Leishmaniose é uma zoonose desenvolvida por protozoários do gênero Leishmania. A doença se manifesta sob a forma visceral e cutânea cujo tratamento apresenta diversas limitações como alto custo, elevada toxicidade dos fármacos e altos índices de recidiva. A leishmaniose cutânea abrange lesões destrutivas e ulceradas que podem evoluir para condições mais graves culminando em óbito dos hospedeiros acometidos. Tratamentos alternativos tem sido implementados com a finalidade de proporcionar acessibilidade financeira e menores efeitos colaterais aos pacientes. A terapia fotodinâmica se insere nesse contexto devido à praticidade, custo reduzido, mínima toxicidade e sem relatos de resistência descritos na literatura. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica em leishmaniose cutânea induzida em camundongos BALB/c infectados com leishmaniose cutânea. A otimização da PDT também foi avaliada pela administração de doadores de óxido nítrico (S-nitroso-MSA) encapsulados em nanopartículas de quitosana (CSNPs), já que esse composto é altamente reativo e potencialmente tóxico para o parasito. Camundongos BALB/c foram infectados no membro posterior esquerdo com 1.106 promastigotas de Leishmania (L) amazonensis que expressam o gene da luciferase e acompanhados por 4 semanas até o surgimento da lesão. Após esse período, os animais foram distribuídos em 6 grupos (n=4): Controle (não tratado), PDT1 (submetidos à uma sessão de PDT), PDT2 (duas sessões ), PDT1NPNO e PDT2NPNO (uma sessão e duas sessões de PDT em associação com S-nitroso-MSACPNPS, respectivamente), e NPNO (somente S-nitroso-MSA-CP NPS). A segunda sessão foi realizada 24 h após a primeira. A PDT foi efetuada usando um diodo emissor de luz (LED, λ=660 ± 22 nm) e azul de metileno (100 μM), com densidade de energia de 150 J/cm2. O progresso da doença foi avaliado por meio do tamanho da lesão e escala de dor utilizando um paquímetro e filamentos von Frey, respectivamente. A carga parasitária foi quantificada por intermédio do bioimageamento nas primeiras 96 h após o tratamento e nas 4 semanas seguintes. Os resultados obtidos demonstraram redução na carga parasitária durante o período experimental, com exceção do grupo PDT1NPNO. Houve redução parasitária significante em 72 h e 96 h para os grupos PDT2, PDT2NPNO e NPNO. A maior redução da lesão foi observada para o grupo PDT2 bem como menor sensibilidade ao estímulo doloroso. Nossos resultados indicam efeitos benéficos da PDT em duas sessões, sugerindo que pode ter ocorrido modulação do processo inflamatório. Entretanto, o uso das nanopartículas nas condições utilizadas nesse experimento não foi capaz de otimizar a eficiência da PDT nos animais infectados com Leishmania (L) amazonensis. / Leishmaniasis is a zoonotic disease developed by protozoa of genus leishmania. There are two dominant forms including visceral and cutaneous manifestations in which treatments are limited because of price, toxicity and resistance. Cutaneous leishmaniasis (CL) promotes destructive and ulcerated lesions that might intensify to a more severe symptom that could lead to patient death. Alternative treatments have been studied to promote reduction of side effects, cost and higher efficacy for the hosts. Photodynamic therapy has been introduced once the technic is practical, less expensive and with no resistance described in literature. Additionally, several studies indicate that the administration of exogenous NO donors represents an interesting strategy against cutaneous leishmaniasis. The aim of this work was to evaluate the effects of photodynamic therapy on cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice. Besides, the optimization of PDT was evaluated through its association with encapsulated NO donors (S-nitroso-MSA) in chitosan nanoparticles (CSNPs) on CL in BALB/c mice using real time bioluminescence. In addition, we monitored lesion size progression and hyperalgesia. Promastigotes of L. (L) amazonensis transgenic line expressing luciferase were used. BALB/c mice were infected in the left footpad with 1.106 promastigotes. After 4 weeks, mice were randomly assigned to 6 experimental groups (n=4): Control (non-treated), PDT1 (submitted to one PDT session) PDT2 (submitted to two PDT sessions), (PDT1NPNO and PDT2NPNO (submitted to one and two PDT sessions following S-nitroso-MSA-CSNPs, respectively) and NPNO (treated only with S-nitroso-MSA-CSNPs). The second PDT session was performed 24 h after the first. PDT was performed using a red LED (λ= 660±22 nm), MB (100 μM) and fluence of 150 J/cm2. Disease progression was evaluated once a week for 4 weeks by measuring lesion size with a caliper and hyperalgesia with von Frey filaments. Parasite burden was analyzed through luciferase detection by bioimaging, every day, in the first 96 h and then for the next 4 weeks. Test groups presented significant reduction in parasite load compared to control during all experimental period except for PDT2NPNO. Our results indicate that two PDT sessions were more efficient suggesting a modulation of the inflammatory process. However, under these conditions, our results demonstrate that CSNPs were not able to enhance MB-mediated PDT efficiency on parasite burden on L. (L) amazonensis-induced CL in mice.