Orientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose negligenciada e emergente na Região Sudeste do Brasil. Sua alta letalidade e as dificuldades para prevenção e controle fazem da LV um grave problema de saúde pública. Nós realizamos um estudo em casuística de um hospital de referência no município de Bauru, São Paulo. Foram realizadas: (I) descrição do quadro clínico e laboratorial; (II) estudo de preditores de óbito, recidiva e aquisição de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS, anteriormente denominadas “infecções hospitalares”); (III) análise de preditores de incidência de LV e da coinfecção LV-HIV em setores censitários de Bauru. A coorte de base deste estudo foi composta de 683 sujeitos. O quadro clínico típico, com febre e hepatoesplenomegalia, foi mais frequente em monoinfectados que na coinfecção. Os preditores de óbito foram a idade e a soropositividade para HIV, sendo esta última também associada à recidiva. A carga de comorbidades e a inserção de cateteres venosos centrais foram fatores associados à aquisição de IRAS. Por fim, na análise espacial, observou-se maior incidência de LV e coinfecção LV-HIV em áreas periféricas de baixa renda e com urbanização precária. / Abstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is a neglected and emerging zoonosis in the Southeastern Region of Brazil. Its high lethality and the difficulties for prevention and control make VL a serious public health problem. We studied VL cases attending a referral hospital in the city of Bauru, São Paulo State, Brazil. The following analyses were performed: (I) description of clinical and laboratory conditions; (II) study of predictors of death, recurrence and acquisition of healthcareassociated infections (HAIs, formerly referred to as "nosocomial infections"); (III) analysis of predictors of VL incidence and VL-HIV coinfection in Bauru census sectors. The baseline cohort of this study was composed of 683 subjects. The typical clinical picture, with fever and hepatosplenomegaly, was more frequent in monoinfected subjects than in coinfection. The predictors of death were age and HIV seropositivity, the latter being also associated with relapse. The burden of comorbidities and the insertion of central venous catheters were factors associated with the acquisition of HAIs. Finally, in the spatial analysis, we found higher incidence of VL and VL-HIV co-infection in peripheral areas of low income and with precarious urbanization. / Doutor

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-12-21T14:48:29Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Eliane Pereira Menezes.pdf: 18598624 bytes, checksum: e2cc868d4bb1be2b815801b4f4db02b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-21T14:48:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Eliane Pereira Menezes.pdf: 18598624 bytes, checksum: e2cc868d4bb1be2b815801b4f4db02b8 (MD5) / Estudos mais recentes mostraram uma complexidade da resposta imune e diferentes tipos celulares estão envolvidos na imunoregulação de diversas doenças, incluindo a leishmaniose. Sendo assim, o tipo de resposta imune do hospedeiro infectado é determinado pelo padrão de citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+. A resposta imune Th1 é principalmente representada pela produção de INF-y, IL-2, TNF- e corresponde a denominada imunidade celular que auxilia a resposta efetora de outros linfócitos T CD4+, T CD8+ citotóxicos e macrófagos. A resposta imune Th2 está relacionada com a produção de IL-4, IL-5 e IL-10 e estimulação de linfócitos B na síntese de anticorpos IgG1, IgG4 e IgE, ativação de eosinófilos e mastócitos. As células T regulatórias suprimem ambos os tipos de resposta através de contato celular e pela produção de citocinas como IL-10 e TGF-b. Diversos estudos têm demonstrado uma influência genética em muitas doenças complexas, usando escaneamento de genoma e estudos de associação. Inicialmente diversos estudos mostraram associação entre doenças infecciosas, incluindo a leishmaniose e HLA. Posteriormente, a observação de polimorfismos genéticos em genes de citocinas, quimiocinas, receptores celulares, fatores de transcrição e diversos produtos que influenciam direta ou indiretamente a resposta imune, gerou diversos estudos associando esses polimorfismos com doenças. Por exemplo, um polimorfismo na posição -308, com mutação de G por A, no gene de TNF- , foi demonstrado que induzia a produção de níveis mais elevados dessa citocina e tem sido associado com várias doenças, incluindo leishmaniose cutânea (LC), mucosa (LM) e visceral (LV). No presente trabalho, avaliamos alguns polimorfismos funcionais em genes que codificam produtos relacionados à resposta imune com o objetivo de investigar se fatores genéticos relacionados com o controle da resposta imune influenciam o curso da infecção por Leishmania. Dois tipos de análises foram realizados: 1) Um estudo tipo caso-controle com objetivo de comparar as freqüências alélicas dos genes de IL- 6, linfotoxina- e MCP-1 em quatro grupos de 60 indivíduos cada: LM, LC, controle de vizinhança sem doença (“aparentemente normal”) (CN) e controle DTH+; 2) Um estudo baseado em família (FBAT) para confirmar as associações encontradas no estudo caso-controle. O estudo caso-controle demonstrou: 1) Alta freqüência do alelo C de IL-6 -174 G/C em LM quando comparado com LC e CN. A análise de FBAT confirmou a associação entre o alelo C e LM tanto no modelo aditivo (z=4.295, p=0.000017) como no modelo dominante (z=4.325, p=0.000015); 2) Uma freqüência alta do alelo G de linfotoxina- +252 G/A em LM quando comparado com LC, não sendo essa associação confirmada pelo estudo de famílias: 3) Uma freqüência alta do alelo G de CCL2/MCP-1 -2518 A/G em LM quando comparado com CN (OR=2.3; p=0.0078; 95% CI 1.3-4.1). O teste de FBAT confirmou a associação do alelo G de MCP-1 com LM no modelo recessivo (z=2.69, p=0.007). Esse estudo demonstrou uma associação entre os polimorfismos de genes que induzem a resposta inflamatória com a LM, sugerindo que eles podem influenciar o curso clínico da leishmaniose. Esta tese inclui 3 artigos originais e um capítulo de livro.