Introdução: Imunidade inata é a primeira linha de defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores, a qual é mediada por moléculas específicas que reconhecem patógenos, chamadas receptores toll-símile (TLRs). Os TLRs são também capazes de reconhecer ligantes endógenos, tais como conteúdos de células necróticas e proteínas de choque térmico (HSP), resultando na produção de citocinas e ativação do sistema imune adquirido. A função exata dos TLRs ainda é pouco entendida em transplante de órgãos. No entanto, tem sido sugerido que eles podem estar envolvidos na rejeição aguda ou crônica e atuar na resposta do enxerto a lesão por isquemia e reperfusão. Objetivo: Examinar as alterações na expressão gênica dos TLRs durante a fase inicial do transplante pulmonar em humanos e sua relação com citocinas potencialmente envolvidas na lesão por isquemia e reperfusão em transplante de órgãos. Métodos: Foram analisadas biópsias pulmonares de 14 pacientes submetidos a transplante pulmonar (LTx). Estas amostras foram coletadas no final do período de isquemia fria (TIF, n=14), no final do período de isquemia quente (TIQ, n=13),1 hora (n=12) e 2 horas (n=8) após a reperfusão do enxerto. RNA total foi isolado a partir de tecido pulmonar e os níveis de RNA mensageiro (mRNA) dos TLRs (1-10) bem como citocinas (IL-8, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-1β) e proteína de choque térmico 70 (HSP70) foram medidos por reação em cadeia pela polimerase em tempo real. Resultados: Foi detectada a expressão de mRNA de todos TLRs em tecido pulmonar. Nas amostras no TIF, os níveis de mRNA dos TLRs apresentaram-se com diferentes expressões gênicas. Os níveis de expressão dos TLRs, com exceção para o TLR3, estavam altamente correlacionados entre si no TIF e com os níveis de mRNA de IFN-γ, IL-10 e IL-1β e menos significativamente com os níveis de IL-6 e IL-8. Houve diminuição dos níveis de mRNA na grande maioria dos TLRs após reperfusão, o que foi diferente para a maioria das citocinas e HSP70, que apresentaram tendência a aumentar após transplante. A expressão gênica de TLR4 apresentou-se correlacionada com os níveis de IL-8 e IL-1β antes e após transplante (P<0.05). Pulmões de doadores que foram intubados por períodos acima de 72 horas (n=5) apresentaram níveis mais elevados de TLR2 e TLR10 (P<0.05). Conclusão: Pela primeira vez, foi demonstrado que a expressão dos TLRs altera-se durante o período de isquemia e reperfusão em transplante pulmonar em humanos. O tempo de intubação dos doadores pulmonares pode influenciar a expressão de receptores Toll-símile específicos. A correlação entre TLR4 e IL-8/IL-1β sugere que os TLRs pulmonares podem ter alguma função na resposta precoce do enxerto. / Introduction: Innate immunity is the first line of host defense against invading microorganisms, which is mediated by specific pathogen recognition molecules called Toll-like receptors (TLRs). TLRs can also recognize endogenous ligands, such as contents of necrotic cells and heat shock proteins (HSP), resulting in cytokine production and activation of adaptive immune system. The exact role of the Toll-like receptors and their signalling pathways is still poorly understood in organ transplantation. However, it is suggested that they may be involved in either chronic or acute organ rejection and may play a role in graft response to ischemia reperfusion injury. Objective: To examine the changes in gen expression of TLRs during the early phase of human lung transplantation and their relationship with cytokines potentially involved in ischemia reperfusion injury in organ transplantation. Methods: We analyzed lung biopsies from 14 patients submitted to lung transplantation (LTx). Biopsies were collected at the end of the cold ischemic time (CIT, n=14), end of warm ischemic time (WIT, n=13), and after 1h (n=12) and 2h (n=8) of reperfusion. Total RNA was isolated from lung tissues, and messenger RNA (mRNA) levels of TLRs (TLR 1-10) as well as cytokines (IL-8, IL-6, IL-10, IFN-γ and IL-1β) and heat shock protein 70 (HSP70) were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction. Results: We observed mRNA expression of all TLRs in lung tissue. In the CIT samples, TLR mRNAs levels were differentially expressed in donor samples. In the CIT samples, the expression levels of TLRs, except for TLR3, were highly correlated with each other and with mRNA levels of IFN-γ, IL-10 and IL-1β, and less significantly correlated with IL-6 and IL-8. After reperfusion, expression of almost all TLR mRNAs decreased to lower levels what was different for most of the cytokines and HSP70, which trended to increase after LTx. TLR4 gen expression was closely correlated with IL-8 and IL-1β levels prior to and after LTX (P<0.01). Lungs from donors who were intubated longer than 72 h (n=5) expressed higher levels of TLR2 and TLR10 (P<0.05). Conclusion: For the first time, we showed that the expression of TLRs is altered during ischemia-reperfusion period of human lung transplantation. The donor length of intubation may influence the expression of specific TLRs. Correlation between TLR4 and IL-8/IL-1β suggests that pulmonary TLRs may play a role in early graft response.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T19:09:59Z : No. of bitstreams: 1 silva_aa_me_botfmvz.pdf: 329313 bytes, checksum: acaef38ccfb3815a5cbf93f92e3438da (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Avaliou-se a segurança e a eficácia da técnica de biopsia pulmonar transtorácica percutânea e seus efeitos sobre o metabolismo oxidativo na espécie ovina. Foram utilizados 20 ovinos clinicamente sadios e destinados ao abate. Inicialmente, foram coletadas amostras de sangue da veia jugular em tubos de ensaio contendo heparina. Após a colheita, foi realizado o exame clínico seguido da biopsia pulmonar com agulha semi-automática no 7º espaço intercostal direito cerca de 5 cm acima do olécrano. Avaliou-se o número de tentativas para a realização do procedimento e o tamanho dos fragmentos. As amostras obtidas foram analisadas histologicamente. Uma nova colheita de sangue foi realizada 30 minutos após a biopsia, e as amostras levadas ao laboratório para a detecção indireta dos radicais livres [superóxido dismutase (SOD), glutationa total (GSH-t) e peroxidase (GSH-Px) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)]. Após o abate foi realizado o exame pos mortem para avaliação de complicações da técnica e das eventuais lesões provocadas. Entre todos os animais submetidos à biopsia apenas dois demonstraram resistência à técnica, sendo obtidos fragmentos pulmonares que mediram entre 4 mm a 7 mm de comprimento, com média de 1,8 1 tentativas por fragmento. As principais alterações relacionadas à técnica foram: tosse, dispnéia inspiratória, elevação das freqüências cardíaca e respiratória e aumento do ruído broncobronquiolar. Ao exame pos mortem observou-se hemorragia dos músculos intercostais e pleura visceral de tamanho variado em todos os cordeiros, além de feridas lineares de até 14 mm nos dois animais que não reagiram bem ao procedimento. Das 20 tentativas de execução da técnica, 18 obtiveram sucesso, enquanto que em duas o fígado foi equivocadamente puncionado. As amostras de tecido pulmonar foram consideradas representativas... / It was evaluated the safety and effectiveness of the percutaneous transthoracic lung biopsy technique and its effects of the procedure on oxidative metabolism in sheep. It was used 20 clinically healthy sheep. Initially, blood samples were collected from the jugular vein in test tubes containing heparin. After collecting the blood, the clinical examination was carried out followed by lung biopsy with a semi-automatic needle biopsy. The number of attempts and size of the fragments were measured and the samples were analyzed histologically. New blood samples were collected 30 minutes after the biopsy. All blood samples were taken to the laboratory for the indirect detection of free radicals [superoxide dismutase (SOD), total glutathione (GSH-t), glutathione peroxidase (GSH-Px) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)]. After the slaughter, a post mortem examination assessed the technical complications and possible injuries. Among all animals underwent biopsy only two did not tolerate the technique. It were obtained Lung fragments from 4 mm to 7 mm and it were required on average 1,8 attempts. The main changes related to the procedure were: cough, labored breathing, increased heart and breathing rate and increased broncobronquiolar noise. The post-mortem examination revealed bleeding of the intercostal muscles and visceral pleura of various sizes in all lambs, and a wound up to 14 mm in the lung of two animals that did not tolerate the procedure. From 20 attempts to implement the technique, 18 were successful, while in two of them the liver was mistakenly punctured. Samples of lung tissue were representative. It was possible to visualize intact structures, including bronchioles and alveoli. The activity of SOD and GSH-Px decreased thirty minutes after the biopsy. There were no changes in GSH-t and TBARS concentrations after the procedure. The percutaneous transthoracic lung... (Complete abstract click electronic access below)

Objetivos: Desenvolver e caracterizar nanocápsulas poliméricas contendo erlotinib, bem como avaliar sua atividade antitumoral in vitro em células de adenocarcinoma de pulmão humano. Metodologia: As nanocápsulas contendo erlotinib (0,5 mg.mL-1) foram obtidas pelo método de nanoprecipitação utilizando poli(ε-caprolactona) e óleo de copaíba como parede polimérica e núcleo oleoso, respectivamente. Os parâmetros físico-químicos avaliados foram: diâmetro médio e distribuição de tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, concentração de partículas e pH. Para determinação do teor e eficiência de encapsulação do erlotinib, utilizou-se metodologia validada por CLAE-UV. O estudo de liberação in vitro, utilizando sacos de diálise, foi realizado para obter o perfil de liberação do fármaco a partir das nanocápsulas. As nanocápsulas contendo erlotinib foram avaliadas quanto ao seu potencial de inibir o crescimento, induzir a apoptose, interferir com o ciclo celular e sobrevivência clonogênica de células de adenocarcinoma de pulmão, linhagem A549. Resultados: As nanocápsulas apresentaram diâmetro médio de 171 ± 2 (PDI < 0, 10), potencial zeta de −8,17 ± 2.26 mV, número de partículas por mL de 6,97 ± 0,22 × 1013 e pH de 6,24 ± 0,02. O teor e a eficiência de encapsulação foram próximos de 100%. Com exceção do pH, todos parâmetros mantiveram-se iguais após 30 dias de armazenamento em temperatura ambiente. Observou-se uma liberação controlada do fármaco devido à nanoencapsulação. Os ensaios de citotoxicidade demonstraram que as nanocápsulas contendo erlotinib apresentaram maior atividade antitumoral quando comparado com o fármaco livre. Também foi demonstrado indução de apoptose, pela análise de ciclo celular e marcação por Anexina-V conjugada ao 7-AAD. No ensaio clonogênico, as nanocápsulas contendo erlotinib reduziram 100% o número de colônias formadas. Conclusões: Foram obtidas nanocápsulas com propriedades nanotécnologicas adequadas e capazes de controlar a liberação do erlotinib. Os estudos in vitro na linhagem celular A549 demonstraram aumento no efeito antitumoral e foi demonstrado que o encapsulamento do fármaco é imprescindível para essa melhor atividade. / Purpose: To develop and characterise erlotinib-loaded polymeric nanocapsules and to evaluate its in vitro antitumor activity in human lung adenocarcinoma cells. Methodology: The erlotinib-loaded nanocapsules (0.5 mg.mL-1) were obtained by nanoprecipitation method using poly (ε-caprolactone) and copaiba oil as the polymeric wall and oily core, respectively. The physicochemical parameters evaluated were: mean diameter and size distribution, polydispersity index, zeta potential, particle concentration and pH. An HPLC-UV validated method was used to determine the drug content and encapsulation efficiency. The in vitro release study using dialysis bags was performed to obtain the drug release profile from nanocapsules. The erlotinib-loaded nanocapsules were evaluated regarding their potential to inhibit the growth, induce apoptosis, interfere with the cell cycle and clonogenic survival of lung adenocarcinoma cell (A549). Results: The nanocapsule formulation presented z-average diameter of 171 ± 2 (PDI <0.10), zeta potential value of -8.17 ± 2.26 mV, number of particles per mL of 6.97 ± 0.22 × 1013, and pH value of 6.24 ± 0.02. The drug content and the encapsulation efficiency were nearly 100%. Except for the pH value, all these parameters remained the same after 30 days of storage. A controlled release of the drug was observed due to nanoencapsulation. The cytotoxicity assays demonstrated that the erlotinib-loaded nanocapsules showed higher antitumor activity compared to free drug. Induction of apoptosis was demonstrated by cell cycle analysis and Annexin-V/7AAD staining. In the clonogenic assay, erlotinib-loaded nanocapsules reduced 100% the number of colonies formed. Conclusions: Nanocapsules with appropriate nanotechnological properties and capable of controlling the erlotinib release were obtained. The in vitro studies in the A549 cell line showed an increase in antitumor effect and was demonstrated that the drug encapsulation is essential for this better activity.

Objetivo: O câncer de pulmão é a primeira causa de morte relacionada ao câncer quando considerados ambos os sexos. Os grandes esforços para a redução do tabagismo e para a introdução do filtro de cigarro mudaram a epidemiologia do câncer de pulmão. Em países desenvolvidos, a ascensão do adenocarcinoma e o declínio do epidermoide são de notório conhecimento. Outra característica é o aumento da incidência da doença entre mulheres. Um entendimento melhor da atual epidemiologia do câncer de pulmão é necessário para o desenvolvimento de estratégias de saúde pública de prevenção, diagnóstico e tratamento. Métodos: Análise retrospectiva de todos os pacientes com CPNPC tratados com ressecção pulmonar entre 1986 e 2010 em um hospital universitário do Sul do Brasil. As análises foram divididas em três períodos: 1986-1990, 1991-2000 e 2001-2010. O mesmo grupo de patologistas realizou o diagnóstico, e os estágios foram atualizados para a nova classificação da IASLC, 7ª edição. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa SAS, versão 13. Resultados: Foram estudados 817 pacientes submetidos à ressecção pulmonar por CPNPC entre 1986 e 2010. Setenta por cento eram homens, média de idade de 61,4 anos, 44,2% carcinoma epidermoide e 40% adenocarcinoma, 26,7% estágio IIIA. A proporção de mulheres apresentou um aumento de 22% no primeiro período para 36% na última década. A idade média no momento da cirurgia era de 52,7 anos para mulheres e 57,3 para homens no primeiro período, e 60,1 para mulheres e 63,9 para homens no último período (p<0.001). A proporção de carcinoma epidermoide modificou de 49,1% inicialmente para 38,7% no último período (p=0.017). Em comparação, a prevalência do adenocarcinoma cresceu de 35,4% para 39,6% e, mais recentemente, para 41,2%. Em relação ao número total de pessoas acometidas pela doença, mulheres com adenocarcinoma representavam 9,4% no primeiro período, 12,5% no segundo e 16,8% no último período. Pacientes com estágio IIIA representavam 27,9% na última década. O tipo de cirurgia predominante foi a lobectomia. A pneumonectomia foi o procedimento cirúrgico em 21,9%, 18,8% e 16,8% dos casos em cada período, em ordem crescente, respectivamente (p<0.03). Conclusão: Neste estudo de pacientes no Sul do Brasil, a análise de gênero demonstrou que a taxa de câncer de pulmão entre as mulheres está aumentando nas últimas três décadas, mas ainda não chegou a ultrapassar a taxa masculina. A proporção de adenocarcinoma em mulheres aumentou. O significativo declínio da quantidade proporcional de pneumonectomia provavelmente reflete a mudança da indicação e técnica cirúrgica. A idade média de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico aumentou tanto para homens quanto para mulheres, mas não alcançou a média de países desenvolvidos de 71 anos. A mudança da proporção do tipo histológico e de mulheres está de acordo com os dados de países desenvolvidos. / Objective: Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide when considering both genders. The great effort to reduce smoking and to introduce the usage of cigarette filter has changed lung cancer epidemiology. In developed countries, the increasing incidence of adenocarcinoma and the decrease of squamous cell carcinoma are well known. Other characteristic reported is the rising number of women with the disease. Better understanding of current lung cancer epidemiology is necessary for the appropriate design of public health strategies for prevention, diagnosis and treatment. Methods: Retrospective analysis of all patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) treated with lung resection between 1986 and 2010 in a university hospital of Southern Brazil. Analysis was divided in three periods: 1986-1990, 1991-2000 and 2001-2010. The same pathology group performed histological diagnosis and all staging was updated according to the new IASLC, 7th edition. All analyses were performed using the SAS program, version 13. Results: We studied 817 patients who underwent lung resection for NSCLC from 1986 to 2010. Seventy percent were males, average age 61.4 years old, 44.2% squamous cell carcinoma and 40% adenocarcinoma, 26.7% stage IIIA. The female proportion increased from 22% in the first period to 36% in the last decade. Mean age at surgery treatment was 52.7 years old for women and 57.3 years old for men in the first period, and 60.1 for women and 63.9 for men in the last period (p<0.001). The proportion of squamous cell changed from 49.1% initially to 38.7% in the last period (p=0.017). In comparison, the adenocarcinoma prevalence increased from 35.4% to 39.6% and, most recently, to 41.21%. Of the total NSCLC patients, females with adenocarcinoma represented 9.4% in the first period, 12.5% in the second and 16.8% in last period. Patients with stage IIIA represented 27.9% in the last decade. Lobectomy was the predominant type of surgery. Pneumonectomy was the surgical procedure in 21.9%, 18.8% and 16.8% of the cases in each period, respectively (p<0.03). Conclusions: In this cohort of patients in Southern Brazil, gender analysis shows that rates of lung cancer in females are rising over the last three decades, but have not surpassed men rates. The proportion of adenocarcinoma in females has increased. The significant decrease of pneumonectomy rates probably reflects changes on surgical management techniques and indication. The mean age of patients undergoing surgical treatment has increased for both men and women, but has not reached the average age reported in developed countries, 71 years old. The histological and gender findings for lung cancer are in accordance with the data of developed countries.

A avaliação da técnica de cintilografia da perfusão pulmonar foi realizada em 10 cães machos, da raça Rottweiler, radiograficamente normais e soronegativos para dirofilariose, utilizando-se o macroagregado de albumina sérica humana marcado com tecnécio-99m ([99mTc](MAA)) como radiofármaco. Cada animal sedado foi submetido a três diferentes tratamentos, com administração de 50.000, 100.000 e 300.000 partículas de MAA. As imagens obtidas com as doses variadas do radiofármaco, foram comparadas de forma qualitativa e quantitativa, incluindo nesta última a avaliação do índice de perfusão pulmonar e homogeneidade das imagens. Não foram observadas diferenças significativas entre as imagens durante a avaliação visual e cálculo da quantificação relativa da perfusão pulmonar. Porém, o cálculo da uniformidade integral demonstrou diferença significativa na homogeneidade da imagem pulmonar entre as diferentes doses de MAA. Pode-se concluir que existe um aumento na homogeneidade da imagem diretamente relacionado ao número de partículas de magroagregado de albumina injetado, ainda que tal diferença não tenha sido percebida pela análise qualitativa. / The evaluation of pulmonary perfusion scintigraphy technique was accomplished in 10 Rottweiler male dogs, with normal thoracic radiographs and negative for Dirofilaria immitis, using macroaggregated human serum albumin tagged with technetium-99m ([99mTc](MAA)) as radiopharmaceutical. Each sedated animal was subimited to 3 different treatments, with administration of 50.000, 100.000 and 300.000 particles of MAA. The obtained images with diverse radiopharmaceutical doses were qualitative and quantitative compared, including in this the evaluation of radiopharmaceutical distribution and the homogeneity index. There were observed no significative differences between the images during the visual evaluation and calculation of the relative quantification of the lung perfusion. However, the integral uniformity calculation demonstrated significative difference at the homogeneity of the lung image between the different MAA doses. That leads to the conclusion that there is an increase at the images homogeneity directly related to the number of albumin macroaggregated particles injected, though difference has not been realized by the qualitative analysis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A pancreatite aguda (PA) Ã considerada uma situaÃÃo de emergÃncia abdominal, na forma grave da doenÃa os pacientes desenvolvem acentuada resposta inflamatÃria sistÃmica e SÃndrome de DisfunÃÃo de MÃltiplos ÃrgÃos (SDMO). Um terÃo das mortes relacionadas com PA acontecem antes da admissÃo hospitalar, e a maior parte dos casos estÃo relacionados com lesÃo pulmonar aguda (LPA) e sÃndrome do desconforto respiratÃrio agudo (SDRA). Objetivos: Avaliar as alteraÃÃes inflamatÃrias e funcionais do pulmÃo no curso da pancreatite aguda experimental induzida por ceruleÃna. MÃtodos: PA foi induzida em Ratos Wistar, machos pensando 100-150g, pela administraÃÃo de 4 doses de ceruleÃna (20Âg/kg) com intervalo de uma hora e os grupos controle receberam apenas soluÃÃo salina. ApÃs 24 horas, os animais foram sedados, analgesiados e traqueostomizados e anÃlise da funÃÃo pulmonar foi realizada atravÃs da espirometria, onde foram avaliados Fluxo, Volume Corrente (VC), FrequÃncia RespiratÃria (FR) e Volume Minuto (VM), e da mecÃnica pulmonar onde foram observados ElastÃncia DinÃmica (Edin), ComplacÃncia DinÃmica (Cdin), PressÃo de Pico, ResistÃncia (Res). Lavado bronco-alveolar (LBA) foi realizado para contagem total e diferencial de cÃlulas. Amostra de sangue arterial foi colhida para avaliaÃÃo dos parÃmetros gasomÃtricos. Em seguida os animais foram sacrificados e nÃveis sÃricos de amilase, lipase, EPO, TNF-&#945;, GRO-KC, MIP-1, VEGF, IL-1&#946;, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18 e de malondialdeÃdo (MDA) foram medidos. Atividade de mieloperoxidase (MPO) e avaliaÃÃo histolÃgica de pÃncreas e pulmÃo foram determinadas. AlÃm disso, amostras de sangue venoso foram colhidas para avaliaÃÃo de translocaÃÃo bacteriana. Resultados: NÃveis sÃricos de amilase, lipase, citocinas, MDA e atividade de MPO pancreÃtica e pulmonar estavam aumentados nos animais com PA; houve danos ao tecido pancreÃtico e pulmonar, revelados na histologia, nos animais que receberam ceruleÃna, quando comparados ao grupo controle. O LBA dos animais tratados com ceruleÃna demonstrou maior quantidade de cÃlulas, sendo predominantemente macrÃfagos. Gasometria arterial nÃo apresentou diferenÃa significativa entre os grupos. Fluxo, VC e VM se mostraram diminuÃdos nos animais com PA; FR permaneceu inalterada. Edin e PressÃo de Pico estavam maiores e Cdin estava menor nos animais com PA e nÃo houve alteraÃÃes na Res. Estudo da bacteremia foi negativo em ambos grupos. ConclusÃo: CeruleÃna induz PA em ratos com elevaÃÃo dos nÃveis de amilase e lipase pancreÃtica, com alteraÃÃes histopatolÃgicas no pÃncreas e no pulmÃo dependente do infiltrado neutrofÃlico, radicais livres e citocinas inflamatÃrias. PA induz alteraÃÃes espiromÃtricas e na mecÃnica pulmonar que nÃo sÃo dependentes de processo infeccioso. / Acute pancreatitis (AP) is considered an emergency abdominal, the severe form of the disease patients develop intense systemic inflammatory response and Multiple Organ Dysfunction Syndrome (MODS). About one-third of all deaths from acute pancreatitis has been reported to occur prior to admission to hospital, and in most cases, is associated with acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Objectives: To assess the inflammatory and functional lung alterations in the course of AP induced by cerulein. Methods: Male Wistar rats (100-150g) were treated four times with one hour interval, intraperitoneally with cerulein (20 &#956;g / kg, suspended in saline) or saline. Twenty-four hours after the first injection of cerulein, the animals were anesthetized, tracheostomized and placed in a spirometer for small animals and with following parameters evaluated: Flow, Volume(VC), Respiratory Frequency(RF) and Minute Volume(MV), and lung mechanics were observed where Dynamic Elastance (Edyn), Dynamic Compliance (Cdyn), Peak Pressure, Resistance (Raw). Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed to count and differential cell. Arterial blood sample was drawn for assessment of pulmonary gas exchange parameters. Then the animals were sacrificed and serum amylase, lipase, EPO, TNF-&#945;, GRO-KC, MIP-1, VEGF, IL-1&#946;, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18 and malondialdehyde (MDA) were measured. Myeloperoxidase activity (MPO) and histological evaluation of pancreas and lung were determined. In addition, venous blood samples were collected for evaluation of bacterial translocation. Results: Serum levels of amylase, lipase, cytokines, MDA and MPO activity of pancreatic and lung were increased in animals with PA, there was damage to pancreatic tissue and lung histology revealed, in animals that received cerulein compared to the control group. There was an increase in the number of BAL cells, predominantly macrophages. Arterial blood gas analysis showed no significant difference between groups. Flow, and MV proved lower in animals with PA; FR remained unchanged. Edyn and pressure peak were larger and Cdyn was lower in animals with PA and no changes in Res. There was no translocation in any groups. Conclusion: Cerulein induced AP in rats with elevated serum amylase and pancreatic lipase, with histopathological changes in the pancreas and lung dependent neutrophilic infiltrate, free radicals and inflammatory cytokines. PA induces spirometric and lung mechanics alterations that are not dependent on bacterial translocation

Introdução: Imunidade inata é a primeira linha de defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores, a qual é mediada por moléculas específicas que reconhecem patógenos, chamadas receptores toll-símile (TLRs). Os TLRs são também capazes de reconhecer ligantes endógenos, tais como conteúdos de células necróticas e proteínas de choque térmico (HSP), resultando na produção de citocinas e ativação do sistema imune adquirido. A função exata dos TLRs ainda é pouco entendida em transplante de órgãos. No entanto, tem sido sugerido que eles podem estar envolvidos na rejeição aguda ou crônica e atuar na resposta do enxerto a lesão por isquemia e reperfusão. Objetivo: Examinar as alterações na expressão gênica dos TLRs durante a fase inicial do transplante pulmonar em humanos e sua relação com citocinas potencialmente envolvidas na lesão por isquemia e reperfusão em transplante de órgãos. Métodos: Foram analisadas biópsias pulmonares de 14 pacientes submetidos a transplante pulmonar (LTx). Estas amostras foram coletadas no final do período de isquemia fria (TIF, n=14), no final do período de isquemia quente (TIQ, n=13),1 hora (n=12) e 2 horas (n=8) após a reperfusão do enxerto. RNA total foi isolado a partir de tecido pulmonar e os níveis de RNA mensageiro (mRNA) dos TLRs (1-10) bem como citocinas (IL-8, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-1β) e proteína de choque térmico 70 (HSP70) foram medidos por reação em cadeia pela polimerase em tempo real. Resultados: Foi detectada a expressão de mRNA de todos TLRs em tecido pulmonar. Nas amostras no TIF, os níveis de mRNA dos TLRs apresentaram-se com diferentes expressões gênicas. Os níveis de expressão dos TLRs, com exceção para o TLR3, estavam altamente correlacionados entre si no TIF e com os níveis de mRNA de IFN-γ, IL-10 e IL-1β e menos significativamente com os níveis de IL-6 e IL-8. Houve diminuição dos níveis de mRNA na grande maioria dos TLRs após reperfusão, o que foi diferente para a maioria das citocinas e HSP70, que apresentaram tendência a aumentar após transplante. A expressão gênica de TLR4 apresentou-se correlacionada com os níveis de IL-8 e IL-1β antes e após transplante (P<0.05). Pulmões de doadores que foram intubados por períodos acima de 72 horas (n=5) apresentaram níveis mais elevados de TLR2 e TLR10 (P<0.05). Conclusão: Pela primeira vez, foi demonstrado que a expressão dos TLRs altera-se durante o período de isquemia e reperfusão em transplante pulmonar em humanos. O tempo de intubação dos doadores pulmonares pode influenciar a expressão de receptores Toll-símile específicos. A correlação entre TLR4 e IL-8/IL-1β sugere que os TLRs pulmonares podem ter alguma função na resposta precoce do enxerto. / Introduction: Innate immunity is the first line of host defense against invading microorganisms, which is mediated by specific pathogen recognition molecules called Toll-like receptors (TLRs). TLRs can also recognize endogenous ligands, such as contents of necrotic cells and heat shock proteins (HSP), resulting in cytokine production and activation of adaptive immune system. The exact role of the Toll-like receptors and their signalling pathways is still poorly understood in organ transplantation. However, it is suggested that they may be involved in either chronic or acute organ rejection and may play a role in graft response to ischemia reperfusion injury. Objective: To examine the changes in gen expression of TLRs during the early phase of human lung transplantation and their relationship with cytokines potentially involved in ischemia reperfusion injury in organ transplantation. Methods: We analyzed lung biopsies from 14 patients submitted to lung transplantation (LTx). Biopsies were collected at the end of the cold ischemic time (CIT, n=14), end of warm ischemic time (WIT, n=13), and after 1h (n=12) and 2h (n=8) of reperfusion. Total RNA was isolated from lung tissues, and messenger RNA (mRNA) levels of TLRs (TLR 1-10) as well as cytokines (IL-8, IL-6, IL-10, IFN-γ and IL-1β) and heat shock protein 70 (HSP70) were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction. Results: We observed mRNA expression of all TLRs in lung tissue. In the CIT samples, TLR mRNAs levels were differentially expressed in donor samples. In the CIT samples, the expression levels of TLRs, except for TLR3, were highly correlated with each other and with mRNA levels of IFN-γ, IL-10 and IL-1β, and less significantly correlated with IL-6 and IL-8. After reperfusion, expression of almost all TLR mRNAs decreased to lower levels what was different for most of the cytokines and HSP70, which trended to increase after LTx. TLR4 gen expression was closely correlated with IL-8 and IL-1β levels prior to and after LTX (P<0.01). Lungs from donors who were intubated longer than 72 h (n=5) expressed higher levels of TLR2 and TLR10 (P<0.05). Conclusion: For the first time, we showed that the expression of TLRs is altered during ischemia-reperfusion period of human lung transplantation. The donor length of intubation may influence the expression of specific TLRs. Correlation between TLR4 and IL-8/IL-1β suggests that pulmonary TLRs may play a role in early graft response.

