Étude de la régulation transcriptionnelle du virus de la leucémie bovine :rôle des facteurs de transcription Sp1/Sp3 et de la méthylation de l’ADN / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The epidemiological, clinical and pathological aspects of 128 cases of bovine lymphoma are retrospectively described in this study (1965-2014).Out of the cases were the gender was informed (n=111), 84.7% of affected animals were females and 15.3% were males. Out of the cases were breed was informed (n=108), 63% of affected animals were Holstein cows. The age of affected cows (n=107) varied from 1 to 14 years, with most animals being adults (80.4%) with 5 to 8 years of age (57.9%). The most common clinical sign (n=89) was lymphadenomegaly (74.1%). Gross findings (n=125) included enlargement of lymph nodes in 71.2% of the cases; this finding was classified as localized in 89.6% of the cases and generalized in 10.3% of the cases. A retrospective study of 86 cases of bovine lymphoma classified as with diffuse pattern of distribution and verified by phenotypic (histology) and immunophenotypic (immunohistochemistry [IHC]) is presented. Based on these results, the lymphoma cases were classified by the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin s Lymphomas for Clinical Usage as: diffuse large non-cleaved cell (46.5%), diffuse large cleaved cell (33.7%), diffuse mixed small and large cell (4.6%), diffuse small cell plasmacytoid (7%), immunoblastic (3.5%), diffuse small cell intermediate (2.3%), diffuse small non-cleaved cell (1.2%), and diffuse small non-cleaved cell Burkitt s (1.2%). According to the IHC, 27 out of 86 (31.4%) lymphomas were positive to monoclonal antibody CD79αcy, used to detect B cells, and none were positive for polyclonal antibody CD3, used to detect T cells. Based on this, the B-cell type lymphomas were distributed as follows: diffuse large B-cell lymphoma (81.5%), large cell immunoblastic lymphoma (11.1%), and lymphoplasmacytoid lymphoma (7.4%), according the Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL). The results of this retrospective study, similar to what has been described in other parts of the world, allow us to conclude that bovine lymphomas are basically diffuse and predominantly made of intermediate-grade, large cells, with cleaved or non-cleaved nuclei. These lymphomas are due to neoplastic proliferation of B cells and correspond to almost all (92.6%) to what is currently classified as diffuse large B-cell lymphoma by REAL. / Foi realizado um estudo retrospectivo dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) com base nos casos de necropsia e materiais de necropsia de bovinos dos últimos 50 anos (1965-2014). Foram incluídos nesse estudo somente os laudos que possuíam o diagnóstico de linfoma (n=128). Dos laudos que informavam o sexo (n=111), 84,7% correspondiam a fêmeas e 15,3% a machos. Dos laudos em que constava a raça (n=108), a mais prevalente foi a holandesa (63%). Em relação à idade (n=107), houve uma variação entre um e 14 anos. A maioria dos bovinos era adulta (80,4%) e a maior concentração dos casos ocorreu entre 5-8 anos (57,9%). Clinicamente (n=89), linfadenomegalia foi o achado mais frequentemente observado (74,1%). Na necropsia (n=125), 71,2% dos bovinos apresentavam aumento de volume dos linfonodos; essa linfadenomegalia foi classificada como localizada em 89,6% dos casos e generalizada em 10,3% dos casos. Realizou-se também a avaliação fenotípica (histologia) e imunofenotípica (imuno-histoquímica [IHQ]) de 86 casos de linfoma bovino. Com base nestes resultados, os linfomas foram assim distribuídos utilizando-se a classificação proposta pela Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin s Lymphomas for Clinical Usage: difuso de grandes células não clivadas (46,5%), difuso de grandes células clivadas (33,7%), difuso de pequenas e grandes células (4,6%), difuso de pequenas células tipo plasmocitoide (7%), imunoblástico (3,5%), difuso de pequenas células tipo intermediário (2,3%), difuso de pequenas células não clivadas (1,2%) e difuso de pequenas células não clivadas tipo Burkitt (1,2%). Na IHQ, 27 dos 86 (31,4%) linfomas foram positivos para o anticorpo monoclonal CD79αcy, utilizado para detecção de linfócitos B, e nenhum caso foi positivo para o anticorpo policlonal CD3, utilizado para detecção de linfócitos T. Com base nestes resultados, os linfomas B foram assim distribuídos utilizando-se a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL): linfoma difuso de grandes células B (81,5%), linfomas imunoblásticos de grandes células (11,1%) e linfomas linfoplasmocíticos (7,4%). Os resultados aqui apresentados permitem concluir que à semelhança do que vem sendo descrito em outras partes do mundo, os linfomas bovinos são basicamente difusos e predominantemente de grau intermediário, de grandes células, com núcleos clivados ou não clivados. Esses linfomas são decorrentes da proliferação neoplásica de linfócitos B e correspondem, em sua quase totalidade (92,6%), ao que atualmente é incluído na REAL como linfoma difuso de grandes células B.

