the most selective (IS = 190) when compared to its cytotoxicity on macrophages. The other thiodiketopiperazines BM1 and BM3 were active but less selective (IC50 = 0.69 and 0.44 μM, SI = 3 and 15, respectively), whereas BM2 was moderately active (IC50 = 3.88 μM) and not selective. BM8 and BM9, despite their absence of cytotoxicity against macrophages, were also moderately active against L. infantum (IC50 = 13.35 and 4.53 μM respectively). Compounds BM5-BM7, and the mixtures BM10 and BM11 did not show any leishmanicidal activities. This work highlights the interest of fungal endophytes as sources of new leishmanicidal compounds.

Ce projet vise à proposer des nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les infections parasitaires cutanéo-muqueuses qui représentent un problème de santé majeur. C’est notamment le cas de la Trichomonose urogénitale et la leishmaniose cutanée.Malheureusement, l’administration systémique de première intention par le métronidazole (MTZ) pour traiter la trichomonose urogéntitale occasionne des problèmes de résistances et des effets secondaires indésirables. Ainsi, nous avons développé de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant à la fois les mécanismes pharmacologiques et physiques de l’infection par Trichomonas vaginalis. Après avoir réussi à augmenter la solubilité apparente du MTZ dans l’eau en utilisant une beta-cyclodextrine méthylée, nous l’avons formulé dans un hydrogel thermosensible et mucoadhésif composé de pluronic® F127 et d’un biopolymère cationique et mucoadhésif, le chitosane. Cette formulation est spécifiquement adaptée à une application topique tout en offrant un contrôle de la libération du MTZ et une réduction de son passage systémique à travers la muqueuse vaginale. La viscosité élevée de l’hydrogel à température corporelle nous a conduit à étudier son effet sur la mobilité du protozoaire Trichomonas vaginalis. Il s’agit d’une stratégie physique d’immobilisation du parasite en parallèle à la chimiothérapie par le MTZ. Le suivi des trajectoires des parasites par vidéo-microscopie a montré la capacité de l’hydrogel seul ou en association avec le chitosane à immobiliser complètement T. vaginalis et à inhiber son attachement à la muqueuse. Ces évaluations ont été réalisées chez la souris. Cependant, le chitosane seul n’a pas permis d’immobilier les parasites et n’a pas montré une activité anti-T. vaginalis propre. Dans ce contexte, nous nous sommes inspirés des travaux antérieurs menés par notre équipe sur le développement de formulations à base de chitosane, et plus particulièrement des nanoparticules (NPs) composées de poly(isobutylcyanoacrylates) recouvertes de chitosane. Ces NPs ont une activité trichomonacide propre, même sans rajouter des substances actives, alors que des NPs sans chitosane étaient inactives. Nous avons étudié le mécanisme d’action et nous avons montré une meilleure internalisation des NPs lorsqu’elles étaient recouvertes de chitosane. Ces NPs ont provoqué des altérations morphologiques drastiques de la membrane du parasite. Cette activité pourrait être due en partie à l’interaction électrostatique entre la surface de T. vaginalis chargée négativement et les NPs recouvertes de chitosane cationique.Dans le but d’élargir le champ des applications de ces NPs à d’autres parasites, nous nous sommes intéressés à l’évaluation de leur effet anti-leishmanien vis-à-vis de Leishmania major. En effet, le chitosane connu pour ces propriétés cicatrisantes nous a paru particulièrement adapté pour cette pathologie. Nous avons ainsi montré in vitro et in vivo que les NPs recouvertes de chitosane avaient une activité anti-L. major propre, sans ajouter de substances actives. Dans un deuxième temps, nous avons décidé de nous orienter vers des particules de formes allongées et d’évaluer leur activité anti-leishmanienne. Ces particules appelées « plaquettes » sont constituées d’assemblages de chitosane hydrophobisé avec l’acide oléique et l’alpha-cyclodextrine dans l’eau. Cette stratégie nous a paru intéressante pour améliorer l’interaction des plaquettes avec la membrane de L. major, vue que ces parasites sont également de morphologie non-sphérique. Les résultats histologiques et immunohistochimiques des lésions cutanées ont montré une diminution significative du granulome inflammatoire et une réduction de la charge parasitaire par rapport à l'amphotéricine B seule utilisée comme référence.En conclusion, au cours de cette thèse, plusieurs formulations ont été développées et ont montré des efficacités biologiques en agissant sur des mécanismes pharmacologiques et/ou physiques des parasites. / This project aims at developing new therapeutic strategies against parasitic muco-cutaneous infections such as urogenital trichomonosis and cutaneous leishmaniasis which still represents a major health problem worldwide.Unfortunately, metronidazole (MTZ) is a first-line systemic treatment for urogenital trichomoniasis that causes resistance and side effects. We have thus developed new strategies by acting on both the pharmacological and the physical mechanisms of Trichomonas vaginalis infection. After a successfull increase of the apparent solubility of MTZ in water using a methylated -cyclodextrin, we formulated it in a thermosensitive and mucoadhesive hydrogel composed of pluronic® F127 and a cationic and mucoadhesive biopolymer, chitosan. This formulation is specifically adapted for topical application providing a control of MTZ release and reduction of its systemic passage through the vaginal mucosa.Then, the ability of the high viscosity hydrogel to immobilize T. vaginalis was investigated by video-microscopy. Monitoring the trajectories of each parasite by multiple particle tracking showed the ability of the hydrogel alone or in combination with chitosan to completely immobilize T. vaginalis and to inhibit parasite attachment to the mucosa. These evaluations were performed on mice experimental model. However, chitosan alone did not allow parasite immobilization and did not show any anti-T. vaginalis activity. In this context, we were inspired by previous works conducted by our team on the development of formulations based on chitosan, and more particularly nanoparticles (NPs) composed of poly(isobutylcyanoacrylates) coated with chitosan. These NPs have their own trichomonacidal activity, even without adding active substances, while NPs without chitosan were inactive. Investigated of the mechanism of the activity showed better internalization of NPs when coated with chitosan. These NPs caused drastic morphological alterations on the parasite membrane. This activity could be due to the electrostatic interaction between negatively charged T. vaginalis surface and cationic chitosan coated NPs.In order to broaden the applications of these NPs to other parasites, we were interested in evaluating the anti-L. major activity of NPs coated or not with chitosan. Indeed, chitosan known for its healing properties could be particularly adapted for this pathology. We thus showed in vitro and in vivo that NPs coated with chitosan had intrinsic anti-L. major activity without adding any drug. In a second step, we decided to design chitosan elongated particles and to evaluate their anti-leishmanial activity. These particles called "platelets" are composed of chitosan hydrophobically-modified with oleic acid and cyclodextrin in water. This strategy could be interesting to improve the interaction of platelets with the L. major membrane, as these parasites had also non-spherical morphology. The histological and immunohistochemical results of skin lesions showed a significant decrease in inflammatory granuloma and a reduction in parasitic load compared with amphotericin B alone, used as a reference.In conclusion, during this thesis, several formulations were developed and showed biological activities by acting on pharmacological and/or physical mechanisms of the parasites.

Orientador: Marcia Perez dos Santos Cabrera / Coorientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Léo Degrève / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: A leishmaniose é considerada uma das 14 doenças negligenciadas segundo a Organização Mundial da Saúde, afetando cerca de 500 milhões de pessoas que vivem nas zonas subtropicais e tropicais. É causada pela infecção do hospedeiro por protozoários da família Leishmania, podendo ser do tipo cutânea, muco-cutânea e visceral. As atuais formas de tratamento da doença são através de pentavalentes antimoniais e drogas como Anfotericina B, porém ambos causam sérios efeitos colaterais, e alguns estudos sugerem que o parasita vem apresentando resistência. Neste trabalho investigamos peptídeos antimicrobianos com conhecida ação leishmanicida buscando parâmetros estruturais que possam ser responsáveis pela eficiência contra Leishmania. Sete peptídeos foram escolhidos, sendo cinco extraídos de anfíbios: Bombinin H2 e H4 da espécie Bombina variegata, Temporin A e B da espécie Rana temporária, e o Phylloseptin-1 da espécie Phyllomedusa azurea. E dois peptídeos provenientes de vespa, Decoralin com e sem o terminal-C amidado, sendo que somente a forma sem amidação é natural e ocorre na vespa solitária Ouremenes decoratus. Os parâmetros estruturais dos peptídeos escolhidos foram pesquisados através da técnica computacional de Dinâmica Molecular, em uma caixa de solvente contendo TFE/água na proporção 30/70 (v:v). Foram encontrados alguns fatores que podem estar relacionados à maior eficiência de alguns peptídeos, dentre eles o comprimento e estabilidade da hélice-α, o volume dos peptídeos, a anfipaticidade, e a solvatação da cadeia principal e dos terminais. Baseados nessas características 14 novos peptídeos foram desenhados buscando reproduzir e aperfeiçoar as caracteríticas estruturais daqueles peptídeos de melhor eficiência biológica. Esses peptídeos foram estudados por Dinâmica Molecular seguindo as mesmas condições dos peptídeos de referência. Dentre esses novos peptídeos alguns apresentaram ... / Abstract: Leishmaniasis is considered one among 14 neglected diseases according to the World Health Organization, affecting about 500 million people that live in tropical and subtropical areas. The disease is caused by the infection of the host by a protozoan of the Leishmania family, and could be cutaneous, mucocutaneous or visceral. The current forms of treatment involve pentavalent antimonial drugs and others as amphotericin B; however, both cause serious side effects and some studies suggest that the parasite has already shown resistance. In this work, we investigate antimicrobial peptides with known leishmanicidal activity seeking structural parameters that could be correlated to their effectiveness against Leishmania. Seven peptides were chosen, five extracted from amphibian skins and secretions: Bombinin H2 and H4 from Bombina variegata, Temporin A and B from Rana temporaria, and Phylloseptin-1 from Phyllomedusa azurea. In addition, two peptides Decoralin with and without an amidated C-terminal, the natural form being the carboxylated, and occurring in the venom of the solitary wasp Ouremenes decoratus. The structural parameters of selected peptides were investigated by Molecular Dynamics, in a box containing the solvent TFE/water at 30/70 (v:v) concentration. Some features were found that may be related to the greater efficiency of these peptides. They include the length and stability of the α-helix, the volume of the peptides, the amphipathicity, and solvation of the backbone and terminals. Based on these features, 13 new peptides were designed to reproduce and enhance the structural features of those peptides with increased biological efficiency. The new peptides were studied by Molecular Dynamics following the same procedures used for the reference peptides. Among these new peptides some show optimized structural characteristics and will have their leishmanicidal activity determined / Mestre

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Resumo: A leishmaniose é uma doença antropozoonótica causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Ele apresenta três formas clínicas, conhecidas como leishmaniose visceral, leishmaniose cutânea e leishmaniose mucocutânea. A leishmaniose visceral afeta dois milhões de indivíduos anualmente no mundo. Os fato res genéticos envolvidos na interação hospedeiro - parasita foram associados ao desfecho clínico da doença. Este estudo investigou pela primeira vez a associação de polimorfismos nos genes candidatos IL10, NOD2 e TLR1 com leishmaniose visceral na população b rasileira. Para isso, escolhemos três marcadores anteriormente associados a infecções causadas por parasitas intracelulares na população brasileira. Nós genotipificamos 135 pacientes e 380 controles saudáveis. A presença do alelo G do rs4833095 no gene TLR 1 foi fortemente associada à susceptibilidade a esta doença: análise do alelo G (OR 2.04; IC 1.22 - 3.39; p - value 0.0061); Análise do genótipo GG (OR 3,87; 95 %IC 1,85 - 8,08, p - valor 0,0003); Análise de portadores de G (OR 2,5; 95 %IC 1,33 - 5,00; valor p 0,0047) . Para o gene NOD2, também encontramos uma associação para o genótipo AA (OR 2.07 95 %IC 1.05 - 4.05, p - value 0.0335) do polimorfismo rs8057341. Finalmente, poderíamos confirmar a associação do marcador rs1800871 na região promotora do gene IL10 com susceptib ilidade à leishmaniose visceral, para o genótipo TT (OR 2,34; CI 95 %IC 1,11 - 4,94 p - value 0,0245). Conclusão. Nossos dados demonstram pela primeira... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.