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-28T13:18:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ChristianeCostaPereira.pdf: 812471 bytes, checksum: a060b7309392afdca00cecb47969c8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-28T13:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ChristianeCostaPereira.pdf: 812471 bytes, checksum: a060b7309392afdca00cecb47969c8a5 (MD5) Previous issue date: 2013 / A leishmaniose visceral é endêmica em muitas regiões do Brasil e é uma importante doença infecto-parasitária causada por protozoários. Além dos seres humanos, os cães também são seriamente acometidos e, no meio urbano, são considerados os principais reservatórios da doença. Esta espécie animal caracteriza-se como fonte de transmissão eficaz por coabitar com as pessoas e, muitas vezes, apresentar altas taxas de infecção sem ter um quadro clínico aparente. A atual estratégia para o controle desta doença é baseada na eliminação de cães soropositivos, tratamento sistemático dos casos humanos e o controle vetorial. Embora a eutanásia do cão seja a principal estratégia de controle da doença, não é amplamente aceita, especialmente por parte dos proprietários. Contudo, as estratégias terapêuticas mais estudadas em cães não conseguiram alcançar a cura parasitológica consistente em CVL. Neste contexto, o desenvolvimento de uma vacina protetora contra CVL poderia ser uma ferramenta promissora para o controle de CVL e consequentemente para Leishmaniose visceral humana. Normalmente, há um consenso de que o microambiente citocina desempenha um papel central no resultado da patogênese da leishmaniose. O principal mecanismo efetor envolvido na resposta imunoprotetora em cães infectados com Leishmania é a ativação dos macrófagos pelo IFN-γ, levando-o a eliminar a forma amastigota intracelular mediada pela produção de óxido nítrico. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o perfil de citocinas em cães, e m diferentes tempos pós vacinação com Leishmune ®, após estímulo in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi. Empregamos citometria de fluxo e ELISA para análise da produção de citocinas intracelular e secretadas, respectivamente. Os nossos resultados mostraram que a Leishmune ® foi capaz de induzir um aumento do nível de produção de IL-8 e IFN−γ, IL-17a e TNF- α e redução de IL-10 no primeiro e sexto mês após a vacinação, e também redução de IL-4 seis meses após vacinação. No grupo de cães com um ano a pós vacinação, não foi encontrada nenhuma alteração significativa em relação ao perfil de citocinas do grupo de cães não vacinados. As alterações imunológicas acima citadas , levam-nos a acreditar que o processo vacinal promove o desenvolvimento de um perfil de resposta imune celular capaz de induzir imunoproteção aos cães vacinados, ou seja, o animal desenvolve mecanismos imunobiológicos supostamente efetivos contra infecção. Portanto, fica claro que estas alterações permanecem até 6 meses, sendo que após 1 ano da vacinação os animais retornam à um perfil de biomarcadores basal, o que sugere a necessidade do reforço vacinal neste período ou até mesmo anterior a ele / Visceral leishmaniasis is endemic in many regions of Brazil, and it is an important infectious disease caused by protozoan. Apart from humans, dog s are also seriously affected and, in urban areas, are considered the main reservoir of the disease. This species is characterized as a source of transmission for effective cohabit with people and often exhibit high rates of infection without having a seeming clinical condition. The current strategy for the control of this disease is based on the elimination of seropositive dogs, systematic human cases treatment and vector control. Although dog euthanas ia is the main strategy to control the disease, it is not widely accepted, especially by the owners. However, the most often therapeutic strategies studied in dogs had failed t o achieve a consistent parasitological cure in CVL. In this context, the development of a protective vaccine against CVL could be a promising tool for the control of CVL and consequently for human visceral leishmaniasis. Typically, there is a consensus that the cytokine microenvironment performs a central role in the outcome of the pathogenesis of leishmaniasis. The major effector mechanism involved inLeishmania immunoprotective response on infected do gs is the activation of macrophages by IFN-y, leading to destroy the intracellular amastigote form mediated by the production of nitric oxide. The aim of our study was to evaluate the cytokine profile in dogs at different Leishmune ® vaccination times, after in vitro stimulation with soluble antigen of Leishmania chagasi. We had used flow cytometry and ELISA method to an alysis the cytokine production. Our results showed that Leishmune® was capable of the induction of increasing IL-8, IFN-γ,IL-17a and TNF-α production levels in the first and sixth months after vaccination, also IL-10 reduction rates in first and sixth month after vaccination and decreased IL-4 rates only six months after the vaccination. In the “T12 time” group of dogs, one year after vaccination, we did not find any significant difference in the cyto kine profile for the group of non-vaccinated dogs group. The immunobiological changes aforementioned lead us to believe the immunization process promotes the development of a cellular immune response profile capable of inducing immunoprotection on vaccinated dogs. Therefore, it is clear that those changes remain up to 6 months whereas after 1 year after the vaccination the animal returns to a baseline profile of biomarkers, which suggests the necessity of the strengthen the vaccine either at this time or even before

