O conhecimento da dinâmica da resistência de pragas a pesticidas é de fundamental importância para a implementação de estratégias de manejo da resistência. Desta forma, o principal objetivo do presente trabalho foi estudar a dinâmica da resistência de Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) ao acaricida dicofol em pomares comerciais de citros durante um período de aproximadamente três anos. Para tanto, foram realizados estudos para avaliar a resposta à pressão de seleção com dicofol em populações de B. phoenicis com diferentes freqüências iniciais de resistência e acompanhamento da freqüência de resistência na ausência de pressão seletiva. Alguns fatores que podem estar envolvidos na dinâmica da resistência de B. phoenicis a acaricidas como a capacidade de dispersão e a efetividade de hospedeiros alternativos como refúgio de indivíduos suscetíveis foram avaliados. Aplicações de dicofol em alguns talhões de citros resultaram em aumentos significativos na freqüência de resistência. A velocidade de restabelecimento da suscetibilidade na ausência de pressão seletiva variou entre os talhões. Em alguns talhões, o restabelecimento da suscetibilidade foi observado em um período de aproximadamente um ano. Em outros talhões, o restabelecimento da suscetibilidade não foi observado mesmo após 29 meses sem o uso do dicofol. Trabalhos de dispersão de B. phoenicis conduzidos em casa de vegetação mostraram que a capacidade de dispersão por caminhamento é limitada. Com a liberação de 6.000 ácaros em um determinado ponto, apenas 3% atingiram distâncias de 40 a 50 cm. As distâncias percorridas por este ácaro foram geralmente inferiores a 1 cm.dia-1. Em condições de laboratório, verificou-se que vento de 23 km.h-1 não foi capaz de arrastar ácaros da superfície de frutos; e velocidades de 30 e 40 km.h-1 foram capazes de arrastar menos de 1% da população de ácaros provenientes tanto de colônias novas quanto de colônias velhas. Trabalhos de dispersão em condições de campo mediante a utilização de armadilhas adesivas também comprovaram que a dispersão de B. phoenicis é bastante limitada quando comparada a de outras espécies de ácaros que ocorrem nos pomares de citros. De um total 2.420 e 661 ácaros coletados em dois talhões de citros na região de Descalvado-SP, apenas 0,45 e 11,80% dos ácaros pertenciam à família Tenuipalpidae, respectivamente. Para verificar a efetividade de outras plantas hospedeiras de B. phoenicis como refúgio de indivíduos suscetíveis, a variabilidade genética em populações de B. phoenicis provenientes de cercas-vivas de sansão-de-campo (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) localizadas próximas aos pomares de citros foi avaliada mediante estimativa da freqüência de resistência ao dicofol e análise molecular. Em geral, a freqüência de resistência em populações de B. phoenicis provenientes de sansão-de-campo foi inferior a de citros em um mesmo pomar. No entanto, a análise da variabilidade genética através da técnica de RAPD - PCR mostrou que as populações de B. phoenicis provenientes de sansão-do-campo são geneticamente diferentes das populações provenientes de citros. Portanto, baseado nos resultados obtidos conclui-se que o restabelecimento da suscetibilidade de B. phoenicis ao dicofol é bastante variável e a imigração de indivíduos suscetíveis de áreas não tratadas ou de hospedeiros alternativos é bastante limitada. / The knowledge of dynamics of pest resistance to pesticides is crucial for the implementation of resistance management strategies. Therefore, the main objective of this research was to study the dynamics of the resistance of Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) to the acaricide dicofol in commercial citrus groves during a 3-year period. Studies to evaluate the selection response to dicofol were conducted in populations of B. phoenicis with different initial resistance frequencies. The frequency of resistance was also estimated in the absence of selection pressure. Some factors that influence the resistance dynamics of B. phoenicis such as the dispersal capacity and the effectiveness of alternative hosts as refuges for susceptible individuals were also evaluated in this study. There was a significant increase in the frequency of dicofol resistance with applications of dicofol in some citrus field plots. The rate of reset to susceptibility in the absence of selection pressure varied from field to field. In some fields, the reset to susceptibility was observed within approximately 12-month period. On the other hand, the reset to susceptibility was not observed even after 29 months without using dicofol. Dispersal studies of B. phoenicis on sandy surface conducted under greenhouse conditions showed that dispersal capacity by crawling is limited. After the release of 6,000 mites in one point, only 3% reached distances of 40 to 50 cm from the release point. This mite moved less than 1 cm.day-1. Wind speed of 23 km.h-1 was not enough to carry mites from citrus fruit surface under laboratory conditions; and wind speeds of 30 and 40 km.h-1 were capable to carry less than 1% of mites either from new or old mite colonies on fruits. Mite dispersal studies with the use of sticky traps under field conditions also showed that B. phoenicis dispersal is very limited when compared to other mite species that occur in citrus groves. From a total of 2,420 and 661 mites collected from two citrus fields in Descalvado-SP region, only 0.45 and 11.80% of mites were in the Tenuipalpidae family, respectively. In order to evaluate the effectiveness of other host plants of B. phoenicis as refuges for susceptible individuals, the genetic variability in populations of B. phoenicis from "sansão-de-campo" (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) located near the citrus groves was evaluated by the estimation of resistance frequencies to dicofol and by molecular techniques. In general, the frequency of resistance to dicofol in populations of B. phoenicis from "sansão-de-campo" was lower than that from citrus groves. However, the analysis of genetic variability with RAPD-PCR revealed that B. phoenicis populations from "sansão-de-campo" were genetically different from citrus groves. Based on our results, we concluded that the reset of susceptibility of B. phoenicis to dicofol is very variable and the immigration of susceptible individuals from untreated areas or alternative hosts is very limited.

Os vírus possuem potencial de variabilidade genética muito alto, isso porque necessitam divergir seu material genético suficientemente para se adaptar às inúmeras mudanças às quais são submetidos. Portanto, a variabilidade genética é essencial para a sobrevivência desses organismos; é o primeiro passo para a adaptação em um novo hospedeiro, quebra de resistência, alterações nos sintomas e virulência, o que justifica o interesse em estudos nessa área. Os estudos de variabilidade consistem numa excelente ferramenta para a compreensão da evolução dos vírus e busca pelo manejo adequado de doenças virais. Por isso objetivou-se estudar a variabilidade genética da ORF p29 do CiLV-C, a fim de gerar informações relevantes acerca do patossistema e da preponderância de isolados, com possíveis implicações na epidemiologia da doença e seu manejo no campo, além de uma melhor compreensão sobre a evolução desse vírus, que até então nunca havia sido explorada. Neste trabalho foram avaliadas plantas de citros e outras hospedeiras potenciais do CiLV-C. Os resultados sugerem que as plantas de tangerina Cravo, Tardia da Sicília, Cleópatra, Vermelha, tangor Ortanique, laranja Azeda e trapoeraba são suscetíveis à doença e também podem servir como fontes de inóculo do vírus para citros. Já as plantas de limão Siciliano e Cravo, e limas ácidas Tahiti e Galego e Mimosa caesalpiniaefolia mostraram-se resistentes à doença, mas não à colonização do ácaro vetor. As plantas de Malvaviscus arboreus e Solanum violaefolium não apresentaram sintomas, mas mostraram-se possíveis fontes de inóculo do vírus para plantas de citros. Além disso, foram avaliadas as respostas de 62 genótipos de tangerinas e seus híbridos à doença, sendo que 15 mostraram-se resistentes e podem, posteriormente, ser utilizados em programas de melhoramento genético, que é uma das alternativas para reduzir o uso de pesticidas para o controle do vetor. Foi identificada baixa variabilidade genética entre os isolados do CiLV-C, independentemente do hospedeiro ou localidade, entretanto, o isolado de São José do Rio Preto pareceu ser o mais divergente e capaz de passar suas alterações durante sua transmissão a outros hospedeiros. Mais estudos devem ser feitos para que conclusões inquestionáveis sejam tiradas desse assunto, mas os resultados obtidos abriram um novo leque de possibilidades para futuros estudos nessa área até então pouco explorada. / Viruses have, potentially, broad genetic variability because of their need to adapt to several changes that they are exposed to. Therefore, genetic variability is essential for their survival; it is the first step to adapt to a new host, to break resistance down, to change symptoms and virulence, which justifies the interest in studies in this area. These studies consist in a great tool for a better understanding on the virus evolution and the search for a proper management of viral diseases. Hence, it was aimed to study the genetic variability of ORF p29 from CiLV-C in order to generate relevant information about the pathosystem and the predominance of isolates with possible implications on the epidemiology of the disease and its management in the field, besides a better understanding on the evolution of this virus, which has never been explored before. In this work, we evaluated citrus plants and potential hosts for CiLV-C. The results suggest that the plants of Cravo, Tardia da Sicília, Cleopatra, and Vermelha mandarin, Ortanique tangor, Sour orange and spiderwort are susceptible to the disease and can also serve as sources of inoculum of the virus to citrus. Siciliano lemon, Rangpur, Tahiti, and Mexican limes, and Mimosa caesalpiniaefolia were resistant to the disease, but not to the colonization of the mite vector. Malvaviscus arboreus and Solanum violaefolium plants did not present symptoms, but can be considered possible sources of CiLV-C inoculum to citrus plants. In addition, we evaluated the response of 62 mandarin genotypes and their hybrids to the disease. Fifteen of them were considered resistant and could be used in breeding programs with the objective to reduce the use of pesticides to control the vector. Low genetic variability was found amongst CiLV-C isolates, regardless of the host or geographic region; however, the São José do Rio Preto isolate was the most divergent and the changes in nucleotides were transmitted to the other hosts. Further studies should be conducted before unquestionable conclusions can be drawn from this issue, but the results obtained here have opened a new range of possibilities for future studies in this area so far almost unexplored.

Avaliou-se o efeito de Hirsutella thompsonii ao ácaro da leprose dos citros (Brevipalpus phoenicis). Em laboratório, adultos foram mantidos em arenas sobre folhas de citros em placas contendo ágar-água solidificado. Foram avaliadas a patogenicidade e virulência do fungo ao ácaro, bem como sua persistência e compatibilidade com acaricidas. No campo, os ácaros foram confinados em arenas sobre frutos de laranja pré-infestados com adultos, sendo estes mantidos em plantas de citros. O isolado Esalq-1269 de H. thompsonii foi inoculado em populações do ácaro provenientes de diversas regiões do Estado de São Paulo. Para se verificar o efeito combinado da temperatura e umidade relativa do ar, o patógeno foi aplicado e os ácaros mantidos em condições controladas. A eficiência de Esalq-1269 foi comparada com isolados do banco de patógenos do Cenargen/Embrapa, os quais foram identificados. Além destes testes, determinou-se o efeito de Esalq-1269 em ovos de B. phoenicis. As avaliações da virulência e persistência foram realizadas a partir do patógeno produzido em meio de cultura completo e sólido (MC-S); meio completo e líquido (MC-L); arroz pré-cozido (APC) e arroz pré-cozido seco e moído (APC-SM). Nos bioensaios com os acaricidas, determinou-se a compatibilidade com agrotóxicos registrados para B. phoenicis phoenicis em citros. O efeito de sub-concentrações de H. thompsonii e de Propargite (Omite 720 SC) foram avaliadas, isoladamente e em mistura, para o ácaro. Em todos os bioensaios, as suspensões contendo propágulos do fungo foram preparadas em diferentes concentrações e após a pulverização avaliou-se a mortalidade durante quatro dias. No experimento de campo o patógeno foi aplicado em diferentes concentrações. O primeiro experimento constou da testemunha e H. thompsonii produzida em APC (6kg/ha). O segundo experimento constou: testemunha, H. thompsonii produzida em APC (20kg/ha e 10kg/ha) e H. thompsonii produzida em MC-L (5L/ha). As avaliações foram realizadas após 10 e 20 dias das aplicações, verificando a sobrevivência de adultos e o número de ovos e ninfas. Esalq-1269 foi patogênico a adultos de B. phoenicis provenientes de todas as regiões do Estado avaliadas, porém com diferenças quanto suscetibilidade. Todos os isolados testados foram patogênicos a B. phoenicis, sendo Esalq-1269 o mais virulento. Nos testes de temperatura x umidade, observou-se que Esalq-1269 apresentou alta atividade a 30°C, independentemente da umidade relativa. Porém, baixas temperaturas prejudicaram o desenvolvimento da doença. O patógeno não apresentou efeito em ovos do ácaro. Nos testes de virulência, a menor CL25 obtida foi para o fungo produzido em MC-S (1,9x105con/mL), já as CL25 para o patógeno produzido em APC e APCSM foram semelhantes. O fungo produzido em MC-L foi o que apresentou maior persistência em relação aos demais, sendo capaz de causar mortalidade devido ao efeito indireto. Quanto à toxicidade, a exceção de Dicofol e Cihexatina, todos os acaricidas foram compatíveis com o fungo. Observou-se efeito sinérgico entre a mistura patógeno x propargite, com alta mortalidade de B. phoenicis em sub-concentrações. Em campo, houve diferenças dos tratamentos com o fungo em relação à testemunha, havendo redução no número de adultos e de ovos. / This study aimed to evaluate the effect of Hirsutella thompsonii on the false spider mite (Brevipalpus phoenicis). In laboratory bioassays, adults were confined to arenas prepared with citrus leaves in acrylic dishes containing water-agar. The pathogenicity and virulence of the fungus against B. phoenicis adults, the persistence in citrus leaves and the compatibility with acaricides were studied. Adults were maintained in arenas prepared with fruits which were placed in plants in the field. The H. thompsonii isolate Esalq-1269 was inoculated on mite populations from different regions of São Paulo state. Also, the combined effect of temperature and humidity was measured on the fungus performance when mites were maintained in controlled conditions. The efficiency of Esalq-1269 was compared to isolates from Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Besides these bioassays, the effect of Esalq-1269 isolate in eggs of B. phoenicis was determined. The virulence and persistence tests were conducted using the fungi produced on complete solid culture medium (MC-S); complete liquid culture medium (MC-L); rice (APC) and rice powder (APC-SM). Compatibility of acaricides registered for B. phoenicis control with Esalq-1269 was evaluated and the combined effect of Propagite (Omite 720 SC) with sub-doses of H. thompsonii was determined. Mortality of mites was observed during four days after application of conidial suspensions. In field tests, the pathogen was applied in different concentrations. In the first assay, fungi were produced in APC (6kg/ha). In the second test, three treatments were applied: H. thompsonii cultured on rice (APC) at two concentrations (20Kg/ha and 10 Kg/ha) and H. thompsonii produced by liquid fermentation (MC-L) (5L/ha). Observations were performed after 10 and 20 days after application and adult survival, number of eggs and nymphs per fruit were observed. The isolate Esalq-1269 caused high mortality in all populations of B. phoenicis tested. Also, this strain was the most virulent against the mite and it was negatively affected by low temperatures. At 30°C, high mortality of adults was observed regardless of humidity levels. B. phoenicis was not pathogenic to eggs of B. phoencis . The lowest LC25 value calculated was from pathogen produced in MC-S (1,9x105 conidia/mL). The LC25 values calculated to APC and ACP-SM did not differ statistically. The pathogen produced by liquid fermentation was the most persistent in citrus leaves, causing higher levels of adult mortality. The acaricides Dicofol and Cyhexatin were toxic to Esalq-1269. Synergism between Propargite and H. thompsonii was observed resulting in high adult mortality under low concentrations. In field, results showed differences on concentration and time to death between treatments and control. Field applications resulted in reduction of adult and eggs.

Acaricidas que interferem na respiração celular, especialmente na produção de energia (ATP), tem sido um importante componente em programas de manejo da resistência a acaricidas. Basicamente esses acaricidas interferem na fosforilação oxidativa ou no transporte de elétrons na mitocôndria pela inibição ou disrupção de algum processo específico. Esse grupo de acaricidas tem sido um dos mais utilizados para o controle de Brevipalpus phoenicis (Geijskes) na cultura dos citros no Brasil. No entanto, há poucos estudos sobre a suscetibilidade e possíveis relações de resistência cruzada para os acaricidas inibidores da respiração celular em B. phoenicis. Sendo assim, o objetivo principal do presente trabalho foi entender a situação da resistência de B. phoenicis a esses acaricidas para o estabelecimento de estratégias de manejo da resistência. Foram conduzidos estudo para avaliar (a) a variabilidade na suscetibilidade de populações de B. phoenicis coletadas em pomares de citros aos acaricidas cyhexatin, azocyclotin, propargite e enxofre; (b) as relações de resistência cruzada entre propargite e os acaricidas azocyclotin, cyhexatin, dinocap, pyridaben e enxofre; e (c) o custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite em condições de laboratório. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de B. phoenicis a esses acaricidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses acaricidas em diferentes populações de B. phoenicis B. phoenicis foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada acaricida. Para verificar a presença de resistência cruzada entre propargite e demais acaricidas, as respostas de concentração-mortalidade das linhagens suscetível (S) e resistente ao propargite (Propargite-R) foram caracterizadas para cyhexatin, azocyclotin, dinocap, pyridaben e enxofre. O custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite foi avaliado mediante comparação de parâmetros biológicos das linhagens S e Propargite-R mantidas em frutos de laranja a 25 ± 1 °C e fotofase de 14 h. Foram verificadas diferenças significativas na sobrevivência de populações de B. phoenicis nas concentrações diagnósticas testadas para cyhexatin (de 16,3 a 80,5%), azocyclotin (de 3,0 a 15,0%), propargite (de 1,0 a 71,6%) e enxofre (de 9,0 a 82,6%). Uma baixa intensidade de resistência cruzada foi verificada entre propargite e os acaricidas azocyclotin (1,8 vezes), cyhexatin (4,6 vezes), dinocap (3,5 vezes) e pyridaben (3,5 vezes). Por outro lado, a intensidade de resistência cruzada a enxofre (> 111 vezes) foi bastante alta. Não foi verificada presença de custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite, baseado nos parâmetros biológicos avaliados. Portanto, o uso desses acaricidas também deve ser feito de maneira criteriosa em programas de manejo da resistência de B. phoenicis a acaricidas. / Acaricides that affect the cellular respiration process, specifically in the energy production (ATP), have been an important component in acaricide resistance management programs. Basically, these acaricides interfere in the oxidative phosphorilation or electron transportation in the mitochondria, by inhibiting or disrupting some specific process. This group of acaricide plays an important role in the control of Brevipalpus phoenicis (Geijskes) in citrus groves in Brazil. However, there are only few studies on the susceptibility and possible crossresistance to the acaricides that are inhibitors of cellular respiration in B. phoenicis . Then, the major objective of this work was to collect data to implement strategies to manage the resistance of B. phoenicis to these acaricides. Studies were conducted to evaluate (a) the variability in the susceptibility among B. phoenicis populations collected from citrus groves to the acaricides cyhexatin, azocyclotin, propargite and sulphur; (b) cross-resistance relationships between propargite and the acaricides azocyclotin, cyhexatin, dinocap, pyridaben and sulphur; and (c) the fitness cost associated with propargite resistance in B. phoenicis under laboratory conditions. A residual-type contact bioassay was used to characterize the susceptibility of B. phoenicis to these acaricides. The monitoring of the susceptibility to these acaricides in different B. phoenicis populations was conducted with diagnostic concentrations based on lethal concentration 95 (LC95) of each acaricide. The cross-resistance between propargite and other acaricides was evaluated by characterizing the concentration-mortality responses of susceptible (S) and propargite-resistant (Propargite-R) strains to cyhexatin, azocyclotin, dinocap, pyridaben and sulphur. The fitness cost associated with B. phoenicis resistance to propargite was evaluated by measuring the biological parameters of S and Propargite-R strains on citrus fruits at 25 ± 1 °C and fotophase of 14 h. Significant differences in the susceptibility of B. phoenicis were detected at diagnostic concentration of cyhexatin (survivorship from 16.3 to 80.5%), azocyclotin (from 3.0 to 15.0%), propargite (from 1.0 a 71.6%) and sulphur (from 9.0 to 82.6%). A low intensity of crossresistance was detected between propargite and the acaricides azocyclotin (1.8-fold), cyhexatin (4.6-fold), dinocap (3.5-fold) and pyridaben (3.5-fold). On the other hand, the intensity of crossresistance to sulphur (> 111-fold) was very high. There was no fitness cost associated with B. phoenicis resistance to propargite, based on biological parameters evaluated. Therefore, the use of these acaricides should also be done very carefully in resistance management of B. phoenicis to acaricides.

O conhecimento da dinâmica da resistência de pragas a pesticidas é de fundamental importância para a implementação de estratégias de manejo da resistência. Desta forma, o principal objetivo do presente trabalho foi estudar a dinâmica da resistência de Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) ao acaricida dicofol em pomares comerciais de citros durante um período de aproximadamente três anos. Para tanto, foram realizados estudos para avaliar a resposta à pressão de seleção com dicofol em populações de B. phoenicis com diferentes freqüências iniciais de resistência e acompanhamento da freqüência de resistência na ausência de pressão seletiva. Alguns fatores que podem estar envolvidos na dinâmica da resistência de B. phoenicis a acaricidas como a capacidade de dispersão e a efetividade de hospedeiros alternativos como refúgio de indivíduos suscetíveis foram avaliados. Aplicações de dicofol em alguns talhões de citros resultaram em aumentos significativos na freqüência de resistência. A velocidade de restabelecimento da suscetibilidade na ausência de pressão seletiva variou entre os talhões. Em alguns talhões, o restabelecimento da suscetibilidade foi observado em um período de aproximadamente um ano. Em outros talhões, o restabelecimento da suscetibilidade não foi observado mesmo após 29 meses sem o uso do dicofol. Trabalhos de dispersão de B. phoenicis conduzidos em casa de vegetação mostraram que a capacidade de dispersão por caminhamento é limitada. Com a liberação de 6.000 ácaros em um determinado ponto, apenas 3% atingiram distâncias de 40 a 50 cm. As distâncias percorridas por este ácaro foram geralmente inferiores a 1 cm.dia-1. Em condições de laboratório, verificou-se que vento de 23 km.h-1 não foi capaz de arrastar ácaros da superfície de frutos; e velocidades de 30 e 40 km.h-1 foram capazes de arrastar menos de 1% da população de ácaros provenientes tanto de colônias novas quanto de colônias velhas. Trabalhos de dispersão em condições de campo mediante a utilização de armadilhas adesivas também comprovaram que a dispersão de B. phoenicis é bastante limitada quando comparada a de outras espécies de ácaros que ocorrem nos pomares de citros. De um total 2.420 e 661 ácaros coletados em dois talhões de citros na região de Descalvado-SP, apenas 0,45 e 11,80% dos ácaros pertenciam à família Tenuipalpidae, respectivamente. Para verificar a efetividade de outras plantas hospedeiras de B. phoenicis como refúgio de indivíduos suscetíveis, a variabilidade genética em populações de B. phoenicis provenientes de cercas-vivas de sansão-de-campo (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) localizadas próximas aos pomares de citros foi avaliada mediante estimativa da freqüência de resistência ao dicofol e análise molecular. Em geral, a freqüência de resistência em populações de B. phoenicis provenientes de sansão-de-campo foi inferior a de citros em um mesmo pomar. No entanto, a análise da variabilidade genética através da técnica de RAPD - PCR mostrou que as populações de B. phoenicis provenientes de sansão-do-campo são geneticamente diferentes das populações provenientes de citros. Portanto, baseado nos resultados obtidos conclui-se que o restabelecimento da suscetibilidade de B. phoenicis ao dicofol é bastante variável e a imigração de indivíduos suscetíveis de áreas não tratadas ou de hospedeiros alternativos é bastante limitada. / The knowledge of dynamics of pest resistance to pesticides is crucial for the implementation of resistance management strategies. Therefore, the main objective of this research was to study the dynamics of the resistance of Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) to the acaricide dicofol in commercial citrus groves during a 3-year period. Studies to evaluate the selection response to dicofol were conducted in populations of B. phoenicis with different initial resistance frequencies. The frequency of resistance was also estimated in the absence of selection pressure. Some factors that influence the resistance dynamics of B. phoenicis such as the dispersal capacity and the effectiveness of alternative hosts as refuges for susceptible individuals were also evaluated in this study. There was a significant increase in the frequency of dicofol resistance with applications of dicofol in some citrus field plots. The rate of reset to susceptibility in the absence of selection pressure varied from field to field. In some fields, the reset to susceptibility was observed within approximately 12-month period. On the other hand, the reset to susceptibility was not observed even after 29 months without using dicofol. Dispersal studies of B. phoenicis on sandy surface conducted under greenhouse conditions showed that dispersal capacity by crawling is limited. After the release of 6,000 mites in one point, only 3% reached distances of 40 to 50 cm from the release point. This mite moved less than 1 cm.day-1. Wind speed of 23 km.h-1 was not enough to carry mites from citrus fruit surface under laboratory conditions; and wind speeds of 30 and 40 km.h-1 were capable to carry less than 1% of mites either from new or old mite colonies on fruits. Mite dispersal studies with the use of sticky traps under field conditions also showed that B. phoenicis dispersal is very limited when compared to other mite species that occur in citrus groves. From a total of 2,420 and 661 mites collected from two citrus fields in Descalvado-SP region, only 0.45 and 11.80% of mites were in the Tenuipalpidae family, respectively. In order to evaluate the effectiveness of other host plants of B. phoenicis as refuges for susceptible individuals, the genetic variability in populations of B. phoenicis from “sansão-de-campo” (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) located near the citrus groves was evaluated by the estimation of resistance frequencies to dicofol and by molecular techniques. In general, the frequency of resistance to dicofol in populations of B. phoenicis from “sansão-de-campo” was lower than that from citrus groves. However, the analysis of genetic variability with RAPD-PCR revealed that B. phoenicis populations from “sansão-de-campo” were genetically different from citrus groves. Based on our results, we concluded that the reset of susceptibility of B. phoenicis to dicofol is very variable and the immigration of susceptible individuals from untreated areas or alternative hosts is very limited.

A leprose dos citros é considerada uma das doenças mais destrutivas da indústria citrícola. O patossistema dessa doença envolve o agente causal o Citrus leprosis virus C, o vetor Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae) e as plantas hospedeiras. Este vírus com genoma conhecido é membro tipo do gênero Cilevirus. Causa sintomas localizados nas folhas, frutos e caules e está restrito ao continente Americano. Apesar de muitos esforços para se conhecer o patossistema, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações. O presente trabalho teve como objetivo obter informações detalhadas sobre as relações vetorvírus- hospedeiro da leprose citoplasmática, estando dividido em três objetivos: 1. Procurou-se uma planta indicadora padrão que fosse de facil obtenção, manejo e baixo custo, e que expressase em curto tempo os sintomas de CiLV-C e outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTBr); 2. Determinar parâmetros como o período de acesso para aquisição e inoculação do CiLV-C pelo ácaro vetor, o período de retenção do vírus pelo ácaro, avaliação da capacidade das diferentes fases do ácaro de transmitir o vírus e a % de indivíduos de uma população de ácaros colonizando plantas afetadas pela leprose capazes de transmitir o vírus; 3. Avaliar um grande número de espécies de plantas, de diferentes famílias botânicas, quanto à suscetibilidade experimental à infecção pelo CiLV-C, pelo ácaro vetor. A presença de CiLV-C nestes ensaios foi confirmada por testes de ELISA, RT-PCR, microscopia eletrônica de transmissão e imunofluorescência. O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) reage com lesões necróticas locais em apenas cinco dias à inoculação com ácaros virulíferos, podendo-se reduzir para dois dias se as plantas forem incubadas a 28ºC. O cv. ,,Una\" foi selecionado como planta-teste padrão dentre 113 cvs. avaliados. Outros vírus transmitidos por Brevipalpus do tipo citoplasmático (VTBr) como vírus da pinta verde do maracujá (Passion fruit green spot virus PFGSV), vírus da mancha anular de Ligustrum (Ligustrum ringspot virus LigRSV) e mancha verde do hibisco (Hibiscus green spot vírus HGSV) também causaram lesões locais necróticas em feijoeiro. Usando feijão como planta teste e ácaros virulíferos, se determinou o período de acesso à aquisição do vírus-4 h; período de acesso à inoculação do vírus-4h; período de retenção do vírus no ácaro de 12 dias, porcentagem de ácaros virulíferos, colonizando tecidos infectados, transmitirem CiLV-C em até 45%. Os experimentos também confirmaram que todas as etapas de desenvolvimento do ácaro (larvas, proto-deutoninfa e adultos) são capazes de transmitir CiLV-C, inclusive confirmou-se que o macho tem a capacidade de transmissão e que o vírus pode ser adquirido a partir de lesões de folhas, frutos e caules. Não se constatou transmissão transovariana do CiLV-C. Foram testadas 140 espécies, de 45 famílias, dentro das quais 62 espécies de 26 famílias apresentaram lesões localizadas nas folhas. Destas, 46 espécies sintomáticas, o CiLV-C foi detectado em pelo menos um dos testes para sua detecção, confirmando a transmissão. O conhecimento de parâmetros de alimentação, retenção do vírus e porcentagem de ácaros viruliferos na população, além do genoma de hospedeiras suscetíveis ao vírus tem importantes implicações no entendimento da epidemiologia, na quarentena e podem oferecer indícios da origem do CiLV-C. / Citrus leprosis (CL), caused by the Citrus leprosis virus C (CiLV-C), is reported only in the American continent. The pathosystem of the CL involves the causal agent, the main vector Brevipalpus phoenicis Geijeskes (Acari: Tenuipalpidae) and the susceptible hosts. For long time only Citrus spp. were considered the sole susceptible host. The entire genome of the CiLV-C was sequenced and a new genus, Cilevirus, was assigned for this virus. CL is characterized by the induction of localized symptoms on the leaves, fruits and stems. Important advances were made recently for the understanding of CL pathosystem, but despite these efforts little is known about details of the virus/vector/host relationship. The present work aimed to cover such deficiencies. In the first place a search of suitable indicator plant was made and the common bean (Phaseolus vulgaris L.) was found to respond with localized necrotic lesions after infestation with viruliferous B. phoenicis in five days and when infested leaves are incubated at 28°C. Furthermore, bean plants are easy and cheap to produce and handle. The black bean cv. ,,IAC Una\" was adopted as a standard test variety, among 113 assayed cultivars of various genetic backgrounds. Common bean plants mite-inoculated with other cytoplasmic-type Brevipalpus-transmitted viruses (BrTVs) [Passion fruit green spot virus (PFGSV), Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), Ligustrum ringspot virus (LigRSV) and Hibiscus green spot virus (HGSV)] also responded with necrotic local lesions and could serve as test plants for these viruses. Detecion of these viruses were made by RTPCR and/or transmission electron microscopy. Using common bean as test plant, some parameters of the vector/virus relationship were determined: virus acquisition feeding period- 4 h; virus inoculation feeding period- 4h; period of retention of the virus by a single viruliferous mite- at least 12 days; percentage of viruliferous mites from a mites colonizing infected tissues- 45%. The experiments also confirmed that all the developmental stages of the mite (larvae, proto- and deutonymph, adult) as well as males are able to transmit CiLV-C. No transovarial passage of the CiLV-C was registered. The virus can be acquired from lesions of leaves, fruits and stems. To assess the experimental host range of CiLV-C, a large number of plant species were inoculated with B. phoenicis, viruliferous to CiLV-C, under experimental conditions. Of the140 species tested, belonging to 45 families, 62 (of 26 families) produced localized lesions on inoculated leaves. Of these 62 plants producing local lesions, 45 had the presence of CiLV-C confirmed by at least one of the assays to detect the virus (RT-PCR, ELISA, transmission electron microscopy and immunofluorescence). These assays were also used to confirm the presence of CiLV-C in transmission experiments. Although only few non Citrus species were found naturally infected by CiLV-C, present results show that a large number of plant species are susceptible to the virus with implications on the epidemiology, quarantine and the evolution of the citrus leprosis pathosystem.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Juliana de Freitas Astúa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kubo_KarenSumire_D.pdf: 11235043 bytes, checksum: fb3c7d7e7af4e5fc35ef4a27c3364fda (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Citrus leprosis virus C (CiLV-C) é o agente causal da leprose dos citros, uma doença incomum transmitida pelo ácaro Brevipalpus phoenicis. Uma vez que o CiLV-C permanece confinado em lesões localizadas nas folhas, ramos e frutos sem causar infecção sistêmica, o vetor precisa se alimentar nestas lesões para adquirir o vírus. O objetivo deste trabalho foi analisar os perfis de expressão diferencial entre um genótipo resistente (tangor 'Murcott') e um suscetível (laranja 'Pera') em resposta à leprose dos citros e identificar os possíveis mecanismos de resistência envolvidos na resistência à doença. Por esse motivo, antes da instalação dos experimentos biológicos, nós aperfeiçoamos a detecção do CiLV-C em seu vetor, para certificação da aquisição viral. O experimento biológico incluiu quatro grupos: genótipo resistente ou suscetível infestados com ácaros virulíferos ou avirulíferos para CiLV-C. Com o intuito de se identificar genes diferencialmente expressos, nós utilizamos lâminas de microarranjo com sondas baseadas na base de dados do Citrus EST (CitEST). As análises estatísticas foram realizadas por two-way ANOVA considerando os fatores genótipo e a infecção pelo CiLV-C, de maneira a se encontrar respostas envolvidas na resistência ao CiLV-C. Os resultados foram interpretados por Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Os resultados sugerem que existem receptor-like proteins (RLP) e receptor-like kinase (RLK) que podem reconhecer o vírus ou o ácaro, ativando uma resposta de defesa baseada na assinatura de 'Ca POT.2+' e ativação da via do ácido salicílico. Estudos adicionais ainda são necessários para verificar se a resposta de defesa pode estar relacionada à resistência sistêmica adquirida (SAR) / Abstract: Citrus leprosis virus C (CiLV-C) is the causal agent of citrus leprosis, an unusual disease transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis. Since CiLV-C remains confined in localized lesions in leaves, stems and fruits without causing systemic infection, the vector needs to feed in these lesions to acquire the virus. The aim of this work was to analyze the differential gene expression profiles between resistant ('Murcott' tangor) and susceptible ('Pera' sweet orange) citrus genotypes in response to CiLV-C, and to identify possible mechanisms involved in disease resistance. For this reason, before the biological experiments were set, we improved the detection of CiLV-C in the mite vector to ensure virus acquisition. The biological experiment consisted in four groups: susceptible or resistant genotype infested with CiLV-C viruliferous or nonviruliferous mites. In order to identify differentially expressed genes, we used microarray chips designed using the Citrus EST database (CitEST). The statistical analysis was performed by two-way ANOVA considering the genotype and the infection by CiLV-C, aiming to find defense responses against CiLV-C. The results were interpreted by Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) and led to the hypothesis that receptor-like proteins (RLP) and receptor-like kinase (RLK) may recognize the virus or the mite triggering a defense response based on 'Ca POT.2+' signature and activation of Salicylic acid pathway (SA). Further studies are necessary to evaluate if the defense response could be related to the development of systemic acquired resistance (SAR) / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular