Submitted by JAQUELINE FRANCIOSI DELLA VECHIA null (jaque_dellavechia@hotmail.com) on 2017-09-15T18:50:38Z No. of bitstreams: 1 dellavechia_jf_me_jabo.pdf: 2153516 bytes, checksum: d1e26e0ce1d7a5b2127705dc341206d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-19T17:35:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dellavechia_jf_me_jabo.pdf: 2153516 bytes, checksum: d1e26e0ce1d7a5b2127705dc341206d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T17:35:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dellavechia_jf_me_jabo.pdf: 2153516 bytes, checksum: d1e26e0ce1d7a5b2127705dc341206d5 (MD5) Previous issue date: 2017-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Com o aumento da incidência de insetos e ácaros vetores de doenças viróticas e bacterianas na citricultura brasileira, a combinação de produtos fitossanitários tem sido uma prática comum entre os citricultores, a fim de manter a capacidade operacional e a viabilidade econômica da cultura. Entretanto, é desconhecido o efeito da interação destes produtos sobre as espécies alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre inseticida e acaricida quanto às características físicas, compatibilidade das misturas e o efeito biológico sobre o ácaro Brevipalpus yothersi e o inseto Diaphorina citri. Experimentos foram conduzidos no Laboratório de Acarologia e no Núcleo de Estudo e Desenvolvimento em Tecnologia de Aplicação da UNESP, Câmpus de Jaboticabal. Os tratamentos foram constituídos da combinação do acaricida espirodiclofeno com os inseticidas lambda-cialotrina+tiamethoxam, fosmete e imidacloprido, um a um, além de cada produto isolado. Foram determinadas características de tensão superficial, ângulo de contato, e diâmetro de gotas das caldas. A eficiência de controle dos produtos isolados e em mistura foram determinados para B. yothersi e D. citri. Também foram realizadas avaliações de compatibilidade física das combinações, bem como do pH e condutividade elétrica das caldas. A combinação dos inseticidas lambda-cialotrina + thiametoxam, fosmete e imidacloprido com o acaricida espirodiclofeno interfere na cobertura do alvo, uma vez que reduz a tensão superficial das caldas, consequentemente o ângulo de contato das gotas formadas com a superfície da folha de laranja, aumentam o DMV, diminuem a % de gotas < 100 μm e o SPAN. A eficiência dos inseticidas lambda-cialotrina + thiametoxam, fosmete e imidacloprido utilizados no controle de D. citri não é afetada pela adição de espirodiclofeno. No entanto, a combinação de espirodiclofeno com fosmete e imidacloprido comprometem a eficiência do acaricida no controle de B. yothersi. / With the increase of the incidence of insects and mites vectors of viral and bacterial diseases in brazilian citriculture, the combination of pesticides has been a common practice among citrus growers in order to maintain the operating capacity and economic viability of the crop. However, the effect of the interaction of these products on target species is unknown. In this context, the objective of this work was to evaluate the interaction between the insecticide and the acaricide regarding the physical characteristics, the compatibility of the mixtures and the biological effect on the Brevipalpus yothersi mite and the Diaphorina citri insect. The experiments were conducted at the Laboratory of Acarology and at the Nucleus of Study and Development in Application Technology of UNESP, Jaboticabal Campus, SP, Brazil. The treatments consisted of the combination of the spirodiclofen acaricide with the lambda-cyhalothrin + thiamethoxam, phosmet and imidacloprid insecticides, one by one, in addition to each isolated product. Characteristics of surface tension, contact angle, and diameter of droplets were determined. The control efficiency of the isolated and mixture products were determined for B. yothersi and D. citri. It were also carried out physical compatibility evaluations of the combinations, as well as the pH and electrical conductivity of the spraying liquids. The combination of the lambda-cyhalothrin + thiametoxam, phosmet and imidacloprid insecticides with the spirodiclofen acaricide interfer on the coverage of the target, since it reduces the surface tension of the spraying liquid and, consequently, the contact angle of the droplets formed with the surface of the orange leaf, increases the VMD, decreases the % of droplets <100 μm and the SPAN. The efficiency of the lambdacyhalothrin + thiametoxam, phosmet and imidacloprid insecticides used in the control of D. citri was not affected by the addition of spirodiclofen. However, the combination of spirodiclofen with phosmet and imidacloprid compromises the efficiency of the acaricide in the control of B. yothersi. / CNPq: 134528/2015-8

Orientador: Carlos Amadeu Leite de Oliveira / Banca: Celso Omoto / Banca: Mário Eidi Sato / Banca: Nilza Maria Martinelli / Banca: Marcelo da Costa Ferreira / Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar a viabilidade técnico-econômica da poda associada ao controle químico no manejo da leprose. Visou também, investigar as relações entre leprose e características da planta, bem como o efeito de sucessivas aplicações de calda sulfocálcica sobre propriedades químicas do solo. O experimento foi conduzido de 2003 a 2010, totalizando sete safras, em um pomar de laranja „Pera‟ localizado no município de Reginópolis-SP. Neste pomar foram realizadas podas severas e leves, e replantio, e aplicações de acaricidas para controlar do ácaro vetor Brevipalpus phoenicis. Realizaram-se levantamentos populacionais do B. phoenicis e de ácaros predadores, quantificação