Submitted by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-08-17T17:26:59Z No. of bitstreams: 1 DissSACA.pdf: 2241501 bytes, checksum: b88dd9ad345544bce3926b892f257af7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-08-17T17:27:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissSACA.pdf: 2241501 bytes, checksum: b88dd9ad345544bce3926b892f257af7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-08-17T17:27:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissSACA.pdf: 2241501 bytes, checksum: b88dd9ad345544bce3926b892f257af7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-17T17:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissSACA.pdf: 2241501 bytes, checksum: b88dd9ad345544bce3926b892f257af7 (MD5) Previous issue date: 2017-04-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The aim of this dissertation is to study a family of asymmetric link functions for binary regression models under Bayesian approach. Specifically, we present the estimation of parameters of power and reversal power binary regression models considering Hamiltonian Monte Carlo method, on No-U-Turn Sampler extension, and Metropolis-Hastings within Gibbs sampling method. Furthermore, we study a wide variety of model comparison measures, including information criteria and measures of predictive evaluation. A simulation study was conducted in order to research accuracy and efficiency on estimated parameters. Through analysis of educational data we show that models using the proposed link functions perform better fit than models using standard links. / O objetivo desta dissertação é estudar uma família de ligações assimétricas para modelos de regressão binária sob a abordagem bayesiana. Especificamente, apresenta-se a estimação dos parâmetros da família de modelos de regressão binária com funções de ligação potência e reversa de potência considerando o método de estimação Monte Cario Hamiltoniano, na extensão No-U-Turn Sampler, e o método Metropolis-Hastings dentro de Gibbs. Além disso, estudam-se diferentes medidas de comparação de modelos, incluindo critérios de informação e de avaliação preditiva. Um estudo de simulação foi desenvolvido para estudar a acurácia e eficiência nos parâmetros estimados. Através da análise de dados educacionais, mostra-se que os modelos usando as ligações propostas apresentam melhor ajuste do que os modelos usando ligações tradicionais.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3457.pdf: 9418556 bytes, checksum: f1f8eee0e6ab76b87435fc819a9bf0ba (MD5) Previous issue date: 2011-02-04 / As a consequence of student difficulties related to concepts of greater abstraction of Chemistry, the concept of Meaningful Learning according to the theory of Ausubel was used in this work. From it, the twodimensional diagrams Conceptual Maps intend to represent the relationships among concepts, through propositions, in a particular topic. They can be used as teaching, assessment, and study strategies among others. In order to minimize the mentioned difficulties, we organized a short course relating to Chemical Bonds that were applied in a class of high school first year in the State of Minas Gerais. In classes, students came into contact with diversified educational strategies: computer-related activities (virtual reality-3D, animation, video), modeling (plastic models, balloons) and instructional material (book) organized from the theory of Ausubel. As a way of learning assessment, we used the preparation of conceptual maps. Upon completion, students answered a Questionnaire evaluating the teaching methodology. The major difficulties were related to the absence of examples in the maps and the correct construction of propositions, supported by appropriated linking words. With this study, we found that the strategy of Conceptual Maps is a valuable resource to probe in depth the limitations and potential for students learning, even in very arid field, dominated by a lack of motivation for learning meaningful and the absence of material resources. On the other hand, there was a wide acceptance by students of information technology and models, but lower for the preparation of maps. It is possible that this resistance is a consequence of the good results in previous approaches to learning by memorization, because students become unsafe for the strategies for change in Meaningful Learning, when considering a challenge to take responsibility to build their own meanings, though rewarding for some apprentices. / Como consequência das dificuldades dos alunos relacionadas aos conceitos de maior abstração de Química, utilizou-se no presente trabalho, a concepção de Aprendizagem Significativa conforme a teoria de Ausubel. Daí, derivam-se os Mapas Conceituais que são diagramas bidimensionais, cujo objetivo é representar as relações entre os conceitos, por meio de proposições, em um determinado tópico. Podem ser utilizados como estratégia de ensino, avaliação, estudo, entre outros. Com a finalidade de minimizar as mencionadas dificuldades, organizou-se um minicurso referente às Ligações Químicas, que foi aplicado em uma turma de primeira série do Ensino Médio, no interior do Estado de Minas Gerais. Nas aulas, os estudantes entraram em contato com estratégias diversificadas de ensino: atividades de informática (realidade virtual-3D, animações, vídeos), modelagem (modelos plásticos, bexigas) e material instrucional (apostila) organizado a partir da Teoria de Ausubel. Como forma de avaliação da aprendizagem, recorreu-se à elaboração de mapas conceituais. Ao término, os alunos responderam a um Questionário de avaliação da metodologia de ensino. As maiores dificuldades estiveram relacionadas à ausência de exemplos nos mapas e à correta construção de proposições, apoiadas em palavras de ligação apropriadas. Com este trabalho, foi possível constatar que a estratégia dos Mapas Conceituais é um recurso válido para sondar em profundidade as limitações e potencialidades de aprendizagem dos alunos, mesmo em terrenos muito áridos, onde predomina a falta de motivação para a aprendizagem significativa e a ausência de recursos materiais. Por outro lado, houve uma grande aceitação dos alunos por atividades de informática e modelos, mas menor pela elaboração dos mapas. É possível que esta resistência seja uma consequência dos bons resultados anteriores em abordagens de aprendizagem por memorização, porque tornam os estudantes inseguros na mudança para estratégias de Aprendizagem Significativa, visto que consideram um desafio tomarem a responsabilidade pela construção dos seus próprios significados, embora compensadora para alguns aprendizes.

Ao nascerem os mamíferos não estão com o sistema nervoso plenamente desenvolvido e os primeiros dias de vida representam uma fase crítica para o desenvolvimento do sistema nervoso, de fato nesta fase o encéfalo esta passando por diversos processos fundamentais como organização funcional das redes neurais, proliferação neuronal, migração, diferenciação, além de gliogênese e mielinização. Em ratos, um procedimento simples, como “manipular” os filhotes por alguns minutos durante a primeira semana de vida, pode marcar decisivamente o desenvolvimento do indivíduo. Assim, a manipulação neonatal tem sido muito utilizada para se examinar os mecanismos pelos quais variações ambientais podem afetar o desenvolvimento do filhote. A manipulação neonatal promove uma série de alterações comportamentais e neuroendócrinas que se caracterizam basicamente por uma diminuição do medo no adulto. Além das mudanças neuroendócrinas já foram relatadas diversas alterações sobre a estrutura do sistema nervoso, como por exemplo, na densidade de células na área pré-óptica medial, na amígdala medial póstero-dorsal e no núcleo periventricular antero ventral, no córtex pré-frontal, núcleos amidalóides e no Locus coeruleus que apresenta papel decisivo durante o desenvolvimento. Sabe-se que o Locus coeruleus apresenta uma atuação muito importante no aprendizado olfatório, pois, apresenta uma via de conexão com o bulbo olfatório. O estímulo tátil realizado pela mãe (Lambida) atua sobre o locus coeruleus promovendo um aumento na liberação de noradrenalina no bulbo olfatório, que vai resultar na fosforilação do CREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc), que por sua vez promove a transcrição de vários genes como o de BDNF (Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo). Como foi demonstrado que a manipulação pode atuar na estrutura do Locus coeruleus e também pode alterar o comportamento maternal isso provoca profundas mudanças na via noradrenérgica e o bulbo como sendo uma de suas áreas de eferência também estaria sujeito a essa modificações. A manipulação neonatal poderia alterar o comportamento maternal, modificando o padrão de lambida da mãe nos filhotes, comprometendo o aporte de noradrenalina no bulbo e por sua vez alterando os níveis de pCREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc fosforilada) e BDNF no bulbo olfatório O BDNF atua em diversos processos durante o desenvolvimento do sistema nervoso, sendo que alterações na sinalização desse fator poderia ser a causa de modificações estruturais e comportamentais encontradas para a manipulação neonatal. Portanto, nesta dissertação avaliamos o efeito da manipulação neonatal sobre a fosforilação da CREB usando uma abordagem diferente daquela utilizada por Raineki et al (2009) e também analisar o efeito da manipulação do sinal de BDNF no bulbo olfatório de ratos no dia 7 pós-natal com o intuito de verificar se as alterações na fosforilação do CREB se traduzem em alterações nos níveis de proteínas (BDNF e seu pré-cursor o pro-BDNF). Os resultados dessa dissertação mostram que manipulação neonatal tanto única como repetida foi capaz de promover alterações bioquímicas no bulbo olfatório de filhotes no dia 7 pós-natal. Além disso, as modificações encontradas nos níveis de pCREB e BDNF em resposta a manipulação sugerem que este protocolo promova alterações duradouras nos níveis de BDNF. Essas mudanças poderiam ser responsáveis por alterações estruturais estáveis no bulbo olfatório desses animais, como já relatados para muitas outras áreas do encéfalo. Sendo que essas alterações na estrutura cerebral poderiam ser a causa de diversos distúrbios psiquiátricos encontrados na vida adulta.

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2016-11-25T14:08:49Z No. of bitstreams: 1 AnânkiaOR_DISSERT.pdf: 597580 bytes, checksum: a044a0afd2f68a5d8f127a9167ef8a63 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-03-21T14:38:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AnânkiaOR_DISSERT.pdf: 597580 bytes, checksum: a044a0afd2f68a5d8f127a9167ef8a63 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-03-21T15:05:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AnânkiaOR_DISSERT.pdf: 597580 bytes, checksum: a044a0afd2f68a5d8f127a9167ef8a63 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-21T15:05:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnânkiaOR_DISSERT.pdf: 597580 bytes, checksum: a044a0afd2f68a5d8f127a9167ef8a63 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Powdery mildew is a disease that causes substantial losses in melon production around the world. Obtaining resistant cultivars is possible through introgression of alleles in the breeding program. In this study, it was investigated the inheritance of resistance of AC-02 accession to races 1 and 5 of Podosphaera xanthii in cross with susceptible cultivar ‘Védrantais’, under greenhouses conditions. The segregations ratios for resistance/susceptibility observed in the different populations (F1, F2, RC1 and RC2) indicated a monogenic and dominant inheritance in AC-02 to races 1 and 5. The distance between the gene controlling resistance to race 1 (px1-ac02) and the gene which confers resistance race 5 (px5-ac02) is 28.5 cM. / oídio é uma doença que causa perdas significativas na produção de melão em todo o mundo. A obtenção de cultivares resistentes é feita mediante introgressão de alelos de resistência. Neste estudo, investigou-se a herança da resistência do acesso AC-02 às raças 1 e 5 de Podosphaera xanthii por meio de cruzamento com a cultivar suscetível ‘Védrantais’, sob condições de casa de vegetação. As razões de segregações de resistência/suscetibilidade observadas nas diferentes populações (F1, F2, RC1 e RC2) indicaram que a herança da resistência do AC-02 às raças 1 e 5 é controlada, cada uma por um gene composto por dois alelos, de modo que o alelo que confere resistência domina o alelo para suscetibilidade. A distância entre o gene que controla a resistência à raça 1 (px1-ac02) e o gene que confere resistência à raça 5 (px5-ac02) é 28,5 cM. / 2016-11-23

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Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada pela produção de múltiplos auto-anticorpos, com componentes celulares nucleares como principal alvo. De etiologia desconhecida, envolve fatores genéticos, imunológicos, hormonais e ambientais. A deficiência na lectina ligadora da manose (MBL), um dos componentes do sistema de complemento, pode produzir uma apresentação anormal de antígenos para o sistema imunológico. Os polimorfismos genéticos na região promotora e codificante do gene MBL2 estão fortemente correlacionados com os níveis séricos da proteína MBL, tendo um possível impacto no mecanismo de tolerância imunológica. A influência do tabagismo ainda não foi avaliada em pacientes que apresentam estas variações alélicas. Nosso objetivo foi investigar o papel dos haplótipos associados à produção de MBL e tabagista sobre os índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES. Investigamos a frequência haplótipica da MBL em 327 pacientes com LES, classificados em Euro e Afro-descendentes. O hábito tabagista, dados clínicos e laboratoriais foram retirados dos prontuários e protocolos de pesquisa. A genotipagem do promotor e das variantes do exon 1 da MBL2 foram feitas por PCR-SSP e PCR-RFLP, respectivamente. Os índices SLICC e SLEDAI foram analisados comparando tabagismo, maços/ano (MA) e haplótipos através do teste Kruskal-Wallis e quiquadrado com Bonferroni para as outras análises. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do HCPA. Quando comparados fumantes e não-fumantes, não encontramos associação entre SLEDAI e SLICC com tabagismo, MA e os haplótipos da MBL. Em uma subanálise, manifestações como serosite (p = 0.025), pericardite (p = 0.015), convulsões (p = 0.011) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.016) apresentaram uma maior frequência em não-fumantes. Entre fumantes, foi observado uma associação significativa entre alterações imunológicas (p = 0.032) e anti-RNP (p = 0,013) em pacientes que fumam de 4-24.7 MA, em comparação com quem fuma menos de 4 ou mais de 24.7 MA. Quando estratificados por etnia e os haplótipos da MBL, Euro-descendentes com haplótipos para deficiência de MBL apresentaram uma maior frequência de anticoagulante lúpico em fumantes (p = 0.016) e pleurite (p = 0.001) entre os que nunca fumaram. Nos haplótipos associados à baixa MBL, encontramos uma associação positiva entre pericardite em não-fumantes (p= 0.027). Entre os haplótipos para alta MBL, vimos uma menor frequência de distúrbios neurológicos (p = 0.05) e imunológicos (p = 0.027) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.035) em não-fumantes. Em relação aos Afro-descendentes com haplótipos para baixa MBL, observou-se uma associação significativa entre o anti-RNP (p = 0.017) e não-fumantes. Aqueles indivíduos com haplótipo para alta MBL tiveram uma pequena associação entre o VDRL em não-fumantes (p = 0.048). Contudo, quando ajustado o p-valor para a correção de Bonferroni, todas essas associações perderam significância. Os resultados não apresentaram evidências de que o tabagismo possa atuar como um modulador dos índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES relacionado aos haplótipos da MBL. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by multiple autoantibody production, with cellular nuclear components as the most notable targets. With an unknown etiology, it involves genetic, immunological, hormonal and environmental factors. Deficiencies in the mannose-binding lectin (MBL), a component of the complement system, can produce an abnormal presentation of antigens to the immune system. Genetic polymorphisms in the promoter and coding regions of the MBL2 gene are strongly correlated to serum levels of the MBL protein, with possible impact in the immunological tolerance mechanism. The influence of smoking has not been evaluated in patients who present these allelic variants. Our aim was to investigate the role of MBL haplotypes (divided as deficient, low and high serum level-associated haplotypes) and smoking habit on disease activity and damage indexes in SLE patients. We investigated the frequencies of haplotype variants in 327 European and African-descendants SLE patients. Smoking habits, clinical and laboratory data were revised from clinical charts and genotyping of the promoter and exon 1 variants of MBL2 were performed by PCR-SSP and PCR-RFLP, respectively. SLICC and SLEDAI score were analyzed comparing the haplotype, smoking habits and pack-years (PY) of smoking using Kruskal-Wallis test for quantitative variables and chi-square test with Bonferroni for other analysis. The study was approved by the local ethical committee. When comparing ever smokers vs. never smokers, we found a lack of association between SLICC and SLEDAI among smoking habit, PY and MBL haplotypes. Further subanalysis on SLE manifestations showed a higher frequency of serositis (p=0.025), pericarditis (p=0.015), convulsion (p=0,011) and presence of anti-Sm (p=0.016) on never smokers. Among ever smokers, a significant association was observed between immunologic disorders (p=0.032) and anti-RNP (p=0.013) in patients who smoke 4 – 24.7 PY, compared with less than 4 or more than 24.7 PY. When stratified by ethnicity and MBL haplotypes, European-descendants with deficient MBL haplotype showed a higher frequency of lupus anticoagulant in smokers (p=0.001) and pleuritis (p= 0.016) among never smokers. On low MBL haplotype, we found a positive association between pericarditis and never smokers (p= 0.027). Among high MBL haplotype we identified a smaller frequency of neurologic (p=0.05) and immunologic disorders (p= 0.027) and presence of anti-Sm (p= 0.035) in never smokers. In relation to African-descendants with low MBL haplotype, a significant association between anti-RNP (p=0.017) and never smokers was observed. Those with high MBL haplotype had small association between false positive VDRL and never smokers (p=0.048). However, by adjusting the p-value for Bonferroni correction, all these associations lost significance. Our findings presented no evidence that smoking may act as a modulator of disease activity and damage indexes on SLE patients associated to serum MBL haplotypes.

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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-17T18:21:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / Plant BiP (binding protein) has been described as an important mediator of translocation, folding and assembly of nascent secretory proteins in the endoplasmic reticulum lumen and it responds to a variety of biotic and abiotic stresses. Despite its functional relevance, little is known about the regulation mechanisms of plant BiP gene expression and the structure of their promoters. Here, we have fused two BiP promoters, designated gsBiP6 and gsBiP9, as well as different extensions of their 5'-flanking sequences to beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced into Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters possess cis-regulatory elements of most plant promoters, such as CAAT e TATA boxes, in addition to potential regulatory cis-elements, such as endoplasmic reticulum stress elements (ERSE) and G-box-related sequences. GUS activity assays from leaf discs expressing BiP6- GUS e BiP9-GUS demonstrated that gsBiP6 promoter is induced by a variety of stress conditions, whereas the induction of gsBiP9 is restricted to tunicamycin treatment, a potent activator of the unfolded protein response (UPR) pathway. Furthermore, histochemical analysis of transgenic lines harbouring -358pbip6-gus (BiP6) and -2200pbip9-gus (BiP9) revealed that BiP promoters drove an intense and uniform pattern of GUS expression in leaves and stems, with the expression of BiP genes in tissues with high secretory activity and in regions of intense cell division. Promoter deletion analyses allowed to identify two cis-regulatory functional domains, designated CRD-1 (-1090 to -670) and CRD-2 (-670 to +1), that are important for the spatially-regulated activation of BiP expression under normal plant development. CRD-1 corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. CDR-2 is able to maintain a basal expression of the reporter gene in root, stem and leaves and, most likely, it contains all the required elements of a eukaryotic promoter. In spite of that, the gene reporter expression levels driven by CRD-2 domain were not sufficiently high in these organs, and GUS activity were not detected in apical meristems. In fact, the BiP promoter activity in meristematic tissues requires the presence of a second activating domain CRD-1 (-1090 to -670), that corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. These results suggest that the tissue-specific control of BiP gene expression requires a complex integration of multiple cis- acting regulatory elements on the promoter. / Dissertação importada do Alexandria

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