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Nos animais soropositivos, foi realizado o leucograma pareado para a determinação de linfocitose persistente (LP). Para a determinação da prevalência do vírus da Diarréia Viral Bovina, foi realizado o teste de vírus neutralização(VN) com cepa citopática NADL (BVDV-1). A detecção de possíveis animais persistentemente infectados (PI) foi utilizada a técnica de RT-PCR. O lote experimental era composto por 179 animais de raças leiteiras e cruzas, divididos em cinco lotes por faixa etária e peso, não fixos, submetidos ao manejo pelo método do Pastoreio Racional Voisin (PRV). As taxas de prevalência iniciais para LEB e DVB foram de 3,91% e 51,98% respectivamente. Foram calculadas taxas de incidência para as duas doenças resultando em 21,51% para LEB e 11,77% para DVB. A dinâmica de transmissão da Diarréia viral Bovina foi relativamente, lenta justificada pela ausência de animais PI dentro do lote experimental. Constatou-se que dos 39 animais positivos para LEB ao final do período experimental, dez apresentaram linfocitose persistente (LP), ou seja, uma prevalência de 25,64%, considerada alta, elevando os riscos de transmissão do vírus para outros animais dentro do centro de recria. A intensificação do manejo das novilhas dentro do centro de recria aumenta os riscos de disseminação de destas doenças. Como formas de controle destas enfermidades no rebanho, sugeriu-se a identificação de animais LEB positivos com estratégias de manejo e utensílios separados dos animais negativos; quanto a DVB como não foram encontrados animais persistentemente infectados no rebanho a vacinação das novilhas na idade reprodutiva deve ser preconizada reduzindo o risco da ocorrência de animais PI nas unidades de produção após o retorno dos animais e evitando problemas reprodutivos. / This work is presented in the form of a scientific paper whose objective of the study was to determine the prevalence and incidence of Bovine Leukosis (LEB) and bovine viral diarrhea (DVB), evaluating the dynamics of transmission of viral diseases in a center for rearing dairy heifers Pastoreio Racional Voisin (PRV). These viral diseases have a significant economic impact on the creation of dairy cattle leading to reduced milk production and pre-arranging the heifers to other infections immunosuppression. For antibodies against Bovine Leukosis was carried out immunodiffusion test Agar Gel (AGID) commercial. In seropositive animals, was held the WBC paired for the determination of persistent lymphocytosis (PL). To determine the prevalence of bovine viral diarrhea virus, we performed the virus neutralization test (VN) with cytopathic strain NADL (BVDV-1). The detection of possible persistently infected (PI) animals was used for RT-PCR. The experimental plot consisted of 179 animals of dairy breeds and crosses, divided into five lots by age and weight, not fixed, subject to management by the method of grazing Rational Voisin (PRV). The initial prevalence rates for LEB and DVB were 3.91% and 51.98% respectively. Incidence rates were calculated for the two conditions resulting in LEB 21.51% and 11.77% for DVB. The dynamic transmission of bovine viral diarrhea was relatively slow explained by the absence of PI animals within the test batchIt was found that out of 39 animals positive for LEB the end of the trial, ten presented persistent lymphocytosis (LP), or a prevalence of 25.64%, which is considered high, increasing the risk of virus transmission to other animals within the center recreates. Intensified management of heifers in the center of growing increases the risk of spread of these diseases As ways to control these diseases in the herd, suggested the identification of positive LEB animals with separate management strategies and tools of negative animals; as the DVB as vaccination of heifers in the reproductive age persistently infected animals in the herd were not found to be recommended, reducing the risk of occurrence of animal IP in production units after the return of animals and avoiding reproductive problems.