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-06-14T13:30:19Z No. of bitstreams: 1 Marcela de Lima Moreira-Duração da imunidade vacinal na Leishmaniose visceral canina- perfil fenotípico e funcional da atividade fagocítica anti Leishmania chagasi- 2013.pdf: 1972625 bytes, checksum: 20bef25e1a3fb4e90b4e04090bdb1adf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-14T13:30:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcela de Lima Moreira-Duração da imunidade vacinal na Leishmaniose visceral canina- perfil fenotípico e funcional da atividade fagocítica anti Leishmania chagasi- 2013.pdf: 1972625 bytes, checksum: 20bef25e1a3fb4e90b4e04090bdb1adf (MD5) Previous issue date: 2013 / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença que nas Américas, possui a Leishmania chagasi como agente etiológico, sendo transmitida através da picada de flebotomíneos e tem como principais hospedeiros membros da família Canidae. Por esta razão a eutanásia de cães soropositivos é recomendada no Brasil como estratégia de controle da doença, sendo a eficácia desta medida muitas vezes contestada. Desta forma, o uso de uma vacina efetiva na proteção contra leishmaniose visceral canina (LVC) poderá ser a melhor ferramenta de controle, capaz de reduzir o número de animais infectados e consequentemente a oferta de parasitos aos vetores, reduzindo assim o número de casos de LV. A primeira vacina contra a LVC licenciada e disponível comercialmente no Brasil é a Leishmune ®, uma vacina de segunda geração constituída da fração fucose manose ligante (FML) de Leishmania donovani, acrescida de saponina como adjuvante. Sua formulação demonstrou segurança e alta imunogenicidade para cães, mas poucos estudos a respeito da duração da imunidade foram realizados até o momento.Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi investigar, nos intervalos de um, seis e doze meses após a intervenção vacinal com a Leishmune®, alterações de alguns eventos imunológicos relacionados a imunoproteção como: atividade fagocítica, produção de óxido nítrico e os aspectos fenotípicos e funcionais em células do sangue periférico dos animais. Nossos dados demonstraram que Leishmune® foi capaz de induzir aumento da atividade fagocítica em monócitos, e que este aumento apresentou correlação com a produção de óxido nítrico, atingindo pico de atividade funcional seis meses após a vacinação. Em neutrófilos, foi observado também aumento da capacidade fagocítica. A busca de fatores que possivelmente poderiam estar auxiliando o aumento da atividade fagocítica induzido pela vacinação, mostrou que os animais vacinados apresentavam aumento dos níveis de IgG anti-promastigotas de Leishmania chagasium e seis meses após a vacinação, acompanhado do aumento de expressão de receptor de FC(CD32) por monócitos. Além disso, aumentos na expressão de TLR2 e TLR4 foram correlacionados positivamente com atividade fagocítica e TLR5 e TLR9 estiveram correlacionados ao aumento de produção de óxido nítrico em monócitos. Aumento de expressão de moléculas ativadora (MHC II) e coativadora (CD80) também foram observados em monócitos um mês após a vacinação. A vacinação induziu,ainda, inibição da produção de IL-4 um e seis meses após a vacinação e aumento duradouro da produção de IL-8 por monócitos, acompanhados do aumento da produção de IFN-um e seis meses após a vacinação e da produção de IL-17a um mês após a vacinação por linfócitos T totais. Os resultados observados, leva-nos a acreditar que a vacinação com Leishmune® é capaz de induzir alterações na resposta imune mediada pela interação de imunidades inata e adaptativa, com impacto em propriedades funcionais de monócitos, consistentes com mecanismos potencialmente leishmanicidas que podem participar na imunidade protetora contra LVC. Além disso, os resultados indicam a necessidade de revacinação dos animais antes de doze meses após a primeira dose da vacina, conforme recomendado pelo fabricante. / Viceral Leishmaniasis (LV), a severe disease caused by Leishmania chagasi, is transmitted by the bite of phlebotimine sandflies and it hasthe main reservoir hosts wild canine and domestic dogs. For this reason, the elimination of seropositive dogs is recommended in Brazil as the current strategy for managing the disease control. Although the dog culling had a positive impact in maintenance of a low ratio of increase of LV, the canine incidence and seroprevalence do not negativate, maintaining a residual reservoir of parasites in the field. Comparatively, the use of a canine protective vaccine would represent the better control tool, reducing the parasites offer to sand fly vectors and consequently the LV cases number. The Leishmune®, a second-generation vaccine, have been recently licensed in Brazil and become commercially available. Its formulation proved to be safe protective and highly immunogenic for dogs, butthere are a few studies aboutduration of protective immunity responses. Accordingly, the main goal of the current work was to investigate if the time-frameof one year, proposed for protective immunity following vaccination with Leishmune®, is accompainied by supportive imunological events,such as cytokine profile change, nitric oxide syntesis, and phagocytosis in peripheral blood immunity cell. Our data identified that Leishmune® was able to induce an incremented phagocytic capacity in monocytes closely associated with the NO production by these phagocytes, reaching a peak of functionalactivity at six months after vaccination. In neutrophils, the higher long lasting phagocytic capacity triggered was not accompanied by enhanced NOproduction by them. Among the immunological events correlated with phagocytic capacity increase, high levels of anti-Leishmania chagasi promastigotes IgG were detected by flow cytometry (PPFP), one and six months following vaccination, besides increase of Fcreceptor (CD32) expression by monocytes. Moreover, increase expression of TLR2 and TLR4 were positively correlated with phagocytic capacity and TLR5 and TLR9 were positively correlated with NO production in monocytes. In addition, we observed increase expression of activation (MHC) and costimulatory (CD80) molecules by monocytes one month following vaccination.The vaccination induced too a long lasting blockage to IL-4 and an increase in the IL-8 production by monocytes along with higher IFN- production by T-cells upon L. chagasi challenge in vitro. The evidences presented suggested that Leishmune® is able to induce a long lasting change in the immune response mediated by the interface of adaptive/innate immunity with impact on the monocyte functional properties, consistent with supportive immunological events with potential anti-Leishmaniaeffector mechanisms that could participate in protective immunity against CVL.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-10-08T12:26:57Z No. of bitstreams: 1 Tese Jacqueline Fiuza.pdf: 10186945 bytes, checksum: ad5d72f0c0040b9985453d0f8d1b7116 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-08T12:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Jacqueline Fiuza.pdf: 10186945 bytes, checksum: ad5d72f0c0040b9985453d0f8d1b7116 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Laboratório de Imunologia Celular e Molecular / A leishmaniose visceral zoonótica (LVZ), causada pelo parasito intracelular Leishmania infantum, é uma doença tropical negligenciada que pode ser fatal quando não tratada. Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de L. infantum na LVZ, já que a presença de cães infectados pode aumentar o risco de infecção humana. A leishmaniose visceral canina (LVC) representa um dos maiores problemas veterinários e de saúde pública no sul da Europa, Oriente Médio e América do Sul. O controle de reservatórios animais é baseado na eliminação de cães soropositivos em áreas endêmicas. Contudo, o tratamento de cães infectados não é indicado no Brasil, pois esse procedimento pode levar a seleção de parasitos resistentes já que as mesmas drogas são usadas no tratamento de infecções em humanos. Sendo assim, o uso de vacinas contra a LVC continua sendo a melhor alternativa no controle de parasitos. Nesse trabalho, nós apresentamos dados de perfil de imunogenicidade e proteção conferido pelo uso de parasitos vivos atenuados LdCen -/-em modelo canino, comparando com Leishmune ® , uma vacina disponível comercialmente. A imunogenicidade e proteção foram avaliadas através da produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores TLR, produção de citocinas intracitoplasmáticas e secretadas no sobrenadante, e carga parasitária por Real Time PCR. A vacinação com LdCen -/-resultou em alta imunogenicidade e proteção, observado pela maior produção de IgG Total, IgG1, e IgG2, e maior linfoproliferação em resposta a antígenos solúveis. Além disso, cães vacinados com LdCen -/-apresentaram maior frequência de células T CD4 + e CD8 + ativadas, maior produção de IFN-γ e menor produção de IL-4 por essas células, secreção aumentada de TNF-α e IL-12/IL-23p40 e menor secreção de IL-4 em sobrenandante de culturas estimuladas. Também podemos observar alta expressão de receptores TLR2, 4 e 9 por linfócitos T CD4 +, maior expressão de TLR4 por células T CD8 +, e menor carga parasitária em cães vacinados. Os dados sugerem que a vacinação com parasitos LdCen -/-induz a produção de anticorpos, proliferação e ativação celular, expressão de receptores Toll e produção de citocinas pró-inflamatórias, sendo que esse conjunto de fatores permitiu a indução de proteção contra o desafio com L. infantum. Baseando nesses dados, a imunização com esses parasitos se mostrou segura e imunogênica, conferindo proteção em cães. / Zoonotic visceral leishmaniasis, caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania infantum, is a neglected tropical disease that is often fatal when untreated. Dogs are considered the main reservoir of L. infantum in zoonotic VL as the presence of infected dogs may increase the risk for human infection. Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a major veterinary and public health problem in Southern Europe, Middle East and South America. Control of animal reservoirs relies on elimination of seropositive dogs in endemic areas. However, treatment of infected dogs is not allowed in Brazil as this approach can lead to emergence of drug resistance since the same drugs are used to treat human infections. Therefore, vaccination against CVL remains the best alternative in control of the animal reservoirs. In this study, we present data on the immunogenicity and protection profile of a live attenuated parasite LdCen -/-in a canine infection model and compared it to that of Leishmune ®, a commercially available recombinant vaccine. The immunogenicity and protection of the LdCen -/-parasites was evaluated by antibody secretion, activation and proliferation of T cells, production of intracytoplasmic and secreted cytokines, TLR expression and parasite load by Real Time PCR. Vaccination with LdCen -/-resulted in high immunogenicity and protection as revealed by the higher IgG Total, IgG1, and IgG2 production and higher lymphoproliferative response. Further, LdCen -/-vaccinated dogs showed higher frequencies of activated CD4 + and CD8 + T cells, IFN-γ production by CD4 + and CD8 + T cells and decreased production of IL-4 by theses cells, increased secretion of TNF-α and IL-12/IL-23p40 and decreased secretion of IL-4 in supernatant of stimulated cultures. We also observed higher expression of TLR2, 4 and 9 by CD4 + T cells, higher expression of TLR4 by CD8 + T cells, and lower parasite load in vaccinated dogs. These data suggest the vaccination using LdCen -/-can induce antibodies secrection, cell activation, lymph proliferative response, TLR expression, proinflammatory cytokines production, and all these factors together induced protection against challenge with L. infantum. Based on that, the immunization with these parasites shown to be safe and immunogenic, conferring protection in dogs.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-29T13:38:11Z No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-29T13:38:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq e PEC-PG / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente (p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados, mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos 13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4, P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm, dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental (imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. / Leishmaniases are a group of antropozoonotic diseases, endemic in 88 countries and present in almost all Brazilian states. The development of vaccines against leishmaniasis is highly desirable because neither the therapy nor the biological and ecoepidemiologic characteristics of parasites and their associated vectors facilitate the disease control. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) is a vaccine candidate molecule against leishmaniasis. Using in vitro and in silico tools, we evaluated the antigenicity of 13 synthetic overlapping peptides covering the entire sequence of KMP-11. For the in vitro experiments we used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cutaneous leishmaniasis (LC) from Rio de Janeiro State. These cells were employed to test the antigenicity of the 13 peptides individually, using ELISA and ELISPOT. By using ELISA we observed that recombinant KMP-11 induced higher cytokine responses than most of the individual peptides. Concerning IFN-γ two peptides (P9 and P10) induced cytokine levels significantly lower (p<0.05) than the entire protein. Ten peptides (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e and P13) induced significantly lower IL-10 and TNF-α levels than those observed with the entire protein. KMP- 11 was a potent inducer of IL-10 production in PBMC cultures from LC patients, confirming previously published observations. It was also capable of inducing higher levels of IFN-γ and TNF-α as compared to the studied peptides. In the evaluation of the IFN-γ/IL-10 ratio, we observed a marked contrast between most of the peptides and KMP-11. The responses to 11 out of 13 peptides presented a clear type 1 bias (IFN-γ>IL-10), except P1 and P10, which showed a type 2 response (IFN-γ<IL-10). The response with the entire recombinant protein IL-10 production predominated over that of IFN-γ. High variability in cytokine production among the patients was observed. An in silico study was made to predict KMP-11 sequences with antigenic potential with the SYFPEITHI algorithm. This analysis has revealed that the studied peptides were promiscuous for most of the class I and class II HLA alleles analyzed. For class II HLA, P4 showed scores significantly higher than the other peptides (p<0.05), except those of P10 and P12. For class I HLA, the score values for P1 were significantly higher than those for P4, P10 and P11 (p<0.05). On the other hand, the score values for the P11 were significantly lower than those for P1, P2, P5, P6, P12 and P13 (p<0.05). The P3, P4 and P11 peptides showed negative score values, indicating that they contain amino acids that interfere with the binding to HLA I molecules. In addition to this, we used the PAPROC, MAPP and NetChop tools that have predicted that sequences contained in P1, P5 and P5 would be naturally produced by the proteolytic machinery. The PHYRE algorithm has predicted that KMP-11 has a "hairpin" conformation with two alpha-helixes joined together by a loop. Additionally this software has predicted the tridimensional structure of the protein. The PROTSCALE algorithm revealed three regions of high polarity in the KMP-11 molecule (at the positions 14-29, 34-36 and 44-71), what would be related to the tridimensional structure already mentioned. Finally, the analysis of KMP-11 conservation confirmed that this molecule is highly conserved in Kinetoplastidae, However, it was able to distinguish the sequences of the KMP-11-coding genes in the genus Leishmania from those existent in Trypanosoma and Crithidia. The results obtained in the bioinformatic analysis were partially in agreement with those obtained in the experimental (immunologic) part of the present study and in previous studies on KMP-11.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-01T14:31:00Z No. of bitstreams: 1 karis_maria_p_rodrigues_ioc_bp_0027_2011.pdf: 37180086 bytes, checksum: 5edafa91606122063b098c48eb81a834 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-01T14:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karis_maria_p_rodrigues_ioc_bp_0027_2011.pdf: 37180086 bytes, checksum: 5edafa91606122063b098c48eb81a834 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença que se caracteriza pela presença de lesões cultâneas (LCL) e, em um número pequeno de pacientes, pelo desenvolvimento de lesão mucosa (ML). A evolução clínica e a resposta ao tratamento dependem de múltiplos fatores, incluindo o equilíbrio entre as citocinas Th1 e Th2, influenciando no controle parasitário e na extensão da lesão. Nesse equilíbrio complexo é possível que outras citocinas inflamatórias como IL-17 e IL-18, bem como fatores que influenciem na diferenciação de queratinócitos e nos processos inflamatórios da pele, como o sistema Notch, também possam se relacionar ao prognóstico das lesões. IL-18 é uma potente citocina indutora de IFN-γ, já tendo sido observado efeito protetor em doenças por protozoários. IL-17 é produzida por uma linhagem de células T descritas mais recentemente, que são consideradas essenciais em processos inflamatórios de vários tecidos e em doenças auto-imunes. O sistema de sinalização Notch é composto por um grupo de proteínas transmembrana que regulam processos decisórios em diversos tecidos, tanto no período embrionário como na vida adulta, incluindo a diferenciação de queratinócitos e de linfócitos T, na dependência do ligante envolvido em sua ativação (Delta-like – DLL1/DLL3/DLL4 ou Jagged 1 e 2). Estudamos a expressão das proteínas do sistema Notch e das citocinas IL-17 e IL-18 em lesões e sangue de pacientes com LTA causada por Leishmania (Viannia) braz possa estar associado com reação inflamatória mais intensa e retardo na resolução das lesões. Nas lesões mucosas foi observada maior expressão do receptor Notch3 e dos ligantes Delta-like (DLL1 e DLL4). O sistema Notch está associado à homeostase da pele regulando a diferenciação de queratinócitos e a cicratização. Nas células do sistema imune, quando linfócitos T CD2+ expressando Notch são ativados por células apresentadoras de antígenos expressando ligantes Delta-like, uma resposta Th1 ou Th17 é gerada. Nesse sentido, o papel do sistema Notch nas lesões de LTA pode ser associado tanto à homeostase do tecido cutâneo quanto ao sistema imune ou a ambos, além de poder estar correlacionado ao aumento de IL-17 observado no mesmo grupo de pacientes. A alta expressão de receptores Notch, ligantes Delta-like e das citocinas inflamatórias IL-17 e IL-18 sugere que o aumento desses fatores pode indicar pacientes para os quais esteja indicado um esquema terapêutico mais agressivo, ou pelo menos, um acompanhamento mais rigoroso

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-27T11:46:56Z No. of bitstreams: 1 edezio_f_cunhajunior_ioc_bcm_0046_2011.pdf: 1328543 bytes, checksum: 6f45369f40d42516302f4eecaec5409c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-27T11:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 edezio_f_cunhajunior_ioc_bcm_0046_2011.pdf: 1328543 bytes, checksum: 6f45369f40d42516302f4eecaec5409c (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programe de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (TDR/OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Fica evidente, então, a necessidade e urgência do desenvolvimento de novos medicamentos eficazes, seletivos, de baixo custo e, de preferência, de administração oral. A LQB-118 e seus análogos surgiram da união de dois grupos de moléculas bioativas, os pterocarpanos e as quinonas, formando as naftopterocarpanoquinonas, que vem demonstrando atividade leishmanicida. Neste trabalho avaliamos a atividade in vitro e in vivo do protótipo mais promissor. A LQB-118 demonstrou atividade leishmanicida em promastigotas de diferentes espécies de Leishmania, tanto do novo mundo como do velho mundo. No tratamento da leishmaniose cutânea em modelo murino, mostrou-se eficaz, tanto no tratamento subcutâneo por vias de administração sistêmica, oral e intraperitoneal. Ensaios bioquímicos indicaram que a LQB-118 induz um aumento expressivo da atividade de redutases mitocondriais nas primeiras horas, com concomitante aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos parasitos. Juntos, esses resultados indicaram que a LQB-118 é um protótipo seletivo, atuando primariamente sobre a mitocôndria dos parasitos, com atividade in vivo por via oral, o que a credencia como uma potencial candidata a fármaco.(AU) / Leishmaniasis is still today a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on injectable drugs that cause serious side effects, which is unaffordable for several endemic countries. It is evident, then, the need and urgency of developing new selective, inexpensive, effective drugs, preferably orally delivered. LQB-118 and its analogues have emerged from the union of two groups of bioactive molecules, pterocarpans and quinones, forming the naphthopterocarpanoquinones, which have shown leishmanicidal activity. In this study, the in vitro and in vivo activity of the most promising prototype is demonstrated. The LQB-118 showed antileishmanial activity in promastigotes of different species of Leishmania, both of new as the old world. LQB-118 has shown to be effective in treatment of cutaneous leishmaniasis in a murine model by subcutaneous, oral, and intraperitoneal routes. Biochemical assays indicate that the LQB-118 induces an expressive enhancement of mitochondrial reductases activity in the early hours of incubation, which is paralleled with enhancement of reactive oxygen species (ROS) production by the parasites. Altogether, these results indicate that LQB-118 is a selective lead compound, acting primarily on the parasite mitochondria, orally active in murine model, what qualifies it as a potential drug candidate.

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 livia_carvalho_ipec_mest_2012.pdf: 2880203 bytes, checksum: 7bd6bd57b25b05667dce1ddd625d140a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-08-11 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) apresenta formas clínicas variadas, podendo simular outras doenças. A forma esporotricóide da leishmaniose é relativamente incomum, e apresenta-se como úlcera de inoculação com nódulos e/ou gomas ao longo de trajeto linfático. Tal apresentação torna-se particularmente relevante no contexto da epidemia de esporotricose vivenciada no Rio de Janeiro há pouco mais de uma década, pois ambas as enfermidades compartilham espaços físicos semelhantes neste estado. No intuito de compreender melhor a forma esporotricóide da LTA (LE), em especial o papel da resposta imune celular na determinação desta apresentação clínica peculiar, estudamos o comportamento clínico, epidemiológico e imunológico in situ destes pacientes, comparando os resultados obtidos com os de pacientes que apresentam formas clínicas típicas de leishmaniose cutânea (LC). O estudo compreendeu 494 pacientes consecutivamente atendidos no Laboratório de Vigilância em Leishmanioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, entre janeiro de 2004 e dezembro de 2010, tendo sido excluídos os pacientes com leishmaniose mucosa e com leishmaniose difusa anérgica atendidos no período, e foi dividido em duas etapas Na primeira, foi feita uma análise clínica, comparando-se as características clínicas e epidemiológicas de 23 pacientes com diagnóstico de LE e 471 pacientes com LC. Demonstrou-se que 14 (60,9%) pacientes de LE eram do sexo feminino; a média de idade era de 44,74 anos; doze pacientes (52,2%) tiveram lesões localizadas em membros superiores (p = 0,037). Já no grupo com LC predominava o sexo masculino, com 304 (64,5%) pacientes (p = 0,024); a média de idade era de 35,94 anos (p = 0,032); e as lesões localizavam-se nos membros inferiores em 38% dos casos (p = 0,048). A distribuição entre os sexos, a idade e a localização das lesões foram consideradas significativamente diferentes entre os dois grupos. Na segunda etapa, realizou-se a análise imunohistoquímica de fragmentos obtidos através de biópsia de lesões cutâneas de 15 pacientes com LE comparados com os de 30 pacientes de LC. Observou-se que o infiltrado inflamatório, de distribuição heterogênea nas lesões de pacientes com LC, era mais intenso nas lesões dos pacientes com LE, que apresentavam ainda grande quantidade de tecido fibrótico Observamos elevação significativa do percentual de neutrófilos (média LE = 21,21; LC = 13,53; p=0,019), maior intensidade da Óxido Nítrico Sintase 2, e diminuição da concentração de células Bcl2 (média LE = 22,58; LC = ix 32,98; p=0,036), conferindo à forma esporotricóide de LTA um caráter mais inflamatório e destrutivo quando comparada com a forma típica da doença. Os resultados demonstram que a LTA esporotricóide pode se assemelhar clínica e imunologicamente com a esporotricose cutaneolinfática, sugerindo-se um estudo comparativo entre ambas / American Tegumentary Leishmania sis (ATL) has varied clinical presentations and can mimic other diseases. The sporotrichoid form of leishmaniasis is relatively uncommon and clinically may presents as an ulcer with nodules and / or gums along lymphatic pathways . This presentation is parti cularly relevant in the context of the epidemic of sporotrichosis in Rio de Janeiro State experienced for a little more than a decade, because both diseases share endemic areas there. In order to better understand sporotrichoid leishmaniasis (SL), in parti cular the role of cellular immune response in determining this peculiar clinical presentation , we studied the clinical , epidemiological and immunological in situ behavior of these patients , comparing the results with those of patients presenting typical cl inical forms of cutaneous leishmaniasis ( CL). T he study comprised 494 consecutive patients treated at the Leishmaniasis Surveillance Laboratory at Evandro Chagas Clinical Research Institute ( IPEC), Oswaldo Cruz Foundation ( FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazil, between January 2004 and December 2010 ; patients with mucosal leishmaniasis and cutaneous diffuse anergic leishmaniasis attended at this period of time were excluded. It was divided into two steps. At first a clinical analysis was made, comparing the clinical and epidemiological characteristics of 23 patients with S L and 471 patients with C L . I t was demonstrated that 14 (60.9 %) of the SL p atients were female; their average age was 44.74 years; twelve patien ts (52.2 %) had lesions in the upper limbs ( p = 0.037) . In the CL group males predominated , with 304 ( 64.5% ) of the patients ( p = 0.024); the average age was 35.94 years ( p = 0.032); and lesions were located in the lower limbs in 38% of cases ( p = 0.048) . G ender distribution , age and location of the lesions were considered significantly different between the two groups. In the second step , immunohistochemical analysis of lesion samples from skin lesions in 15 patients with S L was performed and compared with those of 30 C L patients . I t was observed that the inflammatory infiltrate , which was heterogeneously distributed in the lesions of patients with C L, wa s more intense in lesions of patients with SL , which additionally had large amounts of fibrotic tissue. We observed an increase in the percentage of neutrophils (mean SL = 21.21; C L = 13.53; p = 0.019) , greater intensity of nitric oxide synthase 2 , and decreased concentration of Bcl2 cells (mean SL = 22.58; LC = 32.98; p = 0.036) , giving the SL form more in flammatory and destructive characteristics when compared with the typical form of the disease. The results showed important differences in the characterization of clinical presentation of ATL that can be useful during the diagnostic procedures

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-07T19:04:34Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_SharaReginadaSilva.pdf: 575472 bytes, checksum: 90fbdbc94aef7c2eb888b39541523483 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-07T19:08:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_SharaReginadaSilva.pdf: 575472 bytes, checksum: 90fbdbc94aef7c2eb888b39541523483 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-07T19:08:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_SharaReginadaSilva.pdf: 575472 bytes, checksum: 90fbdbc94aef7c2eb888b39541523483 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou / O presente trabalho avaliou a transmissibilidade de Leishmania spp. para Lutzomyia longipalpis em 136 cães nativos e beagles-sentinelas , vacinados ou não (placebo) com Leish- Tec ® (vacina anti-leishmaniose visceral canina), domiciliados em Porteirinha, município endêmico para leishmaniose visceral, em Minas Gerais. Esses animais foram selecionados a partir da amostra total de cães que compõem o ensaio clínico de fase III que determinou a eficácia da vacina Leish-Tec ® , conforme diretrizes estabelecida s pelo Ministério da Saúde do Brasil. Além da técnica de xenodiagnóstico, e sses cães também foram submetidos aos testes diagnósticos ELISA, RIFI, te ste rápido Kalazar Detect TM e exames de detecção do parasito. Uma tendência de redução da infectividade (p -valor 0,052) foi obser vada no grupo de cães vacinados com Leish-Tec ® que apresentaram resposta sorológi ca positiva ao antígeno vacinal A2. Os testes RIFI, Kalazar Detect TM e xenodiagnóstico apresentar am maior percentual de positividade entre os cães sintomáticos da amostra (p<0,05), quando comparados aos cães assintomáticos, na análise global. Na análise estr atificada e, para o grupo de cães que recebeu vacina, as diferenças se mantiveram para a RIFI e o teste rápido, mas não para o xenodiagnóstico; já para os cães que receberam pl acebo, as diferenças entre grupos clínicos se mantiveram para o xenodiagnóstico e teste rápido, mas não para a RIFI. Nossos resultados sugerem que a Leish-Tec ® possui potencial de redução da in fectividade em cães vacinados e desafiados em área endêmica e que a vacinação com Leish-Tec ® pode contribuir para a redução da transmissão da leishmaniose viscer al canina, desde que utilizada como medida protetiva individual e em conjunto com as dema is estratégias, individuais e coletivas, de prevenção e controle da doença. Com rel ação à diferença de desempenho dos testes diagnósticos entre grupos clínicos, nossos resultados apontam para a necessidade de desenvolvimento de testes mais eficazes no di agnóstico da infecção assintomática por Leishmania e demonstra que essas diferenças in terferem nos resultados e devem ser consideradas na avaliação de ensaios clínicos. / This study evaluated the transmission of Leishmania spp. to Lutzomyia longipalpis in 136 native and beagles sentinel dogs, vaccina ted or not (placebo) with Leish-Tec ® (canine visceral anti-leishmaniasis vaccine), domiciled in Port eirinha, visceral leishm aniasis endemic county in Minas Gerais, Brazil. These animals were sele cted from the total sample of dogs that make up the phase III clinical trial that determined the efficacy of Leish-Tec ® vaccine, according to guidelines established by Brazilia n Ministry of Health. Beside s the xenodiagnosis technique, these dogs were also subjected to the sorological tests ELI SA, IFAT, rapid test Kalazar Detect TM and parasite detection. A tendency of reduction of infectivity (p-value 0.052) was observed in the group of dogs vaccinated with Leish-Tec ® that presented positive serological response to the vaccine antig en A2. IFAT, Kalazar Detect TM and xenodiagnosis showed a higher percentage of positivity among symptomatic dogs (p <0.05) compared to asymptomatic dogs. In stratified analysis, and for the vaccine dogs group, differences remained for the IFAT and the rapid test, bu t not for xenodiagnosis; already for placebo dogs group, the differences between clinical groups re mained to xenodiagnosis and rapid test, but not for the IFAT. Our results suggest that the Leish-Tec ® has the potential to reduce the infectivity of vaccinated and challenged dogs in endemic areas and could contribute to the reduction of transmission of canine visceral le ishmaniasis, since used as an individual protective measure and together w ith other strategies, individual and collective, to prevent and control the disease. Regarding the performance difference of di agnostic tests between clinical groups, our results point to the need for developm ent of more effective tests in the diagnosis of asymptomatic Leishmania infection and shows that these di fferences affect the results and should be considered in ev aluating clinical trials.