O presente trabalho aborda a transformação semi-sintética de afidicolina visando a criação de uma biblioteca de compostos para fins de ensaios de atividade sobre espécies de Leishmania spp. Recentemente, estudos demonstraram a alta atividade da afidicolina, um diterpeno tetracíclico produzido pelo fungo Nigrospora sphaerica, frente ao protozoário Leishmania major. Apesar do promissor potencial leishmanicida, a afidicolina apresenta propriedades físico-químicas e perfil farmacocinético inadequado para terapêutica. Considerando que abordagens semi-síntética são comuns na busca de novos protótipos para doenças negligenciadas e na otimização de propriedades farmacocinéticas, foram desenvolvidas metodologias diversas de transformação de grupo funcional, alquilação e acilação da afidicolina a fim de avaliar os requisitos estruturais para atividade leishmanicida. Um estudo preliminar computacional foi realizado para determinação de cargas atômicas e potencial eletrostático da afidicolina, que forneceu informações valiosas sobre a reatividade química desta molécula, úteis para o planejamento de futuras modificações envolvendo este protótipo. No total, foram sintetizados dez compostos, sendo sete inéditos, que foram testados contra espécies de L. major e L.braziliensis. A avaliação leishmanicida dos compostos sintetizados demonstrou seletividade do derivado do tipo oxima contra a espécie L. brasiliensis, epidemiologicamente importante no Brasil. A partir dos dados da avaliação biológica foi possível propor, de forma preliminar, requisitos estruturais para a atividade leishmanicida da afidicolina e de seus derivados semi-sintéticos. / his work presents the use of semisynthetic approach to create a library of compounds from the lead compound aphidicolin for biological assays against Leishmania spp. Recently, studies have shown high activity of aphidicolin, a secondary metabolite from the fungus Nigrospora sphaerica, against the protozoan Leishmania major. Despite the promising leishmanicidal potential, aphidicolin presents physico-chemical and pharmacokinetic profile unsuitable for therapy. As the semi-synthetic approach is widely used in the search for new prototypes for neglected diseases, new methodologies have been developed for functional group transformation, alkylation and acylation of aphidicolin. A preliminary computational study was conducted to determine the atomic charges and electrostatic potential of aphidicolin, which provided valuable information on the chemical reactivity of this molecule, useful for planning future changes involving this prototype. Ten compounds were synthesized; seven of them are unpublished, which have been tested against different species of the protozoa Leishmania spp. The preliminary evaluation of the synthesized compounds showed leishmanicidal selectivity of the compound oxime against L. brasiliensis specie, which has a notorious occurrence in Brazil. We have proposed a preliminary perspective of the structural requirements for the leishmanicidal activity of aphidicolin and its semisynthetic derivatives based on the biological essays.

A Epidemiologia Paisagística parte da premissa de que, se conhecendo as exigências ambientais dos transmissores e reservatórios de doenças, é possível prever riscos epidemiológicos através do conhecimento das variáveis ambientais. Muitas destas variáveis podem ser quali e quantificadas através do uso de Geoprocessamento e Sensoriamento Remoto (S.R.). A análise paisagística da incidência de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é necessária na medida em que pode ajudar a esclarecer o complexo ciclo de transmissão da doença. O objetivo deste trabalho foi o de analisar a influência de algumas importantes variáveis ambientais relacionadas à LTA, que são altitude, densidade de vegetação e desmatamento, na incidência dos casos. Foram mapeadas as possíveis Zonas de Risco de Contato (ZoRC) entre o homem e o mosquito transmissor, e foram observadas as alterações temporais ocorridas na vegetação. Para mapear as ZoRC, inicialmente foram delimitados os fragmentos de vegetação, identificáveis em imagens de satélite, considerados aqui como habitats dos mosquitos. As bordas dos fragmentos foram expandidas em 250, 500 e 1000 metros, gerando as possíveis ZoRC. Dentro destas ZoRCs foram quantificadas as áreas relativas às classes de altitude, obtidas do Modelo de Elevação Digital, bem como as classes de vegetação, obtidas da imagem Índice de Vegetação de Diferença Normalizada (IVDN). A variação temporal da vegetação foi feita a partir da Análise de Componentes Principais (ACP) de duas imagens de satélite (1992 e 1999), sendo que apenas a segunda Principal Componente (PC2) foi classificada e analisada. Os resultados mostraram que cerca de 50% das casas onde houve LTA se encontram em uma distância menor que 200 