Hintergrund: Der Phospholipase A2 Rezeptor 1 (PLA2R1) ist ein Typ 1 Transmembranrezeptor, welcher der Mannose-Rezeptor-Familie zugeordnet werden kann. Die Bedeutung von PLA2R1 für physiologische und pathologische Vorgänge ist noch weitestgehend unbekannt. Jedoch wird die Regulation wichtiger zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Apoptose/ Seneszenz, Adhäsion, Migration/ Invasion und Inflammation im Zusammenhang mit dem Rezeptor diskutiert. Darüber hinaus ist eine Änderung der PLA2R1-Expression bei der Entstehung verschiedenster Krebserkrankung nachweisbar. Hierbei wird der Rezeptor einerseits mit einer pro-onkogenen und pro-migratorischen Wirkung in Verbindung gebracht. Andererseits ist ein tumorsuppressiver Effekt von PLA2R1 und eine Induktion der mitochondrialen Apoptose in Tumorzellen beschrieben. Zudem ist die Expression von PLA2R1 durch epigenetische Mechanismen kontrolliert und eine Promotor-Hypermethylierung ist assoziiert mit einer Repression der Rezeptor-Expression in der Prostatakarzinom (PCa)-Zelllinie LNCaP und der pädiatrischen, akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL)-Zelllinie Jurkat. Vorangegangene Arbeiten zeigten eine Hypermethylierung innerhalb eines definierten Bereiches des PLA2R1-Promotors bei adulten Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischem Syndrom (MDS) sowie eine Korrelation der PLA2R1-Promotormethylierung mit dem Krankheitsstadium und der Klassifizierung nach dem Internationalen Prognostischen Scoring System (IPSS). Fragestellung/ Hypothese: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war einerseits die Untersuchung der Funktion von PLA2R1 in den PCa-Zelllinien LNCaP und PC-3. Während in LNCaP die Rezeptor-Expression durch Promotor-Hypermethylierung unterdrückt ist, kann in PC-3-Zellen eine Hochregulation von PLA2R1 im Vergleich zu normalen Prostataepithelzellen nachgewiesen werden. Durch in vitro Transfektionsexperimente sollte der Effekt einer Re-expression von PLA2R1 in LNCaP-Zellen sowie die Auswirkungen einer Reduktion der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen untersucht werden. Der Einfluss der veränderten PLA2R1-Expressionslevel auf wichtige Zellparameter wurde evaluiert. Die in vitro Daten der PCa-Zelllinien wurden mit den in vivo Ergebnissen des Tumorwachstums von transfizierten LNCaP- und PC-3-Zellen in Xenograft-Mausmodellen verglichen. Andererseits sollte basierend auf den Ergebnissen von adulten Patienten mit AML- und MDS-Diagnose und der dabei festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors der Methylierungsstatus des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL untersucht werden. Überdies sollte die Eignung der PLA2R1-Methylierungsanalyse als sensitiver Biomarker für die Therapiekontrolle, Überwachung der minimalen Resterkrankung (MRD) und Risikostratifizierung der pädiatrischen ALL evaluiert werden. Die Funktion des Rezeptors im Kontext der pädiatrischen ALL wurde durch eine transfektionsbasierte Re-expression von PLA2R1 in der Jurkat-ALL-Zelllinie untersucht. Durch in vitro Experimente wurden die Auswirkungen der verschiedenen PLA2R1-Expressionslevel auf Proliferation und Apoptose/ Nekrose in transfizierten Jurkat-Zellen analysiert. Material und Methoden: Durch Transfektion mit einem PLA2R1-Expressionsvektor konnte eine stabile Überexpression des Rezeptors in LNCaP- (LNCaP-PLA2R1) und Jurkat-Zellen (Jurkat-PLA2R1) erreicht und die Ergebnisse mit Kontrollvektor-transfizierten LNCaP- (LNCaP-Ctrl) und Jurkat-Zellen (Jurkat-Ctrl) verglichen werden. Mittels CRISPR/Cas9-Knockdown konnte eine Verminderung der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen (PC-3-KD) im Vergleich zu Kontrollvektor-transfizierten PC-3-Zellen (PC-3-Ctrl) erreicht werden. Genexpressionsanalysen wurden mittels quantitativer PCR nach reverser Transkription (RT-qPCR) durchgeführt und die Proteinsynthese des Rezeptors durch Western Blot Analyse überprüft. In vitro sollten die Auswirkungen der differenziellen PLA2R1-Expression der transfizierten Zellen auf wichtige proliferative und metastatische Zellparameter untersucht werden. Die Zellviabilität/ Proliferation wurde mittels WST-1 Assay für adhärente Zellen und Zellwachstumskurven-Analyse mit Trypanblau-Färbung bei Suspensionszellen analysiert. Zellmotilität und Proliferation wurden bei transfizierten PCa-Zelllinien mithilfe des Wundheilungsassays beurteilt. Apoptose konnte durch Wasserstoffperoxid stimuliert und mittels Caspase-Glo® 3/7 Assay und RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay für transfizierte PCa-Zelllinien sowie durchflusszytometrische Analysen nach Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 Färbung für transfizierte Jurkat-Zellen untersucht werden. Die klonogene Überlebensrate und das Koloniewachstum der transfizierten PCa-Zelllinien sollten mithilfe des klonogenen Assays analysiert werden. In einer in vivo Pilotstudie wurde der Effekt von PLA2R1 auf das Tumorwachstum mittels Xenograft-Mausmodellen (männliche SCID/beige Mäuse) durch subkutane Injektion der transfizierten LNCaP- (n = 5) und PC-3-Zellen (n = 9) überprüft. Die PLA2R1-Promotormethylierung als sensitiver Biomarker für die pädiatrische ALL wurde durch Isolation und Bisulfit-Behandlung der genomischen DNA von Knochenmark (KM)-Aspiraten und Leukozyten des peripheren Blutes (PB) von ALL-diagnostizierten Kindern (n = 44) sowie einer anschließenden Analyse mittels digitaler PCR (dPCR) evaluiert. Die Ergebnisse konnten mit dem Methylierungsstatus einer gesunden Kontrollgruppe (n = 20) verglichen werden. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In LNCaP-PLA2R1 und Jurkat-PLA2R1 konnte im Gegensatz zu den dazugehörigen Kontrollzellen eine stabile Überexpression des Rezeptors auf Ebene der Genexpression und Proteinsynthese detektiert werden. Bei PC-3-KD-Zellen war eine Reduktion der PLA2R1-Genexpression und eine Repression der Proteinsynthese unterhalb der Nachweisgrenze des Western Blot Assays zu verzeichnen, während PC-3-Ctrl-Zellen eine Genexpression und Proteinsynthese des Rezeptors zeigten. Die Zellviabilität/ Proliferation und Motilität war signifikant erhöht in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl im Vergleich zu LNCaP-Ctrl- und PC-3-KD-Zellen. Demgegenüber war eine Verminderung von Apoptose und Koloniewachstum in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl-Zellen nachweisbar. Durch Genexpressionsanalysen konnte eine Induktion der Expression von Fibronektin 1 (FN1), TWIST Homolog 1 (TWIST1) und Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1-Zellen identifiziert werden. In vivo schien die PLA2R1-abhängige negative Regulation des Koloniewachstums die pro-onkogenen Eigenschaften des Rezeptors zu überwiegen. Dies resultierte in einem verminderten Tumorwachstum von LNCaP-PLA2R1 und einer tumorsuppressiven Rolle des Rezeptors in dieser PCa-Zelllinie. Im Gegensatz dazu zeigten PC-3-Ctrl-Zellen ein schnelleres Tumorwachstum im Xenograft-Mausmodell, was für einen pro-onkogenen Effekt der endogenen PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen sprechen würde. Der differenzielle Einfluss von PLA2R1 auf die Regulierung des Tumorzellwachstums könnte im Zusammenhang mit der veränderten Expression von FN1, TWIST1 und CDK6 stehen, jedoch sind weiterführende Experimente nötig, um die Beteiligung dieser Gene in der PLA2R1-Signaltransduktion zu untersuchen. Die Analyse der Zellwachstumskurve der transfizierten Jurkat-Zellen zeigte eine Abnahme der Proliferationsrate und eine Zunahme des Anteils an toten Zellen bei Jurkat-PLA2R1 im Vergleich zu Jurkat-Ctrl-Zellen. Durchflusszytometrische Analysen bestätigten eine Abnahme des Anteils gesunder sowie eine vermehrte Repräsentation von apoptotischen und nekrotischen Jurkat-PLA2R1-Zellen im Vergleich zur Kontrolle, was einen tumorsuppressiven Einfluss des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL suggeriert. Die Funktion von PLA2R1 als Tumorsuppressor steht im Einklang mit der festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors in KM-Aspiraten und PB-Proben von pädiatrischen Patienten mit prä-B und common ALL zum Zeitpunkt der Diagnose der primären Krebserkrankung und des ALL-Rezidives im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Der parallele Abfall der PLA2R1-Promotormethylierung und der relativen Blastenzahl im Verlauf der ALL-Induktionstherapie sowie eine signifikante, positive Korrelation beider Größen in KM- und PB-Proben ließen auf die leukämischen Blasten als Quelle der Hypermethylierung des PLA2R1-Promotors schließen. Überdies wiesen Hochrisikopatienten der pädiatrischen ALL eine signifikant höhere PLA2R1-Promotormethylierung am Tag 15 der ALL-Induktionstherapie auf im Vergleich zu Patienten mit einem geringeren Risiko. Zusammenfassend deuteten die in vitro und in vivo Daten auf eine wichtige Funktion des Rezeptors bei der Regulation von Proliferation und Apoptose bei der pädiatrischen ALL hin. Die Analyse der PLA2R1-Promotormethylierung könnte als sensitiver Biomarker zu einer verbesserten ALL-Therapiekontrolle, MRD-Überwachung und Risikostratifizierung während der ALL-Induktionstherapie beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42 / Background: The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) is a type I transmembrane receptor and a member of the mannose receptor family. Physiological and pathophysiological functions of PLA2R1 are still not completely understood. However, PLA2R1 expression is discussed to have an impact on proliferation, apoptosis/ senescence, adhesion, migration/ invasion as well as inflammatory cell responses and divergent PLA2R1 expression is detectable in different types of cancer compared to corresponding normal tissues. In this context, receptor expression is linked to both a pro-oncogenic/ pro-migratory and a tumour-suppressive/ pro-apoptotic impact in different cancer cells. Moreover, PLA2R1 expression is controlled by epigenetic mechanisms and hypermethylation of the PLA2R1 promoter is associated with silenced expression of the receptor in the prostate carcinoma (PCa) cell line LNCaP and the paediatric, acute lymphocytic leukaemia (ALL) cell line Jurkat. Previous work revealed a defined hypermethylated region of the PLA2R1 promoter in adult patients with acute leukaemia and myelodysplastic syndrome (MDS). PLA2R1 promoter methylation correlated with disease stage and International Prognostic Scoring System (IPSS) classification. Aim: The aim of the present study was to evaluate the function of PLA2R1 in PCa cell lines LNCaP and PC-3. The receptor expression is silenced in LNCaP but upregulated in PC-3 cells compared to normal prostate epithelial cells. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP and PC-3 cells. Based on previous findings of PLA2R1 promoter hypermethylation in adult ALL and MDS patients, the aim of the present study was to analyse the methylation status of the PLA2R1 promoter in paediatric ALL patients compared to healthy individuals. PLA2R1 methylation analysis was evaluated as sensitive biomarker for ALL treatment response, minimal residual disease (MRD) monitoring, and risk stratification. The impact of the receptor in childhood ALL was investigated by transfection-based re-expression of PLA2R1 in the paediatric ALL cell line Jurkat and the effect of different PLA2R1 expression levels on proliferation and apoptosis/ necrosis was analysed in in vitro experiments. Material and Methods: Stable PLA2R1 overexpression was achieved by transfection of LNCaP (LNCaP-PLA2R1) and Jurkat cells (Jurkat-PLA2R1) with a PLA2R1 plasmid vector. Results were compared to control vector transfected LNCaP (LNCaP-Ctrl) and Jurkat cells (Jurkat-Ctrl). Alternatively, PLA2R1 was knocked down using CRISPR/Cas9 in PC-3 cells (PC-3-KD) and compared to the corresponding control-transfected cells (PC-3-Ctrl). Gene expression analysis was conducted by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). PLA2R1 protein synthesis was analysed by western blot. The impact of the differential PLA2R1 expression on proliferative and metastatic parameters of transfected cancer cells was investigated in vitro. Cell viability/ proliferation was assessed by means of WST-1 Assay for adherent cells and via cell growth curve analysis after trypan blue staining for suspension cells. Cell motility and proliferation of transfected PCa cell lines were estimated by wound healing assay. Hydrogen peroxide-stimulated apoptosis was analysed by Caspase-Glo® 3/7 Assay and RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay for transfected PCa cell lines and flow cytometric analysis after Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 staining for transfected Jurkat cells. Colony formation of transfected PCa cell lines was evaluated by clonogenic assay. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP (n = 5) and PC-3 cells (n = 9). Evaluating PLA2R1 promoter methylation as sensitive biomarker for paediatric ALL, genomic DNA was isolated from bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) of 44 paediatric ALL patients. After bisulfite treatment of isolated DNA samples, PLA2R1 methylation was analysed using digital PCR and compared to 20 healthy controls. Results and Conclusions: PLA2R1 gene expression and protein synthesis were detectable in LNCaP-PLA2R1, PC-3-Ctrl, and Jurkat-PLA2R1 cells but not in LNCaP-Ctrl and Jurkat-Ctrl cells. In PC-3-KD cells, PLA2R1 gene expression was significantly reduced compared to PC-3-Ctrl and PLA2R1 protein synthesis of PC-3-KD cells was below the limit of detection of western blot analysis. Cell viability/proliferation and motility were significantly increased in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl compared to LNCaP-Ctrl and PC-3-KD cells, respectively. However, levels of apoptosis and clonogenicity were reduced in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl cells. Gene expression analysis revealed an up-regulation of fibronectin 1 (FN1), TWIST homolog 1 (TWIST1), and cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1 compared to control cells. In LNCaP xenografts, PLA2R1-dependent regulation of clonogenicity appeared to outweigh the receptor’s pro-oncogenic properties, resulting in decreased tumour growth, supporting the tumour-suppressive role of PLA2R1. Alternatively, PC-3-Ctrl xenografts exhibited faster tumour growth compared to PC-3-KD cells, suggesting a pro-oncogenic effect of endogenous PLA2R1 expression. The differential growth-regulatory effects of PLA2R1 may be mediated by FN1, TWIST1, and CDK6 expression, although further investigation is required. Cell growth curve analyses of transfected Jurkat cells revealed a decreased proliferation and increased cell death of Jurkat-PLA2R1 compared to Jurkat-Ctrl cells. Flow cytometry confirmed the reduced fraction of healthy cells and an increase of the apoptotic and necrotic fractions in Jurkat-PLA2R1 cells compared to control cells, suggesting a tumour-suppressive effect of the receptor in paediatric ALL. PLA2R1’s tumour-suppressive function is in accordance with hypermethylation of the receptor promoter in BM aspirates and PB samples of paediatric patients diagnosed with pre-B and common ALL as well as in patients with disease relapse in comparison to healthy controls. PLA2R1 methylation decreased along with leukaemic blast cell reduction during ALL induction treatment and significant positive correlations between PLA2R1 methylation and leukaemic blast cell numbers of BM and PB samples were observable. Therefore, our data suggests that leukaemic blasts are the origin of PLA2R1 hypermethylation in BM and PB samples. Moreover, high risk paediatric ALL patients exhibited increased levels of PLA2R1 promoter methylation compared to non-high risk groups on day 15 of ALL induction treatment. Collected data indicates that PLA2R1 promoter methylation quantitation can be used as biomarker for ALL induction treatment control, risk stratification, and early detection of ALL relapse.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42

Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population de cellules innées lymphoïdes aux fonctions anti-infectieuses et antitumorales. Les leucémies aiguës lymphoblastiques pré-B (LAL pré-B) constituent le cancer de l’enfant le plus fréquent et ont été décrites comme résistantes à la cytotoxicité médiée par les NK bien que les bases moléculaires demeurent inconnues.L’objectif de ces travaux a été de caractériser cette résistance. En développant un essai de cytotoxicité par cytométrie en flux et en utilisant des cellules effectrices activées in vitro, nous avons établi la sensibilité retardée des LAL pré-B à la cytotoxicité NK : initialement résistantes après 4h d’incubation, elles sont fortement tuées après 25h.Cette cytotoxicité est contact-dépendante mais ni la voie de l’exocytose des granules cytotoxiques ni celle des récepteurs de mort n’y contribuent. La mort cellulaire des cibles est de profil apoptotique mais indépendante des caspases ; la signalisation mitochondriale l’amplifie partiellement. Interférer avec les dérivés de l’oxygène par un antioxydant diminue la cytotoxicité. Nous montrons que les cellules NK de patients atteints de granulomatose septique chronique liée à l’X présentent un défaut de cette nouvelle cytotoxicité. Nous démontrons l’expression par les NK des composants clefs d’une NADPH oxydase distincte du complexe utilisé par les phagocytes. Nos travaux établissent l’existence d’une voie de cytotoxicité non conventionnelle et en définissent les principaux prérequis moléculaires. / Natural Killer (NK) cells are innate lymphoid cells with anti-infectious and anti-tumoral activities. Among neoplasia, pre-B acute lymphoblastic leukemias (pre-B ALL) represent the most common form of cancer in childhood and were shown to be resistant to NK cell mediated cytotoxicity although the mechanisms explaining this phenomenon are incompletely understood.In the present work, we investigated the relative immune resistance of pediatric pre-B ALL targets to activated NK cells. We developed a flow cytometry based cytotoxicity assay to assess the NK activity and the involvement of long term cytotoxic pathways. Although pre-B ALL blasts were strongly resistant at 4h, we found a considerable delayed NK killing at 25h.Further investigations revealed that cell contact was mandatory for efficient killing but also that neither the granule exocytosis nor the death receptor pathway were involved. Target cell death was caspase independent but mitochondria signaling amplified it. We then showed that NK cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease could not kill efficiently ALL blasts and that NK cells expressed key components of a NADPH oxidase complex that was distinct from the phagocyte type. Our work reveals an uncharacterized effector pathway among cytotoxic lymphocytes and establishes key molecular requirements for this unconventional pathway.

Bakgrund: Akut lymfatisk leukemi (ALL) är den vanligaste cancerformen bland barn och ungdomar och kan innebära stor fysisk och psykisk påfrestning hos föräldrar och barn. När barnet drabbas av ALL kan föräldrar känna oro och rädsla för att förlora barnet. Syfte: Syftet med studien var att belysa föräldrars upplevelser när barnet har drabbats av akut lymfatisk leukemi (ALL). Metod: En litteraturstudie med induktiv ansats genomfördes där elva artiklar granskades och valdes till resultat. Resultat: I resultatet framkom huvudkategorin: Upplevelse av att vara förälder till barn som drabbats av ALL med underkategorier: att känna livet krascha, att känna otillräcklighet, att oroas över ekonomin, att känna behov av förändrade föräldrastrategier och att blicka framåt. Andra huvudkategorin var Upplevelse av sjuksköterskans betydelse med underkategorier: att känna emotionellt stöd och att uppleva behov av information och undervisning. Föräldrar upplevde kommunikation med sjuksköterska som viktigt och hjälpte föräldrar hantera påfrestningen. Vid bristande kommunikation upplevde föräldrar att sjuksköterskan undanhöll information och tilliten till sjuksköterskan försvann. Slutsats: Studien kan ge kunskap om föräldrars upplevelser när barnet drabbas av ALL och vilka behov som finns av hjälp och stöd. Mer forskning krävs för att undersöka på vilket sätt sjuksköterskan kan underlätta för föräldrar under den påfrestande tiden. / Background: Acute lymphocytic leukemia (ALL) is the most common cancer in children and youth and may cause great physical and psychological burden on parents and children. Parents might worry and fear losing the child when their child has ALL. Aim: The aim of this study was to explore parent's experiences when their child suffered from acute lymphocytic leukemia (ALL). Method: A literature review with an inductive structure was performed where eleven articles were analyzed and chosen for results. Result: The result presents main category: Experience of being a parent off a child affected by ALL with subcategories: to feel life crashing, to feel insufficient, to worry about economics, to feel the need of changing parent strategies, to focus ahead. The second main category was The experience of the importance of the nurse with subcategories: to feel emotional support and to experience the need for information and education. Parents experienced that communication with the nurse was important and helped parents manage burden. Lack of communication made parents experience that the nurse withheld information and the trust disappeared. Conclusions: The study can provide knowledge about parent's experiences when their child has ALL and the need of help and support. More research is required to investigate in which way the nurse can ease parent's burden during the stressful time.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant et dérivent le plus souvent de précurseurs lymphoïdes B. D’importants progrès thérapeutiques ont permis d’améliorer considérablement le pronostic. Néanmoins, 15 à 20 % des enfants rechutent encore. Ces rechutes peuvent survenir de façon isolée ou combinée dans la moelle osseuse, le site primitif des lymphoblastes, et/ou dans des organes extramédullaires tels que le testicule ou le système nerveux central. Notre équipe a montré que la protéine transmembranaire CD9 jouait un rôle majeur dans la migration des blastes dans ces sites et notamment le testicule, par l’activation de la voie RAC1 en réponse à la stimulation des cellules par le CXCL12. Ici, nous avons mis en évidence qu’un faible niveau d’oxygène, caractéristique commune aux niches médullaire et extramédullaires, régulait positivement l’expression de CD9 aux niveaux transcriptionnel et protéique, via la voie majeure de réponse à l’hypoxie, dépendante du facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a). Nous montrons que HIF1a se fixe directement sur le promoteur de CD9 pour induire sa transcription. Nous montrons aussi que la protéine CD9 est essentielle aux propriétés d’adhérence et de migration des blastes dans des conditions de basse oxygénation, et que son action pourrait s’exercer à travers RAC1 comme en normoxie. Nos résultats dans des expériences de xénogreffe à des souris indiquent que la voie HIF1a favorise la dissémination des blastes, possiblement à travers la régulation qu’elle exerce sur CD9. Ainsi, ce travail contribue à mieux comprendre le rôle de CD9 dans la pathogenèse des LAL de l’enfant. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) are the most frequent cancer in children and derive most often from B-cell precursors. Huge therapeutic improvements have allowed to reach high survival rates near 90% at 10 years from diagnosis. However, 15-20% of children still relapse with a significant risk of death. Relapses can occur in bone marrow and/or extramedullary sites such as testis or central nervous system, usually referred as “sanctuary sites”. Our previous work showed that the transmembrane protein CD9 plays a major role in lymphoblasts migration into these sites, especially in testis, through the activation of RAC1 signaling upon blasts stimulation with C-X-C chemokine ligand 12 (CXCl12). Here, we addressed the question of putative common factors shared by bone marrow and extramedullary niches which could upregulate CD9 expression and function. Consequently, we found that low oxygen levels could actually enhance CD9 expression both at mRNA and protein levels. We further determined that Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a), the master transcription factor involved in hypoxia response, binds directly CD9 promoter to induce its transcription. We also showed that CD9 protein is crucial for leukemic cell adhesion and migration at low oxygen levels, possibly through its action on RAC1 signaling. Mouse xenograft experiments indicate that HIF1a signaling pathway favors ALL cells dissemination, which may involve CD9 as well. The present work increments our understanding of CD9 implication in ALL pathogenesis.

Cette étude s’intéresse au lien entre les dynamiques cérébrales et les capacités cognitives, cette problématique a déjà été explorée auparavant en imagerie cérébrale, notamment à l’aide de tâches effectuées pendant l’imagerie. Cependant la caractérisation de l’activité spontanée a principalement été faite soit avec une faible précision spatiale (capteur EEG/MEG), soit en IRMf qui a une faible résolution temporelle. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’activité spontanée au repos au niveau cortical associée à différents processus cognitifs et leur performance. Le second chapitre cherche à établir les corrélats neuronaux de la performance de la mémoire au repos à l’aide des puissances spectrales localisées au niveau des sources corticales. Le troisième chapitre cherche à répliquer les méthodes utilisées dans l’article 1 avec les mêmes participants, mais dans un autre domaine cognitif afin d’établir les corrélats neuronaux de la fluence verbale ainsi que de discriminer une composante verbale et exécutive. Ces deux composantes ont été mises en évidence en utilisant une factorisation avec un test purement exécutif (Trail making test- condition 4) et un autre purement verbal (richesse du vocabulaire). Dans le quatrième chapitre, nous répliquons encore la méthode de l’article 1 avec les mêmes sujets, mais sur un test d’apprentissage verbal. Lors de l’apprentissage verbal, deux stratégies d’apprentissage (sériel et sémantique) possibles sont utilisées de manière concurrente, nous avons cherché à établir si des différences comportementales se traduisaient par des patrons d’activation différents. Dans le cinquième chapitre, nous avons cherché à établir des différences fonctionnelles entre les survivants de la leucémie et des sujets contrôles, puis à établir un lien entre la neurotoxicité et le déficit cognitif rencontré chez cette population, finalement nous avons établi un modèle intégrant neurotoxicité, performance cognitive et marqueur neurophysiologique fonctionnel cérébral. Cette recherche aura approfondi les connaissances sur l’état de repos et principalement fourni les premiers travaux qui mettent en lien l’activité cérébrale spontanée au repos au niveau des sources corticales avec plusieurs tests neuropsychologiques comportementaux. Les résultats ont amené des patrons d’activation spatio-fréquentielle différents, démontrant des spécificités reliées à certains tests comportementaux ou des traitements de l’information (sériel ou sémantique). Finalement les travaux sur les survivants de la leucémie ont montré que l’état de repos pouvait caractériser le fonctionnement des déficits cognitifs à long terme et être un marqueur de remédiation pour de futurs traitements. / This study is interested in the link between brain dynamics and cognitive abilities. This problem has already been explored before in brain imaging, notably with the help of task performed during imaging. However, the characterization of spontaneous activity has mainly been done either with weak spatial resolution (EEG/MEG sensor) or in fMRI which has a low temporal resolution. The objective of this thesis is to characterize the spontaneous activity at rest at the cortical level associated with different cognitive processes and their performance. The second chapter seeks to establish the neural correlates of resting memory performance using spectral powers localized at cortical sources. The third chapter seeks to replicate the methods used in article 1 with the same participants but in another cognitive domain in order to establish the neural correlates of verbal fluency as well as to discriminate a verbal and an executive component. These two components were highlighted using a factorization with a purely executive test (Trail making test-condition 4) and another purely verbal one (vocabulary richness). In the fourth chapter, we replicate the method of article 1 with the same subjects, but on a verbal learning test. During verbal learning, two possible learning strategies (serial and semantic) are used concurrently, we sought to establish whether behavioural differences translate into different activation patterns. In the fifth chapter, we sought to establish functional differences between leukemia survivors and control subjects, then to search for a link between neurotoxicity and the cognitive deficit encountered in this population; finally we established a model integrating neurotoxicity, cognitive performance and functional neurophysiological brain markers. This research will have deepened the knowledge on the resting state and mainly provided the first works that link the spontaneous brain activity at rest at the level of cortical sources with several behavioural neuropsychological tests. The results led to different spatio-frequential activation patterns, showing specificities related to certain behavioural tests or information processing (serial or semantic). Finally, work on leukemia survivors has shown that resting states could characterize the functioning of long-term cognitive deficits and be a remediation marker for future treatments.

Acute lymphoblastic leukemia is a hematological malignancy that gains a proliferative advantage and originates in the bone marrow. One of the more common genetic alterations in ALL is KMT2A-rearrangement which constitutes 80% of the cases of ALL in infants. Patients carrying the KMT2A rearrangement have a poor prognosis and will eventually develop drug resistance. This project aimed to find new therapeutic targets which would help in the development of novel drugs. We designed a model which uses gene expression data, to infer expressions of oncogenes and the genes which could be associated with immune pathways. The data was extracted and transformed by removing the batch effects and identifying the biotypes of these genes for more focused research. Here we utilized exome RNA-seq,  hence it was necessary to reduce the high dimensionality of the data. The dimensionality reduction was performed using Monte Carlo Feature Selection. After the feature selection, a list of highly significant genes was obtained. These genes were used in a machine learning model, R.ROSETTA, which produces rule-based results centered on rough sets theory. The rules were visualized using VisuNet, an interactive tool that creates networks from the rules. Among others, we identified levels of expressions of genes such as JAK3, TOX3, and DMRTA1 and their relations to other genes  using the machine learning model. These significant genes were also used to do pathway analysis using pathfindR which allowed us to infer the oncogenic pathways. The pathway analysis helped us deduce pathways such as immunodeficiency and other signaling pathways that could be potential drugs

Je tiens à remercier les bourses des IRSC en collaboration avec le programme COPSE, les Bourses du Programme de Sciences biomédicales 2014-2015 et les Bourses d’excellence de la Faculté des études supérieures et post-doctorales Hydro-Québec (2015- 2016) pour leur contribution. / Introduction. Avec l’optimisation des traitements, le taux de guérison de la leucémie lymphoblastique aigüe (LLA) de l’enfant approche 90%. Cependant, 60% des survivants devront faire face à des complications à long-terme en lien avec les traitements. Ces patients ont un risque accru de complications cardiométaboliques telles que l’obésité, la résistance à l’insuline, la dyslipidémie et l’hypertension artérielle. Alors qu’il est reconnu que des facteurs génétiques contribuent au développement de ces complications, peu d’études ont observé l’impact de ces déterminants chez les survivants. Le but de cette étude est d’évaluer les associations entre les variantes rares et communes et le développement des complications cardiométaboliques chez les survivants de la LLA. Méthodes. La caractérisation du profil cardiométabolique et le séquençage de l’exome ont été réalisés dans une cohorte de 209 survivants de la LLA pédiatrique. Les variantes associées avec les complications cardiométaboliques ont été identifiées avec PLINK (commune) ou SKAT (rare et commune) et une régression logistique a été utilisée pour évaluer leur impact dans des modèles multivariés. Résultats. Nos analyses ont démontré que des variantes rares et communes dans les gènes BAD et FCRL3 sont associées au risque de présenter un phénotype dit extrême, soit trois facteurs de risque cardiométabolique et plus. Les variantes communes dans OGFOD3 et APOB et les variantes rares et communes dans BAD ont été associées à la dyslipidémie. Les variantes communes dans BAD et SERPINA6 ont été associées respectivement à l’obésité et la résistance à l’insuline. Conclusion. Notre étude a révélé une susceptibilité génétique au développement des complications cardiométaboliques chez les survivants de la LLA pédiatrique. Ces biomarqueurs pourront être utilisés pour la détection précoce et l’intervention chez cette population à haut risque. / Background. While cure rates for childhood acute lymphoblastic leukemia (cALL) now exceed 80%, over 60% of survivors will face treatment-related long-term sequelae, including cardiometabolic complications such as obesity, insulin resistance, dyslipidemia and hypertension. Although genetic susceptibility contributes to the development of these problems, there are very few studies that have so far addressed this issue in a cALL survivorship context. In this study, we aimed at evaluating the associations between common and rare genetic variants and long-term cardiometabolic complications in survivors of cALL. Method. We examined the cardiometabolic profile and performed whole-exome sequencing in 209 cALL survivors from the PETALE cohort. Variants associated with cardiometabolic outcomes were identified using PLINK (common) or SKAT (common and rare) and a logistic regression was used to evaluate their impact in multivariate models. Results. Our results showed that rare and common variants in the BAD and FCRL3 genes were associated (p<0.05) with an extreme cardiometabolic phenotype (3 or more cardiometabolic risk factors). Common variants in OGFOD3 and APOB as well as rare and common BAD variants were significantly (p<0.05) associated with dyslipidemia. Common BAD and SERPINA6 variants were associated (p<0.05) with obesity and insulin resistance, respectively. Conclusion. In summary, we identified genetic susceptibility loci as contributing factors to the development of late treatment-related cardiometabolic complications in cALL survivors. These biomarkers could be used as early detection strategies to identify susceptible individuals and implement appropriate measures and follow-up to prevent the development of risk factors in this high-risk population.

Le dihydrofolate réductase (DHFR) est la principale cible du méthotrexate, un important composant du traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Une association des polymorphismes du promoteur de DHFR avec l’issue de la LLA a été mise en évidence au laboratoire. Une survie sans événement (EFS) réduite corrélait avec les allèles A -317 et C -1610, et l’haplotype *1, défini par ces allèles. L’haplotype *1 était aussi associé à une expression élevée du DHFR. Dans cette étude, nous étendons l’analyse à la région régulatrice adjacente, d’environ 400 pb, correspondant au transcrit mineur non-codant du DHFR, qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la transcription au niveau du promoteur majeur. Six polymorphismes ont été identifiés, parmi lesquels 5 étaient des SNPs et un polymorphisme de longueur composé d’un nombre variable d’éléments de 9 pb et d’une insertion/délétion de 9 pb. L’analyse d’haplotype, incluant tous les polymorphismes promoteurs, a révélé une diversification de l’haploytpe *1 en 5 sous-types (*1a à *1e). Les variations du promoteur majeur et les sous-types de l’haplotype *1 ont été par la suite analysés pour l’association avec l’issue de LLA. Un EFS réduit corrélait avec l’allèle A du polymorphisme G308A (p=0,02) et avec l’haplotype *1 (p=0,01). Des niveaux élevées d’ARNm étaient trouvés chez les porteurs de l’haplotype *1b (p=0,005) et pas pour les autres sous-types de l’haplotype *1. Alors, la mauvaise issue de LLA associée avec l'haplotype *1 est en effet déterminée par le sous-type *1b. Cette étude donne un nouvel aperçu des polymorphismes régulateurs du DHFR définissant plus précisément les variations du DHFR prédisposant un événement. / Dihydrofolate reductase (DHFR) is the major target of methotrexate, a key component in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment. We recently reported an association of DHFR promoter polymorphisms with ALL outcome. Lower event free survival (EFS) correlated with the alleles A -317 and C -1610, and with haplotype *1, defined by these alleles. Haplotype*1 was also associated higher DHFR expression. Here we extended the analysis to adjacent 400bp regulatory region corresponding to non-coding minor DHFR transcript which plays an essential role in the regulation of transcription from the major promoter. Six polymorphisms were identified, of which 5 were SNPs and one length polymorphism composed of variable number of 9bp elements and 9bp insertion/deletion. Haplotype analysis including all promoter polymorphisms revealed diversification of haplotype *1 into 5 subtypes (*1a to *1e). Major promoter variations and haplotype *1 subtypes were subsequently analyzed for the association with ALL outcome. Lower EFS correlated with an A allele of G308A polymorphism (p=0.02) and with *1b haplotype (p=0.01). Higher mRNA levels were found in the carriers of *1b haplotype (p=0.005) and not for remaining haplotype *1 subtypes. So, the worse ALL outcome associated with haplotype *1 is actually determined by the subtype *1b. The study provides a new insight into DHFR regulatory polymorphisms defining more precisely event–predisposing DHFR variations.

Les améliorations dans les protocoles de traitement pour la majorité des cancers pédiatriques ont augmenté de façon marquée les taux de survie. Cependant, des risques élevés de multiples problèmes de santé chez les survivants sont bien documentés. En ce qui concerne spécifiquement les problèmes neuropsychologiques, les principaux facteurs de risque individuels connus à ce jour (l’âge au diagnostic, le genre du patient, l’exposition aux radiations) demeurent insuffisants pour cibler efficacement et prévenir les séquelles à long terme. Les objectifs généraux de cette thèse étaient : 1) la caractérisation des trajectoires individuelles de problèmes de comportement chez une population de patients pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique aiguë; 2) l’identification des principaux déterminants génétiques, médicaux et psychosociaux associés aux problèmes de comportements. Les hypothèses étaient : 1) Il existe une association entre les trajectoires individuelles de problèmes de comportement et a - des facteurs psychosociaux liés au fonctionnement familial, b - des polymorphismes dans les gènes modérateurs des effets thérapeutiques du méthotrexate et des glucocorticoïdes, c - des variables liées aux traitements oncologiques. 2) L'utilisation de modèles statistiques multi-niveaux peut permettre d’effectuer cette caractérisation des trajectoires individuelles et l’identification des facteurs de risque associés. 138 patients pédiatriques (0-18 ans) ayant reçu un diagnostic de leucémie lymphoblastique aiguë entre 1993 et 1999 au CHU Ste-Justine ont participé à une étude longitudinale d’une durée de 4 ans. Un instrument validé et standardisés, le Child Behavior Checklist, a été utilisé pour obtenir un indice de problèmes de comportement, tel que rapporté par la mère, au moment du diagnostic, puis 1, 2, 3 et 4 ans post-diagnostic. Des données génétiques, psychosociales et médicales ont aussi été collectées au cours de cette même étude longitudinale, puis ont été exploitées dans les modélisations statistiques effectuées. Les résultats obtenus suggèrent que les problèmes de comportement de type internalisés et externalisés possèdent des trajectoires et des facteurs de risque distincts. Les problèmes internalisés sont des manifestations de troubles affectifs chez le patient, tels que des symptômes dépressifs ou anxieux, par exemple. Ceux-ci sont très prévalents tôt après le diagnostic et se normalisent par la suite, indiquant des difficultés significatives, mais temporaires. Des facteurs médicaux exacerbant l'expérience de stress, soit le risque de rechute associé au diagnostic et les complications médicales affectant la durée de l'hospitalisation, ralentissent cette normalisation. Les problèmes externalisés se manifestent dans le contact avec autrui; des démonstrations d’agression ou de violence font partie des symptômes. Les problèmes externalisés sont plus stables dans le temps relativement aux problèmes internalisés. Des variables pharmacologiques et génétiques contribuent aux différences individuelles : l'administration d’un glucocorticoïde plus puissant du point de vue des effets pharmacologiques et toxicologiques, ainsi que l’homozygotie pour l’haplotype -786C844T du gène NOS3 sont liés à la modulation des scores de problèmes externalisés au fil du temps. Finalement, le niveau de stress familial perçu au diagnostic est positivement corrélé avec le niveau initial de problèmes externalisés chez le patient, tandis que peu après la fin de la période d’induction, le niveau de stress familial est en lien avec le niveau initial de problèmes internalisés. Ces résultats supportent l'idée qu'une approche holistique est essentielle pour espérer mettre en place des interventions préventives efficaces dans cette population. À long terme, ces connaissances pourraient contribuer significativement à l'amélioration de la qualité de vie des patients. Ces travaux enrichissent les connaissances actuelles en soulignant les bénéfices des suivis longitudinaux et multidisciplinaires pour comprendre la dynamique de changement opérant chez les patients. Le décloisonnement des savoirs semble devenir incontournable pour aspirer dépasser le cadre descriptif et atteindre un certain niveau de compréhension des phénomènes observés. Malgré des défis méthodologiques et logistiques évidents, ce type d’approche est non seulement souhaitable pour étudier des processus dynamiques, mais les travaux présentés dans cette thèse indiquent que cela est possible avec les moyens analytiques actuels. / Recent improvements in pediatric cancers treatment have led to marked increases in patient survival rate. However, it has been well documented that pediatric cancer survivors are at elevated risk for various other health problems. With respect specifically to neuropsychological side effects, known predictors (mainly: age at diagnosis, patient gender, exposure to radiation therapy) remain insufficient so far to target, and prevent efficiently, long term sequelae in this population. General objectives related to this thesis were: 1) characterization of individual trajectories of behavioral problems in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia; 2) the identification of genetic, medical and psychosocial determinants of behavioral problems in this population. This research program was based on the following hypotheses: 1) there is an association between the trajectories of individual behavioral problems and a – familial well-being-related psychosocial factors, b – gene polymorphisms involved in the therapeutic responses to methotrexate and glucocorticoids, c – anti-cancer treatments-related variables. 2) Multilevel statistical modeling can be used to characterize patient groups according to their individual behavioral problem trajectories, and can also identify predictive factors. 138 pediatric patients (0-18 years old) who received an acute lymphoblastic leukemia diagnosis between 1993 and 1999 at CHU Ste-Justine participated in this 4 years-long longitudinal study. A standardized and validated instrument, the Child Behavior Checklist, was used to measure behavior problems, as reported by the mother, at diagnosis, and then 1, 2, 3 and 4 years post-diagnosis. Genetic, psychosocial and medical data were also collected during this longitudinal study; these data were exploited in the context of the statistical modeling performed. Results obtained suggest that internalized and externalized behavioral problems have distinct trajectories and have different predictive factors. Internalized problems are affective issues presented by the patient, such as depressive or anxious symptoms. They are highly prevalent post-diagnosis and normalize over the following years, suggestive of temporary yet significant problems. Stress-enhancing medical variables such as a higher relapse risk at diagnosis and medical complications requiring a longer hospitalization slow down the normalization process. Externalized problems need interpersonal contact to occur; violence or aggressiveness manifestations are some examples. Compared to internalized problems, externalized problems are much more stable across time. However, pharmacological and genetic variables do contribute to individual differences in trajectories. In particular, administration of a more potent glucocorticoid (from pharmacological and toxicological perspectives) and being homozygous for NOS3 gene -786C844T haplotype are linked to modulation of externalized problems in time. Finally, the level of perceived family stress at time of diagnosis is positively correlated with initial externalized problems, while shortly after the induction period, the level of familial stress is linked with the initial internalized problems. Together, these results support the idea that a holistic care strategy is essential to develop efficient, preventive interventions in this population, due to the multifactorial nature of these behavioral problems. The knowledge generated in the present studies could contribute to better quality of life for these patients. This thesis also brings a more holistic contribution to our current knowledge of behavioral problems in this population, by highlighting the need for individual, multidisciplinary follow-ups, with particular emphasis on repeated measurements and appropriate statistical analyses. More than ever, knowledge de-compartmentalization appears essential in reaching a certain comprehension level of observed phenomena, rather than adhering to descriptive settings. It indicates that, despite obvious methodological and logistic challenges, this type of research is not only desirable in studying dynamic processes, but is certainly achievable with current analytical tools.

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood cancer. Many chromosomal rearrangements have been identified in leukemia, including the translocation t(12;21), which is observed in approximately 25% of children diagnosed with pre-B ALL. This translocation results in the expression of the ETV6-AML1 chimera. However, the fusion protein ETV6-AML1 is not sufficient to initiate leukemia by itself, suggesting that additional mutations are required to promote oncogenic transformation. Accordingly, the expression of the non-rearranged ETV6 allele is lost in 75% of the t(12;21) cases. This deletion leads to the complete inactivation of ETV6 transcription factor and the abolition of its biological function. Because ETV6 seems to be a tumor suppressor, we believe that its inactivation could promote the development of leukemia through the deregulation of its downstream target genes. This project aimed to identify new transcriptional targets of ETV6, in order to elucidate its role in leukemogenesis. A RNA-Seq experiment has led to the identification of more than 200 genes whose expression is correlated with ETV6 mRNA levels in CD34 + hematopoietic stem cells. Among these, several genes are involved in immune and inflammatory responses, cell migration, ion homeostasis and intracellular signaling. We also implemented a chromatin immunoprecipitation approach to identify the binding sites of ETV6. This approach confirmed an interaction between ETV6 and SLCO2B1 gene, whose expression is also co-regulated with ETV6. This study suggests that ETV6 may contribute to leukemogenesis by deregulating the expression levels of several oncogenes.