da produção, incidência e severidade da leprose, assim como a viabilidade de cada estratégia empregada foi calculada. Nas duas últimas safras do experimento realizaram-se avaliações das características físico-químicas dos frutos, análises foliares e de solo. Após as sete safras, verificou-se que a poda utilizada isoladamente não foi suficiente para o controle da leprose, sendo necessária a associação de outras táticas. A poda leve associada a acaricidas específicos foi à tática mais eficiente e viável economicamente. Os parâmetros físico-químicos de frutos não foram afetados pela alta severidade leprose na planta, indicando que os frutos que permanecem na planta até a colheita apresentam características idênticas às plantas isentas de leprose. Entretanto, embora a leprose não afete a qualidade do suco, afeta significativamente a produtividade da planta, podendo reduzi-lá a zero. As plantas com maior severidade da leprose apresentaram menores teores foliares de cálcio e maiores teores de potássio, fósforo e nitrogênio. As várias aplicações de calda sulfocálcica sobre as plantas proporcionaram maior teor de enxofre no solo nas camadas de 0-20 cm e de 20-40 cm / Abstract: The aim of this work was to evaluate the technical and economic feasibility of pruning associated with chemical control in citrus leprosis management. And also investigate the relationship among the disease and properties plant, as well as the effect of successive applications of lime sulfur on chemical properties of soil. The study was conducted from 2003 to 2010, totaling seven seasons in an orange plantation of the „Pear‟ variety in the city of Reginópolis-SP. In the orchard were realized severe and light pruning over citrus trees and replanting and pesticide spraying to control Brevipalpus phoenicismite, the disease vector. There had been performed B. phoenicis and predator mite population surveys, yield evaluation, leprosis incidence, as well as the variability of each strategy was also measured. By the two last seasons during the experiment was carried out fruit physical and chemical properties evaluation, leaf and soil analysis. After seven seasons period, it was observed that the pruning only is not able to control leprosis by itself, being necessary another strategy associated. The light pruning associated to the specific acaricide application was the more efficient and economically viable. The main fruit physical and chemical parameters were not affected by the leprosis incidence, what shows that the fruit that remain on the plant until the harvest have identical characteristics to that plant free from the disease. However, although the leprosis not affect juice quality, the disease reduces production significantly. The plant presenting higher leprosis severity present lower leaf calcium content and higher potassium, phosphorus and nitrogen contents.The various lime sulfur spray on the plant had provided a highersulfur content at 0 - 20 cm and 20 - 40 cm soil depth / Doutor

Avaliou-se em laboratório a patogenicidade de 52 isolados de fungos entomopatogênicos a Brevipalpus phoenicis e a produção, em meio sólido, de quatro isolados de Hirsutella spp.. Utilizando-se microscópio eletrônico de varredura, estudou-se as etapas do ciclo biológico de Hirsutella sp. (isolado 1269) em adultos de B. phoenicis, além da ocorrência de transmissão horizontal deste patógeno para adultos do ácaro a partir de cadáveres esporulados e de substrato contaminado. Todos os isolados de Hirsutella sp. foram patogênicos para o ácaro causando mortalidade de adultos superiores a 90% após seis dias da inoculação. Comprovou-se também que em meio de cultura completo (M.C.) que o isolado 1269 foi o que apresentou maior crescimento vegetativo e esporulação, sendo selecionado como o mais promissor. O ciclo biológico completo de Hirsutella sp., desde a adesão dos conídios ao ácaro até sua extrusão, ocorreu em 120 horas após a aplicação. A transmissão horizontal do patógeno a partir de cadáveres e do substrato contaminado ocasionou mortalidade superior a 50% em ambas as situações, comprovando que o fungo foi capaz de infectar novos hospedeiros. Contatou-se que Hirsutella sp. é um patógeno eficiente no controle de B. phoenicis podendo ser utilizado em campo em estratégias de introdução inoculativa, inundativa, incremento e conservação. / In this research, the patogenicity of 52 isolates of entomopathogenic fungi against Brevipalpus phoenicis and the production of four isolates of Hirsutella spp. in solid medium (M.C.) were evalueted under laboratory condition. The stages of the biological cycle of Hirsutella sp. (isolated 1269) on adults of B. phoenicis were evalueted with the use of an electron scan microscope, besides the occurrence of horizontal transmission of this fungi from cadavers and from an inoculate substract to new hosts. The isolates of Hirsutella sp. tested were pathogenic to the mite, with high mortality (>90%) after six days of the inoculation. The isolate 1269 showed high levels of vegetative growth and sporulation and was selected as the most promising one. The complete biological cycle of Hirsutella sp. ocurred after 120 hours of the inoculation, from adhesion to extrusion processes. The horizontal transmission of fungi from cadavers and inoculate substract ocurred by causing levels mortality superior to 50% in both cases, showing that the fungi was capable to infect new hosts in these situations. Hirsutella sp. was an efficient pathogen in the control of B. phoenicis and could be exploited in field control strategies through an inoculative introduction, increment or conservation.

A leprose dos citros, causada por Citrus leprosis vírus (CiLV), é uma doença endêmica nas regiões produtoras do estado de São Paulo que causa sérios prejuízos à produção. O vírus é transmitido exclusivamente pelo ácaro Brevipalpus phoenicis e medidas de controle da doença visam principalmente reduzir a população do vetor através de aplicações de acaricidas. Apesar do controle da doença ser determinado por meio de amostragens da população do ácaro, não há nenhum estudo de longo prazo que correlacione a população do vetor com a incidência da doença. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os padrões de crescimento temporal e os padrões espaciais da distribuição do ácaro e da doença e estabelecer uma associação entre as duas populações. A população do ácaro e os sintomas de leprose foram monitorados durante três anos sob condições naturais de epidemia, em um talhão de laranja doce, variedade Valência enxertada sobre limão cravo, A população de B. phoenicis apresentou flutuações, mas com picos crescentes ao longo do período. As oscilações na sua densidade dependeram principalmente da fenologia das plantas e menos das condições climáticas. O crescimento da incidência da doença foi lento e seguiu comportamento logístico. Apesar de não ser sistêmica a leprose dos citros comporta-se como poliética com acúmulo de inoculo de ano para ano. A infecção em ramos é a principal causa do caráter cumulativo da doença. Através de regressão logística, a probabilidade de doença foi modelada em função de covariáveis construídas de forma a captar informação da vizinhança das plantas no tempo passado a respeito da incidência do ácaro e da própria doença. Não houve correlação entre o nível de doença numa avaliação e a quantidade de ácaros em avaliações anteriores, em períodos pregressos de até 70 dias. O padrão espacial de plantas com sintomas foi altamente agregado e não correspondeu à distribuição espacial de plantas infestadas pelo ácaro, que foi fracamente agregada. A probabilidade de infestação e de infecção nas plantas foi modelada como dependente do estado das plantas vizinhas, quanto às próprias características, através de modelos autologísticos. A probabilidade de plantas estarem infestadas pelo ácaro não depende de sua vizinhança estar ou não hospedando a praga, ao mesmo tempo. Já a probabilidade de doença em uma árvore depende de árvores vizinhas estarem doentes naquele momento. O padrão espacial da incidência de plantas com sintomas visíveis provavelmente reflete o padrão de infestação pelos ácaros contaminados por CiLV, pois existe uma subpopulação de vetores inserida na população de B. phoenicis. O controle da doença baseado na população de B. phoenicis, não é portanto, recomendável. A amostragem para a tomada de decisão de controle deve ser pautada pela presença de sintomas e ácaros e não somente pela presença de ácaros. / Citrus leprosis, caused by Citrus leprosis virus (CiLV), is a disease endemic to the producing regions of the state of São Paulo, where it has a heavy impact on production. The virus is transmitted exclusively by the Brevipalpus phoenicis mite and disease control measures aim to reduce the vector population mainly by acaricide applications. Although the disease control is based on mite population samplings, there are no long-term studies available that correlate the vector population with the disease incidence. The objective of this study was to characterize temporal and spatial growth patterns of the mite, disease distribution and the association between the two populations. The mite population and citrus leprosis symptoms were monitored for three years under natural epidemic conditions, in a sweet orange stand of the variety Valencia, grafted unto Citrus limonia Osbeck. The B. phoenicis population presented fluctuations, although with increasing peaks along the study period. The oscillation density depended more on the tree phenology than on climate conditions. The disease incidence increased slowly under a logistic model. Although citrus leprosis is not systemic, it has a polietic performance and builds up inoculum year after year. The infection of branches is the main cause of the cumulative nature of the disease. The disease probability was modeled by a covariable constructed to capture information of the trees surroundings in the past, concerning mite incidence and the disease itself. There was no correlation between the disease level in one evaluation and the mite quantity in earlier evaluations, in antecedent periods of up to 70 days. The spatial pattern of trees with symptoms was highly aggregated and did not correspond to the spatial distribution of miteinfested trees, which was weakly aggregated. The probability of tree infestation and infection was modeled as dependent of the state of the surrounding trees through autologistic models. The probability of mite infestation of a tree does not depend on whether the neighbor trees host the pest or not, but on whether the neighbor trees are diseased at that moment. A vector subpopulation is inserted in the B. phoenicis population. The spatial pattern of tree incidence with visible symptoms probably reflects the infestation pattern by CiLV-contaminated mites. Sampling for decision taking regarding disease control must be based on the presence of symptoms as well as of mites, rather than on the mite population only.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

Os vírus possuem potencial de variabilidade genética muito alto, isso porque necessitam divergir seu material genético suficientemente para se adaptar às inúmeras mudanças às quais são submetidos. Portanto, a variabilidade genética é essencial para a sobrevivência desses organismos; é o primeiro passo para a adaptação em um novo hospedeiro, quebra de resistência, alterações nos sintomas e virulência, o que justifica o interesse em estudos nessa área. Os estudos de variabilidade consistem numa excelente ferramenta para a compreensão da evolução dos vírus e busca pelo manejo adequado de doenças virais. Por isso objetivou-se estudar a variabilidade genética da ORF p29 do CiLV-C, a fim de gerar informações relevantes acerca do patossistema e da preponderância de isolados, com possíveis implicações na epidemiologia da doença e seu manejo no campo, além de uma melhor compreensão sobre a evolução desse vírus, que até então nunca havia sido explorada. Neste trabalho foram avaliadas plantas de citros e outras hospedeiras potenciais do CiLV-C. Os resultados sugerem que as plantas de tangerina Cravo, Tardia da Sicília, Cleópatra, Vermelha, tangor Ortanique, laranja Azeda e trapoeraba são suscetíveis à doença e também podem servir como fontes de inóculo do vírus para citros. Já as plantas de limão Siciliano e Cravo, e limas ácidas Tahiti e Galego e Mimosa caesalpiniaefolia mostraram-se resistentes à doença, mas não à colonização do ácaro vetor. As plantas de Malvaviscus arboreus e Solanum violaefolium não apresentaram sintomas, mas mostraram-se possíveis fontes de inóculo do vírus para plantas de citros. Além disso, foram avaliadas as respostas de 62 genótipos de tangerinas e seus híbridos à doença, sendo que 15 mostraram-se resistentes e podem, posteriormente, ser utilizados em programas de melhoramento genético, que é uma das alternativas para reduzir o uso de pesticidas para o controle do vetor. Foi identificada baixa variabilidade genética entre os isolados do CiLV-C, independentemente do hospedeiro ou localidade, entretanto, o isolado de São José do Rio Preto pareceu ser o mais divergente e capaz de passar suas alterações durante sua transmissão a outros hospedeiros. Mais estudos devem ser feitos para que conclusões inquestionáveis sejam tiradas desse assunto, mas os resultados obtidos abriram um novo leque de possibilidades para futuros estudos nessa área até então pouco explorada. / Viruses have, potentially, broad genetic variability because of their need to adapt to several changes that they are exposed to. Therefore, genetic variability is essential for their survival; it is the first step to adapt to a new host, to break resistance down, to change symptoms and virulence, which justifies the interest in studies in this area. These studies consist in a great tool for a better understanding on the virus evolution and the search for a proper management of viral diseases. Hence, it was aimed to study the genetic variability of ORF p29 from CiLV-C in order to generate relevant information about the pathosystem and the predominance of isolates with possible implications on the epidemiology of the disease and its management in the field, besides a better understanding on the evolution of this virus, which has never been explored before. In this work, we evaluated citrus plants and potential hosts for CiLV-C. The results suggest that the plants of Cravo, Tardia da Sicília, Cleopatra, and Vermelha mandarin, Ortanique tangor, Sour orange and spiderwort are susceptible to the disease and can also serve as sources of inoculum of the virus to citrus. Siciliano lemon, Rangpur, Tahiti, and Mexican limes, and Mimosa caesalpiniaefolia were resistant to the disease, but not to the colonization of the mite vector. Malvaviscus arboreus and Solanum violaefolium plants did not present symptoms, but can be considered possible sources of CiLV-C inoculum to citrus plants. In addition, we evaluated the response of 62 mandarin genotypes and their hybrids to the disease. Fifteen of them were considered resistant and could be used in breeding programs with the objective to reduce the use of pesticides to control the vector. Low genetic variability was found amongst CiLV-C isolates, regardless of the host or geographic region; however, the São José do Rio Preto isolate was the most divergent and the changes in nucleotides were transmitted to the other hosts. Further studies should be conducted before unquestionable conclusions can be drawn from this issue, but the results obtained here have opened a new range of possibilities for future studies in this area so far almost unexplored.