metros da borda de algum fragmento de mata; que mais que 70% das áreas totais das ZoRC em cada distância se encontram em altitudes menores que 750 metros; e também que cerca de 50% das ZoRC, em cada distância, apresentavam uma área verde muito densa (IVDN variando de 0,45 a 1). A alta porcentagem de área encontrada no intervalo de altitude mencionado concorda com as observações de Gomes & Neves (1998) sobre as condições de sobrevivência do mosquito transmissor na área de estudos, que costuma ser encontrado em altitudes de até 750 metros. O intervalo de IVDN alto encontrado em mais metade das ZoRC, pode estar indicando a necessidade de haver área verde suficientemente densa, espalhada ao redor dos fragmentos de mata, para que o mosquito consiga alcançar as habitações humanas. O fato de o resultado da análise das porcentagens de área relativa às classes de altitude e IVDN mostrar o mesmo padrão tanto para as distâncias de 250, quanto de 500 e de 1000 metros indica que o epidemiologista pode optar por qualquer das três distâncias que obterá resultados semelhantes. A ACP, mostrou-se muito apropriada na medida em que foi possível observar pelo menos duas grandes áreas onde o desmatamento parece ter influenciado no aparecimento dos casos. Os resultados das análises realizadas concordam com a possibilidade de que a transmissão esteja sendo influenciada por: (1) presença de vegetação suficientemente densa ao redor dos fragmentos facilita uma dispersão dos mosquitos a distâncias maiores que 250 metros ou (2) ocorrência de um processo de domiciliação dos mosquitos transmissores na área de estudos.

Doença de Chagas e Leishmaniose, são doenças causadas por protozoários da família Trypanosomatidae (Trypanosoma cruzi e Leishmania sp., respectivamente) e estão, ambas, no grupo das doenças consideradas tropicais negligenciadas (DTNs). Juntas, elas afetam cerca de 30 milhões de pessoas em 98 países no mundo. Embora tão epidemiologicamente importantes, essas doenças ainda carecem de um tratamento quimioterápico robusto e seguro, pois os medicamentos disponíveis apresentam, além de baixa eficácia terapêutica, baixas taxas de adesão, devido aos sérios efeitos colaterais gerados por serem extremamente tóxicos e acabando, por isso, sendo geradores de resistência. Nas últimas décadas, tem sido intenso o esforço dos grupos de pesquisa em desenvolver alternativas para o tratamento dessas doenças, especialmente explorando produtos de origem natural e através do emprego de tecnologia farmacêutica, gerando formulações mais viáveis clinicamente devido ao provimento de propriedades físico-químicas favoráveis à absorção e permeabilidade celular, com consequente maior biodisponibilidade e potencialização do efeito biológico. Em nosso presente trabalho, objetivamos propor novas estratégias de tratamento dessas doenças, utilizando como candidato, o ácido ursólico (AU), um triterpenoide de origem natural. Foram testados o AU isolado e associado com fármacos estabelecidos, assim como uma dispersão sólida contendo 10% do princípio ativo (DSAU). Em ensaios in vitro contra as várias formas evolutivas intra e extracelulares de Trypanosoma cruzi e Leishmania braziliensis, obtivemos muito bons resultados, como 99,8% de lise em 128 ?M sobre as formas tripomastigotas, com IC50 de 14,1 ?M para o AU. Em experimentos in vivo sobre doença de Chagas experimental, observamos uma redução de parasitemia de 60,2% e 61,6% em animais tratados com doses de 20 mg/Kg de AU e DSAU, respectivamente. Embora não tenham causado diminuição na carga parasitária nos tecidos analisados (coração e fígado) em relação ao controle negativo, a sobrevida dos animais tratados com AU e DSAU foi semelhante a dos animais tratados com benzonidazol na mesma dose. Sobre leishmaniose muco-cutânea experimental, observamos a diminuição do diâmetro médio das lesões em animais tratados com dose de 20 mg/Kg de nossos compostos avaliados. Esses resultados demonstram que o ácido ursólico é um potente candidato a quimioterápico para o tratamento de tripanosomíases. Além disso, a associação a fármacos existentes, e a utilização de tecnologia farmacêutica podem ser boas estratégias para o tratamento dessas doenças. / Chagas disease and Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the family Trypanosomatidae (Trypanosoma cruzi and Leishmania sp., Respectively) and both are in the group of diseases considered neglected tropical (NTDs). All together, they affect about 30 million people in 98 countries worldwide. Although so very epidemiologically important, these diseases still lack a safe and robust chemotherapeutic treatment seeing that the available drugs present besides low therapeutic efficacy, low compliance rates, since they are extremely toxic and cause serious side effects ending up, therefore, being resistance generators. In recent decades, there have been intense efforts of research groups to develop alternatives for treating these diseases, especially exploring natural products and by applying pharmaceutical technology, generating more clinically viable formulations due to providing favorable physicochemical properties to the cell absorption and permeability, thus resulting in increased bioavailability and enhancement of biological effect. In our present study, we aimed to propose new treatment strategies for these diseases by using as a candidate, the ursolic acid (UA), a naturally occurring triterpenoid. Isolated UA and associated with established drugs have been tested, as well as a solid dispersion containing 10% of the active ingredient (SDUA). In the in vitro tests against several extracellular and intracellular evolving forms of Trypanosoma cruzi and Leishmania braziliensis, we have obtained very good results, such as 99.8 of lysis at 128 ?M on trypomastigotes, with IC50 of 14.1 ?M for the UA. In the in vivo experiments about experimental Chagas disease, a decrease of parasitaemi of 60.2% and 61.6% has been observed in animals treated with doses of 20 mg / kg of UA and SDUA respectively. Although not having caused a decrease in the parasite load in the tissues analyzed (heart and liver) compared to the negative control, the PFS of animals treated with UA and SDUA was similar to that of the animals treated with the same dose of benznidazole. About the experimental skin mucus leishmaniasis, we have observed a decrease of the average diameter of lesions in animals treated with 20 mg / kg of our evaluated compounds. These results demonstrate that the ursolic acid is a potent candidate for chemotherapy for the treatment of trypanosomiasis. Furthermore, the association of existing drugs, and the use of pharmaceutical technology can be good strategies to treat these diseases

Dentre os diversos tipos de patologias, as doenças negligenciadas apresentam grande prevalência na população em países tropicais. A leishmaniose é uma doença negligenciada endêmica no Brasil, com incidência em áreas urbanas e rurais. A ineficácia e elevados efeitos colaterais de fármacos como a Anfotericina B, que é atualmente empregada, tem levado a pesquisa e desenvolvimento de substâncias bioativas antileishmaniose. Um alvo macromolecular de interesse terapêutico é a cisteíno protease B (CPB) devido a sua atuação e importância em diversas etapas do ciclo de vida da Leishmania. Assim, o Grupo de Química Medicinal (NEQUIMED) estuda inibidores covalentes reversíveis da cisteíno protease CPB com potencial atividade antileishmaniose. Neste projeto, a síntese de derivados de dipeptidil-nitrilas é realizada para que com potencial atividade inibidora da CPB e antileishmaniose seja acessado por meio dos ensaios biológicos correspondentes. Neste projeto, derivados e estereoisômeros do composto N-(1-cianociclopropil)-3-fenil-2-((-2,2,2-trifluoro-1-fenil-etil)amino) propanamida foram produzidos e caracterizados. 15 substâncias foram produzidas e purificadas por HPLC e sua pureza determinada por medição de ponto de fusão e HPLC-MS, com caracterização por RMN (1H e 13C) e FT-IR. A partir desta série, a estereosseletividade enzimática para a CPB será acessada por meio de ensaios bioquímicos e biofísicos e também por ensaios celulares a serem realizados por outros membros do grupo. / Among several types of pathologies, neglected tropical diseases present high prevalence in the population in tropical countries. Leishmaniasis is a neglected disease which endemic in Brazil, with incidence in urban and rural areas. The ineffectiveness and numerous side effects of drugs such as amphotericin B, which is currently used for treatment has led to the research and development of bioactive antileishmanial substances. A macromolecular target of therapeutic interest is the enzyme cysteine protease B (CPB) because of its performance and importance at various stages of the Leishmania life cycle. Thus, the Medicinal Chemistry Group (NEQUIMED) studies covalent inhibitors of cysteine protease CPB with potential antileishmanial activity. In this study, the synthesis of dipeptidyl nitrile derivatives is performed so that with potential inhibitory activity for CPB and antileishmaniasis is accessed through the corresponding biological assays. In this project, it was produced and characterized derivatives and stereoisomers of the compound N-(1-cyanocyclopropyl)-3-phenyl-2-((2,2,2-trifluoro-1-phenyl-ethyl)amino)propanamide. 15 substances were produced and purified by HPLC and determined purity by melting point measurement and HPLC-MS, characterizing by NMR (1H and 13C) and FT-IR. From this series, the enzymatic stereoselectivity for CPB will be accessed through biochemical and biophysical assays and by cellular assays to be performed by other members of the group.

Orientador: Ieda Maria Begnini. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Orientadora: Iêda Maria Begnini. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Orientador: Iêda Maria Begnini. / Dissertação (Mestrado em Química) - Programa de Pós-Graduação em Química, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Universidade Regional de Blumenau, Blumenau.

Nenhuma / O controle epidemiológico da leishmaniose visceral (LV) no Brasil envolve a eliminação de cães infectados, portanto, métodos diagnósticos confiáveis são essenciais para evitar a transmissão da doença ou o sacrifício desnecessário de animais. O programa de controle da LV no Brasil é baseado em inquéritos sorológicos. Os métodos sorológicos, no entanto, apresentam problemas de sensibilidade e especificidade. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) demonstrou ser uma técnica rápida e sensível para a detecção de Leishmania, no entanto amostras não invasivas representam um instrumento essencial, neste contexto, uma vez que elas são mais simples, indolores e mais facilmente aceitas pelos proprietários de cães. Um método útil é o swab conjuntival (SC) que utiliza um swab estéril para a realização de um esfregaço das conjuntivas do cão. O SC mostrou-se altamente sensível para o diagnostico da LV por PCR. O objetivo deste estudo foi avaliar através do SC a prevalência de animais infectados em dois grupos de cães: assintomáticos e vacinados contra a LV. O primeiro grupo foi composto por 30 animais assintomáticos, positivos nos diagnósticos sorológico e parasitológico. Os resultados do SC foram comparados com os obtidos através de duas amostras pouco invasivas, sangue (S) e biopsia de pele (BP). As amostras foram analisadas por dois métodos diferentes de PCR: kDNA PCR-hibridização e ITS-1 nPCR. O volume de amostra de DNA utilizada para o kDNA PCR-hibridização foi de 1,0 &#61549;L e para o ITS-1 nPCR o volume foi de 10,0 L. Utilizando-se o SC o método kDNA PCR- hybridização detectou DNA de Leishmania em 24/30 cães (80%) através da conjuntiva direita (CD) e 23/30 cães (76,6%) utlizando-se a conjuntiva esquerda (CE), 17/30 cães (56,7%) por meio de BP e 4/30 cães (13.3%) com S. A positividade do SC obtida combinando-se ambas as conjuntivas foi de 90% (27/30 cães). A análise das amostras de SC pelo método ITS-1 nPCR revelou que 25/30 cães (83,3%) foram positivos utilizando-se a CD e 20/30 cães (66,6%) foram positivos via a CE. Pelo mesmo método 15/30 cães (50,0%) foram positivos através de BP e 17/30 cães (56,7%) com S. A positividade obtida combinando-se ambas as oculares foi de 83,3%. Para o método kDNA PCR- hybridização as positividades do SC para a CD e CE foram significantemente superiores (p<0.05) as obtidas com BP e S. Diferença estatística em relação a BP e S foi verificada pelo método ITS-1 nPCR apenas para CD. Os métodos kDNA PCR-hibridação e ITS-1 nPCR apresentaram sensibilidade semelhante para SC e amostras BP. Por outro lado, a positividade do ITS-1 nPCR para amostras de S, foi significativamente maior que a obtida pelo kDNA PCR-hibridização, indicando que a sensibilidade dos métodos de PCR pode variar de acordo com o tecido examinado. A melhor sensibilidade neste estudo (90%) foi obtido através de amostras SC (combinando-se as duas conjuntivas) associada ao kDNA PCR-hibridização. Este nível de sensibilidade foi semelhante ao obtido em outros estudos utilizando SC para o diagnóstico da LV em cães sintomáticos. O segundo grupo foi de 42 cães militares, todos vacinados contra a LV. Neste grupo os resultados do SC foram comparados aos obtidos por testes sorológicos. Os testes sorológicos foram realizados de forma independente por três laboratórios. Os laboratórios 1 e 2 (Lab1 e Lab2) foram laboratórios comerciais. O laboratório 3 (Lab3) foi o Laboratório de Referência Nacional. A primeira triagem sorológica realizada pelo Lab1 mostrou 15 cães reativos e 4 cães foram classificados como indeterminados. Devido à alta positividade encontrada neste ensaio, animais com sorologia reativa e indeterminada, diagnosticados pelo Lab1, foram submetidos a novos testes sorológicos pelos Lab2 e Lab3. O Lab2 confirmou apenas 3 cães reativos e 2 animais foram indeterminados. O Lab3 confirmou 7 cães reativos e 3 cães foram classificados como indeterminados. Os cães que foram confirmados como reativos no diagnóstico sorológico do Lab3 foram submetidos à eutanásia. O diagnóstico molecular por PCR, utilizando o SC em todos os 42 animais foi capaz de detectar o DNA de Leishmania em 17 cães. Comparando os resultados da PCR com os obtidos através do teste sorológico do Lab1, a PCR foi positiva para 10 casos reativos e um caso indeterminado, mas foi negativo para 5 reativos e 3 casos indeterminados. Além disso, a PCR foi positiva em 5 casos não reativos. Os casos reativos e indeterminados, de acordo com o Lab1 que foram PCR negativos, apresentaram resultados negativos nos testes sorológicos dos Lab2 e Lab3. Para o Lab2, a PCR confirmou os 3 casos reativos e foi positiva para os 2 casos indeterminados. Em relação ao Lab3, a PCR confirmou todos os 7 casos reativos e foi positiva para os 3 casos indeterminados. O ensaio de PCR confirmou todos os casos, simultaneamente reativos nos testes sorológicos de dois laboratórios. Nossos resultados mostraram que o SC é um método sensível e prático para coleta de amostra permitindo diagnósticos confiáveis por PCR, além de apresentar sensibilidade superior a outras amostras pouco invasivas. Concluímos que o uso do SC deve ser considerado para os inquéritos caninos rotineiros para a LV / The epidemiological control of visceral Leishmaniasis (VL) in Brazil involves the elimination of infected dogs. Therefore, reliable diagnostic tests are essential to prevent the transmission of the disease or unnecessary culling of dogs. The VL control in Brazil is based on serological surveys, nevertheless serologic assays present problems related to sensitivity and specificity. Polymerase chain reaction (PCR) proved to be a rapid and sensitive technique for detection of Leishmania. However, non-invasive samples are an essential tool in this context, since they are simpler, painless and more easily accepted by dog owners. A useful method is the conjunctival swab (CS) that uses a sterile swab to sample the dog conjunctiva. The SC was highly sensitive for the VL diagnosis by PCR. The objective of this study was to evaluate by CS the prevalence of infected animals in two groups of dogs: asymptomatic and vaccinated against VL. The first group had 30 asymptomatic dogs with positive serological and parasitological tests. The SC samples were compared with two non-invasive samples: blood (B) and skin biopsy (SB). The samples were analyzed by two different PCR methods: kDNA PCR-hybridization and ITS-1 nPCR. The volume of DNA sample used for kDNA PCR-hybridization was 1.0 &#61549; L and ITS-1 nPCR volume was 10.0 L. The DNA sample volume used was of 1.0 L and 10.0 L respectively. Using CS samples the kDNA PCR- hybridization was able to detected parasite DNA in 24/30 dogs (80%) using the right conjunctiva (RC) and 23/30 dogs (76.6%) with the left conjunctiva (LC), 17/30 dogs (56.7%) by means of SB and 4/30 dogs (13.3%) with B. The CS positivity obtained combining RC and LC results was of 90% (27/30 dogs). The assay of CS samples by ITS-1 nPCR revealed that 25/30 dogs (83.3%) were positive when using RC and 20/30 dogs (66.6%) were positive when using LC. Via the same method 15/30 dogs (50.0%) were positive by SB and 17/30 dogs (56.7%) with B. The CS positivity obtained by ITS-1 nPCR combining RC and LC was of 83.3%. The CS positivities for RC and LC were significantly higher (p<0.05) than SB and B for kDNA PCR- hybridization method. Statistical difference in relation to SB and B was verified by ITS-1 nPCR only for RC. Methods kDNA PCR-hybridization and ITS-1 nPCR showed similar sensitivities to CS and SB samples. Moreover, the positivity of ITS-1 nPCR 11 for B samples, was significantly higher than that obtained by kDNA PCR-hybridization, indicating that the sensitivity of the PCR may vary with the tissue examined. The best sensitivity in this study (90%) was obtained from CS samples (by combining both conjunctivas) associated with kDNA PCR-hybridization. This level of sensitivity was similar to that obtained in other studies using CS for the VL diagnosis in symptomatic dogs. The second group was of 42 military dogs, all of them vaccinated against VL. In this group CS and compared with the results obtained by serological tests. The serological tests were carried out independently by three laboratories. Laboratories 1 and 2 (Lab1 and Lab2) were private laboratories. Laboratory 3 (Lab3) was the National Reference Laboratory. The first serological screening performed by the Lab 1 showed 15 reactive dogs and 4 dogs were classified as indeterminate. Due to the high positivity found in this test, animals with reactive and indeterminate serology according Lab 1 were subjected to new serological tests by Lab 2 and Lab 3. Lab 2 confirmed only 3 reactive dogs and 2 animals were undetermined. The Lab 3 found 7 reactive dogs and 3 dogs were classified as indeterminate. Dogs that were confirmed as reactive by Lab 3 were euthanized. The molecular diagnosis by PCR, using CS, was performed in all 42 animals and was able to detect Leishmanial DNA in 17 dogs. Comparing the PCR results with those obtained by serological test of Lab 1, PCR was positive for 10 reactive and one indeterminate case, but was negative for 5 reactive and 3 indeterminate cases. In addition, the PCR was positive in 5 non-reactive cases. The reactive and indeterminate cases according to Lab 1 that were PCR negatives, tested negative in the serologic assays of Lab 2 and Lab 3. For the Lab 2, the PCR confirmed the 3 reactive cases and was positive for the 2 indeterminate cases. In relation to Lab 3, the PCR confirmed all 7 reactive cases and test positive for the 3 indeterminate cases. The PCR assay confirmed all cases simultaneously reactive in the serologic tests of two laboratories. Our results showed that the SC is a sensitive and practical method for collecting samples, allowing reliable diagnostic tests by PCR and showed higher sensitivity than other low invasive samples. We conclude that the use of CS for the regular screenings of dogs by PCR should be considered.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Na área urbana o cão é a principal fonte de infecção e o controle da LV no Brasil envolve a eliminação de cães infectados. Testes sorológicos são utilizados para os levantamentos rotineiros, mas estes apresentam problemas de especificidade e sensibilidade. Os métodos moleculares como a PCR são úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de Leishmania. São capazes de detectar animais infectados soronegativos e são mais sensíveis e específicos, particularmente no diagnóstico de cães assintomáticos. Um dos maiores obstáculos na implementação de ensaios moleculares é a falta de padronização. Mais de 400 publicações sobre o diagnóstico molecular da leishmaniose foram realizadas desde 1989, porém pouquíssimas compararam a eficiência das diversas técnicas disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar diferentes métodos de PCR em diferentes amostras clínicas para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) em cães assintomáticos. Amostras clínicas de medula óssea, sangue periférico, swab conjuntival e biópsias de pele foram analisadas pelos métodos kDNA PCR hibridização, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Foram utilizados 30 cães assintomáticos positivos na sorologia e no exame parasitológico. Seis cães não infectados foram utilizados como controles. A extração de DNA a partir dos swabs foi realizada pelo método do Fenol-Clorofórmio. Para as amostras de sangue, medula e biópsias de pele foram utilizados kits comerciais. As análises pelo método kDNA PCR hibridização detectaram 5/30 (16,7%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 19/30 (63,3%) para medula e 21/30 (70%) para swab conjuntival. Utilizando-se o método kDNA snPCR, foram encontrados 7/30 (23,3%) cães positivos para sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 12/30 (40%) para as amostras de medula e 24/30 (80%) para amostras de swab