Orientador: Samir Issa Samara / Banca: Maria da Gloria Buzinaro / Banca: Fumio Honma Ito / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo verificar a variação da ocorrência da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR) pela associação com duas doenças virais imunossupressoras: a Diarréia Viral Bovina (BVD) e a Leucose Enzoótica Bovina (LEB), em seis propriedades onde não se adota esquema de vacinação contra essas enfermidades. Amostras de soro sangüíneo foram analisadas no teste de virusneutralização (VN), para constatação de IBR e BVD, e Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA), para a LEB. Foram selecionados cinco rebanhos bovinos, em propriedades localizadas em municípios dos Estados de São Paulo e Minas Gerais, sendo três de exploração leiteira, um de gado de corte e um misto, com animais soropositivos ao BoHV-1, além de um rebanho controle, sem anticorpos contra essa enfermidade. Das 278 amostras analisadas, 54,68% (152/278) foram positivas ao BoHV-1, 69,70% (194/278) ao BVDV-1 e 34,33% (96/278) ao VLEB. Na análise estatística, ao relacionar cada enfermidade com o tipo de exploração do rebanho e a idade dos animais, houve diferença significativa, indicando que estas variáveis são fatores de risco para as enfermidades estudadas. Em relação ao tipo de exploração, os rebanhos leiteiros foram mais suscetíveis ao BoHV-1 e a LEB (81,31% e 49,53% respectivamente, (α = 1 ) enquanto no rebanho de gado de corte o BVDV-1 teve maior ocorrência (94,74%, α = 1). A idade foi fator de risco apenas para o BoHV-1 e a LEB, sendo os animais mais velhos os mais suscetíveis (α = 1). As associações entre o BoHV-1 e o BVDV-1, e o BoHV-1 e a LEB também foram significativas (α = 5 e α = 1 respectivamente), indicando que em rebanhos infectados por BVDV-1 e/ou LEB, a probabilidade de se encontrar o BoHV-1 é maior do que naqueles onde não ocorre essas duas enfermidades. / Abstract: The present research had as objective to verify the variation of the occurrence of Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) by association with two viral infections that affect the immune system, Bovine Viral Diarrhoea (BVD) and enzootic bovine leukosis (EBL), in six farms where vaccination against these diseases was not adopted. Serum samples had been analyzed by the virus neutralization (VN) test for IBR and BVD diagnosis, and agar gel immunodiffusion (IDGA) test for EBL diagnosis. Five cattle herds with BoHV-1 seropositive animals had been selected in the states of São Paulo and Minas Gerais, three of them exploiting dairy cattle, one exploiting beef cattle and one exploiting mixed cattle, in addition to a control herd without seropositive animals. From 278 analyzed samples, 54.68% (152/278) reacted to the BoHV-1, 69.70% (194/278) to the BVDV-1, and 34.33% (97/278) to the EBLV. The statistic analysis showed a significant difference (α = 1) in infection occurrence according to the kind of exploitation and the age of the animals. Dairy cattle were more sensitive to the BoHV-1 (81.31%) and to the EBLV (49.53%) and less to BVDV-1 infection (45.79%). Among the beef herds, the major occurrence was BVDV-1 infection (94.74%), followed by BoHV-1(34.19%) and EBLV (3.95%). The age was a risk factor (α = 1) only for BoHV-1 and EBLV. The associations between BoHV-1 and BVDV-1 infections (α = 5) and between BoHV-1 and EBLV infections (α = 1) also indicated that among BVDV-1 and/or EBLV infected herds the probability of finding BoHV-1 is higher than among herds where these two infections does not occur. / Mestre

Parmi les rétrovirus tumorigènes, les rétrovirus appelés « complexes » dont font partie HTLV-1 chez l’homme et BLV chez le mouton, sont responsables de leucémies lymphoïdes chroniques caractérisées par des pathogenèses similaires. Bien que la contribution essentielle de la protéine Tax dans la leucémogenèse soit bien établie pour ces deux virus, il existe toujours une contreverse quant à l’expression des protéines virales -dont l’oncoprotéine Tax- dans les cellules transformées. Dans le cas de HTLV-1 et BLV, le virus est latent. Une hypothèse attrayante suggère que l’extinction complète du provirus accompagnée du blocage transcriptionnel de l’expression de Tax dans la cellule leucémique serait un élément indispensable au développement de la tumeur en réduisant son immunogénicité. Le silencing viral permettrait à la cellule infectée d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte. <p>Dans la première partie de notre travail, nous avons pu montrer, grâce à l’observation et le suivi de deux moutons infectés par BLV, que l’extinction virale était associée au développement tumoral. Alors que la phase asymptomatique est caractérisée par l’existence de différents clones cellulaires infectés et exprimant le virus, la phase tumorale est caractérisée par l’existence d’un seul clone cellulaire dans lequel l’expression virale est éteinte. Dans le cas du mouton S2531, nous avons mis en évidence que le silencing observé dans la phase tumorale est d’origine génétique. L’extinction de l’expression virale et la domination du clone muté au niveau de la protéine Tax (K303) sont associées à l’émergence de la leucémie et constituent une caractéristique de la phase tumorale. Le deuxième mouton étudié, S267, est caractérisé par la présence de cellules infectées non transformées et transformées au même moment. Par ailleurs, le mouton S267 est caractérisé par une absence de mutations ou délétions au niveau du provirus intégré dans les cellules tumorales. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons pu, grâce à l’établissement de la lignée L267 dans laquelle le silencing viral n’est pas lié à une défection dans la structure génomique du provirus, élucider les mécanismes épigénétiques responsables du silencing. Nous montrons que ce provirus silencieux peut être réactivé in vitro 1) lorsque la protéine Tax sauvage est introduite par transfert rétroviral, 2) après traitement des cellules par la trichostatine A (TSA), un inhibiteur des histones désacétylases, 3) par traitement des cellules à la 5’azacytidine, un agent inhibiteur de DNA méthyltransférases. La réactivation du provirus silencieux lui confère la capacité d’infecter des moutons sains, suggérant que le provirus est complet et exempt de mutation qui pourrait altérer son fonctionnement. Les complexes de désacétylation des histones msin3A et HDAC-1 jouent un rôle important dans l’établissement du silencing viral via la condensation de la chromatine, et ce changement de la structure chromatinienne est lié a un ensemble de modifications ciblant les acides aminés des queues N-terminales des histones H3 et H4 établissant ainsi un code histone pour l’extinction et l’expression du provirus. Enfin, l’étude comparative des profils d’expression génique de cellules B tumorales dans lesquelles le provirus BLV est soit silencieux, soit ré-activé suite à l’expression exogène de Tax a montré que les mécanismes épigénétiques de silencing se superposent même dans le modèle génétique de silencing. De plus le rétablissement de l’expression virale par Tax est associé à une élimination des complexes de désacétylation des histones au niveau du promoteur viral.<p>Nos résultats ouvrent le champ vers l’utilisation de modèle de leucémie ovine dans des essais thérapeutiques basés sur la combinaison du traitement par des inhibiteurs des HDACs et des DNMTs et une immunothérapie ciblant des antigènes tumoraux d’origine virale ou cellulaire. De telles expériences in vivo constitueront un modèle utile pour le traitement l’ATLL et de pathologies prolifératives touchant les cellules B chez l’homme.<p><p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus B-lymphotrope qui a été identifié comme l’agent étiologique de la leucose bovine enzootique. L’infection par le BLV se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle du provirus in vivo; elle favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire de l’hôte. Cependant, la transcription du BLV peut être activée de manière rapide et très efficace par la protéine virale TaxBLV. La trans-activation par TaxBLV joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée au BLV car elle permet la production de nouvelles particules virales nécessaires à la propagation du virus. Au cours de notre travail de thèse, nous avons étudié différents mécanismes impliqués au cours de ces deux phases clés (latence et trans-activation par TaxBLV) de l’expression du BLV.<p><p>Le promoteur unique de la transcription du BLV se situe à l’extrémité 5’ du génome proviral, dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) composée des régions U3, R et U5. Les mécanismes impliqués dans la trans-activation du LTR 5’ par TaxBLV sont encore mal connus. La trans-activation du LTR 5’ du BLV par TaxBLV requiert la présence de trois répétitions imparfaites de 21pb (TxREs pour Tax Responsive Elements) agissant en cis et situées dans la région U3. Chacune des TxREs possède dans sa partie centrale un motif imparfait de 8 nucléotides correspondant au site de liaison des protéines de la famille CREB/ATF (sites CREs pour cAMP-Responsive Element). Des expériences de retard de migration sur gel ont montré que les protéines CREB, ATF-1 et ATF-2 lient les CREs viraux in vitro. Comme TaxBLV ne semble pas capable de lier directement l’ADN du LTR, il a été suggéré que les facteurs CREB/ATF serviraient de médiateurs de la trans-activation par TaxBLV. De plus, il a également été suggéré au cours de ces dernières années que les facteurs de transcription CREB/ATF jouent aussi un rôle essentiel en l’absence de TaxBLV lors de l’initiation de la transcription virale.<p><p>CREB/ATF sont connus pour recruter les co-activateurs CBP/p300 qui possèdent une activité histone-acétyltransférase, suggérant qu’à l’instar d’autres rétrovirus tels que HIV-I ou HTLV-I, l’acétylation protéique pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transcription du BLV. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence un synergisme transcriptionnel entre TaxBLV et les inhibiteurs de désacétylases TSA et NaBut, indiquant que l’acétylation protéique joue un rôle important dans la trans-activation par TaxBLV. Nous avons ensuite montré que ni TaxBLV, ni son médiateur CREB ne sont acétylés in vivo au niveau d’un résidu lysine interne, mais que la TSA synergise avec TaxBLV via un mécanisme indirect, sensible à l’inhibition de la synthèse protéique. Fonctionnellement, CREB/ATF semblent jouer un rôle crucial dans le synergisme TaxBLV/TSA car la mutation des CREs viraux ou la sur-expression d’un dominant négatif CREB inhibent ce synergisme. Des expériences de gel retard et de ChIP ont démontré, in vitro et in vivo, que les inhibiteurs de désacétylases augmentent la liaison des facteurs CREB/ATF aux TxREs. Nos résultats suggèrent donc que le synergisme TaxBLV/TSA serait dû à une augmentation de la trans-activation par TaxBLV observée suite à l’augmentation, induite par la TSA, du recrutement de CREB/ATF au niveau des TxREs.<p><p>CREB/ATF appartiennent à la famille des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF agissant au niveau des promoteurs contenant des éléments CREs. Cependant, la liaison de CREM aux CREs imparfaits du LTR du BLV n’a jamais été étudiée. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que des isoformes du gène CREM sont exprimées dans des PBMCs isolés à partir d’un mouton infecté par le BLV et que ces protéines CREM sont capables de lier in vitro et in vivo le promoteur du BLV, via les motifs CREs présents au centre de chacune des TxREs. Des analyses fonctionnelles ont ensuite montré qu’en l’absence de TaxBLV, la surexpression de l’isoforme activatrice CREMt induit la transcription dirigée par le LTR 5’ du BLV. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que CREMt serait capable d’activer la transcription du BLV en réponse à l’activation des cellules B infectées, via la phosphorylation de la sérine 117 de CREMt et via le recrutement par CREMt des co-activateurs CBP/p300. CREMt serait donc impliqué dans les stades précoces de l’initiation de la transcription du BLV. Cependant, nous avons montré que CREMt n’est pas impliqué dans les stades tardifs de l’expression virale puisqu’il ne semble pas capable d’induire la trans-activation par TaxBLV. Au contraire, nous avons montré par des expériences de compétition que CREMt diminue la trans-activation par TaxBLV lorsque celle-ci est induite par CREB, probablement en entrant en compétition avec CREB pour la liaison au niveau des TxREs.<p><p>L’expression du gène CREM est régulée transcriptionnellement et post-transcriptionnellement et mène à la production de différentes isoformes capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs de la transcription. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence la présence d’isoformes répressives ICER dans les cellules YR2 infectées par le BLV. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons montré qu’ICER est capable de réprimer la trans-activation par TaxBLV, suggérant qu’ICER retarderait la trans-activation par TaxBLV afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté jusqu’à ce qu’un niveau suffisant du trans-activateur TaxBLV soit produit.<p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished