Ao nascerem os mamíferos não estão com o sistema nervoso plenamente desenvolvido e os primeiros dias de vida representam uma fase crítica para o desenvolvimento do sistema nervoso, de fato nesta fase o encéfalo esta passando por diversos processos fundamentais como organização funcional das redes neurais, proliferação neuronal, migração, diferenciação, além de gliogênese e mielinização. Em ratos, um procedimento simples, como “manipular” os filhotes por alguns minutos durante a primeira semana de vida, pode marcar decisivamente o desenvolvimento do indivíduo. Assim, a manipulação neonatal tem sido muito utilizada para se examinar os mecanismos pelos quais variações ambientais podem afetar o desenvolvimento do filhote. A manipulação neonatal promove uma série de alterações comportamentais e neuroendócrinas que se caracterizam basicamente por uma diminuição do medo no adulto. Além das mudanças neuroendócrinas já foram relatadas diversas alterações sobre a estrutura do sistema nervoso, como por exemplo, na densidade de células na área pré-óptica medial, na amígdala medial póstero-dorsal e no núcleo periventricular antero ventral, no córtex pré-frontal, núcleos amidalóides e no Locus coeruleus que apresenta papel decisivo durante o desenvolvimento. Sabe-se que o Locus coeruleus apresenta uma atuação muito importante no aprendizado olfatório, pois, apresenta uma via de conexão com o bulbo olfatório. O estímulo tátil realizado pela mãe (Lambida) atua sobre o locus coeruleus promovendo um aumento na liberação de noradrenalina no bulbo olfatório, que vai resultar na fosforilação do CREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc), que por sua vez promove a transcrição de vários genes como o de BDNF (Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo). Como foi demonstrado que a manipulação pode atuar na estrutura do Locus coeruleus e também pode alterar o comportamento maternal isso provoca profundas mudanças na via noradrenérgica e o bulbo como sendo uma de suas áreas de eferência também estaria sujeito a essa modificações. A manipulação neonatal poderia alterar o comportamento maternal, modificando o padrão de lambida da mãe nos filhotes, comprometendo o aporte de noradrenalina no bulbo e por sua vez alterando os níveis de pCREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc fosforilada) e BDNF no bulbo olfatório O BDNF atua em diversos processos durante o desenvolvimento do sistema nervoso, sendo que alterações na sinalização desse fator poderia ser a causa de modificações estruturais e comportamentais encontradas para a manipulação neonatal. Portanto, nesta dissertação avaliamos o efeito da manipulação neonatal sobre a fosforilação da CREB usando uma abordagem diferente daquela utilizada por Raineki et al (2009) e também analisar o efeito da manipulação do sinal de BDNF no bulbo olfatório de ratos no dia 7 pós-natal com o intuito de verificar se as alterações na fosforilação do CREB se traduzem em alterações nos níveis de proteínas (BDNF e seu pré-cursor o pro-BDNF). Os resultados dessa dissertação mostram que manipulação neonatal tanto única como repetida foi capaz de promover alterações bioquímicas no bulbo olfatório de filhotes no dia 7 pós-natal. Além disso, as modificações encontradas nos níveis de pCREB e BDNF em resposta a manipulação sugerem que este protocolo promova alterações duradouras nos níveis de BDNF. Essas mudanças poderiam ser responsáveis por alterações estruturais estáveis no bulbo olfatório desses animais, como já relatados para muitas outras áreas do encéfalo. Sendo que essas alterações na estrutura cerebral poderiam ser a causa de diversos distúrbios psiquiátricos encontrados na vida adulta.

Submitted by LETÍCIA BORGES JOAQUIM null (leticiajoaquim@gmail.com) on 2016-03-18T19:56:09Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoLeticia.pdf: 1246720 bytes, checksum: 72c61040420200f71667f56d8d424fec (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T12:39:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaquim_lb_me_jabo.pdf: 1246720 bytes, checksum: 72c61040420200f71667f56d8d424fec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T12:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaquim_lb_me_jabo.pdf: 1246720 bytes, checksum: 72c61040420200f71667f56d8d424fec (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os painéis de marcadores de alta densidade têm demonstrado a sua funcionalidade nos estudos de estrutura da população e conservação genética. Esses painéis permitem avaliar similaridades no padrão do desequilíbrio de ligação em toda população, assim como informações sobre parentesco da população. Segmentos de homozigose são utilizados como indicativo da estrutura da população e fornecem informações sobre o histórico demográfico e eventos de endogamia da mesma. O objetivo deste trabalho foi estudar a estrutura genômica de uma linhagem sintética base Landrace por meio de (i) análises de desequilíbrio de ligação; (ii) estimação do coeficiente de endogamia utilizando dados genômicos e de pedigree; (iii) análise do número e tamanho de segmentos de homozigose e (iv) determinação da estratificação da população. Foram utilizados registros de 300 fêmeas e 25 machos de uma linhagem fêmea sintética base Landrace genotipados com o painel Illumina PorcineSNP60 v2 BeadChip. A edição dos dados foi realizada no programa PLINK v.1.9 para remoção de marcadores SNPs (“Single Nucleotide Polymorphism”) que falharam em mais de 10% das amostras (“call rate”) e amostras que falharam em mais de 10% dos marcadores. A extensão do desequilíbrio de ligação foi avaliada entre todos os pares SNPs adjacentes presentes nos cromossomos autossômicos por meio da medida r2. O coeficiente de endogamia foi calculado usando registros de pedigree e de dados genômicos. Os segmentos de homozigose foram detectados para os cromossomos autossômicos com o programa computacional PLINK v.1.9, considerando pelo menos 50 SNPs homozigotos dentro de tamanho mínimo de 1.000 Kb por animal, permitindo um SNP heterozigoto e um SNP faltante/perdido dentro de uma janela de 50 SNPs. Os segmentos de homozigose detectados foram utilizados para cálculo do coeficiente de endogamia genômica e como indicativo do histórico da população. A estratificação da população foi avaliada utilizando análises de componentes principais e pelo modelo de ancestralidade por metodologia bayesiana aplicado no programa STRUCTURE. Na análise de ancestralidade foram testados valores de K (número de “clusters”) variando de um a oito usando período de burn-in de 1.000 iterações e Cadeia de Markov e Monte Carlo de 10.000 iterações. As análises foram repetidas dez vezes para cada K e a determinação do melhor número para K foi estimada utilizando a estatística Delta K. O valor médio de r² encontrado para todos os SNPs adjacentes que estão a uma distância menor que 100 Kb foi de 0,291 ± 0,312. Os coeficientes de endogamia médios obtidos a partir dos segmentos de homozigose e de registros de pedigree foram de 0,119 e 0,00011, respectivamente. A baixa correlação (r<0,04) encontrada entre os coeficientes de endogamia pode ser explicada pelo efeito de recombinação gênica sobre aqueles estimados a partir dos segmentos de homozigose que não é considerada nas estimativas obtidas à partir de registros de pedigree e devido aos erros de identificação dos animais no pedigree. A identificação de um grande número de longos segmentos de homozigose pode ser indicativa de endogamia recente na população estudada. O estudo da estratificação da amostra indicou que a mesma estaria dividida em duas populações (k=2), sendo que a separação pode ser explicada pelo cruzamento entre as raças ocidentais e orientais utilizadas na formação da linhagem. Os dados de genotipagem permitiram concluir que a população estudada possui endogamia recente, sugerindo-se que seja priorizado acasalamento entre indivíduos menos aparentados para assegurar a manutenção da diversidade genética. / High-density single nucleotide polymorphism (SNP) panels have been used in genomic studies, such as population structure and conservation genetic studies. These panels allow to assess similarities in the patterns of linkage disequilibrium across populations and to estimate relatedness between populations. Runs of homozygosity are used as indicative of population structure and it provides information about demographic history and recent inbreeding. The aim of this study was to describe the genomic structure of a synthetic Landrace line by (i) linkage disequilibrium (LD) analyses; (ii) inbreeding estimates through pedigree and genomic data; (iii) analysing the number and length of runs of homozygosity (ROH); and (iv) determination of population structure. A total of 300 females and 25 males from synthetic Landrace line were genotyped using Illumina PorcineSNP60 v2 BeadChip. Data editing was performed using PLINK v.1.9. The SNPs and samples with a call rate lower than 0.90 were excluded from the data set. Only the autosomal chromosomes were considered for LD an ROH analyses. The LD between all pairs of SNPs were measured by the means of the genotype correlation coefficient (r²) and it determined the decay of LD with physical distance. The coefficient of inbreeding was calculated using genomic and pedigree data. ROH were detected using PLINK v.1.9 considering the follow parameters: a minimum ROH of 50 SNPs with a minimum length of 1000 (Kb), one heterozygous SNP and one missing SNP were allowed within the sliding window of 50 SNPs. The individual genomic inbreeding and population history were identified from estimated ROH. The population structure was evaluated using principal component analysis and Bayesian admixture model. The number of clusters (K) was tested from two to eight considering a burning period of 1,000 followed by 10,000 Markov chain Monte Carlo repetitions and replicated ten times for each K. The best K was estimated using the Delta K statistic. For all SNPs adjacent less than 100 kilobase (kb) apart, the average r2 was 0.291 ± 0.312. The average inbreeding coefficient, calculated by ROH and pedigree analyses, were 0.119 and 0.00011, respectively. The low correlation between the inbreeding coefficients can be justified by the genetic recombination effect over those estimated from runs of homozygosity that were no considered on the estimates from the traditional pedigree. The high number of long ROH is an evidence of recent inbreeding in this population. The population structure analysis revealed K=2 was the best number of clusters and separation. This result can be explained by the crossbreeding between the Eastern and Western breeds used in the formation of the line. The genotyping data helped confirm that the inbreeding in the studied population is recent, which suggests that mating between individuals less related occurred to ensure the maintenance of genetic diversity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-07Bitstream added on 2014-06-13T20:03:33Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_mpm_dr_jabo.pdf: 358402 bytes, checksum: d85997fcfe0314483cdbbbf3d2c88ca2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estudos de associação baseados em desequilíbrio de ligação (DL) são importantes ferramentas para construção de mapas de ligação e utilização em programas de melhoramento assistidos por marcadores. Em geral, são utilizadas populações segregantes ou linhagens isogênicas para composição destes programas. Com o objetivo de comparar o desequilíbrio de ligação em linhagens duplo-haplóides (DH) e linhagens obtidas por meio de autofecundação, duzentas e quarenta e cinco linhagens – cento e setenta e cinco convencionais e setenta DHs – foram submetidas à análise de marcadores do tipo Single Nucleotide Polymorphism (SNP), utilizando-se mil duzentos e trinta e quatro marcadores distribuídos pelos dez cromossomos. O resultado da regressão entre as distâncias mostrou um R2 de 0,6546 para linhagens duplo-haplóides e uma equação de tendência logarítmica, sendo y= -0,024ln(x) + 0,159. Para as linhagens convencionais, o R2 foi de 0,5727, com a equação que explica a tendência, sendo y = -0,008ln(x) + 0,0659. Os dados de DL foram analisados individualmente, por cromossomo; e, assim como na análise conjunta, individualmente, todos os cromossomos tiveram o mesmo comportamento quando se comparam o DL de linhagens DH e os convencionais, sendo que os valores de DL nas linhagens DH foram em geral mais altos que nas convencionais. Os resultados indicam que, para a obtenção de linhagens DH, a recombinação ocorre em blocos maiores quando comparado com as linhagens convencionais. / Association studies based on linkage disequilibrium (LD) are important tools for linkage maps construction and to use in marker-assisted breeding programs. Typically, segregating populations or isogenic lines are used to compose them. With objective of compare the linkage disequilibrium on double haploid lines (DH) and lines obtained by self pollination (Conventional), two hundred and forty five inbred lines, where one hundred seventy five conventional and seventy DHs where submitted to the analysis of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) molecular markers, using one thousand two hundred and thirty four markers random distributed over the ten chromosomes. The regression output among the distances showed R2 of 0.6546 for double haploids lines and one logarithmic trend equation, being y = -0.024ln(x) + 0.159 For conventional lines, R2 was 0.5727, with an equation that explains the trend, being y = -0.008ln(x) + 0.0659. LD data were analyzed by chromosomes individually and as such in the joint analysis, all individual chromosomes showed the same patternr when comparing the LD of DH lines versus conventional lines, being the LD of DH lines generally higher that the conventional lines. Results show that to obtain DH lines the recombination occurs in larger blocks when compared against the conventional lines.

Resumo não disponível.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada pela produção de múltiplos auto-anticorpos, com componentes celulares nucleares como principal alvo. De etiologia desconhecida, envolve fatores genéticos, imunológicos, hormonais e ambientais. A deficiência na lectina ligadora da manose (MBL), um dos componentes do sistema de complemento, pode produzir uma apresentação anormal de antígenos para o sistema imunológico. Os polimorfismos genéticos na região promotora e codificante do gene MBL2 estão fortemente correlacionados com os níveis séricos da proteína MBL, tendo um possível impacto no mecanismo de tolerância imunológica. A influência do tabagismo ainda não foi avaliada em pacientes que apresentam estas variações alélicas. Nosso objetivo foi investigar o papel dos haplótipos associados à produção de MBL e tabagista sobre os índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES. Investigamos a frequência haplótipica da MBL em 327 pacientes com LES, classificados em Euro e Afro-descendentes. O hábito tabagista, dados clínicos e laboratoriais foram retirados dos prontuários e protocolos de pesquisa. A genotipagem do promotor e das variantes do exon 1 da MBL2 foram feitas por PCR-SSP e PCR-RFLP, respectivamente. Os índices SLICC e SLEDAI foram analisados comparando tabagismo, maços/ano (MA) e haplótipos através do teste Kruskal-Wallis e quiquadrado com Bonferroni para as outras análises. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do HCPA. Quando comparados fumantes e não-fumantes, não encontramos associação entre SLEDAI e SLICC com tabagismo, MA e os haplótipos da MBL. Em uma subanálise, manifestações como serosite (p = 0.025), pericardite (p = 0.015), convulsões (p = 0.011) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.016) apresentaram uma maior frequência em não-fumantes. Entre fumantes, foi observado uma associação significativa entre alterações imunológicas (p = 0.032) e anti-RNP (p = 0,013) em pacientes que fumam de 4-24.7 MA, em comparação com quem fuma menos de 4 ou mais de 24.7 MA. Quando estratificados por etnia e os haplótipos da MBL, Euro-descendentes com haplótipos para deficiência de MBL apresentaram uma maior frequência de anticoagulante lúpico em fumantes (p = 0.016) e pleurite (p = 0.001) entre os que nunca fumaram. Nos haplótipos associados à baixa MBL, encontramos uma associação positiva entre pericardite em não-fumantes (p= 0.027). Entre os haplótipos para alta MBL, vimos uma menor frequência de distúrbios neurológicos (p = 0.05) e imunológicos (p = 0.027) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.035) em não-fumantes. Em relação aos Afro-descendentes com haplótipos para baixa MBL, observou-se uma associação significativa entre o anti-RNP (p = 0.017) e não-fumantes. Aqueles indivíduos com haplótipo para alta MBL tiveram uma pequena associação entre o VDRL em não-fumantes (p = 0.048). Contudo, quando ajustado o p-valor para a correção de Bonferroni, todas essas associações perderam significância. Os resultados não apresentaram evidências de que o tabagismo possa atuar como um modulador dos índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES relacionado aos haplótipos da MBL. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by multiple autoantibody production, with cellular nuclear components as the most notable targets. With an unknown etiology, it involves genetic, immunological, hormonal and environmental factors. Deficiencies in the mannose-binding lectin (MBL), a component of the complement system, can produce an abnormal presentation of antigens to the immune system. Genetic polymorphisms in the promoter and coding regions of the MBL2 gene are strongly correlated to serum levels of the MBL protein, with possible impact in the immunological tolerance mechanism. The influence of smoking has not been evaluated in patients who present these allelic variants. Our aim was to investigate the role of MBL haplotypes (divided as deficient, low and high serum level-associated haplotypes) and smoking habit on disease activity and damage indexes in SLE patients. We investigated the frequencies of haplotype variants in 327 European and African-descendants SLE patients. Smoking habits, clinical and laboratory data were revised from clinical charts and genotyping of the promoter and exon 1 variants of MBL2 were performed by PCR-SSP and PCR-RFLP, respectively. SLICC and SLEDAI score were analyzed comparing the haplotype, smoking habits and pack-years (PY) of smoking using Kruskal-Wallis test for quantitative variables and chi-square test with Bonferroni for other analysis. The study was approved by the local ethical committee. When comparing ever smokers vs. never smokers, we found a lack of association between SLICC and SLEDAI among smoking habit, PY and MBL haplotypes. Further subanalysis on SLE manifestations showed a higher frequency of serositis (p=0.025), pericarditis (p=0.015), convulsion (p=0,011) and presence of anti-Sm (p=0.016) on never smokers. Among ever smokers, a significant association was observed between immunologic disorders (p=0.032) and anti-RNP (p=0.013) in patients who smoke 4 – 24.7 PY, compared with less than 4 or more than 24.7 PY. When stratified by ethnicity and MBL haplotypes, European-descendants with deficient MBL haplotype showed a higher frequency of lupus anticoagulant in smokers (p=0.001) and pleuritis (p= 0.016) among never smokers. On low MBL haplotype, we found a positive association between pericarditis and never smokers (p= 0.027). Among high MBL haplotype we identified a smaller frequency of neurologic (p=0.05) and immunologic disorders (p= 0.027) and presence of anti-Sm (p= 0.035) in never smokers. In relation to African-descendants with low MBL haplotype, a significant association between anti-RNP (p=0.017) and never smokers was observed. Those with high MBL haplotype had small association between false positive VDRL and never smokers (p=0.048). However, by adjusting the p-value for Bonferroni correction, all these associations lost significance. Our findings presented no evidence that smoking may act as a modulator of disease activity and damage indexes on SLE patients associated to serum MBL haplotypes.

Resumo não disponível

Submitted by ANA CAROLINA DE TOLEDO SANTANA null (actoledo@iq.unesp.br) on 2016-03-17T17:25:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Carol Final.pdf: 7825510 bytes, checksum: 921c29706ed56e5ef489712bae28fc30 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-03-21T20:10:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santana_act_me_iq_par.pdf: 4512361 bytes, checksum: 07a7dc911b2bdd27db8608948a16848b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T20:10:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santana_act_me_iq_par.pdf: 4512361 bytes, checksum: 07a7dc911b2bdd27db8608948a16848b (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho teve como principal objetivo estudar a atividade catalítica de soroalbumina bovina (BSA) em reações formadoras de uma nova ligação C-C: Reações aldólica, de Henry e Morita-Baylis-Hillman (MBH). Em todos os casos a BSA atuou como catalisador, visto que quando as reações foram realizadas sem sua presença, não houve formação dos produtos desejados. Os rendimentos obtidos para as reações aldólica (37%), Henry (80%) e MBH (73%), variaram de bons a moderados e não foi observada enantiosseletividade para nenhuma das reações estudadas. As soroalbuminas são proteínas que formam muita emulsão dificultando os processos downstream na separação dos produtos e materiais de partida. Visando minimizar este inconveniente, a BSA foi submetida à imobilização em MCLEA (magnetic cross-linking enzyme aggregates) utilizando nanopartículas magnéticas de óxido de ferro. Nestes casos, o biocatalisador pôde ser facilmente retirado do meio reacional com aplicação de um campo magnético externo. Esta metodologia afetou diretamente no rendimento da reação de Henry, passando de 80% para 89%. Porém, para as outras reações a melhoria no rendimento não foi tão expressiva. A imobilização também não foi eficaz para o aumento dos excessos enantioméricos. Até o momento para a reação de MBH com os substratos utilizados, não há relatos na literatura para a síntese do aduto desejado catalisado pela BSA. Sendo assim, optamos por realizar um planejamento fatorial completo dessa reação visando otimizar as condições reacionais bem como os rendimentos. As variáveis estudadas foram: temperatura, concentração do biocatalisador e condição do biocatalisador (livre ou imobilizado). Os resultados obtidos mostraram que a variável com maior influência na reação, é a concentração do biocatalisador. A conversão obtida passou de 30% para 40% utilizando 2,2 μmol de BSA. Em seguida, realizamos um estudo de ascendência da concentração do catalisador visando otimizar este parâmetro. A conversão obtida passou para 73% quando foram utilizadas 3,7 μmol de biocatalisador imobilizado. Realizamos um estudo de reciclagem do biocatalisador imobilizado. Foi possível reutiliza-lo porém com diminuição da conversão a partir do segundo ciclo. Os resultados obtidos nesta dissertação evidenciam o potencial biocatalítico da BSA em reações para a formação de ligação C-C. / This work aimed to study the catalytic activity of bovine serum albumin (BSA) in reactions that form a new C-C bond: aldol reactions, Henry and Morita-Baylis-Hillman (MBH). In all cases BSA served as the catalyst, whereas when the reactions were carried out without their presence there was no formation of the desired products. The yields obtained for aldol reactions (37%), Henry (80%) and MBH (73%), ranged from good to moderate enantioselectivity and was not observed for any of the studied reactions. The serum albumins are proteins that form the much emulsion difficulting downstream processes in separation of the products and starting materials. To minimize this inconvenience, the BSA was subjected to immobilization in M-CLEA (magnetic cross-linking enzyme aggregates) using magnetic nanoparticles of iron oxide. In these cases the biocatalyst could be easily removed from the reaction medium by applying an external magnetic field. This methodology directly affect the yield of the Henry reaction, from 80% to 89%. However, for other reactions the improvement of yields was less pronounced. The immobilization was also not effective for improving the enantiomeric excess. So far for the MBH reaction with the worked substrates, there are no reports in the literature for the synthesis of the desired adduct catalyzed by BSA. So we decided to study a full factorial design of this reaction to optimize the reaction conditions and yields. The variables studied were: temperature, the biocatalyst concentration and biocatalyst conditions (free and immobilized). The concentration of biocatalyst was the major factor with interference in all reactions. The conversion increased from 30% to 40% using 2.2 μmol of BSA. Then we perform a study of catalyst concentration to optimize this parameter. The conversion increased to 73% when they were used 3.7 μmol immobilized biocatalyst. To evaluate the retention of catalytic activity of BSA immobilized, it was performed a study of the immobilized biocatalyst recycling. It was possible the reuse but with reduced conversion from the second cycle. The results obtained in this work demonstrated the potential of BSA in C-C bond formation reactions.

A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe&#8594;Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp&#8594;Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp &#8594; Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp &#8594; Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe&#8594;Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp&#8594;Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp&#8594;Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Sepsis is recognized as a systemic inflammatory response (SIRS) to infection with the presence of progressive tissue damage, where multiple organ failure is the most severe expression. The purinergic signaling plays an important role in inflammatory response modulation as well as in immune responses through its extracellular biomolecules, such as adenine nucleotides and its derivative nucleoside adenosine. These signalling molecules are released by cells in response to damage or cellular stimuli induced by pathogens. Adenine nucleotides and adenosine effects are promoted by activation of specific purinergic receptors controlled by an enzymatic cascade on cell surface. In addition to immunologic changes, oxidative stress has an important part in sepsis pathophysiology, contributing to its deleterious systemic effects such as tissue hypoxia and organ failure. This study aims to evaluate the activity of the E-NTPDase, which degrade adenine nucleotides in lymphocytes, as well as analyse the oxidative profile in brain, heart, liver and kidney in rats submitted to experimental sepsis. The sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP). The evaluation of the effects of sepsis on E-NTPDase activity in lymphocytes, as well as on the oxidative stress parameters in different tissues, was divided into two stages. On the first stage, the animals were split into two groups: (1) negative controls and (2) septic, which evaluated the activity of the E-NTPDase and histological analysis of the kidneys, liver and lung. On the second stage, the animals were divided into three groups: (1) negative controls, (2) sham e (3) septic. An increase in ATP hydrolysis was observed in sepsis-induced rats when compared to the control group. Nevertheless, the E-NTPDase activity remained unchanged when ADP was applied as substrate. Histological analyses of kidneys, liver and lung have shown vascular congestion, necrosis and inflammatory mononuclear cell infiltration when compared to control group. Regarding the antioxidant activity, no difference was observed in the NPSH content and SOD activity in the organs analysed. Concerning the oxidative stress parameters, the carbonyl protein content showed no significant difference in brain and liver, whilst in heart and kidney a decrease was observed in the septic group. No significant difference in TBARS levels was observed in brain, however an increase was observed in kidney while a decrease was observed in heart and liver. E. coli was identified as the etiological agent. On the septic group, significant hematological changes such as leucocytosis and thrombocytopenia were observed. This reduction in TBARS levels in heart and liver does not agree with data on the literature; this may be due to the employment of different induction techniques among studies, added to altered neutrophil function and and also the characteristics inherent to the pathogenic microorganism. Our findings suggest that the increase in ATP hydrolysis in induced sepsis may be a dynamic response in order to eliminate the increased ATP levels resulting from cell death. Regarding the oxidative stress parameters, the reduction in heart and liver may be due differences in the sepsis induction of CLP model by between different research groups added to altered neutrophil function and and also the characteristics inherent to the pathogenic microorganism. / A sepse pode ser definida como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) decorrente da reação do sistema imunológico à infecção, denotando um processo progressivo de dano tecidual, onde a disfunção múltipla dos órgãos é a expressão mais grave. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado nucleosídeo adenosina. Essas moléculas sinalizadoras são liberadas do meio intracelular em resposta ao dano ou ao estímulo celular por ação de patógenos. Os efeitos dos nucleotídeos de adenina e da adenosina são promovidos através da ativação de receptores purinérgicos específicos e controlados por uma cascata enzimática localizada na superfície das células. Além das alterações imunes, o estresse oxidativo desempenha um importante papel na patofisiologia desta doença, contribuindo para os principais efeitos sistêmicos deletérios da sepse como a hipóxia tecidual e a falência de órgãos. Sendo assim, visando à melhor compreensão desta patologia, este trabalho teve por objetivo avaliar a atividade da enzima E-NTPDase em linfócitos bem como analisar o perfil oxidativo em cérebro, coração, fígado e rins em ratos submetidos à sepse experimental utilizando a técnica de ligação e perfuração do ceco (CLP). Os procedimentos para avaliação dos efeitos da sepse sob a atividade das enzimas ENTPDase em linfócitos e sob os parâmetros de estresse oxidativo nos tecidos foram divididos em duas etapas. Na primeira etapa, os animais foram divididos em dois grupos: (1) controle negativo e (2) séptico, onde se avaliou a atividade da E-NTPDase e a análise histológica dos rins, fígado e pulmão. Para a segunda etapa, os animais foram divididos em 3 grupos: (1) controle negativo, (2) Sham e (3) séptico, na qual se determinou os parâmetros de estresse oxidativo, bem como o perfil bacteriano e hematológico. Observou-se um aumento na hidrólise de ATP em ratos com sepse induzida quando comparado ao grupo controle. Contudo, a atividade da E-NTPDase não foi alterada, quando utilizado ADP como substrato. Pelas análises histológicas de rins, fígado e pulmão verificou-se no grupo séptico a presença de congestão vascular, necrose e infiltrado inflamatório mononuclear quando comparados com o grupo controle. Em relação à atividade antioxidante não se observou diferença significativa no conteúdo de NPSH e na atividade da SOD em nenhum órgão analisado. Quanto aos parâmetros do estresse oxidativo, o teor de proteína carbonil não apresentou diferença significativa no cérebro e no fígado enquanto nos tecidos cardíaco e renal observou-se um decréscimo no grupo séptico em relação aos demais grupos. Não foi observada nenhuma diferença significativa nos níveis de TBARS no cérebro, no entanto, estes níveis estavam reduzidos no coração e no fígado e aumentados no tecido renal. Foi identificado como agente etiológico da sepse E. coli. Observou-se significativas alterações hematológicas no grupo séptico como: leucocitose e trombocitopenia. Com o presente trabalho conclui-se que, na sepse induzida, o aumento da hidrólise do ATP seja provavelmente consequência de uma resposta dinâmica para reduzir os níveis elevados de ATP resultantes da morte celular. Já a redução nos parâmetros de estresse oxidativo no coração e no fígado pode ter ocorrido devido a diferenças na indução da sepse pelo modelo CLP entre os diferentes grupos de pesquisa, adicionado à função dos neutrófilos alterados e também às características inerentes do tipo de micro-organismo patogênico.