conjuntival. Através de método LnPCR foram detectados 9/30 (30%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 15/30 (50%) para medula, 13/30 (43,3%) para as amostras de pele e 19/30 (63,3%) para swab conjuntival. As análises pelo método ITS-1 nPCR das amostras de sangue periférico detectaram 19/30 (63,3%) cães positivos, 19/30 (63,33%) para pele, 29/30 (97%) para medula óssea e 29/30 (97%) para swab conjuntival. Quando comparados os métodos com base no somatório das positividades obtidas para todas as amostras clínicas, o método ITS-1 nPCR obteve 96/120 resultados positivos, o kDNA PCR hibridização 62/120, o kDNA snPCR 60/120 e o LnPCR 56/120. Na comparação da amostras com base na positividade obtida para todos os métodos o swab conjuntival apresentou 93/120 resultados positivos, a medula 68/120, a pele 63/120 e o sangue 40/120. Os resultados deste estudo indicam o swab conjuntival associado ao método ITS 1 nPCR como a melhor opção, entre os métodos e amostras testados, para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral canina em animais assintomáticos. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral canina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Diagnóstico. / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health problem in Brazil. In the urban area the dog is the main source of infection and VL control in Brazil involves the elimination of infected dogs. Serological tests are used for routine surveys, but they present problems of specificity and sensitivity. Molecular methods as the PCR are useful in the diagnosis and identification of Leishmania species. PCR is able to detect seronegative animals and is more sensitive and specific, particularly in the diagnosis in asymptomatic dogs. One obstacle on the implementation of molecular assays is the lack of standardization. More than 400 articles on the diagnosis of leishmaniasis had been pubhished since 1989, however a few studies had compared the efficiency of the diverse available techniques. The aim of this work was compare different methods of PCR in different clinical samples for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in asymptomatic animals. Bone marrow, peripheral blood, conjunctival swab and skin biopsies had been analyzed by the methods kDNA PCR - Hybridization, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Thirty positive asymptomatic dogs for serology and parasitology examination had been used. Six not infected dogs had been used as controls. The DNA extration from swabs was performed by Phenol-Chloroform method. Commercial kits had been used for DNA extraction of peripheral blood, bone marrow and skin biopsies. The kDNA PCR - Hybridization detected 5/30 (16.7%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 19/30 (63.3%) for bone marrow and 21/30 (70%) for conjunctival swab. Using the method kDNA snPCR had been found 7/30 (23.3%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 12/30 (40%) for bone marrow and 24/30 (80%) samples of conjunctival swab. Through LnPCR method 9/30 (30%) positive dogs for the samples of peripheral blood had been detected, 15/30 (50%) for bone marrow, 13/30 (43.3%) for the samples of skin and 19/30 (63.3%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR analyse showed 19/30 (63.3%) positive dogs for peripheral blood, 19/30 (63.33%) for skin, 29/30 (97%) for bone marrow and 29/30 (97%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR was superior to other methods based on the positivities obtained using the summatory of all clinical samples. The ITS-1 nPCR obtained 96/120 positive results, kDNA PCR-hibridization 62/120, kDNA snPCR 60/120 and LnPCR 56/120. The conjunctival swab presented the best result considering the summatory of the positivities obtained by all methods. The conjunctival swab obtained 93/120 positive results, medula 73/120, skin biopsies 68/120 and blood 40/120. The results of this study indicated the conjunctival swab associated to ITS-1 nPCR as the best option for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, among the methods and samples analysed.

Nenhuma / O diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) é uma etapa importante do programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil uma vez que o cão é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar o swab conjuntival (SC) como uma ferramenta de triagem em massa para o diagnóstico molecular da LVC em uma área endêmica classificada como prioritária para as ações de vigilância do Ministério da Saúde. Um total de 1.350 cães domiciliados foi envolvido neste estudo. Os animais foram avaliados por testes sorológicos (ELISA como triagem e IFI para confirmação) e moleculares. A PCR em tempo real, tendo como alvo os minicírculos do kDNA, foi o principal teste molecular utilizado para análise das amostras de SC. Dos 1.350 cães triados 369 (27,3%) foram positivos no SC-PCR em tempo real e 126 (9,3%) obtiveram resultado positivo por ELISA. Trinta e um por cento (39/126) dos cães positivos no teste de ELISA foram confirmados pelo IFI, enquanto que comparativamente 83,3% (105/126) obtiveram resultados positivos no método SC-PCR em tempo real. Entre os cães avaliados, um subgrupo de 484 animais foi adicionalmente submetido à avaliação clínica e diagnóstico molecular através do SC associado ao ITS-1 nested PCR. Neste subgrupo o número de animais positivos por SC-PCR em tempo real foi 156/484 (32,2%), por SC-ITS-1 nested PCR 44/484 (9,0%) e por ELISA 52/484 (10,7%). SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção em cães, independentemente do grau de sintomatologia (p> 0,05), enquanto ELISA foi mais sensível no grupo de cães que apresentavam três ou mais sinais clínicos relacionados à LVC (SII). Cães infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis e L. (L.) amazonensis foram também identificados neste estudo através de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) dos amplicons obtidos por ITS-1 nested PCR. Os resultados do presente estudo demonstraram que o SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar um maior número de cães infectados que o ELISA e que a prevalência de infecções caninas tem sido subestimada pelos testes sorológicos. A utilização de métodos diagnósticos altamente sensíveis como SC-PCR em tempo real, principalmente em áreas endêmicas, poderia dar uma contribuição significativa para o controle da enfermidade. / The canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis is an important step of visceral leishmaniais control program in Brazil once the dog is the main animal reservoir host of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiologic agent of the disease. The aim of this study was to evaluate conjunctival swab (CS) as a mass-screening tool for CVL molecular diagnosis in an endemic area classified as priority for the Brazilian Ministry of Healthy for surveillance action. A total of 1,350 domiciled dogs were screened. The animals were evaluated by the serological tests (ELISA as screening and IFI for confirmation) and by CS associated to real-time PCR using kDNA minicircles as targets. Of the 1,350 dogs screened 369 (27.3%) were positive by CS real-time PCR and 126 (9.3%) tested positive by ELISA. Thirty one percent (39/126) of the ELISA positive dogs were confirmed by IFI, while 83.3% (105/126) tested positive in the CS real-time PCR assay. Among the dogs screened, a sub-group of 484 animals were also submitted to clinical evaluation and molecular diagnosis using CS associate to ITS-1 nested PCR. In this sub-group the number of animais positive by CS real-time PCR was 156/484 (32.2%), by CS ITS-1 nested PCR 44/484 (9.0%) and by ELISA 52/484 (10.7%). The CS real-time PCR was able to detect infection in dogs independently of the symptomatology degree (p > 0.05), while ELISA was more sensitive in the group of dogs that present three or more clinical signs related to CVL (SII). Dogs infected by L. (Viannia) braziliensis and L. (L.) amazonensis were also found in this study by means of RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analysis of ITS-1 nested PCR amplicons. The results of present study demonstrated that CS real-time PCR was able to detected a higher number of infected dogs than ELISA and that the prevalence of canine infections has been underestimated by the serological assays. The use of sensitive molecular diagnostic methods like CS real-time PCR, mainly in endemic areas, could greatly contribute to disease control.