Orientador: Eduardo Mello de Capitani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:31:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cerqueira_ElzaMariaFigueirasPedreirade_M.pdf: 18712156 bytes, checksum: 7f2620dcabd247de06998a15e4784d3f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar as anormalidades torácicas na fase ativa da forma clínica crônica de paracoccidioidomicose através da tomografia computadorizada de alta resolução. Trinta e três pacientes (31 homens, 2 mulheres), com idade entre 32 e 69 anos, com diagnóstico confirmado de paracoccidioidomicose e em tratamento há menos de 30 dias, realizaram tomografia computadorizada de alta resolução. Dois radiologistas determinaram o grau de profusão (ausente, discreto, moderado e acentuado) de 25 achados pulmonares, a distribuição dos achados nos eixos pulmonares vertical e horizontal e a presença de aprisionamento aéreo, espessamento pleural, derrame pleural e linfonodomegalias Os achados mais freqüentes foram vidro fosco (97%), espessamento do interstício interlobular (93,9%), nódulo (75,8%), cavidade (71,2%), enfisema (69,7%), linfonodomegalias (69,7%), pequenos nódulos centrolobulares (66,7%), espessamento intersticial peribroncovascular (63,6%), consolidação (57,6%), e distorção arquitetural (57,6%). Diferentes graus de profusão foram observados na maioria dos achados, e dentre os achados pulmonares mais freqüentemente observados apenas consolidação não apresentou grau de profusão acentuado Predominam as alterações pulmonares distribuídas difusamente no eixo vertical pulmonar, comprometendo indistintamente a região central e periférica, poupando as regiões anteriores dos campos inferiores, e com marcante predomínio posterior no campo inferior (78,8%). São diversos os achados observados na tomografia computadorizada de tórax de alta resolução na fase ativa da PCM, não sendo possível caracterizar um padrão tomográfico específico da doença. Estão presentes sinais de comprometimento alveolar e intersticial, nódulos e fibrose que se manifesta principalmente por distorção arquitetural e bronquiectasias e/ou bronquioloectasias de tração / Abstract: Our purpose is to evaluate the pulmonary abnormalities on high-resolution CT in the active phase of chronic clinical form of paracoccidioidomycosis.Thirty-three patients (31 men, 2 women) carrying a confirmed diagnosis of paracoccidioidomycosis and under less than 30 days of treatment, have been submitted to high-resolution chest CT. Twenty-five pulmonary high-resolution CT findings have been graduaded by a four-point scale (0 to 3). The grade of each pulmonary finding, their distribution into transverse and longitudinal axes, and the frequency of air-trapping, pleural thickening , pleural effusion, and lymph nodes enlargement have been determinated by two radiologists Findings present at more than 50% of the patients have been ground-glass opacity (97% of patients), interlobular interstitial thickening (93,9%), nodule (75,8%), cavitation (71,2%), emphysema (69,7%), lymph nodes enlargement (69,7%), small centrilobular nodules (66,7%), peribronchovascular interstitial thickening (63,6%), consolidation (57,6%), and architectural distortion (57,6%). The majority of findings have been presented in all three profusion grades (discrete, moderate and severe). Among those that have been observed at more than 50% of the patients, consolidation is the only, which has not been observed in severe grade of profusion The HRCT findings regarding anterior versus posterior predominance have shown more frequently an indifferent distribution in upper and middle lung fields, and more frequently posterior predominance in lower lung field (78,8%). No predominance regarding central versus peripheral distribution have been observed in the majority of the fields. No specific high-resolution CT pattern was found in the active phase of chronic clinical form of paracoccidioidomycosis. Findings related to alveolar and interstitial disease, nodules and fibrosis, represented mainly by architectural distortion and bronchiectasis and bronchiolectasis have been seen / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

O organismo apresenta diversas reações integradas em resposta à injúria, com o objetivo de restaurar a homeostase. Dentre esses mecanismos, destaca-se a resposta inflamatória, já que sem ela a injúria que acometeu o organismo dificilmente seria resolvida. Todo procedimento cirúrgico representa uma injúria para o organismo. As técnicas cirúrgicas minimamente invasivas tendem a gerar respostas deletérias mais brandas aos animais; as cirurgias torácicas envolvem, porém, um trauma adicional caracterizado pelo colapso pulmonar, que se faz necessário mesmo nas técnicas minimamente invasivas. Foram realizados em humanos diversos estudos que avaliam as vantagens desta técnica em relação à toracotomia; na espécie eqüina, a toracoscopia vem sendo aplicada na rotina hospitalar desde a década de 80 e relatos afirmam ser um procedimento cirúrgico seguro. No entanto, não foram descritos dados referentes à resposta inflamatória decorrente deste procedimento. Desta forma, este estudo visou avaliar a resposta inflamatória sistêmica e local decorrente da técnica, na qual a indução e redução do colapso pulmonar foram feitas de maneira controlada. Foram utilizados 12 eqüinos hígidos, de raça e idade variadas, de ambos os sexos. Os animais foram divididos em dois grupos, submetidos à toracoscopia com duração de 30 e 60 minutos (grupos 1 e 2, respectivamente). As pressões intratorácicas foram controladas em todos os procedimentos, permitindo controle da indução e redução do colapso