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é doença endêmica no Brasil onde apresenta aumento contínuo do número de casos bem como expansão da área geográfica de detecção de casos. Na Amazônia, a situação epidemiológica da LTA é ainda mais complexa, pois há várias espécies de leishmânia como agente causal da doença, cada espécie com seus reservatórios e vetores próprios podendo determinar diferentes quadros clínicos com diversas respostas ao tratamento medicamentoso. O município de Santarém situa-se no oeste do estado do Pará, onde há alta endemicidade da LTA. A participação de cada espécie de leishmânia nos casos de leishmaniose cutânea (LC) na região não é ainda conhecida através de estudos definitivos. Este trabalho tem como objetivo principal identificar as espécies de leishmânia nos casos de pacientes portadores de LC atendidos no Centro de Controle de Zoonoses de Santarém (CCZS) no ano de 2003, e estudar a possibilidade de diferenças significativas na apresentação clínica das lesões causadas pelas diferentes espécies do parasito. Através de duas técnicas moleculares, uma através de identificação de sequência de nucleotídeos que codifica a subunidade menor do RNA ribossomal e outra que identifica sequência de gene que codifica a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, aplicadas em material de biópsia de 93 pacientes atendidos no CCZS, durante o ano de 2003, identificamos espécies de leishmânias. Com os métodos realizados consegue-se diferenciar Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.) amazonensis e o grupo de outras espécies do gênero Leishmania (V.) que não Leishmania (V.) braziliensis a que chamamos Leishmania (L.) outras espécies. As espécies encontradas e suas proporções foram: Leishmania (V.) braziliensis 57%, Leishmania (V.) outras espécies 37% e Leishmania (L.) amazonensis 5%. Encontrou-se maior proporção de lesões em membros inferiores nos casos ocasionados por Leishmania (V.) braziliensis. Não foram encontradas diferenças significativas em outras características clínicas analisadas, tais como sexo, idade e número de lesões. / Tegumentary leishmaniasis (TL) is an endemic disease in Brazil, where it shows a continual rise in the number of cases, as well as geographic expansion in the area of detected cases. In the Amazon, the epidemiological situation of TL is even more complex because there are several species of leishmania as causal agent of the disease, each species with its own reservoir hosts and sandfly vectors being able to determine different clinical expressions with diverse responses to medical treatment. The municipality of Santarem is located in the western part of the state of Pará, where there are high endemic levels of TL. The participation of each species of leishmania in the cases of cutaneous leishmaniasis (CL) in the region has not yet been determined through definitive studies. The principal object of this study is to identify the species of leishmania in the cases of carriers who were patients at the Santarem Zoonosis Control Center in the year 2003, and to study the possibility of significant differences in the clinical presentation of lesions caused by different species of the parasite. We identified species of Leishmania using two molecular techniques, the first through identifying the sequence of nucleotides that encodes the smaller subunit of ribossomal RNA and another that identifies the gene sequence that encodes the enzyme glicose-6-phosphate desidrogenasis applied to biopsy material from 93 patients of the Santarem Zoonosis Control Center, during the year 2003. Using these methods we were able to differentiate Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.) amazonensis and the other species of the genus Leishmania (V.) that were not Leishmania (V.) braziliensis which we call Leishmania (L.) of other species. The species found and their proportions were: Leishmania (V.) braziliensis 57%, Leishmania (V.) other species 37%, and Leishmania (L.) amazonensis 5%. A greater proportion of lesions was found in inferior members in the cases of Leishmania (V.) braziliensis. Significant differences were not found in other analyzed clinical characteristics, such as sex, age, and number of lesions.

Leishmaniose é uma zoonose desenvolvida por protozoários do gênero Leishmania. A doença se manifesta sob a forma visceral e cutânea cujo tratamento apresenta diversas limitações como alto custo, elevada toxicidade dos fármacos e altos índices de recidiva. A leishmaniose cutânea abrange lesões destrutivas e ulceradas que podem evoluir para condições mais graves culminando em óbito dos hospedeiros acometidos. Tratamentos alternativos tem sido implementados com a finalidade de proporcionar acessibilidade financeira e menores efeitos colaterais aos pacientes. A terapia fotodinâmica se insere nesse contexto devido à praticidade, custo reduzido, mínima toxicidade e sem relatos de resistência descritos na literatura. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica em leishmaniose cutânea induzida em camundongos BALB/c infectados com leishmaniose cutânea. A otimização da PDT também foi avaliada pela administração de doadores de óxido nítrico (S-nitroso-MSA) encapsulados em nanopartículas de quitosana (CSNPs), já que esse composto é altamente reativo e potencialmente tóxico para o parasito. Camundongos BALB/c foram infectados no membro posterior esquerdo com 1.106 promastigotas de Leishmania (L) amazonensis que expressam o gene da luciferase e acompanhados por 4 semanas até o surgimento da lesão. Após esse período, os animais foram distribuídos em 6 grupos (n=4): Controle (não tratado), PDT1 (submetidos à uma sessão de PDT), PDT2 (duas sessões ), PDT1NPNO e PDT2NPNO (uma sessão e duas sessões de PDT em associação com S-nitroso-MSACPNPS, respectivamente), e NPNO (somente S-nitroso-MSA-CP NPS). A segunda sessão foi realizada 24 h após a primeira. A PDT foi efetuada usando um diodo emissor de luz (LED, λ=660 ± 22 nm) e azul de metileno (100 μM), com densidade de energia de 150 J/cm2. O progresso da doença foi avaliado por meio do tamanho da lesão e escala de dor utilizando um paquímetro e filamentos von Frey, respectivamente. A carga parasitária foi quantificada por intermédio do bioimageamento nas primeiras 96 h após o tratamento e nas 4 semanas seguintes. Os resultados obtidos demonstraram redução na carga parasitária durante o período experimental, com exceção do grupo PDT1NPNO. Houve redução parasitária significante em 72 h e 96 h para os grupos PDT2, PDT2NPNO e NPNO. A maior redução da lesão foi observada para o grupo PDT2 bem como menor sensibilidade ao estímulo doloroso. Nossos resultados indicam efeitos benéficos da PDT em duas sessões, sugerindo que pode ter ocorrido modulação do processo inflamatório. Entretanto, o uso das nanopartículas nas condições utilizadas nesse experimento não foi capaz de otimizar a eficiência da PDT nos animais infectados com Leishmania (L) amazonensis. / Leishmaniasis is a zoonotic disease developed by protozoa of genus leishmania. There are two dominant forms including visceral and cutaneous manifestations in which treatments are limited because of price, toxicity and resistance. Cutaneous leishmaniasis (CL) promotes destructive and ulcerated lesions that might intensify to a more severe symptom that could lead to patient death. Alternative treatments have been studied to promote reduction of side effects, cost and higher efficacy for the hosts. Photodynamic therapy has been introduced once the technic is practical, less expensive and with no resistance described in literature. Additionally, several studies indicate that the administration of exogenous NO donors represents an interesting strategy against cutaneous leishmaniasis. The aim of this work was to evaluate the effects of photodynamic therapy on cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice. Besides, the optimization of PDT was evaluated through its association with encapsulated NO donors (S-nitroso-MSA) in chitosan nanoparticles (CSNPs) on CL in BALB/c mice using real time bioluminescence. In addition, we monitored lesion size progression and hyperalgesia. Promastigotes of L. (L) amazonensis transgenic line expressing luciferase were used. BALB/c mice were infected in the left footpad with 1.106 promastigotes. After 4 weeks, mice were randomly assigned to 6 experimental groups (n=4): Control (non-treated), PDT1 (submitted to one PDT session) PDT2 (submitted to two PDT sessions), (PDT1NPNO and PDT2NPNO (submitted to one and two PDT sessions following S-nitroso-MSA-CSNPs, respectively) and NPNO (treated only with S-nitroso-MSA-CSNPs). The second PDT session was performed 24 h after the first. PDT was performed using a red LED (λ= 660±22 nm), MB (100 μM) and fluence of 150 J/cm2. Disease progression was evaluated once a week for 4 weeks by measuring lesion size with a caliper and hyperalgesia with von Frey filaments. Parasite burden was analyzed through luciferase detection by bioimaging, every day, in the first 96 h and then for the next 4 weeks. Test groups presented significant reduction in parasite load compared to control during all experimental period except for PDT2NPNO. Our results indicate that two PDT sessions were more efficient suggesting a modulation of the inflammatory process. However, under these conditions, our results demonstrate that CSNPs were not able to enhance MB-mediated PDT efficiency on parasite burden on L. (L) amazonensis-induced CL in mice.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-07-07T19:34:26Z No. of bitstreams: 1 LuecyaSilva.pdf: 2660181 bytes, checksum: 43c675e9011eb6a8b5a8e8e2efc29119 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T19:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuecyaSilva.pdf: 2660181 bytes, checksum: 43c675e9011eb6a8b5a8e8e2efc29119 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The plant species Anacardium Occidentale known in Brazil as cashew tree represents a great economic, social and medical relevance. This study aims to perform the synthesis of the emulsion-type formulation with extract of flowers from A. occidentale L. and evaluates its cicatrizant effect (Chapter I); evaluates the leishmanicidal activity in vitro and in vivo from the extract and base formulation of the flowers from A. occidentale L. (Chapter II); develops and testes a biotech product with biological activity, based on the extract from the flowers of A. occidentale (Chapter III). After developing the biotechnological product, a formulation of emulsion-type based extract of A. occidentale flowers, physicochemical stability tests were performed. It was found, that the formulation showed more stability at room temperature showing no phase separation, loss of viscosity or any of its desirable characteristics throughout the study. In addition, it was shown that the formulation has important cicatrizing activity, possibly related to the IL-6 increase. Furthermore, in vitro antiLeishmania tests were performed using infected macrophages Raw and promastigotes of Leishmania amazonensis, and in vivo using BALB / c mice infected with this protozoan. The results show that the extract of A. occidentale flowers inhibits the growth of promastigotes of L. amazonensis, in vitro and in vivo, as it reduces the viability of promastigotes and infection in macrophages, and reduce the parasitic load of the infection in vivo, possibly by direct action of the extract on the protozoa. Isolated compounds present in plant species, on the other hand, do not exhibit Leishmanicidal effect against L. amazonensis promastigotes. In the same manner, the formulation emulsion-type containing A. occidentale extract has no Leishmanicidal effect while reducing the size of the lesion, when compared to treatment with standard drugs. In conjunction, the results indicate that Anacardium occidentale has pharmacological potential for mining products to be used in the treatment of leishmaniasis and scarring. / A espécie vegetal Anacardium occidentale, conhecida, no Brasil, como cajueiro é uma árvore que apresenta grande relevância econômica, social e medicinal. Este trabalho teve como objetivos: realizar a síntese de formulação do tipo emulsão com extrato das flores de A. occidentale L e avaliar seu efeito cicatrizante (CAPÍTULO I); avaliar a atividade leishmanicida in vitro e in vivo do extrato e formulação a base das flores de A. occidentale L. (CAPÍTULO II); desenvolver e testar um produto biotecnológico com atividade biológica, tendo como base o extrato das flores de A. occidentale (CAPÍTULO III). Após o desenvolvimento do produto biotecnológico, uma formulação do tipo emulsão a base do extrato de flores de A. occidentale, foram realizados testes de estabilidade físico-química. Constatou-se que a formulação demonstrou maior estabilidade na temperatura ambiente não apresentando separação de fases, perda de viscosidade ou de qualquer uma das suas características ideais durante todo o estudo. Em adição, mostrou-se que a formulação possui importante atividade cicatrizante, possivelmente associada ao aumento de IL-6. Ademais, foram realizados ensaios anti-Leishmania in vitro, utilizando macrófagos Raw infectados, bem como formas promastigotas de Leishmania amazonensis, e in vivo utilizando-se camundongos Balb/c infectados com este protozoário. Os resultados obtidos mostram que o extrato das flores de A. occidentale inibe o crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis, in vitro e in vivo, pois reduz a viabilidade de promastigotas, bem como a infecção em macrófagos, além de diminuir a carga parasitária na infecção in vivo, possivelmente por ação direta do extrato sobre os protozoários. Compostos isolados presentes na espécie vegetal, por outro lado, não apresentam efeito leishmanicida contra as formas promastigotas de L. amazonensis. Do mesmo modo, a formulação do tipo emulsão contendo extrato de A. occidentale não apresenta efeito leishmanicida embora reduza o tamanho da lesão, quando comparado ao tratamento com droga padrão. Em conjunto os resultados indicam que Anacardium occidentale apresenta potencial farmacológico para prospecção de produtos a serem utilizados no tratamento das leishmanioses e cicatrização.

As leishmanioses constituem um grupo de zoonoses causadas por várias espécies do gênero Leishmania. O diagnóstico molecular associado aos exames clínicos, sorológicos e parasitológicos facilitam a investigação epidemiológica e controle das infecções. A PCR convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) são utilizadas para detectar moléculas de DNA do parasita em diferentes amostras biológicas, no entanto, quando a carga parasitária é baixa, resultados falsos-negativos são comuns na rotina diagnóstica. O objetivo deste estudo foi o avaliar a utilidade dos iniciadores para qPCR para substituir ou associar à cPCR no diagnóstico molecular da leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA). Foram testados iniciadores moleculares pelo sistema TaqMan® com o objetivo de discriminar Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi a partir de sequências da actina de Leishmania. O gênero Leishmania foi identificado pelos iniciadores LEISH18S que amplifica uma região 18S de Leishmania. Os iniciadores ACTLDon amplifica uma região da actina de L. (L.) infantum chagasi. L. (V.) braziliensis foi identificada pelos iniciadores ACTLVian, que amplifica uma região da actina do complexo L. (V.) braziliensis. Foram testadas 581 amostras de DNA, extraídas de sangue, necropsias de órgãos, aspirados de linfonodo ou medula e biópsia de lesão. Para LV foram testadas 361 amostras (243 caninas e 118 humanas). Destas, 214 foram positivas na cPCR, foi o padrão ouro, e a sensibilidade com os iniciadores da qPCR variou de 92,99% (199) a 95,32% (204). A especificidade foi determinada por 147 amostras negativas na cPCR e variou de 95,91% (141) a 98,63% (145). Os índices de concordância variaram de 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) a 95,32% (RV1-RV2 e LEISH18S). Foram testadas 220 amostras para LTA. A especificidade com os iniciadores foi determinada por 80 amostras negativas e os resultados foram 98,75% e 100% para LEISH18S e ACTLVian respectivamente, e das 140 amostras positivas na cPCR 129 (92.14%) e 124 (88,57%) foram positivas com os iniciadores LEISH18S e ACTLVian respectivamente. Os índices de concordância foram de 88,57% (LB-3C/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) e 92,14% (LB-3C/LU-5A e LEISH18S). Estes resultados mostram que a associação dos iniciadores para qPCR em conjunto com a cPCR pode aumentar a detecção do parasita em amostras clínicas. / Leishmaniasis are a group of zoonosis caused by several species belonging to the genus Leishmania. The molecular diagnostic associated with the clinical, serological and parasitological examination favor the epidemiological investigation and the infection control. The conventional PCR (cPCR) and the real time PCR (qPCR) are used to detect the parasite as from DNA molecules in a number of biological samples, however, when the parasite load is low, false results are common in the diagnostic routine. The ain of the present study was to evaluate the advantage of the primers in qPCR in order to replace or associate with cPCR in the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) molecular diagnostic. The primers were tested on TaqMan® system in order to discriminate Leishmania (Viannia) braziliensis and Leshmania (Leishmania) infantum chagasi based on a sequence of Leishmania actin. The genus Leishmania was recognized by the primer LEISH18S, which amplifies an 18S region of Leishmania. The primer ACTLDon amplifies a region of the L. (L.) infantum chagasi actin. The L. (V.) braziliensis was determined by the primer ACTLVian and this primer amplifies a region of the L. (V.) braziliensis complex actin. A total of 581 DNA samples were tested. These samples were extracted from blood, organs necropsy, lymph node and bone marrow aspirate and lesion biopsy. A number of 361 samples (243 canine and 118 human) were tested for VL. From these 361 samples, 241 were positive in cPCR and the sensitivity in the qPCR primers ranged from 92,99% (199) to 95,32 (204). The specificity was determined by 147 negative samples in cPCR and ranged from 95,91% (141) to 98,63 % (145). The agreement indices ranged from 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) to 95,32% (RV1-RV2 and LEISH18S). A total of 220 samples were tested for CL. The primer\'s specificity was determined by 80 negative samples and the results were 98,75% and 100% for LEISH18S and ACTLVan respectively, and from 140 positive samples in cPCR 129 (92,14%) and 124 (88,57%) were positive for primers LEISH18S and ACTLVian respectively. The agreement indices were 88,57% (LB-3/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) and 92,14% (LB-3C/LU-5A and LEISH18S). These results show that the primers for qPCR are likely to improve the detection of the parasite in clinical samples. These results show that the associate use of qPCR primers with cPCR primers can increase the detection of the parasite in clinical samples.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde (pos.saude@ufba.br) on 2017-09-28T13:14:20Z No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / Approved for entry into archive by Uillis de Assis Santos (uillis.assis@ufba.br) on 2017-09-28T13:20:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T13:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Aline Muniz.pdf: 4528280 bytes, checksum: 1946bc2b7d10cc438a4d5f012ee6f207 (MD5) / INTRODUÇÃO: Leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais comum causada por Leishmania braziliensis. Dez a 15% de indivíduos sadios residentes em uma área endêmica de Leishmania sem história prévia de LC apresentam um teste intradérmico para o antígeno solúvel de leishmania (SLA) positivo e são considerados como tendo a forma subclínica (SC) da doença. Os mecanismos envolvidos no controle da infecção SC por L. braziliensis são desconhecidos. OBJETIVO: Determinar fatores imunológicos associados com o desenvolvimento da infecção subclínica ou da leishmaniose cutânea (LC) em indivíduos expostos à infecção por Leishmania braziliensis. METODOLOGIA: Uma coorte de 308 contatos familiares (CF) de pacientes com LC, sem história de doença foi estabelecido em 2010 em uma área endêmica de leishmaniose tegumentar. Os indivíduos foram acompanhados por cinco anos e participaram de avaliações clínicas e estudos imunológicos. A avaliação da produção de IFN-γ e quimiocinas em culturas de sangue total estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA) e o teste de intradermo reação de Montenegro (RM) foram realizados no início do estudo (ano zero), ano dois e no ano quatro. A identificação das células produtoras de IFN-γ foi realizada por citometria de fluxo e foi determinada a capacidade dos monócitos em controlar a infecção por Leishmania. Durante todo o período os indivíduos foram monitorados para identificar o aparecimento de LC. RESULTADOS: A infecção por L. braziliensis foi evidenciada em 118 (38,3%) indivíduos. LC foi documentada em 45 (14,6%) indivíduos, 101 (32,8%) apresentaram infecção SC e 162 (52,6%) não tinham indícios de exposição à L. braziliensis. A razão de infecção para a doença foi de 3,2:1 e apenas 3% dos indivíduos que apresentaram apenas produção de IFN-γ adoeceram. Houve uma correlação direta e uma concordância razoável entre a RM e a produção de IFN-γ [κ: 0,23 (95% IC: 0.12-0.35)]. Enquanto a produção de IFN-γ por células NK foi associada com proteção, uma RM positiva não impediu o desenvolvimento da doença. Monócitos de indivíduos SC controlaram mais a infecção do que monócitos de indivíduo com LC. Pode haver negativação tanto da RM quanto da produção de IFN-γ. CONCLUSÕES: Proteção contra a LC foi associada com a produção de IFN-γ por células NK, resultados do teste intradérmico negativos e maior capacidade dos monócitos dos indivíduos SC em impedir e controlar o crescimento do parasito na infecção por L.braziliensis.