Avaliou-se o efeito de Hirsutella thompsonii ao ácaro da leprose dos citros (Brevipalpus phoenicis). Em laboratório, adultos foram mantidos em arenas sobre folhas de citros em placas contendo ágar-água solidificado. Foram avaliadas a patogenicidade e virulência do fungo ao ácaro, bem como sua persistência e compatibilidade com acaricidas. No campo, os ácaros foram confinados em arenas sobre frutos de laranja pré-infestados com adultos, sendo estes mantidos em plantas de citros. O isolado Esalq-1269 de H. thompsonii foi inoculado em populações do ácaro provenientes de diversas regiões do Estado de São Paulo. Para se verificar o efeito combinado da temperatura e umidade relativa do ar, o patógeno foi aplicado e os ácaros mantidos em condições controladas. A eficiência de Esalq-1269 foi comparada com isolados do banco de patógenos do Cenargen/Embrapa, os quais foram identificados. Além destes testes, determinou-se o efeito de Esalq-1269 em ovos de B. phoenicis. As avaliações da virulência e persistência foram realizadas a partir do patógeno produzido em meio de cultura completo e sólido (MC-S); meio completo e líquido (MC-L); arroz pré-cozido (APC) e arroz pré-cozido seco e moído (APC-SM). Nos bioensaios com os acaricidas, determinou-se a compatibilidade com agrotóxicos registrados para B. phoenicis phoenicis em citros. O efeito de sub-concentrações de H. thompsonii e de Propargite (Omite 720 SC) foram avaliadas, isoladamente e em mistura, para o ácaro. Em todos os bioensaios, as suspensões contendo propágulos do fungo foram preparadas em diferentes concentrações e após a pulverização avaliou-se a mortalidade durante quatro dias. No experimento de campo o patógeno foi aplicado em diferentes concentrações. O primeiro experimento constou da testemunha e H. thompsonii produzida em APC (6kg/ha). O segundo experimento constou: testemunha, H. thompsonii produzida em APC (20kg/ha e 10kg/ha) e H. thompsonii produzida em MC-L (5L/ha). As avaliações foram realizadas após 10 e 20 dias das aplicações, verificando a sobrevivência de adultos e o número de ovos e ninfas. Esalq-1269 foi patogênico a adultos de B. phoenicis provenientes de todas as regiões do Estado avaliadas, porém com diferenças quanto suscetibilidade. Todos os isolados testados foram patogênicos a B. phoenicis, sendo Esalq-1269 o mais virulento. Nos testes de temperatura x umidade, observou-se que Esalq-1269 apresentou alta atividade a 30&#176;C, independentemente da umidade relativa. Porém, baixas temperaturas prejudicaram o desenvolvimento da doença. O patógeno não apresentou efeito em ovos do ácaro. Nos testes de virulência, a menor CL25 obtida foi para o fungo produzido em MC-S (1,9x105con/mL), já as CL25 para o patógeno produzido em APC e APCSM foram semelhantes. O fungo produzido em MC-L foi o que apresentou maior persistência em relação aos demais, sendo capaz de causar mortalidade devido ao efeito indireto. Quanto à toxicidade, a exceção de Dicofol e Cihexatina, todos os acaricidas foram compatíveis com o fungo. Observou-se efeito sinérgico entre a mistura patógeno x propargite, com alta mortalidade de B. phoenicis em sub-concentrações. Em campo, houve diferenças dos tratamentos com o fungo em relação à testemunha, havendo redução no número de adultos e de ovos. / This study aimed to evaluate the effect of Hirsutella thompsonii on the false spider mite (Brevipalpus phoenicis). In laboratory bioassays, adults were confined to arenas prepared with citrus leaves in acrylic dishes containing water-agar. The pathogenicity and virulence of the fungus against B. phoenicis adults, the persistence in citrus leaves and the compatibility with acaricides were studied. Adults were maintained in arenas prepared with fruits which were placed in plants in the field. The H. thompsonii isolate Esalq-1269 was inoculated on mite populations from different regions of São Paulo state. Also, the combined effect of temperature and humidity was measured on the fungus performance when mites were maintained in controlled conditions. The efficiency of Esalq-1269 was compared to isolates from Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Besides these bioassays, the effect of Esalq-1269 isolate in eggs of B. phoenicis was determined. The virulence and persistence tests were conducted using the fungi produced on complete solid culture medium (MC-S); complete liquid culture medium (MC-L); rice (APC) and rice powder (APC-SM). Compatibility of acaricides registered for B. phoenicis control with Esalq-1269 was evaluated and the combined effect of Propagite (Omite 720 SC) with sub-doses of H. thompsonii was determined. Mortality of mites was observed during four days after application of conidial suspensions. In field tests, the pathogen was applied in different concentrations. In the first assay, fungi were produced in APC (6kg/ha). In the second test, three treatments were applied: H. thompsonii cultured on rice (APC) at two concentrations (20Kg/ha and 10 Kg/ha) and H. thompsonii produced by liquid fermentation (MC-L) (5L/ha). Observations were performed after 10 and 20 days after application and adult survival, number of eggs and nymphs per fruit were observed. The isolate Esalq-1269 caused high mortality in all populations of B. phoenicis tested. Also, this strain was the most virulent against the mite and it was negatively affected by low temperatures. At 30&#176;C, high mortality of adults was observed regardless of humidity levels. B. phoenicis was not pathogenic to eggs of B. phoencis . The lowest LC25 value calculated was from pathogen produced in MC-S (1,9x105 conidia/mL). The LC25 values calculated to APC and ACP-SM did not differ statistically. The pathogen produced by liquid fermentation was the most persistent in citrus leaves, causing higher levels of adult mortality. The acaricides Dicofol and Cyhexatin were toxic to Esalq-1269. Synergism between Propargite and H. thompsonii was observed resulting in high adult mortality under low concentrations. In field, results showed differences on concentration and time to death between treatments and control. Field applications resulted in reduction of adult and eggs.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T12:01:04Z No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brevipalpus mites are vectors of several plant viruses called Brevipalpus transmitted virus –BrTV. Among these, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) are important due to the damages caused in Citrus spp. and Coffea spp., respectively. The symptoms occur as localized infection on both leaves and fruits. The interactions between vector and virus are of particular interest both from the scientific perspective and on the development of control measures. However, for these and other BrTV, the mode interactions are still unknown. Preliminary study suggests that CoRSV replicates in the vector tissue, while CiLV-C is mode circulates manner. The aim of this study was to investigate the interactions established between CiLV-C and CoRSV with B. phoenicis. Adult females aviruliferous of B. phoenicis were submitted to acquisition access period of respective virus during five days. After this time they were transferred to hosts (treatments): mungbean (Canavalia ensiformis, non-host of the virus), symptomatic and healthy (citrus and coffee plants) and collected after four different periods of time: 0; 7; 14 and 21 days. The interactions were investigated by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transmission electron microscopy (TEM) and transmission assays. The qPCR revealed that there was no increase in viral load over time in all treatments for any of the virus in question. The TEM, it was not possible to detect particles of CiLV-C or CoRSV. CiLV-C transmission rate was 83, 75% and 58% for the treatments symptomatic citrus, mungbean and healthy citrus, respectively. The first symptoms of the leprosis were observed after 30±5 days after mites infestation. In the CoRSV transmission assays no symptoms of coffee ringspot were observed during a period of six months. These results suggest that a long incubation period was be necessary before CoRSV transmission by the vector. By the CiLV-C the results indicate that interaction type virus-vector is of the circulative mode. / Ácaros Brevipalpus são vetores de inúmeros vírus, comumente chamados de vírus transmitidos por Brevipalpus- VTB. Dentre esses, o vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) e o vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) são importantes devido aos danos que causam em Citrus spp. e Coffea spp., respectivamente. Os sintomas ocorrem de maneira localizada em folhas e frutos. As interações entre os vírus e seus vetores apresentam particular interesse, tanto do ponto de vista científico quanto no desenvolvimento de novas abordagens para o controle das doenças por eles causadas. Entretanto, para esses e outros VTB, as interações são ainda pouco conhecidas. Estudos preliminares sugerem que o CoRSV se replica no interior do ácaro vetor, enquanto o CiLV-C apenas circula. O objetivo deste trabalho foi investigar os tipos de interações estabelecidas entre o CiLV-C e o CoRSV com B. phoenicis. Fêmeas adultas de B. phoenicis avirulíferas foram submetidas a um período de acesso para aquisição dos respectivos vírus durante cinco dias. Após esse tempo foram transferidas para hospedeiros (tratamentos): feijão-de-porco (não hospedeira dos vírus), plantas suscetíveis, sintomáticas e/ou sadias (laranja doce e cafeeiro) e coletadas após quatro diferentes períodos de tempo: 0; 7; 14 e 21 dias. As interações foram investigadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e testes de transmissão. A qPCR revelou que não houve aumento da carga viral ao longo do tempo em nenhum dos tratamentos avaliados para nenhum dos vírus em questão. A MET não detectou partículas de CiLV-C e CoRSV. A taxa de transmissão do CiLV-C foi de 83; 75 e 58% para os tratamentos frutos de laranja sintomáticos, feijão-de-porco e frutos de laranja sadio, respectivamente. Os primeiros sintomas de leprose dos citros foram observados após 30±5 dias após a infestação dos ácaros. Nos testes de transmissão de CoRSV nenhum sintoma da mancha anular foi observado durante um período de seis meses. Estes resultados indicam a necessidade de longo período é necessário antes da transmissão do CoRSV pelo vetor. Para o CiLV-C os resultados indicam que o tipo de interação vírus-vetor é persistente circulativa.

Acaricidas que interferem na respiração celular, especialmente na produção de energia (ATP), tem sido um importante componente em programas de manejo da resistência a acaricidas. Basicamente esses acaricidas interferem na fosforilação oxidativa ou no transporte de elétrons na mitocôndria pela inibição ou disrupção de algum processo específico. Esse grupo de acaricidas tem sido um dos mais utilizados para o controle de Brevipalpus phoenicis (Geijskes) na cultura dos citros no Brasil. No entanto, há poucos estudos sobre a suscetibilidade e possíveis relações de resistência cruzada para os acaricidas inibidores da respiração celular em B. phoenicis. Sendo assim, o objetivo principal do presente trabalho foi entender a situação da resistência de B. phoenicis a esses acaricidas para o estabelecimento de estratégias de manejo da resistência. Foram conduzidos estudo para avaliar (a) a variabilidade na suscetibilidade de populações de B. phoenicis coletadas em pomares de citros aos acaricidas cyhexatin, azocyclotin, propargite e enxofre; (b) as relações de resistência cruzada entre propargite e os acaricidas azocyclotin, cyhexatin, dinocap, pyridaben e enxofre; e (c) o custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite em condições de laboratório. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de B. phoenicis a esses acaricidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses acaricidas em diferentes populações de B. phoenicis B. phoenicis foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada acaricida. Para verificar a presença de resistência cruzada entre propargite e demais acaricidas, as respostas de concentração-mortalidade das linhagens suscetível (S) e resistente ao propargite (Propargite-R) foram caracterizadas para cyhexatin, azocyclotin, dinocap, pyridaben e enxofre. O custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite foi avaliado mediante comparação de parâmetros biológicos das linhagens S e Propargite-R mantidas em frutos de laranja a 25 &#177; 1 &#176;C e fotofase de 14 h. Foram verificadas diferenças significativas na sobrevivência de populações de B. phoenicis nas concentrações diagnósticas testadas para cyhexatin (de 16,3 a 80,5%), azocyclotin (de 3,0 a 15,0%), propargite (de 1,0 a 71,6%) e enxofre (de 9,0 a 82,6%). Uma baixa intensidade de resistência cruzada foi verificada entre propargite e os acaricidas azocyclotin (1,8 vezes), cyhexatin (4,6 vezes), dinocap (3,5 vezes) e pyridaben (3,5 vezes). Por outro lado, a intensidade de resistência cruzada a enxofre (> 111 vezes) foi bastante alta. Não foi verificada presença de custo adaptativo associado à resistência de B. phoenicis a propargite, baseado nos parâmetros biológicos avaliados. Portanto, o uso desses acaricidas também deve ser feito de maneira criteriosa em programas de manejo da resistência de B. phoenicis a acaricidas. / Acaricides that affect the cellular respiration process, specifically in the energy production (ATP), have been an important component in acaricide resistance management programs. Basically, these acaricides interfere in the oxidative phosphorilation or electron transportation in the mitochondria, by inhibiting or disrupting some specific process. This group of acaricide plays an important role in the control of Brevipalpus phoenicis (Geijskes) in citrus groves in Brazil. However, there are only few studies on the susceptibility and possible crossresistance to the acaricides that are inhibitors of cellular respiration in B. phoenicis . Then, the major objective of this work was to collect data to implement strategies to manage the resistance of B. phoenicis to these acaricides. Studies were conducted to evaluate (a) the variability in the susceptibility among B. phoenicis populations collected from citrus groves to the acaricides cyhexatin, azocyclotin, propargite and sulphur; (b) cross-resistance relationships between propargite and the acaricides azocyclotin, cyhexatin, dinocap, pyridaben and sulphur; and (c) the fitness cost associated with propargite resistance in B. phoenicis under laboratory conditions. A residual-type contact bioassay was used to characterize the susceptibility of B. phoenicis to these acaricides. The monitoring of the susceptibility to these acaricides in different B. phoenicis populations was conducted with diagnostic concentrations based on lethal concentration 95 (LC95) of each acaricide. The cross-resistance between propargite and other acaricides was evaluated by characterizing the concentration-mortality responses of susceptible (S) and propargite-resistant (Propargite-R) strains to cyhexatin, azocyclotin, dinocap, pyridaben and sulphur. The fitness cost associated with B. phoenicis resistance to propargite was evaluated by measuring the biological parameters of S and Propargite-R strains on citrus fruits at 25 &#177; 1 &#176;C and fotophase of 14 h. Significant differences in the susceptibility of B. phoenicis were detected at diagnostic concentration of cyhexatin (survivorship from 16.3 to 80.5%), azocyclotin (from 3.0 to 15.0%), propargite (from 1.0 a 71.6%) and sulphur (from 9.0 to 82.6%). A low intensity of crossresistance was detected between propargite and the acaricides azocyclotin (1.8-fold), cyhexatin (4.6-fold), dinocap (3.5-fold) and pyridaben (3.5-fold). On the other hand, the intensity of crossresistance to sulphur (> 111-fold) was very high. There was no fitness cost associated with B. phoenicis resistance to propargite, based on biological parameters evaluated. Therefore, the use of these acaricides should also be done very carefully in resistance management of B. phoenicis to acaricides.

A leprose dos citros é considerada uma das doenças mais destrutivas da indústria citrícola. O patossistema dessa doença envolve o agente causal o Citrus leprosis virus C, o vetor Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae) e as plantas hospedeiras. Este vírus com genoma conhecido é membro tipo do gênero Cilevirus. Causa sintomas localizados nas folhas, frutos e caules e está restrito ao continente Americano. Apesar de muitos esforços para se conhecer o patossistema, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações. O presente trabalho teve como objetivo obter informações detalhadas sobre as relações vetorvírus- hospedeiro da leprose citoplasmática, estando dividido em três objetivos: 1. Procurou-se uma planta indicadora padrão que fosse de facil obtenção, manejo e baixo custo, e que expressase em curto tempo os sintomas de CiLV-C e outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTBr); 2. Determinar parâmetros como o período de acesso para aquisição e inoculação do CiLV-C pelo ácaro vetor, o período de retenção do vírus pelo ácaro, avaliação da capacidade das diferentes fases do ácaro de transmitir o vírus e a % de indivíduos de uma população de ácaros colonizando plantas afetadas pela leprose capazes de transmitir o vírus; 3. Avaliar um grande número de espécies de plantas, de diferentes famílias botânicas, quanto à suscetibilidade experimental à infecção pelo CiLV-C, pelo ácaro vetor. A presença de CiLV-C nestes ensaios foi confirmada por testes de ELISA, RT-PCR, microscopia eletrônica de transmissão e imunofluorescência. O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) reage com lesões necróticas locais em apenas cinco dias à inoculação com ácaros virulíferos, podendo-se reduzir para dois dias se as plantas forem incubadas a 28ºC. O cv. ,,Una\" foi selecionado como planta-teste padrão dentre 113 cvs. avaliados. Outros vírus transmitidos por Brevipalpus do tipo citoplasmático (VTBr) como vírus da pinta verde do maracujá (Passion fruit green spot virus PFGSV), vírus da mancha anular de Ligustrum (Ligustrum ringspot virus LigRSV) e mancha verde do hibisco (Hibiscus green spot vírus HGSV) também causaram lesões locais necróticas em feijoeiro. Usando feijão como planta teste e ácaros virulíferos, se determinou o período de acesso à aquisição do vírus-4 h; período de acesso à inoculação do vírus-4h; período de retenção do vírus no ácaro de 12 dias, porcentagem de ácaros virulíferos, colonizando tecidos infectados, transmitirem CiLV-C em até 45%. Os experimentos também confirmaram que todas as etapas de desenvolvimento do ácaro (larvas, proto-deutoninfa e adultos) são capazes de transmitir CiLV-C, inclusive confirmou-se que o macho tem a capacidade de transmissão e que o vírus pode ser adquirido a partir de lesões de folhas, frutos e caules. Não se constatou transmissão transovariana do CiLV-C. Foram testadas 140 espécies, de 45 famílias, dentro das quais 62 espécies de 26 famílias apresentaram lesões localizadas nas folhas. Destas, 46 espécies sintomáticas, o CiLV-C foi detectado em pelo menos um dos testes para sua detecção, confirmando a transmissão. O conhecimento de parâmetros de alimentação, retenção do vírus e porcentagem de ácaros viruliferos na população, além do genoma de hospedeiras suscetíveis ao vírus tem importantes implicações no entendimento da epidemiologia, na quarentena e podem oferecer indícios da origem do CiLV-C. / Citrus leprosis (CL), caused by the Citrus leprosis virus C (CiLV-C), is reported only in the American continent. The pathosystem of the CL involves the causal agent, the main vector Brevipalpus phoenicis Geijeskes (Acari: Tenuipalpidae) and the susceptible hosts. For long time only Citrus spp. were considered the sole susceptible host. The entire genome of the CiLV-C was sequenced and a new genus, Cilevirus, was assigned for this virus. CL is characterized by the induction of localized symptoms on the leaves, fruits and stems. Important advances were made recently for the understanding of CL pathosystem, but despite these efforts little is known about details of the virus/vector/host relationship. The present work aimed to cover such deficiencies. In the first place a search of suitable indicator plant was made and the common bean (Phaseolus vulgaris L.) was found to respond with localized necrotic lesions after infestation with viruliferous B. phoenicis in five days and when infested leaves are incubated at 28°C. Furthermore, bean plants are easy and cheap to produce and handle. The black bean cv. ,,IAC Una\" was adopted as a standard test variety, among 113 assayed cultivars of various genetic backgrounds. Common bean plants mite-inoculated with other cytoplasmic-type Brevipalpus-transmitted viruses (BrTVs) [Passion fruit green spot virus (PFGSV), Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), Ligustrum ringspot virus (LigRSV) and Hibiscus green spot virus (HGSV)] also responded with necrotic local lesions and could serve as test plants for these viruses. Detecion of these viruses were made by RTPCR and/or transmission electron microscopy. Using common bean as test plant, some parameters of the vector/virus relationship were determined: virus acquisition feeding period- 4 h; virus inoculation feeding period- 4h; period of retention of the virus by a single viruliferous mite- at least 12 days; percentage of viruliferous mites from a mites colonizing infected tissues- 45%. The experiments also confirmed that all the developmental stages of the mite (larvae, proto- and deutonymph, adult) as well as males are able to transmit CiLV-C. No transovarial passage of the CiLV-C was registered. The virus can be acquired from lesions of leaves, fruits and stems. To assess the experimental host range of CiLV-C, a large number of plant species were inoculated with B. phoenicis, viruliferous to CiLV-C, under experimental conditions. Of the140 species tested, belonging to 45 families, 62 (of 26 families) produced localized lesions on inoculated leaves. Of these 62 plants producing local lesions, 45 had the presence of CiLV-C confirmed by at least one of the assays to detect the virus (RT-PCR, ELISA, transmission electron microscopy and immunofluorescence). These assays were also used to confirm the presence of CiLV-C in transmission experiments. Although only few non Citrus species were found naturally infected by CiLV-C, present results show that a large number of plant species are susceptible to the virus with implications on the epidemiology, quarantine and the evolution of the citrus leprosis pathosystem.