Leishmaniasis is a worldwide neglected disease with high impact among the underprivileged population, especially in developing countries. The therapeutic arsenal is limited, outdated and causes serious side effects and can even cause death. In addition, studies show that there is great resistance of the parasite to treatment. In this regard, 18 (4a - 4o) new dialkylphosphorylhydrazones compounds were synthesized and evaluated against the parasites Leishmania species. Initially, we evaluated the effect of these compounds against L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes in vitro. It was observed that all of compounds showed activity against these parasite, except 4a, 4c and 4e. In order to assess a potential toxicity against mammalian cells, MTT assay were performed in J774 macrophages treated with compounds. All The compounds showed low cytotoxicity with LC50 values >100 mM, except for 4o, which was toxic to approximately 20% of the treated cells. Using the EC50, Emax and cytotoxicity parameters, 4m and 4n compounds were chosen for the subsequent tests. These compounds were tested antiamastigote assay in vitro. In this test, the average of the number of parasites per macrophage, the percentage of infected macrophages and infection index of L. amazonensis-infected macrophages were reduced dose dependently by both compounds, similar to standard drug miltefosine. Since these compounds showed anti-leishmania activity in vitro, later it was tested 4m and 4n anti-leishmania effect in mouse model of cutaneous leishmaniasis, that mimics human disease. In this assay, the oral treatment with both compounds caused a complete healing of nodules and ulcers in L. amazonensis-infected mice ears, but the control of parasite burden at the inoculation site was reduced only in the case of treatment with 4n. On the other hand, none of two compounds interfered in systemic parasite burden, once they did not reduce parasite levels in draining lymph nodes. Thereafter, we also evaluate 4m and 4n effect in L. chagasi-induced visceral leishmaniasis in hamsters (Mesocricetus auratus). Firstly, in vitro assays against promastigotes and amastigotes form of L. chagasi were performed. Similar to observed previously, 4m and 4n were active against both L. chagasi forms. In addition, by scanning electron microscopy, it was observed that promastigotes treated with 4m compound presented multiple flagellae, aberrant shapes and multi-septation; while 4n treatment caused cell body shrinkage and multi-septation. In in vivo test, 15 days after oral treatment with 4m and 4n, it was evaluated the visceral organs weight (spleen and liver). Despite this treatment did not reduce organs weight, it reduced the parasite burden in spleen, which indicate oral effect of 4m and 4n against visceral leishmaniasis in mice. Also, it was observed that 4m and 4n treatment did not induce hepatotoxicity and nephrotoxicity, since they did not increase the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea and creatinine. Taken together, these data indicate that dialkylphosphorylhydrazones compounds are active against Leishmania species, mainly 4m and 4n compunds, which are orally active against cutaneous and visceral leishmanisis. This indicate that 4m and 4n could be new lead compounds therapeutically useful against leishmaniasis. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose é uma doença negligenciada mundialmente com alto impacto dentre a população menos favorecida, principalmente em países em desenvolvimento. O arsenal terapêutico é restrito, ultrapassado e provoca efeitos adversos graves, podendo causar até a morte. Além disso, estudos mostram que há grande resistência do parasita ao tratamento. Nesse sentido, foram racionalmente planejados e sintetizados 18 novos derivados dialquifosforilhidrazonas (4a - 4o) e avaliados contra espécies de Leishmania. Inicialmente, foi avaliado o efeito desses compostos contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis in vitro. Observou-se que todos os compostos apresentaram atividade contra esses parasitos, exceto os compostos 4a, 4c e 4e. Para avaliar a toxicidade destes compostos contra células de mamíferos, foi realizado o ensaio de MTT em macrófagos J774. Nesse ensaio nenhum derivado apresentou citotoxicidade na concentração avaliada (100 mM), exceto 4o, que foi tóxico para aproximadamente 20% das células tratadas. Em seguida, utilizando os parâmetros de CI50, Emax e citotoxicidade, foram escolhidos os compostos 4m e 4n para os testes subsequentes. Esses compostos foram avaliados in vitro no ensaio de amastigota. Nesse teste, a média do número de parasitas por macrófago, a porcentagem de macrófagos infectados e o índice de infecção dos macrófagos por L. amazonensis foram reduzidos de forma dependente de dose por ambos os compostos, semelhante ao fármaco padrão Miltefosina. Uma vez que estas moléculas apresentaram atividade leishmanicida in vitro, foi avaliado o efeito de 4m e 4n no modelo de leishmaniose cutânea em camundongos, que mimetiza a doença em humanos. O tratamento oral com ambos os compostos promoveu a cicatrização total de nódulos e úlceras nas orelhas de camundongos infectados com L. amazonensis, porém apenas o tratamento com 4n reduziu a carga parasitária no local do inóculo. Além disso, nenhum dos compostos interferiu na carga parasitária sistêmica, uma vez que eles não reduziram os níveis dos parasitas nos linfonodos drenantes. O efeito de 4m e 4n foi também avaliado contra L. chagasi, causadora da forma visceral da doença. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro contra as formas promastigotas e amastigotas de L. chagasi. Semelhante ao que foi observado anteriormente, 4m e 4n foram ativos contra ambas as formas de L. chagasi. Além disso, por meio de microscopia eletrônica de varredura, observou-se que as formas promastigotas tratadas com 4m apresentaram múltiplos flagelos, formas anômalas e múltiplos septos, enquanto o tratamento com 4n induziu uma redução do corpo celular das promastigotas e a formação de múltiplos septos. No modelo de leishmaniose visceral em hamsters (Mesocricetus auratus), 15 dias após os tratamentos, o peso dos órgãos viscerais (fígado e baço) foi avaliado. Embora esse tratamento não tenha reduzido o peso dos órgãos, reduziu a carga parasitária no baço, o que indica um efeito oral leishmanicida dos compostos 4m e 4n contra a forma visceral. Adicionalmente, foi observado que o tratamento com 4m e 4n não induziu hepatotoxicidade nem nefrotoxicidade, uma vez que os níveis de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), ureia e creatinina não estavam elevados após o tratamento. Em conjunto, esses dados indicam que os compostos dialquilfosforilhidrazonas são ativos contra espécies de Leishmania, principalmente os compostos 4m e 4n, que são foram ativos por via oral contra leishmaniose cutânea e visceral. Indicando que estes podem ser considerados novos protótipos para o tratamento da leishmaniose.

Os flebotomíneos são dípteros hematófagos pertencentes à família Psychodidae e subfamília Phlebotominae. Considerando o processo migratório da doença no Estado de São Paulo e a complexidade da relação parasito/vetor/hospedeiros da Leishmaniose é necessário realizar estudo sobre os aspectos ecológicos e epidemiológicos desta doença. A expansão da Leishmaniose no interior paulista está associada aos processos antrópicos e ao desequilíbrio ambiental. O município de Bom Jesus dos Perdões passa por um crescente processo de urbanização onde não é conhecida a fauna de flebotomíneos, bem como a pesquisa de parasitas do gênero Leishmania nestes vetores. O presente projeto teve por objetivo principal, a Identificação da fauna de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) e detecção molecular de parasitas do gênero Leishmania no Município de Bom Jesus dos perdões, Estado de São Paulo. Os flebotomíneos foram coletados com armadilha do tipo CDC e armadilha de Shannon, em 12 pontos em três diferentes ambientes, sendo áreas de mata, área Periurbana e áreas urbanas. A taxonomia alfa foi baseada na chave dicotômica descrita por Galati (2003) e o nome das espécies foram abreviado segundo Marcondes (2007). Para a pesquisa de parasitas do gênero Leishmania foram utilizados marcadores baseados nos genes SSU rDNA, citocromo e quitinase. No município de Bom Jesus dos Perdões foi registrada uma riqueza de 12 espécies de flebotomíneos distribuídos em duas Subtribos: Subtribo Lutzomyiina com Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Pintomyia monticola, Pintomyia misionensis, Evandromyia edwardsi e a Subtribo Psychodopygina com Psathyromyia lanei, Psathyromyia sp (série forattiniella), Martinsmyia alphabetica, Psychodopygus arthuri, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai e Nyssomyia whitmani. A análise molecular baseado no gene de quitinase identificou a espécie Leishmania (L.) infantum chagasi em Pi. fischeri, Mg. migonei e Ma. alphabetica e espécies de Leishmania sp. causadoras da doença na forma tegumentar em Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, Martinsmyia alphabetica, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai e Nyssomyia whitmani. Os resultados obtidos alertam para o aumento do risco de transmissão das Leishmanioses e aponta para uma maior importância das medidas de vigilância entomológica, da fiscalização do uso e ocupação do solo e de estudos mais detalhados sobre as espécies desses vetores e de sua relação com os reservatórios silvestres ou urbanos e a população vulnerável no município e região / Sand flies are bloodsucking Diptera belonging to the Psychodidae family and subfamily Phlebotominae. Considering the migration process of the disease in the state of São Paulo and the complexity of the relation parasite / vector / Leishmaniasis of hosts is necessary to conduct study on the ecological and epidemiological aspects of this disease. The expansion of Leishmaniasis in the interior is associated with anthropogenic processes and environmental imbalance. The municipality of Bom Jesus of Pardons goes through a growing process of urbanization which is not known to sandfly fauna as well as the search for parasites of the genus Leishmania in these vectors. This project has as main objective the identification of the sand fly fauna (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) and molecular detection of Leishmania species in the Municipality of Bom Jesus of Pardons, State of Sao Paulo. The sandflies were collected with CDC trap type and trap Shannon on 12 points in three different environments, and forested areas, peri-urban area and urban areas. Alpha taxonomy was based on the dichotomous key described by Galati (2003) and the name of the species were abbreviated according to Marcondes (2007). For the research of the genus Leishmania parasites were used based markers in genes SSU rDNA, cytochrome and chitinase. In the city of Bom Jesus of Pardons has recorded a wealth of 12 species of sand flies distributed into two sub-tribes: Subtribe Lutzomyiina with Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Pintomyia monticola, misionensis Pintomyia, Evandromyia edwardsi and Subtribe Psychodopygina with Psathyromyia lanei, Psathyromyia sp (series forattiniella) alphabetica Martinsmyia, Psychodopygus arthuri, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai and Nyssomyia whitmani. Molecular analysis based on the chitinase gene identified Leishmania (L.) infantum chagasi Pi. fischeri, Mg. migonei and Ma. alphabetica and species of Leishmania. causing disease in cutaneous leishmaniasis in Migonemyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, alphabetica Martinsmyia, Psychodopygus lloydi, Psychodopygus ayrozai and Nyssomyia whitmani. The results warn of the increased risk of transmission of Leishmaniasis and points to greater importance of entomological surveillance measures, surveillance of land use and occupation and more detailed studies of the species of these vectors and their relationship to the reservoirs wild or urban and the vulnerable population in the municipality and region

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jeamile Lima Bezerra.pdf: 337120 bytes, checksum: 7cc500c98107677b77cd4a396bdb645d (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / The Leishmaniose, infectum-parasitic illness caused by protozoans of the Leishmania sort, is still one of the biggest problems of public health affecting about 12 millions of people in 88 countries, with the 1-2 register million new cases annually. Of all the cases of LT, 90% occur in Brazil, Peru, Afghanistan, Algeria, Saudi Arabia, Syria e Anger. In Brazil, leishmaniose is one antropozoonose emergent had mainly to occured changes in the chain epidemiologist, including alterations in the reservoirs, vectors and hosts, in result of the social, economic and cultural conditions of the population. The Leishmaniose American Tegumentar (LTA) has been pointed in practically all the Brazilian states with gradual increase of cases, registering in recent years in the regions North, Northeast, Center-West and South.Isolated natural composites of plants had had and continue having a great one impact in supervened and the treatment of some diseases human beings. Moreover, the plants they are important substance sources, many of which if they constitute in raw materials or archetypes for synthesis of new remedies. / A Leishmaniose Tegumentar (LT), doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, é ainda um dos maiores problemas de saúde pública afetando cerca de 12 milhões de pessoas em 88 países, com o registro de 1-2 milhões de novos casos anualmente. De todos os casos de LT, 90% ocorrem no Brasil, Peru, Afeganistão, Algéria, Arábia Saudita, Síria e Irã. No Brasil, a leishmaniose é uma antropozoonose emergente devido principalmente às mudanças ocorridas na cadeia epidemiológica, incluindo alterações nos reservatórios, vetores e hospedeiros, em decorrência das condições sociais, econômicas e culturais da população. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) tem sido apontada em praticamente todos os estados brasileiros com aumento progressivo de casos nos últimos anos, registrando-se surtos nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste e Sul.Inúmeros compostos naturais isolados de plantas tiveram e continuam tendo um grande impacto na sobrevida e no tratamento de várias enfermidades humanas. Além disso, as plantas são importantes fontes de substâncias, muitas das quais se constituem em matérias-primas ou protótipos para síntese de novos fármacos.

A leishmaniose tegumentar é uma doença infecciosa, amplamente disseminada, sendo L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis, no Brasil, as espécies de maior importância médico-epidemiológica. Devido ao impacto epidemiológico da leishmaniose, medidas profiláticas devem ser desenvolvidas para o controle da doença, tal como vacinas. Portanto, o presente trabalho objetivou avaliar a imunogenicidade e potencial protetor de dois imunógenos denominados como ferro superóxido dismutase (FSD) e serino peptidase (SP). Os genes codificadores dos antígenos foram sintetizados e clonados no plasmídeo pVAX1 (pVAX1-FSD e pVAX1-SP). Camundongos BALB/c foram imunizados com ambos os alvos na concentração de 1,0 ug/uL, por três vezes, a intervalos regulares de 15 dias, e desafiados ou não com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os animais foram avaliados clínica, parasitológica e imunologicamente nos estudos de imunogenicidade e proteção. Os resultados obtidos demonstraram que ambas os imunógenos foram pouco imunogênicos, não apresentando alterações em linfócito T CD4; por outro lado, detectaram-se frequências diminuídas de linfócito TCD8 produtores de IFN-y e TNF-alfa. Entretanto, nos experimentos de desafio, verificou-se que os animais imunizados com pVAX1-FSD apresentaram uma resposta mista Th1 e Th2, devido ao aumento de linfócitos T produtores de IFN-y e IL-4, o que se associou a níveis altos de IgG1 e IgG2a, levando a uma diminuição da carga parasitária. O alvo pVAX1-SP também induziu resposta imunológica mista nos animais, todavia foi detectado frequências elevadas de linfócitos T CD8 produtores IL-10, e esta resposta foi associada a ausência de proteção nesses animais / American tegumentar leishmaniasis is an infectious disease, widespread, and in Brazil the species L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis are the most relevant in medical-epidemiological studies. Due to the epidemiological impact of leishmaniasis, prophylactic measures should be developed to control this disease, such as vaccines. Therefore, the present study aimed to evaluate the immunogenicity and the protective potential of two vaccine candidates known as iron superoxide dismutase (FSD) and serine peptidase (SP). FSD- and SP-coding genes were synthesized and cloned into plasmid pVAX1 (pVAX1-FSD and pVAX1-SP). BALB/c mice were immunized with both candidates at a concentration of 1.0 ug/uL, three times at intervals of 15 days and challenged or not with L. (L.) amazonensis promastigotes. Animals were evaluated clinically, immunologically and parasitologically in the studies of immunogenicity and protection. The results showed that both vaccines presented low immunogenicity, and after immunization BALB/c mice did not show significant changes in CD4 T lymphocytes, by the other side, the frequency of IFN-y and TNF-alfa producing cells were low. However, after challenge pVAX1-FSD-immunized mice presented a mixed Th1 and Th2 immune response, due to the high frequencies of IFN-ye IL-4-producing T lymphocytes, with association to high levels of IgG1 and IgG2a isotypes, leading to parasite burden decreasing. pVAX1-SP vaccine candidate also induced mixed immune response in animals, however high frequencies of IL-10-producing CD8 T lymphocytes was found, justifying the absence of protection in these animals

Visceral leishmaniasis is endemic in many Brazilian states, including Sergipe. Through a cross-sectional study done with relatives of patients with visceral leishmaniasis, we determined the frequency of asymptomatic infection by Leishmania chagasi using Montenegro skin test and/or Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Questionnaire containing socio-demographic data, presence of signs and symptoms, physical examination of 109 subjects were analyzed. Environmental factors such as the presence of dog, chicken and wood in the residence were also investigated. Finally, the levels of cytokines Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Transforming Growth Factor (TGF)-β and Interleukin (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-10 and IL-12 were measured in 59 of these individuals. The frequency of positivity was detected in 51.8% of participants, being higher in males (61.9%). Positive testes were also more common in people over 14 years (79.7%). All positive individuals were considered asymptomatic and did not return to the hospital with complaints until the end of the study, suggesting that did not progress to other clinical forms. There was no difference between the origin: capital or the state, but more positive cases occurred at the capital, confirming the growing urbanization of the disease. Environmental factors was statistically significant when analyzed presence of dog and waste wood together (p <0.05). TGF-β showed a significant difference in favor of the negative individuals (p = 0.002), while IL-10 and IL-12 were higher in people with positive tests (p = 0.024 and 0.038). Control measures should be aimed to the population of our state, who is highly exposed to the parasite. / A leishmaniose visceral é uma doença que possui amplo espectro clínico, variando desde infecção clássica a formas subclínica e assintomática. Através de um estudo transversal feito com familiares de pacientes com leishmaniose visceral, determinamos a frequência de infecção assintomática por Leishmania infantum chagasi, utilizando Intradermorreação de Montenegro e/ou sorologia por Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Questionário contendo dados sócio-demográficos, presença de sinais e sintomas, exame físico de 109 indivíduos foram analisados. Fatores ambientais como presença de cachorro, galinheiro e restos de madeira no domicílio também foram investigados. Níveis do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α), Fator de Transformação do Crescimento (TGF-β) e as interleucinas IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12 foram dosados em 59 destes indivíduos. A frequência de positivos foi detectada em 51,8% dos participantes, sendo maior no sexo masculino (61,9%). Testes com resultado positivo também foram mais frequentes em pessoas acima de 14 anos (79,7%). Todos os indivíduos positivos foram considerados assintomáticos e não retornaram ao serviço de saúde com queixas até o final da pesquisa, sugerindo que não evoluíram para outras formas clínicas. Não houve diferença entre o local de moradia: capital ou interior do Estado, porém mais casos positivos ocorreram na capital, confirmado a crescente urbanização da doença. Dentre os fatores ambientais ocorreu significância estatística quando analisamos presença de cachorro juntamente com restos de madeira (p<0,05). TGF-β mostrou diferença significativa em favor dos negativos (p=0,002), enquanto IL-10 e IL-12 foram maiores nos indivíduos com testes positivos (p= 0,024 e 0,038). Diante dos achados, verificamos que medidas de controle da disseminação da leishmania devem ser efetivadas e direcionadas à população do nosso Estado, uma vez que a exposição ao parasita ainda é muito alta, colocando-a em risco de desenvolver a doença.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia. / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia.

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.

Leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e se apresentam sob forma tegumentar ou visceral. No Brasil, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada, na sua maioria, por Leishmania (Viannia) braziliensis e conhecem-se principalmente as formas cutânea (LC), mucosa (LM) e disseminada (LD) da doença. Na LTA as formas clínicas tem sido atribuídas a diferenças na resposta imune do hospedeiro, mas recentemente vinculam-se também à variabilidade intraespecífica da L. (V.) braziliensis. Neste estudo avaliamos se haveria variabilidade biológica nos isolados de L. (V.) braziliensis, provenientes de pacientes com LC, LM e LD, principalmente em resposta a fator de crescimento insulina-símile-I (IGF-I). Os fatores de crescimento do hospedeiro tem sido alvo de estudos no desenvolvimento das leishmanioses, sendo IGF-I um deles. Havíamos demonstrado em estudos anteriores, utilizando Leishmania (Leishmania) amazonensis, que IGF-I induz proliferação, aumentando a atividade da arginase, com geração de poliaminas e diminuindo a síntese de óxido nítrico. No presente estudo analisamos o efeito de IGF-I em L.(V.) braziliensis, espécie prevalente no Brasil. Avaliamos inicialmente as características dos diferentes isolados enquanto promastigota e no prosseguimento enquanto amastigota em células de linhagem monocítica humana THP-1, com e sem estímulo de IGF-I. Nossos dados sugerem que há diferenças na atividade da arginase basal entre os isolados de L. (V.) braziliensis, sendo maior naqueles provenientes de pacientes com LM. IGF-I aumentou a atividade da arginase nos isolados de LC e LD, mas não de LM. Nos isolados em forma amastigota nas células de linhagem monocítica humana THP-1, o efeito de IGF-I foi de aumento do parasitismo nos isolados de LC e LM e de diminuição com os de LD. Nos isolados de LD a atividade da arginase basal foi menor que nos de LC. Por outro lado, a produção de óxido nítrico tendeu a ser maior em isolados de LD quando sob estímulo de IGF-I. Os dados sugerem que diferenças nas características biológicas dos parasitos podem contribuir na apresentação clínica dos casos da LTA. / Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania that may manifest as cutaneous or visceral disease. In Brazil, American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused mostly by Leishmania (Viannia) braziliensis and cutaneous (CL), mucosal (ML) and disseminated (DL) forms of the disease are known.The diversity of clinical manifestations has been attributed to differences in the host immune response, but recently it has also been related to intraspecific variability of L. (V.) braziliensis. In the present study we evaluated whether there were biological variability in different isolates of L. (V.) braziliensis from patients with CL, ML, and DL, mainly in response to insulin-like growth factor-I (IGF-I). Growth factors of the host have been investigated in the development of leishmaniasis including IGF-I. In previous studies using Leishmania (Leishmania) amazonensis IGF-I was shown to induce proliferation, to increase the activity of arginase, generating polyamines and to decrease the synthesis of nitric oxide. In this study we analyzed the effect of IGF-I in L. (V.) braziliensis, a species prevalent in Brazil. Initially we evaluated the characteristics of individual isolates as promastigote and further as amastigote within human macrophage cell line THP-1 with and without IGF-I stimulation. Our data suggest that there are differences in the basal arginase activity amongst isolates of L. (V.) braziliensis, being higher in those from patients with ML. IGF-I increased the activity of arginase in the isolates of CL and DL, but not of ML. In isolates in the form of amastigotes within THP-1 cells, IGF-I induced the increase of parasitism of isolates from CL and ML, and decrease of those from DL. In isolates of DL the basal arginase activity was lower than in those of CL. Moreover, the production of nitric oxide tended to be higher with isolates of DL upon IGF-I stimulation. The data suggest that differences in the biological characteristics of parasites may contribute to the diversity of clinical presentation of ATL.

Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral, a AIDS aumenta o risco de aparecimento desta doença de cem a mil vezes. Conhecem-se muitos estudos sobre leishmaniose visceral (LV) em HIV/AIDS no Mediterrâneo, mas, pouco sobre leishmaniose tegumentar (LT) em HIV/AIDS. No Brasil não se constatou, até o momento, um aumento de casos de co-infecção HIV-Leishmania, mas, isto pode ser conseqüente ao subdiagnóstico por várias causas incluindo o não conhecimento da apresentação clínica nesses casos. Pela prevalência maior da LT em relação à LV no Brasil, é de se supor que ocorram com freqüência casos de co-infecção com a forma tegumentar de leishmaniose no nosso meio. Como no Brasil não dispomos de estudos de descrição sistemática da apresentação clínica nos casos de co-infecção, um parâmetro importante visando o diagnóstico, realizou-se um estudo transversal e descritivo, durante um período de dois anos a partir de fevereiro de 2002, em dois centros de tratamento de doenças infecciosas em São Paulo. Partimos de uma população alvo de 113 pacientes com sorologia positiva para HIV, procedentes de área endêmica para leishmanioses, 69 com algum sintoma sugestivo de leishmaniose visceral ou tegumentar e 44 assintomáticos. Em dez pacientes foi diagnosticada leishmaniose por encontro de parasitos ou antígeno de Leishmania em tecidos, maioria (8/10) por busca ativa, sendo cinco casos de LV e cinco de LT. Baseados nesses casos, observamos que, o contato com área endêmica de leishmaniose mesmo por um período curto como duas semanas deva ser valorizado, principalmente se foi recente. Houve dificuldade no encontro de casos porque a leishmaniose não é considerado como diagnóstico diferencial de infecções intercorrentes nos casos de HIV/AIDS no nosso meio, houve presença concomitante de outras doenças oportunistas mais prevalentes e manifestações clínicas atípicas ou semelhantes a infecções oportunistas. xvi Os casos de LV apresentaram manifestações clássicas, enquanto que os casos de LT apresentaram lesões diversas, desde úlcera única até lesões múltiplas e polimórficas (placas infiltrativas, pápulas, nódulos, máculas), com tendência à disseminação atingindo mucosa e pele, incluindo área genital (em quatro dos cinco pacientes com LT). Em dois pacientes observaram-se aparecimento de lesões (num caso) e piora (noutro caso), após início da terapia antirretroviral altamente efetiva (HAART), com características sugestivas de síndrome inflamatória de recuperação imune. Quanto à classificação de HIV segundo CDC, oito pacientes eram C3 e dois B3 e todos apresentavam contagem de linfócitos T CD4+ menor que 200 células/?l. A sorologia para leishmaniose foi positiva em todos os casos de LV mas, positiva em três dos cinco casos de LT. O teste de Montenegro foi negativo nos dois casos de LV onde o teste foi realizado e positivo em todos os três pacientes de LT submetidos ao teste. No tratamento da leishmaniose, freqüentemente os pacientes apresentaram efeitos adversos aos medicamentos e obervou-se mortalidade alta (40%) e freqüência alta de recidiva nos pacientes sobreviventes (100% dos LT e 66% dos LV) / In endemic areas of visceral leishmaniasis (VL), AIDS increases the risk for VL in 100 to 1000 times. There are many studies on VL in HIV/AIDS patients from the Mediterranean basin but data on tegumentary leishmaniasis (TL) are scarce. In Brazil, no increase in the number of cases of HIV/Leishmania co-infection was reported so far, but it may be due to subdiagnosis owing to various reasons including ignorance on clinical features of the co-infected patients.. Since the prevalence of TL is greater than VL in Brazil, we presume that cutaneous or mucosal leishmaniasis would be frequent in cases of coinfection in our country. Since there are no studies on systematic description of clinical manifestations of HIV/Leishmania co-infection in Brazil, an important basis for diagnosis, study was done for a period of two years from February 2002 aiming description of clinical manifestations in a transversal study in two infectious disease reference centers in Sao Paulo city, Brazil. The target population was constituted by 113 HIV positive patients that reported some kind of contact with endemic area for leishmaniasis, 69 being with some symptoms suggestive of visceral or tegumentary leishmaniasis, and 44 asymptomatic. In ten patients diagnosis of leishmaniasis was established by the detection of amatigotes or Leishmania antigens in tissue samples, five presented VL and five TL. Eight of 10 were found by active search. Based in these cases, we noted that contact with endemic area, even for short time like two weeks has to be considered in the diagnosis, mainly if it occurred recently. The search for these cases were difficult because leishmaniasis is not considered within differential diagnosis ofopportunistic infections in HIV positive patients among physicians, and in addition more prevalent opportunistic infections were concomitantly present and the clinical features were atypical for leishmaniasis or similar to other opportunistic infections. Clinical manifestation of VL was classic, while that of TL was quite variable, ranging from single to multiple ulcers, with polimorphic xviii presentations (papules, nodules, infiltrative plaques, macules) that tended to disseminate to the other areas of skin and mucosa, including genital area (in four from five TL patients). In two patients appearance of lesions (in one case) and worsening of tegumentary manifestations (in another case) after introduction of highly active anti-retroviral therapy (HAART) were observed that were suggestive of the so called immune reconstitution inflammatory syndrome. Concerning CDC classification of HIV, eight patients were C3 and two B3, and all presented CD4+ T cell count lower than 200/?l. All the VL patients had anti-Leishmania antibody test positive, however in TL three of five cases of was positive. Leishmanin skin (Montenegro) test was negative in two cases of VL submitted to this test, and positive in all three TL patients evalued. Frequent toxicity and adverse events with treatments were observed, as well as high mortality (40%), and high frequency of relapses among survivors (100% of TL and 66% of VL cases)

Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral, a AIDS aumenta o risco de aparecimento desta doença de cem a mil vezes. Conhecem-se muitos estudos sobre leishmaniose visceral (LV) em HIV/AIDS no Mediterrâneo, mas, pouco sobre leishmaniose tegumentar (LT) em HIV/AIDS. No Brasil não se constatou, até o momento, um aumento de casos de co-infecção HIV-Leishmania, mas, isto pode ser conseqüente ao subdiagnóstico por várias causas incluindo o não conhecimento da apresentação clínica nesses casos. Pela prevalência maior da LT em relação à LV no Brasil, é de se supor que ocorram com freqüência casos de co-infecção com a forma tegumentar de leishmaniose no nosso meio. Como no Brasil não dispomos de estudos de descrição sistemática da apresentação clínica nos casos de co-infecção, um parâmetro importante visando o diagnóstico, realizou-se um estudo transversal e descritivo, durante um período de dois anos a partir de fevereiro de 2002, em dois centros de tratamento de doenças infecciosas em São Paulo. Partimos de uma população alvo de 113 pacientes com sorologia positiva para HIV, procedentes de área endêmica para leishmanioses, 69 com algum sintoma sugestivo de leishmaniose visceral ou tegumentar e 44 assintomáticos. Em dez pacientes foi diagnosticada leishmaniose por encontro de parasitos ou antígeno de Leishmania em tecidos, maioria (8/10) por busca ativa, sendo cinco casos de LV e cinco de LT. Baseados nesses casos, observamos que, o contato com área endêmica de leishmaniose mesmo por um período curto como duas semanas deva ser valorizado, principalmente se foi recente. Houve dificuldade no encontro de casos porque a leishmaniose não é considerado como diagnóstico diferencial de infecções intercorrentes nos casos de HIV/AIDS no nosso meio, houve presença concomitante de outras doenças oportunistas mais prevalentes e manifestações clínicas atípicas ou semelhantes a infecções oportunistas. xvi Os casos de LV apresentaram manifestações clássicas, enquanto que os casos de LT apresentaram lesões diversas, desde úlcera única até lesões múltiplas e polimórficas (placas infiltrativas, pápulas, nódulos, máculas), com tendência à disseminação atingindo mucosa e pele, incluindo área genital (em quatro dos cinco pacientes com LT). Em dois pacientes observaram-se aparecimento de lesões (num caso) e piora (noutro caso), após início da terapia antirretroviral altamente efetiva (HAART), com características sugestivas de síndrome inflamatória de recuperação imune. Quanto à classificação de HIV segundo CDC, oito pacientes eram C3 e dois B3 e todos apresentavam contagem de linfócitos T CD4+ menor que 200 células/?l. A sorologia para leishmaniose foi positiva em todos os casos de LV mas, positiva em três dos cinco casos de LT. O teste de Montenegro foi negativo nos dois casos de LV onde o teste foi realizado e positivo em todos os três pacientes de LT submetidos ao teste. No tratamento da leishmaniose, freqüentemente os pacientes apresentaram efeitos adversos aos medicamentos e obervou-se mortalidade alta (40%) e freqüência alta de recidiva nos pacientes sobreviventes (100% dos LT e 66% dos LV) / In endemic areas of visceral leishmaniasis (VL), AIDS increases the risk for VL in 100 to 1000 times. There are many studies on VL in HIV/AIDS patients from the Mediterranean basin but data on tegumentary leishmaniasis (TL) are scarce. In Brazil, no increase in the number of cases of HIV/Leishmania co-infection was reported so far, but it may be due to subdiagnosis owing to various reasons including ignorance on clinical features of the co-infected patients.. Since the prevalence of TL is greater than VL in Brazil, we presume that cutaneous or mucosal leishmaniasis would be frequent in cases of coinfection in our country. Since there are no studies on systematic description of clinical manifestations of HIV/Leishmania co-infection in Brazil, an important basis for diagnosis, study was done for a period of two years from February 2002 aiming description of clinical manifestations in a transversal study in two infectious disease reference centers in Sao Paulo city, Brazil. The target population was constituted by 113 HIV positive patients that reported some kind of contact with endemic area for leishmaniasis, 69 being with some symptoms suggestive of visceral or tegumentary leishmaniasis, and 44 asymptomatic. In ten patients diagnosis of leishmaniasis was established by the detection of amatigotes or Leishmania antigens in tissue samples, five presented VL and five TL. Eight of 10 were found by active search. Based in these cases, we noted that contact with endemic area, even for short time like two weeks has to be considered in the diagnosis, mainly if it occurred recently. The search for these cases were difficult because leishmaniasis is not considered within differential diagnosis ofopportunistic infections in HIV positive patients among physicians, and in addition more prevalent opportunistic infections were concomitantly present and the clinical features were atypical for leishmaniasis or similar to other opportunistic infections. Clinical manifestation of VL was classic, while that of TL was quite variable, ranging from single to multiple ulcers, with polimorphic xviii presentations (papules, nodules, infiltrative plaques, macules) that tended to disseminate to the other areas of skin and mucosa, including genital area (in four from five TL patients). In two patients appearance of lesions (in one case) and worsening of tegumentary manifestations (in another case) after introduction of highly active anti-retroviral therapy (HAART) were observed that were suggestive of the so called immune reconstitution inflammatory syndrome. Concerning CDC classification of HIV, eight patients were C3 and two B3, and all presented CD4+ T cell count lower than 200/?l. All the VL patients had anti-Leishmania antibody test positive, however in TL three of five cases of was positive. Leishmanin skin (Montenegro) test was negative in two cases of VL submitted to this test, and positive in all three TL patients evalued. Frequent toxicity and adverse events with treatments were observed, as well as high mortality (40%), and high frequency of relapses among survivors (100% of TL and 66% of VL cases)