As leishmanioses constituem um grupo de zoonoses causadas por várias espécies do gênero Leishmania. O diagnóstico molecular associado aos exames clínicos, sorológicos e parasitológicos facilitam a investigação epidemiológica e controle das infecções. A PCR convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) são utilizadas para detectar moléculas de DNA do parasita em diferentes amostras biológicas, no entanto, quando a carga parasitária é baixa, resultados falsos-negativos são comuns na rotina diagnóstica. O objetivo deste estudo foi o avaliar a utilidade dos iniciadores para qPCR para substituir ou associar à cPCR no diagnóstico molecular da leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA). Foram testados iniciadores moleculares pelo sistema TaqMan® com o objetivo de discriminar Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi a partir de sequências da actina de Leishmania. O gênero Leishmania foi identificado pelos iniciadores LEISH18S que amplifica uma região 18S de Leishmania. Os iniciadores ACTLDon amplifica uma região da actina de L. (L.) infantum chagasi. L. (V.) braziliensis foi identificada pelos iniciadores ACTLVian, que amplifica uma região da actina do complexo L. (V.) braziliensis. Foram testadas 581 amostras de DNA, extraídas de sangue, necropsias de órgãos, aspirados de linfonodo ou medula e biópsia de lesão. Para LV foram testadas 361 amostras (243 caninas e 118 humanas). Destas, 214 foram positivas na cPCR, foi o padrão ouro, e a sensibilidade com os iniciadores da qPCR variou de 92,99% (199) a 95,32% (204). A especificidade foi determinada por 147 amostras negativas na cPCR e variou de 95,91% (141) a 98,63% (145). Os índices de concordância variaram de 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) a 95,32% (RV1-RV2 e LEISH18S). Foram testadas 220 amostras para LTA. A especificidade com os iniciadores foi determinada por 80 amostras negativas e os resultados foram 98,75% e 100% para LEISH18S e ACTLVian respectivamente, e das 140 amostras positivas na cPCR 129 (92.14%) e 124 (88,57%) foram positivas com os iniciadores LEISH18S e ACTLVian respectivamente. Os índices de concordância foram de 88,57% (LB-3C/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) e 92,14% (LB-3C/LU-5A e LEISH18S). Estes resultados mostram que a associação dos iniciadores para qPCR em conjunto com a cPCR pode aumentar a detecção do parasita em amostras clínicas. / Leishmaniasis are a group of zoonosis caused by several species belonging to the genus Leishmania. The molecular diagnostic associated with the clinical, serological and parasitological examination favor the epidemiological investigation and the infection control. The conventional PCR (cPCR) and the real time PCR (qPCR) are used to detect the parasite as from DNA molecules in a number of biological samples, however, when the parasite load is low, false results are common in the diagnostic routine. The ain of the present study was to evaluate the advantage of the primers in qPCR in order to replace or associate with cPCR in the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) molecular diagnostic. The primers were tested on TaqMan® system in order to discriminate Leishmania (Viannia) braziliensis and Leshmania (Leishmania) infantum chagasi based on a sequence of Leishmania actin. The genus Leishmania was recognized by the primer LEISH18S, which amplifies an 18S region of Leishmania. The primer ACTLDon amplifies a region of the L. (L.) infantum chagasi actin. The L. (V.) braziliensis was determined by the primer ACTLVian and this primer amplifies a region of the L. (V.) braziliensis complex actin. A total of 581 DNA samples were tested. These samples were extracted from blood, organs necropsy, lymph node and bone marrow aspirate and lesion biopsy. A number of 361 samples (243 canine and 118 human) were tested for VL. From these 361 samples, 241 were positive in cPCR and the sensitivity in the qPCR primers ranged from 92,99% (199) to 95,32 (204). The specificity was determined by 147 negative samples in cPCR and ranged from 95,91% (141) to 98,63 % (145). The agreement indices ranged from 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) to 95,32% (RV1-RV2 and LEISH18S). A total of 220 samples were tested for CL. The primer\'s specificity was determined by 80 negative samples and the results were 98,75% and 100% for LEISH18S and ACTLVan respectively, and from 140 positive samples in cPCR 129 (92,14%) and 124 (88,57%) were positive for primers LEISH18S and ACTLVian respectively. The agreement indices were 88,57% (LB-3/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) and 92,14% (LB-3C/LU-5A and LEISH18S). These results show that the primers for qPCR are likely to improve the detection of the parasite in clinical samples. These results show that the associate use of qPCR primers with cPCR primers can increase the detection of the parasite in clinical samples.

Leishmaniasis is a worldwide neglected disease with high impact among the underprivileged population, especially in developing countries. The therapeutic arsenal is limited, outdated and causes serious side effects and can even cause death. In addition, studies show that there is great resistance of the parasite to treatment. In this regard, 18 (4a - 4o) new dialkylphosphorylhydrazones compounds were synthesized and evaluated against the parasites Leishmania species. Initially, we evaluated the effect of these compounds against L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes in vitro. It was observed that all of compounds showed activity against these parasite, except 4a, 4c and 4e. In order to assess a potential toxicity against mammalian cells, MTT assay were performed in J774 macrophages treated with compounds. All The compounds showed low cytotoxicity with LC50 values >100 mM, except for 4o, which was toxic to approximately 20% of the treated cells. Using the EC50, Emax and cytotoxicity parameters, 4m and 4n compounds were chosen for the subsequent tests. These compounds were tested antiamastigote assay in vitro. In this test, the average of the number of parasites per macrophage, the percentage of infected macrophages and infection index of L. amazonensis-infected macrophages were reduced dose dependently by both compounds, similar to standard drug miltefosine. Since these compounds showed anti-leishmania activity in vitro, later it was tested 4m and 4n anti-leishmania effect in mouse model of cutaneous leishmaniasis, that mimics human disease. In this assay, the oral treatment with both compounds caused a complete healing of nodules and ulcers in L. amazonensis-infected mice ears, but the control of parasite burden at the inoculation site was reduced only in the case of treatment with 4n. On the other hand, none of two compounds interfered in systemic parasite burden, once they did not reduce parasite levels in draining lymph nodes. Thereafter, we also evaluate 4m and 4n effect in L. chagasi-induced visceral leishmaniasis in hamsters (Mesocricetus auratus). Firstly, in vitro assays against promastigotes and amastigotes form of L. chagasi were performed. Similar to observed previously, 4m and 4n were active against both L. chagasi forms. In addition, by scanning electron microscopy, it was observed that promastigotes treated with 4m compound presented multiple flagellae, aberrant shapes and multi-septation; while 4n treatment caused cell body shrinkage and multi-septation. In in vivo test, 15 days after oral treatment with 4m and 4n, it was evaluated the visceral organs weight (spleen and liver). Despite this treatment did not reduce organs weight, it reduced the parasite burden in spleen, which indicate oral effect of 4m and 4n against visceral leishmaniasis in mice. Also, it was observed that 4m and 4n treatment did not induce hepatotoxicity and nephrotoxicity, since they did not increase the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea and creatinine. Taken together, these data indicate that dialkylphosphorylhydrazones compounds are active against Leishmania species, mainly 4m and 4n compunds, which are orally active against cutaneous and visceral leishmanisis. This indicate that 4m and 4n could be new lead compounds therapeutically useful against leishmaniasis. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose é uma doença negligenciada mundialmente com alto impacto dentre a população menos favorecida, principalmente em países em desenvolvimento. O arsenal terapêutico é restrito, ultrapassado e provoca efeitos adversos graves, podendo causar até a morte. Além disso, estudos mostram que há grande resistência do parasita ao tratamento. Nesse sentido, foram racionalmente planejados e sintetizados 18 novos derivados dialquifosforilhidrazonas (4a - 4o) e avaliados contra espécies de Leishmania. Inicialmente, foi avaliado o efeito desses compostos contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis in vitro. Observou-se que todos os compostos apresentaram atividade contra esses parasitos, exceto os compostos 4a, 4c e 4e. Para avaliar a toxicidade destes compostos contra células de mamíferos, foi realizado o ensaio de MTT em macrófagos J774. Nesse ensaio nenhum derivado apresentou citotoxicidade na concentração avaliada (100 mM), exceto 4o, que foi tóxico para aproximadamente 20% das células tratadas. Em seguida, utilizando os parâmetros de CI50, Emax e citotoxicidade, foram escolhidos os compostos 4m e 4n para os testes subsequentes. Esses compostos foram avaliados in vitro no ensaio de amastigota. Nesse teste, a média do número de parasitas por macrófago, a porcentagem de macrófagos infectados e o índice de infecção dos macrófagos por L. amazonensis foram reduzidos de forma dependente de dose por ambos os compostos, semelhante ao fármaco padrão Miltefosina. Uma vez que estas moléculas apresentaram atividade leishmanicida in vitro, foi avaliado o efeito de 4m e 4n no modelo de leishmaniose cutânea em camundongos, que mimetiza a doença em humanos. O tratamento oral com ambos os compostos promoveu a cicatrização total de nódulos e úlceras nas orelhas de camundongos infectados com L. amazonensis, porém apenas o tratamento com 4n reduziu a carga parasitária no local do inóculo. Além disso, nenhum dos compostos interferiu na carga parasitária sistêmica, uma vez que eles não reduziram os níveis dos parasitas nos linfonodos drenantes. O efeito de 4m e 4n foi também avaliado contra L. chagasi, causadora da forma visceral da doença. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro contra as formas promastigotas e amastigotas de L. chagasi. Semelhante ao que foi observado anteriormente, 4m e 4n foram ativos contra ambas as formas de L. chagasi. Além disso, por meio de microscopia eletrônica de varredura, observou-se que as formas promastigotas tratadas com 4m apresentaram múltiplos flagelos, formas anômalas e múltiplos septos, enquanto o tratamento com 4n induziu uma redução do corpo celular das promastigotas e a formação de múltiplos septos. No modelo de leishmaniose visceral em hamsters (Mesocricetus auratus), 15 dias após os tratamentos, o peso dos órgãos viscerais (fígado e baço) foi avaliado. Embora esse tratamento não tenha reduzido o peso dos órgãos, reduziu a carga parasitária no baço, o que indica um efeito oral leishmanicida dos compostos 4m e 4n contra a forma visceral. Adicionalmente, foi observado que o tratamento com 4m e 4n não induziu hepatotoxicidade nem nefrotoxicidade, uma vez que os níveis de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), ureia e creatinina não estavam elevados após o tratamento. Em conjunto, esses dados indicam que os compostos dialquilfosforilhidrazonas são ativos contra espécies de Leishmania, principalmente os compostos 4m e 4n, que são foram ativos por via oral contra leishmaniose cutânea e visceral. Indicando que estes podem ser considerados novos protótipos para o tratamento da leishmaniose.

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa endêmica no Brasil, causada por protozoários do gênero Leishmania e possui duas formas clínicas principais, a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). Os macrófagos têm papel crucial na patogênese da Leishmaniose como hospedeiros do parasita e atuam como células apresentadoras de antígenos, promovendo uma resposta imune de perfil Th1 contra a Leishmania. Os macrófagos polarizados M2, relacionados com resposta anti-inflamatória (Th2), são envolvidos no controle da inflamação e dano tecidual em várias doenças e estão associados à cronicidade nas doenças infecciosas. O objetivo deste trabalho foi verificar a participação dos macrófagos M2 nos sítios de lesão cutânea da LTA MÉTODOS: Sessenta e três biópsias de pele de lesões de LTA, obtidas de 48 doentes com LC e 15 de LMC, foram submetidas ao método imuno-histoquímico com os anticorpos anti-CD163 e anti-CD206, marcadores de macrófagos M2. Dez espécimes foram também submetidos à técnica imuno-histoquímica de dupla marcação com a utilização dos marcadores pSTAT-1 e CD68 para identificação de macrófagos M1 e CMAF e CD163 para identificação de macrófagos M2. RESULTADOS: Os espécimes de pele com reação inflamatória difusa (n = 26) exibiram maior número de células imunomarcadas com CD163, quando comparadas ao grupo com reação granulomatosa bem organizada (n = 37) (p= 0,01). Os macrófagos CD163+ também foram mais numerosos nas lesões de pele com a presença de formas amastigotas de Leishmania (n = 39) ao exame histopatológico (p=0,02), quando comparadas às lesões onde os parasitas não foram observados (n = 24). O mesmo ocorreu quando comparados somente os espécimes do grupo de doentes com LC com a presença de parasitas (n = 31) e ausência dos mesmos (n = 17) (p = 0,04). As lesões de pele de doentes com LMC mostraram maior número de células CD206+ (n = 15) que a de doentes com LC (n = 48) (p=0,008). Houve correlação positiva entre o número de células imunomarcadas com os anticorpos CD163 e CD206 (r de Spearman= 0,369). Os macrófagos +pSTAT1/CD68+ (M1) mostraram-se mais numerosos que os macrófagos CMAF+/CD163+ (M2) nos sítios de lesão cutânea da LTA. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos sugerem que os macrófagos M2 têm um papel na resposta imune \"in situ\" da LTA. Essas células devem atuar como células alvo, facilitando a entrada dos parasitas, a progressão da doença e parecem estar envolvidos nos mecanismos de cronicidade e nos processos de remodelamento tecidual dessa doença. As moléculas CD163 e CD206 podem ser consideradas bons marcadores teciduais de macrófagos M2, uma vez que mostraram correlação positiva em sua expressão. A técnica de dupla marcação confirmou a presença dos macrófagos M2 nas lesões cutâneas da LTA. Embora ocorra a presença de macrófagos M2, os macrófagos M1 são a população macrofágica predominante da resposta imune \"in situ\" da LTA / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an endemic infectious disease in Brazil, caused by Leishmania parasites and it has two main clinical forms, cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Macrophages play a key role in leishmaniasis pathogenesis. They are definite parasite host and act as antigen presenting cells, eliciting a Th1 pattern of immune response (M1) against Leishmania. M2 polarized macrophages, related to an anti-inflammatory response (Th2), are involved in controlling inflammation and tissue damage in several diseases and are related to chronicity in infectious diseases. The aim of this study was verifying M2 macrophages \"in situ\" participation in ATL. METHODS: Sixty-three skin biopsies from LTA lesions, obtained from patients with CL (n=48) and MCL (n=15), were subjected to imunohistochemical technique with M2 macrophages markers CD163 and CD206 antibodies. Ten samples were selected for double staining technique with pSTAT1 and CD68 markers for M1 identification, and CMAF and CD163 markers for M2 macrophages identification. RESULTS: Skin samples displaying diffuse inflammatory reaction (n = 26) exhibited higher number of CD163 immune stained macrophages when compared to the well-organized granulomatous reaction group (n = 37) (p=0.01). CD163+ macrophages were higher in samples displaying Leishmania parasites (n = 39) at histopathology exam than the samples without parasites (n = 24) (p=0.02). Same result was observed when comparing the lesions of CL lesions with (n = 31) and without (n = 17) parasites (p = 0.04). MCL skin lesions (n = 15) showed higher number of CD206+ cells (p = 0.008) in comparison with skin lesions taken from CL patients (n = 48). Spearman test demonstrated a positive correlation between the number of CD163+ and CD206+ immune stained cells (Spearman r = 0,369). M1 macrophages (pSTAT1+/CD68+) were present in higher number when compared to M2 macrophages (CMAF+/CD163+) in the samples studied. CONCLUSIONS: The results suggest that M2 macrophages play a role in the in situ immune response of ATL. M2 polarized macrophages may act as host target cells facilitating parasites entry and promoting disease progression, but also seem to be involved with chronicity and tissue remodeling of ATL lesions. CD163 and CD206 molecules may be considered as good markers for M2 macrophages. Double staining technique confirmed the presence of M2 macrophages, although M1 macrophages are the predominant macrophagic component in skin lesions of ATL

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.