pulmonar, diminuindo assim a ocorrência de pneumotórax residual. Amostras de sangue, líquido pleural e lavado bronco alveolar foram coletadas antes do procedimento (M1), e duas (M6), seis (M7) e 24 horas (M8) após o início do colapso pulmonar. Estas foram usadas para avaliação da resposta inflamatória por meio de mensuração da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelas células presentes em cada tipo de amostra, utilizando-se como metodologia a citometria de fluxo, e para a quantificação de citocinas por ELISA (IL-1&beta;) ou por ensaio biológico (TNF-&alpha; e IL-6). Para análise dos resultados foi considerada a possível influência dos fatores grupo e momento experimental em cada uma das variáveis estudadas. Os valores de burst oxidativo apresentados pelas células das amostras em questão não sofreram influência dos fatores avaliados. Não foi possível avaliar a variação dos níveis de IL-1&beta; pela metodologia aplicada. Os níveis de TNF-&alpha; sofreram influência estatisticamente significativa do fator momento experimental nas amostras de lavado broncoalveolar e líquido pleural, sendo que M6 apresentou maiores níveis desta citocina; não foi observada influência desses fatores nos níveis plasmáticos da mesma. Em relação a IL-6, foi observada influência do fator momento experimental nas amostras de plasma e lavado broncoalveolar, e de ambos os fatores nas amostras de líquido pleural, sendo que os níveis dessa citocina apresentaram um padrão de aumento mais tardio que o apresentado pelo TNF-&alpha;. Concluímos que o colapso pulmonar induzido por infusão de gás CO2 em eqüinos hígidos provocou uma reação inflamatória localizada na cavidade torácica, em que não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos experimentais. Assim, a cirurgia torácica videoassistida em eqüinos com até 60 minutos de duração pode ser indicado sem que fatores oriundos da técnica cirúrgica agravem a enfermidade. Uma vez que não foi observada influência dos fatores estudados nos valores de pressão intratorácica, acreditamos que a metodologia aplicada foi adequada para a realização da técnica, provendo adequado controle e redução da ocorrência de pneumotórax residual, que somente foi observado nos casos onde ocorreu pneumotórax bilateral durante o procedimento cirúrgico. / Organisms present several integrative reactions to injury, aiming at the reestablishment of homeostasis. Among these mechanisms is the inflammatory reaction, for without it the initial injury would hardly be solved. Every surgical procedure represents an injury for living organisms. Minimally invasive surgical techniques tend to induce milder negative reactions in animals; nonetheless, thoracic surgery leads to an additional trauma characterized by lung collapse, required even in minimally invasive surgical techniques. Several human studies have assessed the advantages of this technique compared to thoracotomy; in horses, the use of thoracoscopy has increased in routine procedures since the 1980s, and reports point to the safety of its usage. Nevertheless, no data regarding the inflammatory reaction induced by this procedure has been reported. In this matter, our study aimed at the evaluation the local and systemic inflammatory response associated with this technique, in which the induction and reduction of lung collapse were carefully controlled. 12 healthy horses of varied breeds, age, and of both genders were used. Animals were divided in two groups, and submitted to thoracoscopy for 30 or 60 minutes (groups 1 and 2, respectively). Intrathoracic pressure was controlled in every procedure, allowing the induction and reduction of lung collapse, reducing the chance of residual pneumothorax. Samples of blood, pleural fluid, and bronchoalveolar fluid were harvested before the procedure (M1), and two (M6), six (M7) and twenty-four hours (M8) after the onset of lung collapse. These samples were employed for the evaluation of the inflammatory reaction through measurement of reactive oxygen species (ROS) by cells present in each sample, using flow cytometry, and for cytokine quantification by ELISA (IL-1&beta;) or bioassay (TNF-&alpha; and IL-6). For the analysis of our results the factors group and experimental timepoint were considered for every variable studied. Values of oxidative burst displayed by cells in each sample did not depend on the factors analyzed. Variation of IL-1&beta; levels could not be detected by the methods employed here. Levels of TNF-&alpha; were statistically influenced by the factor experimental timepoint in pleural fluid and bronchoalvolar fluid, and the highest levels of this cytokine were observed in M6; no influence of these factors on its plasmatic levels was observed. Regarding IL-6, we found an influence of the factor timepoint in samples of plasma and bronchoalveolar fluid, and an influence of both factors in samples of pleural fluid, being the highest levels of this cytokine found later than the TNF-&alpha; peak. We conclude that the lung collapse induced by CO2 in healthy horses caused an inflammatory reaction restricted to the thoracic cavity, without significant differences between groups 1 and 2. Thus, video-assisted thoracic surgery in horses lasting up to 60 minutes can be recommended leads to no signs of direct negative effects of the technique that could worsen the patient condition. Since we found no influence of either factor studied on values of thoracic pressure, we conclude that the methods employed for the surgery were adequate, supplying sufficient control over the occurrence of residual pneumothorax, observed only in cases of bilateral pneumothorax during the procedure.

Orientador: Lair Zambon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T08:23:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DanielBotelho_D.pdf: 9890444 bytes, checksum: 90e3892529ddea892b184c2ca660ac69 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A maioria dos carcinomas de pulmão não pequenas células (CPNPC) em estádios avançados com mutações ativadoras (deleções do exon 19 ou a mutação L858R do exon 21) do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) respondem inicialmente, aos medicamentos gefitinib e erlotinib, que são inibidores da tirosina quinase (TKIs) do EGFR. Porém em uma média de 6-12, meses esses tumores desenvolvem resistência adquirida aos TKIs do EGFR. Dois mecanismos de resistência ao gefitinib/erlotinib explicam porque os CPNPC com mutações do EGFR se tornam resistentes aos TKIs: mutações de resistência secundária e um sistema de "troca de oncogenes". A mutação T790M-EGFR secundária ocorre em 50% dos pacientes com mutação no EGFR com resistência adquirida aos TKIs do EGFR, e em in vitro esta mutação T790M-EGFR inativa a hipersensitividade das mutações ativadoras do EGFR ao gefitnib ou erlotinib. Outras mutações de resistência secundárias (D761Y, L747S, A854T) são raras. Um outro mecanismo de resistência é a amplificação adquirida do oncogene MET, que ocorre em mais ou menos 20% do pacientes resistentes ao gefitinib/erlotinib e, em metade destes casos, em conjunção com T790M. O MET ativa sinais de sinalização que contornam o EGFR inibido, gerando um sistema de "troca de oncogenes" nesses tumores. Esses dados pré-clinicos relevantes aos CPNPCs com o EGFR mutado e resistência ao gefitinib ou erlotinib levaram ao desenvolvimento de experimentos clínicos com novos inibidores do EGFR que inibem "in vitro" a mutação T790M-EGFR (HKI-272, XL-647, BIBW-2992 e PF00299804), e inibidores de MET mais TKIs do EGFR em combinação. Neste trabalho: 1) Agrupamos e resumimos os dados dos experimentos clínicos prospectivos com o gefinitib em pacientes com o EGFR mutado. Mais de 80% dos pacientes com deleções do exon 19 ou a mutação L858R do EGFR tiveram resposta radiográfica, com sobrevivência livre de progressão de 7,7 a 12,9 meses nos estudos identificados, e sobrevivência geral acima de 15 meses; 2) Usamos células CPNPC com mutações do EGFR para identificarmos a molécula pró-apoptótica BIM como o efetor principal da apoptose induzida pelos TKIs do EGFR; 3) Caracterizamos a mutação resistente ao gefinitib EGFR-L858R-L747S, e determinamos que L858R-L747S apresenta um padrão de resistência menos acentuado ao gefitinib do que o observado com L858R-T790M; e 4) Avaliamos os efeitos do erlotinib em pacientes com CPNPC EGFR mutado e resistência ao gefitinib, caracterizando a correlação da resposta radiográfica e clínica com os mecanismos conhecidos de resistência ao TKIs do EGFR (as mutações de resistência secundárias T790M e L747S, e a amplificação do MET). A maioria (mais de 83%) dos pacientes resistentes ao gefitinib tiveram progressões radiográficas nos primeiros 2 a 4 meses de exposição ao erlotinib 150 mg/dia. Isto é consistente com nossas observações pré-clínicas, indicativas de que a maioria dos tumores resistentes ao gefitinib possui predominantemente T790M e/ou amplificações do MET, que são resistentes tanto ao gefitinib quanto erlotinib. Pesquisas pré-clínicas e experimentos clínicos futuros do CPNPC com EGFR mutado têm o potencial de melhorar os resultados do tratamento clínico de pacientes com essas mutações somáticas. / Abstract: Most advanced non-small cell lung cancers (NSCLCs) with activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations (exon 19 deletions or L858R) initially respond to the EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) gefitinib and erlotinib. However, over time (median of 6-12 months) most tumors develop acquired resistance to EGFR TKIs. Intense research in these NSCLCs has identified two major mechanisms of resistance to gefitinib/erlotinib: secondary resistance mutations and "oncogene kinase switch" systems. The secondary T790M mutation occurs in 50% of EGFR mutated patients with TKI resistance, and in vitro this mutation negates the hypersensitivity of activating EGFR mutations. Other secondary resistance mutations (D761Y, L747S, A854T) seem to be rare. The amplification of the MET oncogene is present in 20% of TKI-resistant tumors; however in half of the cases with this "oncogene kinase switch" mechanism the T790M is co-existent. The growing pre-clinical data in EGFR mutated NSCLCs with acquired resistance to gefitinib or erlotinib has spawned the initiation or conception of clinical trials testing novel EGFR inhibitors that in vitro inhibit T790M (HKI-272, XL-647, BIBW-2992 and PF00299804), and MET inhibitors in combination with EGFR TKIs. In this work we: 1) Pooled and summarized data from prospective clinical trials of gefitinib for EGFR mutated patients. More than 80% of patients with exon 19 deletions or the L858R EGFR mutation attained a radiographic response with progression-free survival of 7.7 to 12.9 months in the identified studies, and overall survival exceeding 15 months; 2) Identified the pro-apoptotic molecule BIM as the main effector of EGFR TKI-induced apoptosis using NSCLC cell lines with EGFR mutations; 3) Characterized the L858R-L747S gefitinib-resistant mutation, and demonstrated that L858R-L747S has a partial resistance pattern when compared to L858R-T790M; and 4) Evaluated the effects of erlotinib in EGFR mutated NSCLC with resistance to gefitinib while characterizing the correlation of response and resistance to this approach to the known mechanisms of resistance to EGFR TKIs (the secondary mutations T790M and L747S, and the amplification of MET). Our clinical observation was that the majority (over 83%) of the gefitinib-resistant patients given erlotinib 150 mg/day had radiographic progression within the first 2 to 4 months of exposure. This is consistent with our pre-clinical observations, since we expected gefitinib-resistant tumors to predominantly harbor T790M and/or MET amplification, which are cross-resistant to both gefitinib and erlotinib. Ongoing pre-clinical and clinical research in EGFR mutated NSCLC has the potential to significantly improve the outcomes of patients with these somatic mutations. / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica