La mémoire immunologique est le mécanisme biologique fondamental à la base du développement de la vaccination. La compréhension de ce mécanisme ainsi que de ses interactions avec les différents acteurs du système immunitaire a permis l’élaboration de vaccins qui sont aujourd’hui les garants d’une protection accrue face à l’émergence de maladies infectieuses potentiellement mortelles. La voie d’injection et le mode de transfert de ces vaccins sont des paramètres majeurs à prendre en considération car ils définissent une modulation des réponses immunitaires et de leurs spécificités d’action. De nos jours, seule la voie intramusculaire demeure la voie majoritaire d’administration de vaccins lors de la prophylaxie primaire en santé humaine. Au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à comparer l’injection d’un antigène (l’ovalbumine) selon deux voies d’administration : la voie intramusculaire et la voie intradermique. Nous nous sommes également appuyés sur une technologie du laboratoire qui consiste à transférer des gènes par des vecteurs AAV2/1 recombinants. Nous disposions de deux constructions de ces vecteurs ayant une spécificité pour cibler les cellules musculaires et permettant l’apport d’un effet auxiliaire par les lymphocytes T CD4+ lors d’injections dans des souris femelles. De plus, une de ces constructions nous permettait d’éviter la voie de présentation directe de l’antigène par les cellules dendritiques (DCs) aux lymphocytes T CD8+. Les capacités modulatrices de ces vecteurs nous permirent de montrer pour la première fois que le vecteur AAV2/1 recombinant était capable de faire exprimer un transgène au sein de la peau et d’y générer une réponse cellulaire forte. Nous avons également montré qu’il existait une synergie d’action entre l’effet auxiliaire et la voie intradermique qui améliorait considérablement les réponses cellulaires issues de la présentation croisée d’antigène. Enfin, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD8+ générés suite à cette synergie d’action présentaient un profil phénotypique de cellules mémoires polyfonctionnelles et capables de protéger l’hôte face à un challenge pathogénique. / Immunological memory is the fundamental biological mechanism at the beginning of the development of vaccination. Understanding this mechanism and its interactions with the various players of the immune system has allowed the development of vaccines that are today the most effective barrier against the emergence of life-threatening infectious diseases. Route of injection and the nature of carriers of these vaccines are key parameters to be taken into consideration because they define a modulation of immune responses and their specific features. Nowadays, only the intramuscular injection route remains the major route of vaccines injection in the context of primary prophylaxis in human health. During our study, we were interested in comparing the injection of antigen (ovalbumin) following two routes of administration: intramuscular and intradermal routes. We also relied on a technology in the laboratory that involves the transfer of genes by rAAV2/1 vectors. We had two constructs of these vectors having specificity to target skeletal muscle cells and allowing us to provide a helper effect from CD4+ T cells during injections into female mice recipients. Moreover, one of these constructs enabled us to avoid the direct presentation of antigens by dendritic cells (DCs) to CD8+ T cells. The capacity of modulation of these vectors allowed us to show for the first time that the rAAV2/1 vector was able to trigger the expression of a transgene in the skin, and there to generate a strong cellular response. We have also shown that CD4+ T cell help and the intradermal route of immunization synergize to improve greatly cellular responses from the cross-presentation of antigens. Finally, we have demonstrated that CD8+ T cells generated following this synergism exhibited a phenotypic profile of polyfunctional memory cells and able to protect the host against a pathogenic challenge.

La détection de lymphocytes T (LT) CD8+ infiltrant les tumeurs (TIL), est généralement associée à un bon pronostic chez des patients atteints du cancer. A l’inverse, l'infiltration des tumeurs par des LT CD4+ régulateurs (Treg), est quant à elle, souvent corrélée à un mauvais pronostic. Plusieurs vaccins « thérapeutiques » capables d’induire des réponses T CD8+ spécifiques d’antigènes tumoraux ont été développés. Cependant, à ce jour, les résultats cliniques obtenus par ces vaccins restent décevants. Dans un premier travail, nous avons développé puis testé un vaccin thérapeutique composé de trois longs peptides synthétiques (LSP) dérivés de la protéine survivine (SVX). La survivine est une protéine surexprimée dans la majorité des cancers humains, mais absente dans les tissus adultes sains, ce qui fait d’elle une cible thérapeutique privilégiée pour les vaccins anti-tumoraux. Nous avons démontré l'efficacité thérapeutique élevée du vaccin SVX contre diverses tumeurs murines. Ceci a été associé à l'induction de réponses T spécifiques de la survivine, un prolongement de la survie et la génération de réponses mémoires antitumorales. De plus, SVX a induit à la fois des LT CD8+ cytotoxiques spécifiques et LT CD4+ auxiliaires de type 1 multifonctionnelles, dans la rate et au sein des tumeurs. Il a aussi induit une diminution des Treg, favorisant ainsi une réponse immunitaire très efficace. Enfin, une étude préliminaire menée chez des patients atteints de différents types de cancers, nous a révélé la présence de taux élevés de précurseurs spontanés de LT spécifiques du vaccin SVX. Ces résultats suggèrent que SVX pourrait potentiellement stimuler l'activation de ces précurseurs spécifiques. Ces résultats constituent une preuve de concept pour amener ce vaccin comme un produit de première génération en essai clinique chez l’homme. Dans le but d’étudier plus en détails la cinétique des réponses immunitaires T spécifiques, associées aux vaccins LSP, nous avons étudié dans un second travail, l’efficacité d’un vaccin LSP dérivé de la protéine Ovalbumine (OVA). Nous avons montré dans plusieurs modèles de tumeurs murines, que la combinaison du vaccin LSP-OVA à un adjuvant approprié, induisait une forte régression de la croissance tumorale, l’expansion des cellules spécifiques T CD4+ et T CD8+ dans les organes lymphoïdes, ainsi que leur migration vers les tumeurs. De plus, le vaccin a induit des cellules T spécifiques fonctionnelles, comme le témoignent les niveaux élevés de cytokines cytotoxiques mesurées. De manière intéressante, le vaccin n’a pas induit de Treg spécifiques d’OVA ou de Treg polyclonaux et ce, malgré la présence de la tumeur. Enfin, lorsque LSP-OVA ne parvenait pas à induire une régression complète de la tumeur, celle-ci était infiltrée par des TIL CD4+ conventionnels et CD8+ exprimant fortement les récepteurs inhibiteurs (PD-1, TIM-3 et TIGIT). Nos résultats suggèrent que pour optimiser ce vaccin LSP, une association à des anticorps bloquant un ou plusieurs de ces récepteurs inhibiteurs, devrait être envisagée. / The presence of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes (TIL) is generally associated with a good prognosis in cancer patients. Conversely, the infiltration of tumors by CD4+ regulators T cells (Treg), is often associated with poor prognosis. Several "therapeutic" vaccines able to induce tumor-specific CD8+ T cell responses have been developed. However, to date, the clinical results of these vaccines remain insufficient. In a first work, we developed and analyzed the immunogenicity and therapeutic efficacy of a new survivin vaccine (SVX) composed of three long synthetic peptides (LSP) containing several CD4 and CD8 T-cell epitopes. Survivin is over-expressed by most human cancers, but absent in healthy adult tissues, making it an interesting therapeutic target for cancer vaccines. We demonstrated the high therapeutic efficacy of SVX vaccine against various established murine tumor models, associated with its capacity to generate both specific cytotoxic CD8+ and multifunctional Th1 CD4+ T-cell responses but also effective memory T-cell responses for long-term protection against relapses. Treatment with SVX vaccine was also found to strongly increase the tumor infiltration of both CD4+ and CD8+ T cells over Treg cells therefore tipping the balance toward a highly efficient immune response. Finally, a preliminary study in patients with different types of cancer revealed the presence of high levels of SVX-specific spontaneous T-cell precursors. This suggests that SVX can potentially stimulate the activation of these specific precursors. Altogether, our results strongly suggest that SVX is a promising cancer vaccine and warrants its further clinical development. In order to study the kinetics of tumor-specific immune responses associated with LSP vaccines, we studied the efficacy of a LSP vaccine derived from the Ovalbumin (OVA) protein. We showed in two tumor models that the combination of LSP-OVA with a suitable adjuvant induced a strong tumor regression, an important expansion of both OVA-specific CD4+ and CD8+ T cells in the lymphoid organs, as well as their migration to the tumor. In addition, the vaccine induced functional specific T cells, as shown by the high levels of cytotoxic cytokines. Interestingly, the vaccine did not induce either OVA-specific or polyclonal Treg, despite the presence of the tumor. Finally, when LSP-OVA failed to induce a complete depletion of the tumor, we observed an important expression of inhibitory receptors (PD-1, TIM-3 and TIGIT) on conventional CD4+ and CD8+ TIL. Our results suggest that to optimize this LSP vaccine, a combination with one or more immune checkpoint blockade agents should be considered.

Les cellules T régulatrices (Treg) jouent un rôle important dans différentes infections chroniques comme le VIH. Lors de l’infection chronique par le VIH, une augmentation du nombre de ces cellules limite la réponse des cellules T effectrices spécifiques du virus mais permet également le contrôle de la très forte activation du système immunitaire. La régulation de l’activité suppressive des Treg constitue une voie importante pour le développement d’un vaccin, l’efficacité de la surveillance tumorale et l’auto-immunité. Dans ce travail, nous avons étudié différents mécanismes de régulation des Treg chez les patients infectés par le VIH et sujets sains. Le but de mon travail a été d’étudier les mécanismes impliqués dans les fonctions suppressives des Treg et de leur régulation. Nous nous sommes particulièrement intéressés au rôle de Notch sur la sensibilité des cellules T effectrices à la fonction suppressive des Treg, en montrant que l’activation de Notch rendait les cellules T effectrices plus sensibles à l’action suppressive des Treg, et ceci même en présence d’un très faible nombre de Treg. Nous avons démontré que certains ligands de Notch, tels que DL-4 et Jagged-1 mais non DL-1, régulent l’effet inhibiteur des Treg sur les cellules T effectrices par une surexpression de TGFβ-RII et à la phosphorylation de Smad3. Le rôle important de l’enzyme CD39 dans la fonction suppressive des Treg a été décrit, mais peu d’études ont démontré son rôle dans l’infection par le VIH. Nous avons montré que les Treg de patients infectés par le VIH experiment plus fortement le CD39, et que leur effet suppresseur était inhibé en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD39 et maintenu en utilisant un agoniste de l’adénosine. Nous avons également montré que le polymorphisme du gène CD39, associé à une plus faible expression de CD39, était corrélé à une plus lente progression de la maladie. Nos résultats montrent non seulement les mécanismes impliqués dans l’activité suppressive des Treg lors de l’infection par le VIH, mais constituent une approche intéressante pour en modifier les fonctions. Enfin, nous avons recherché l’effet de l’IL-7 sur le phénotype des Treg et l’expression de molécules impliquées dans leur fonction suppressive. Nos résultats montrent deux effets synergique de l’IL-7 sur les Treg mémoires: diminution de l’expression de CD39 à leur surface induisant une diminution de leur fonction suppressive, et surexpression du récepteur à l’ATP induisant un phénotype Th17. L’administration d’IL-7 in vivo chez des patients infectés par le VIH a confirmé la modification de phénotype des Treg en Th17 et notamment une surexpression du facteur de transcription spécifique des Th17, RORγt. En conclusion, notre travail apporte de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les fonctions inhibitrices des Treg et comment moduler ces fonctions. Ceci pourrait avoir un impact clinique direct, soit dans le traitement de maladies associées à un dysfonctionnement des Treg (infections chroniques virales, sclérose multiple, diabète de type 1, arthrite rhumatoide et lupus érythémateux), soit dans les stratégies vaccinales. / T regulatory cells (Treg cells) play an important role during various chronic infections like HIV. Increase in Treg cell number during chronic phase limit the HIV specific T effector cell response but may control exaggerated activation of the immune system. Modulation of regulatory T cell (Treg cells) suppression has important implications for vaccine development, the effectiveness of tumor surveillance, and the emergence of autoimmunity. Here we studied various mechanisms of Treg cells modulation in HIV+ patients and healthy subjects. The aim of my work was to decipher some aspects of the mechanisms involved in Treg cell mediated suppressive effects and the modulation of Treg cell suppressive effects in healthy subjects and HIV- infected patients.We have extended knowledge on the role of Notch in Treg/Effectors T cells cross talk. Here we focused our interest on the role of Notch pathway on the sensitivity of effectors T cells to Treg cell-mediated suppression, showing that Notch activation may significantly increase the sensitivity of effector cells to Treg cells even at a low ratio. We demonstrated that Notch ligands DL-4 and Jagged-1, but not DL-1 modulate significantly the suppressive effect of Treg cells on effectors T cells through an up regulation of TGF-RII expression and the phosphorylated form of Smad3 protein.A critical role of CD39 has been described for Treg cells in general but only a few studies have analyzed its role in HIV infection. We showed an increase in CD39 expression on Treg cells in a cohort of HIV- infected patients. Treg cells inhibitory effects were relieved by CD39 down modulation using an antiCD39 monoclonal antibody and this suppressive effect was reproduced on effector CD8+ T cells by an adenosine agonist. We found that CD39 gene polymorphism associated with a lower CD39 expression correlated with slower progression to AIDS. Our results shows not only the mechanism by which Treg cell suppression occurs during HIV infection but also provide an attractive approach to modify Treg cell functions.Finally, we have investigated the role of IL-7 on the phenotype of Treg cells and expression of molecules involved in the suppressive functions of these cells. Our results show that IL-7 exerts two synergistic effects on memory Treg cells. It decreases their suppressive effect by decreasing CD39 expression and increases ATP receptor leading to a switch towards a Th17 phenotype. In vivo administration of IL-7 tipped the balance towards a higher expression of RORγT in PBMCs from HIV infected patients.In conclusion our study bring new findings in the mechanisms involved in Treg cell mediated suppression and the way to modulate these cells which could have direct clinical impact either in the treatment of diseases associated with Treg cell dysregulation (chronic viral infections, autoimmune disorders like multiple sclerosis, type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erthematosus) or during vaccination.

Les lymphocytes T (LT) doivent analyser efficacement un nombre important de cellules présentatrices d'antigène (CPA) afin de détecter un antigène spécifique et d'initier une réponse immunitaire adaptée. La reconnaissance par le récepteur des cellules T (TCR) d'un peptide spécifique associé au complexe majeur d'histocompatibilité (pMHC) doit donc être extrêmement sensible et rapide. Alors que les voies de signalisation en aval du TCR sont largement étudiées, la cinétique de la discrimination des ligands par le TCR et de l'activation initiale du LT reste mal connue. Des surfaces solides recouvertes de ligands du TCR nous ont permis d'étudier les événements cellulaires initiés par la détection d'un antigène. L'utilisation de la microscopie a fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM) et la microscopie interférentielle (IRM) nous a permis de montrer que l'interaction initiale entre surface et LT est attribuable à des microvillosités mobiles. La stimulation du TCR active en quelques secondes un mouvement de rétraction de ces microvillosités. Ces mouvements actifs sont régulés par l'activation de la PLC- γ1 et sont dépendants des myosines (IIA, Ic et Ig), de la cofiline et de l'ezrine. Après cette phase d'analyse de l'environnement extracellulaire, la stimulation du TCR entraîne l'étalement rapide et actif de la cellule. L'amplitude et la vitesse d'étalement reflètent l'efficacité activatrice du ligand reconnu par le TCR. En moins de 5 minutes différents pMHC, ayant des propriétés biophysiques proches, sont donc discriminés par les LT et capables d'induire une première réponse cellulaire spécifique. / T lymphocytes need to efficiently probe a large number of antigen-presenting cell (APC) in order to detect an agonist antigen and to initiate an effective immune response. Therefore, engagement of the T-cell receptor (TCR) by peptide-bound major histocompatibility complex (pMHC) is a highly sensitive and rapid process. While signaling pathways downstream the TCR are extensively studied, little is known about antigen discrimination kinetic and initial T-cell response.Model planar surfaces coated with TCR ligand allowed us to study cellular events initiated by antigen detection. Using TIRFM (total internal reflexion microscopy) and IRM (interference reflexion microscopy) we showed that T-cell initial contacts with the surface were mediated by mobile microvilli. TCR engagement triggers a pulling motion of T cell surface microvilli within seconds. Active microvilli movements are dependent on PLC-γ1 activation and on the presence of myosins (IIA, Ic and Ig) as well as cofilin and ezrin. After this extracellular environment probing period, TCR stimulation triggered a rapid and active cell spreading. Cell spreading amplitude and speed reflect the ligand activating efficacity. In less than 5 minutes pMHC with different biophysical properties were discriminated by T-cells and triggered a first specific cellular response.

L’échappement des tumeurs à la surveillance du système immunitaire est une des raisons pour lesquelles le cancer parvient à se développer. Un des objectifs de notre équipe consiste à étudier les lymphocytes T CD4+ et leurs rôles dans un contexte de cancer. Mon travail de thèse a eu pour objectif de déterminer si les résultats murins obtenus au laboratoire étaient transposables à l’Homme, et surtout dans le cancer du sein. Nous avons tout d’abord mis en évidence que les lymphocytes Th17 infiltrant les cancers du sein inhibent les fonctions effectrices des lymphocytes T cytotoxiques de manière dépendante des ectonucléotidases. Enfin, nous avons montré qu’une infiltration tumorale riche en cellules Th17 est associée à un moins bon pronostic clinique des patientes atteintes de cancer du sein. Nous avons ensuite eu pour objectif de tenter de limiter la différenciation de ces cellules Th17. Nous avons démontré que l’activation de SIRT1 diminue l’acétylation de STAT3 ce qui perturbe le programme de différenciation de ces cellules. L’activation de SIRT1 in vivo limite l’expansion des Th17 et conduit à un ralentissement de la croissance tumorale. Ce concept fut validé chez l’Homme et ouvre donc la possibilité d’association d’agonistes de SIRT1 avec la chimiothérapie. Le dernier projet porte sur les lymphocytes Th9 et leur rôle pronostique dans le cancer du sein. Nous avons mis en évidence que les propriétés effectrices des lymphocytes Th9 humains pouvaient être augmentées par l’IFNα via l’activation du facteur de transcription IRF1. Nous avons enfin démontré que l’infiltration tumorale de lymphocytes Th9 était associée au meilleur pronostic des patientes. / Tumor escape to immune system surveillance is one of the reasons why human cancer achieves to grow. In my research team, we aim to study CD4 T cell populations and their functions in the context of cancer. My work was precisely to determine if the results obtained in mice could be transposable in humans, in the context of breast cancer. . We first unraveled that tumor infiltrating Th17 cells could inhibit effector and cytotoxic functions of Th1 and CD8 T cells in an ectonucleotidase-dependent manner. Finally, we showed that high tumor infiltration in IL-17+ cells were significantly associated with a worse clinical prognosis for breast cancer patients. Then, we aim to prevent Th17 cell differentiation. We first established that SIRT1 activation reduces STAT3 acetylation thus limiting Th17 cell differentiation. Activation of SIRT1 limits in vivo Th17 cell expansion and leads to the decrease of tumor growth. This concept has been validated in humans and gives the possibility to associate SIRT1 agonists with chemotherapy. The last project concerns the role and the prognosis impact of Th9 lymphocytes in breast cancer. We highlighted that the effector properties of human Th9 cells could be increased by IFNα via IRF1 activation. Finally, we attested that the tumor infiltration of Th9 lymphocytes was associated with a better prognosis for breast cancer patients.

Les événements biochimiques de l'activation T ont été décrits depuis longtemps et sont bien connus. A l'échelle moléculaire la liaison du Récepteur des Cellules T (TCR) présent à la surface du lymphocyte T avec un peptide (du soi ou non soi), ce dernier étant chargé sur le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (MHC), présent à la surface des Cellules Présentatrices d'Antigène (CPA) conduit à l'initiation de la réponse immunitaire. La réponse des lymphocytes T est extrêmement spécifique, sensible, robuste et semble présenter des caractéristiques de mécano-transduction. En effet, il a été démontré récemment que le TCR agirait comme un mécanosenseur alors que le lymphocyte T peut sentir la mécanique de son environnement à une échelle cellulaire. Cependant, la majorité de ces études ont été réalisées en opposant un lymphocyte T à un substrat inerte limitant la compréhension sur la contribution éventuelle de chaque partenaire cellulaire car la présence de l'APC peut induire des changements dans l'organisation du lymphocyte T.Le but de cette thèse a été de mettre en place un suivi de l’activation des lymphocytes T pat une APC modèle, sous force grâce à l’utilisation de la microscopie à force atomique. Il a mené à plusieurs développements méthodologiques originaux validés de manière expérimentale avec un système cellulaire modèle (hybridomes murins vs. Cellules COS modifiées pour être des APC pouvant être modifiées à souhait grâce à l’expression d’une grande variété de molécules impliquées dans la réponse immunitaire). / The biochemical events of T activation have been described for a long time and are well known. At the molecular level, the binding of the T-cell receptor (TCR) present on the surface of the T-cell with a peptide (self or non-self) loaded on the Major Histocompatibility Complex (MHC), present on the surface of the Antigen Presenting Cells (APC), leads to the initiation of the immune response. In addition, the T cell response is extremely specific, sensitive, robust and appears to have mechano-transduction characteristics. Indeed, it has recently been demonstrated that the TCR would act as a mechanosensor while the T lymphocyte can feel the mechanics of its environment on a cellular scale. However, the majority of these studies were performed by opposing/facing a T cell to an inert substrate (e.g., bead, functionnlized glass slides molecularly decorated or not), limiting the understanding of the possible contribution of each cell partner because the presence of APC can induce changes in the organization of the T cell. The aim of this thesis was to set up a follow-up of the activation, under force, between a model APC and a T lymphocyte. It has led to several original methodological developments experimentally validated with a model cell system (mouse hybridomas vs. COS cells modified to be complexifiable APCs).

La sous-unité catalytique p110 de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) est exprimée spécifiquement dans les leucocytes, et possède un rôle central dans la biologie des lymphocytes. Des mutations germinales dominantes gain-de-fonction de PI3KCD (codant p110 ) ont été identifiées récemment chez des patients présentant une immunodéficience combinée caractérisée par une présentation clinique hétérogène incluant des infections récurrentes des voies respiratoires et des lymphoproliférations associées à une virémie EBV et/ou CMV élevée, connue sous le nom de syndromes APDS. L’hétérogénéité des présentations cliniques suggère l’existence de facteurs secondaires, génétiques ou environnementaux. Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai rapporté le cas de deux nouveaux patients présentant des anomalies génétiques affectant la voie PI3K. Le premier patient, né dans une famille consanguine, présentait une mutation gain- de-fonction de PIK3CD déjà décrite. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une seconde mutation homozygote non-sens de SEC14L2, un régulateur connu de la voie PI3K. Nous avons analysé le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes du patient, et avons mis en évidence in vitro certains mécanismes de régulation de l’activation lymphocytaire par SEC14L2. Enfin, nous avons réalisé une étude de transcriptome afin d’identifier les voies de régulation dérégulées chez notre patient. Dans l’ensemble, ces résultats ont permis d’identifier le premier co-facteur génétique associé au syndrome APDS. Le second patient est également né dans une famille consanguine et présentait des infections sévères des voies respiratoires et un syndrome d’infection chronique à l’EBV (CAEBV) fatal. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une mutation homozygote rare dans PIK3CD. Une modélisation de la structure de la protéine a montré que l’acide aminé muté se situe dans le domaine catalytique de p110 , dans une boucle phylogénétiquement conservée interagissant avec la sous-unité régulatrice p85↵ de la PI3K, et que la mutation conduisait à la perte de cette interaction. In vitro, la mutation de p110 cause la perte de l’activité PI3K, et les lymphocytes T du patient présentaient une diminution de phosphorylation d’AKT et de p70 S6K, deux cibles de la PI3K. Les lymphocytes T du patient présentaient également une production diminuée d’IFN- et de TNF↵, et un excès de prolifération et de flux calcium suite à la stimulation du TCR. Des lignées cellulaires Jurkat déficientes pour PIK3CD générées par CRISPR/Cas9 ont également présenté un défaut de phosphorylation d’ATK et un excès de prolifération et de flux calcium. L’expression de la version sauvage de p110 dans ces cellules, mais pas de la version mutée, a permis une restauration des réponses normales, prouvant l’implication de la mutation dans les phénotypes cellulaires identifiés. De manière intéressante, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre l’activité PI3K et PLC- 1 lors de l’activation T, qui pourrait être expliqué par une compétition pour l’accès à leur substrat commun, le PIP2. Enfin, nous avons identifié chez notre patient une seconde mutation homozygote délétère dans le gène TNFRSF9. Cette mutation est également retrouvée chez la sœur saine du patient, qui présentait une réplication persistante de l’EBV dans le sang, suggérant que cette mutation pourrait agir comme facteur génétique secondaire. Dans l’ensemble, cette étude à permis l’identification de la première immunodéficience associée à des mutations perte-de-fonction de PIK3CD. / The pathway p110 catalytic subunit of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) is selectively expressed in leukocytes and has a central role in lymphocytes biology. Gain-of-function dominant germline mutations of PIK3CD (encoding p110 ) have been recently described in patients presenting a heterogeneous combined immunodeficiency associated with respiratory tract infections, lymphadenopathy and high EBV and/or CMV viremia. The heterogeneous clinical presentation suggests the existence of genetic or environmental modifying factors. In my thesis I report two new patients with different genetic defects causing CID. The first patient, born from a consanguineous family, presented a known gain-of- function mutation of PIK3CD. His clinical presentation was partially compatible with the already described patients. By whole exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in SEC14L2, a known regulator of PI3K pathway. We further analyzed the phenotype and functions of patient’s lymphocytes, and performed a transcriptome analysis to better characterize the implication of SEC14L2 mutation in the pathology. The second patient was born from consanguineous family and presented recurrent severe respiratory tract infections and a fatal Chronic Active EBV disease (CAEBV). By Whole Exome Sequencing, we identified a homozygous rare missense mutation in PIK3CD. 3D structure modelization showed that the mutated amino acid is located in p110 catalytic domain, in an evolutionarily conserved loop that interacts with alpha-helix of PI3K regulatory subunit p85a, which interaction is lost in mutated p110 . Phenotyping of patient’s circulating lymphocytes showed increased CD8+ T cells and reduced NK and CD4+ T cells. The mutation in PI3KCD resulted in impaired PI3K activity in vitro and in vivo. Moreover, patient’s T cells exhibited reduced activation-induced phosphorylation of AKT and p70-S6K, two indirect targets of p110 , that we restored by expressing wild type p110 . Patient’s T cells also showed a decreased induction of IFN- and TNF-↵ and an increased proliferation and calcium flux after TCR stimulation. By CRISPR CAS9 technology, we generated Jurkat T- cell lines expressing wild type or mutated PI3K. Jurkat cells expressing mutant PI3K showed decreased AKT phosphorylation and increased calcium flux and proliferation after TCR stimulation, confirming the implication of PIK3CD mutation in patient’s cells phenotype. Interestingly, we highlighted the existence of a balance between PI3K and PLC- 1 activity during T cell activation, that may be due to a competition for access to their shared substrate, the PIP2. Finally, we identified in our patient a second deleterious mutation in TNFRSF9 that is shared by his healthy sister, who also presented persistent EBV replication in blood, suggesting that this additional mutation may act as a modifying genetic factor. Taken together, the results presented in this thesis identified the first loss-of-function mutation in PIK3CD causing CID.

Lors de l’infection par le VIH, les réponses T CD8+ présentent de nombreux défauts fonctionnels d’ordre qualitatif et quantitatif. Les « HIV controllers » (HIC) constituent un rare groupe de patients (0,5%) qui contrôle spontanément in vivo la réplication virale. Des études ont montré que les fortes réponses T CD8+ observées chez les HIC jouent probablement un rôle majeur dans ce contrôle. Par ailleurs, l’activation immunitaire joue un rôle clé dans la déplétion T CD4+ et la progression. En effet, les patients virémiques présentent une forte activation mesurée par la fréquence de lymphocytes T CD8+ CD38+/HLA-DR+ alors que l’activation observée chez les HIC est faible, similaire à celle des patients sous traitements anti-rétroviraux ce qui pourrait expliquer l’absence fréquente de progression chez ces patients. De plus, les HIC sont caractérisés par une activation paradoxale avec une forte proportion de lymphocytes T CD8+ présentant une forte expression de HLA-DR contrastant avec une faible expression de CD38 et donc une fréquence plus importante de lymphocytes T CD8+ exprimant le phénotype particulier CD38-/HLA-DR+ que les lymphocytes T CD8+ des patients ne contrôlant pas le VIH.L’objectif de mon projet de thèse a été de caractériser les réponses T optimales pour le contrôle de la réplication virale chez les patients HIC. En étudiant la sous population CD38-/HLA-DR+, nous avons démontré que cette sous population exprime un phénotype particulier avec l’expression seule de HLA-DR comme marqueur d’activation mais aussi qu’elle possède de très bonnes fonctions effectrices (cytotoxicité) et mémoires (survie, polyfonctionnalité et prolifération). Nous avons par la suite étudié le mécanisme responsable de l’induction de ce phénotype particulier et démontré qu’une activation par de faibles doses d’antigènes induit préférentiellement le phénotype d’intérêt CD38-/HLA-DR+ alors qu’une activation par de fortes doses d’antigènes induit préférentiellement le phénotype CD38+/HLA-DR+.Nous avons par la suite caractérisé les lymphocytes T CD8+ des HIC à l’aide de marqueurs associés à une activité cytotoxique : les facteurs de transcription de la « boîte T », T-bet et Eomes et le marqueur CD57. Nous avons ainsi montré qu’il existe une hétérogénéité de l’expression d’Eomes et que seules les sous populations CD57+/Eomeshi et CD57+/Eomesint présentent ex vivo des capacités cytotoxiques. Il s’avère que les lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH des HIC expriment préférentiellement le phénotype CD57+/Eomeshi qui démontre de bonnes fonctionnalités (prolifération, survie). De plus la fréquence de cette sous population corrèle avec une faible charge virale suggérant que ces cellules CD57+/Eomeshi participent au contrôle de la réplication virale. Cependant, les fortes réponses T CD8+ ne sont pas retrouvées chez tous les patients HIC et il existe un certain nombre de patients, authentiquement contrôleurs in vivo mais dont les lymphocytes T CD8+ ne possèdent pas une activité inhibitrice ex vivo et que l’on a appelé « Weak Responders » par opposition aux « Strong Responders » qui présentent une forte capacité antivirale. Notre étude a permis de montrer que les réponses T CD8+ sont corrélés aux réponses T CD4+ : les « Weak Responders » présentent de faibles réponses T CD4+ et T CD8+ et les « Strong Responders » présentent de fortes réponses T CD4+ et T CD8+. Ces résultats ont permis de définir deux sous populations T CD8+ probablement impliquées dans le contrôle de la réplication virale in vivo. La faible dose d’antigène et la faible activation des lymphocytes pourraient être impliquées dans l’induction et la persistance de fortes réponses T CD8+ anti-VIH. L’utilisation de faibles doses d’antigènes permettant d’induire des lymphocytes T CD8+ avec une forte capacité d’inhibition de la réplication virale pourrait être envisagée dans de futurs essais cliniques vaccinaux. / Several defects of the immune response have been evidenced during HIV infection, especially CD8+ T cell response. A rare group of patients (0.5%) called HIV controllers (HIC) can spontaneously control HIV infection and studies showed that these patients present high HIV-specific CD8+ T cell responses. Moreover excessive activation of CD8+ T cells seems to play a major role since this parameter correlates strongly with disease progression. Indeed, immune activation observed in HIC is lower than in viremic patients and similar as in HAART-treated patients. Furthermore HIC exhibit a peculiar activation phenotype with low CD38 expression and high HLA-DR expression and characterized by a higher frequency of CD38-/HLA-DR+ expressing cells. The aim of these works was to characterize optimal HIV-specific T cells which are implicated in the control of viral replication in HIC. We first studied this subpopulation CD38-/HLA-DR+ and showed that it is characterized by an absence of activation marker expression except for HLA-DR and by efficient effector functions (high cytotoxicity) and good memory functions (better survival, proliferation and higher frequency of polyfunctional cells). We then deciphered the mechanism responsible for the induction of this phenotype and demonstrated that low dose of antigen induce preferentially CD38-/HLA-DR+ phenotype while high dose of antigen induce preferentially CD38+/HLA-DR+. We next characterized HIV-specific CD8+ T cells from HIC by markers associated with cytotoxicity: T-box transcription factor T-bet and Eomes and CD57. We demonstrated heterogeneity of Eomes expression and only CD57+/Eomeshi and CD57+/Eomesint subpopulation exhibit cytotoxic capacity ex vivo. We then showed that HIC exhibited higher frequency of CD57+/Eomeshi expressing HIV specific CD8+ T cells with high functionalities (proliferation, survival). Furthermore frequency of this subpopulation correlated with low viral load suggesting a role of CD57+/Eomeshi in the control of viral replication. Nevertheless, the high CD8+ T cell responses are not found in all HIC and some patients who control viral replication in vivo exhibit low inhibition by CD8+ T cells ex vivo and are called Weak Responders by opposition to Strong Responders who exhibit high inhibition by CD8+ T cells. Our study demonstrated that the CD8+ T cell response is associated with the CD4+ T cells: Weak Responders showed low CD4+ and CD8+ T cell responses especially low CD38-/HLA-DR+ frequency and Strong Responders showed high CD4+ and CD8+ T cell response especially high CD38-/HLA-DR+ frequency. We therefore defined two subpopulations which are overrepresented in HIC and which are probably implicated in control of HIV. The low dose and low immune activation could be involved in the induction and persistence of high anti-HIV CD8+ T cell response and might have implications for HIV vaccine strategies.

Le système immunitaire est un ensemble de mécanismes impliquant différents types de cellules qui produisent des facteurs solubles (cytokines, chimiokines ou molécules cytotoxiques) qui contribuent à la régulation et aux réponses immunitaires. La caractérisation à l'échelle cellulaire de la production de ces facteurs solubles présente un grand intérêt d'une part sur le plan fondamental pour comprendre les cascades d'événements des régulations cellulaires, et d'autre part dans le suivi de la réponse immunitaire (infections, cancers, auto-immunités, greffes, vaccins, etc.). Cependant, la plupart des techniques actuellement disponibles (ELISpot, cytométrie en flux, microarrays, etc.) ne permettent pas d'étudier plusieurs cytokines en rapport avec le phénotype des cellules sécrétrices et/ou sans marquage et d'analyser les secrétions de cytokines en temps réel par des cellules individuelles. Dans cette étude, une « biopuce à cellules » a été développée pour analyser les secrétions de cytokines par les cellules individuelles (lymphocytes T) in vitro. La biopuce est fonctionnalisée par greffage électrochimique des motifs d'anticorps spécifiques aux protéines membranaires de cellules et/ou d'anticorps spécifiques aux cytokines, tous couplés au pyrrole. Ensuite, un traitement de surface est effectué avec du poly (éthylène glycol) thiol (Thiol-PEG) pour empêcher la fixation non spécifique de cellules sur la surface de la biopuce. Un dispositif microfluidique en polydimethyllsiloxane (PDMS) et maintenu à 37°C a aussi été développé afin d'intégrer toutes les opérations d'analyse et de détection dans un seul système. La biopuce développée dans cette étude permet la capture spécifique et stable de lymphocytes T individuels viables et la détection ultérieure de cytokines sécrétées par chaque cellule individuelle. Dans ce travail, la détection des cytokines sécrétées (IL-2 et IFN-γ) a été effectuée par fluorescence dans un format en sandwich. Cette «biopuce à cellules» est également compatible avec l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), ce qui pourrait permettre de réaliser des analyses en temps réel et la détection sans marquage de plusieurs cytokines sécrétées par des cellules individuelles. Cette technique fournit un outil très prometteur pour l'analyse de marqueurs biologiques et de l'activité de cellules et l'étude des réponses immunitaires. / The immune system is a set of mechanisms involving many different cell types which communicate through downstream signals mediated principally by soluble factors (i.e. cytokines) to protect the host against invading organisms and to control adequate immune responses. The identification and characterization at the cellular level of cytokine production has a huge interest for both fundamental research and clinical studies. However, the majority of techniques currently available (ELISpot, flow cytometry, microarrays, etc.) have several shortcomings including notably the assessment of multiple cytokines in relation to secreting cell phenotypic classification and/or label-free and real-time analysis of cytokine secretions at individual cell level. Hence, in this study, we developed a « cell biochip » to analyze the secretion of cytokines by individual cells (T lymphocytes) activated and cultured in vitro. The biochip is functionalized by electrochemically grafting patterns of pyrrole-conjugated cell membrane-specific and cytokine-specific antibodies and treated with Poly(ethylene glycol)thiol (Thiol-PEG) self-assembled monolayers (SAMs) to stably avoid non-specific binding of cells on the surface. A polydimethyllsiloxane (PDMS)-based microfluidic device maintained at 37°C was also developed in order to integrate all the detection assay operations in a single system. The biochip developed here allows specific and stable capture of viable and bioactive individual T cells and subsequent detection of secreted cytokines in the close vicinity of each individual cell. In this work, the detection of secreted cytokines (IL-2 and IFN-γ) was performed by fluorescence in an immunosandwich assay format. This « cell biochip » is also compatible with surface plasmon resonance imaging (SPRi), which could therefore allow expanding its functionality to enable real-time and label-free detection of multiple cytokines from individual cells. Such technique provides a very promising tool for the analysis of biomarkers and cell activity and the monitoring of immune responses.

Le système immunitaire est un réseau d'organes, de cellules et de molécules reliés dynamiquement chargé de surveiller l'intégrité de l'organisme. La meilleure connaissance de son fonctionnement est de nature à amener de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter nombre de maladies telles que le cancer, les maladies auto immunes ou les maladies infectieuses. Nos travaux sur la tolérance immunitaire ont montré sans équivoque dans deux modèles différents qu'une population spécialisée de lymphocytes T exprimant le facteur de transcription foxp3 était sélectionnée par l'expression de l'antigène cognitif dans le thymus. La redécouverte de cette population de lymphocytes a rejoint les avancées majeures de l'immunologie moderne. Nous avons montré chez la souris que l'expression de foxp3, tenu pour responsable de la fonction suppressive dans le système immunitaire, était instable et très sensible à l'action d'inhibiteurs " coupant " la voie de signalisation initié par l'IL-2. Nous rechercherons d'autres voies de signalisation spécifique aux lymphocytes T régulateurs chez la souris dans un modèle "naturel " de sélection thymique. Cette étude systémique permettra de définir de nouvelles cibles pour une inhibition pharmacologique ou génétique de foxp3. L'utilisation d'inhibiteur de foxp3 présente un intérêt évident pour l'immunothérapie anti-tumorale où la fonction régulatrice joue contre l'élimination de la tumeur. Nous avons pour projet de transposer nos résultats obtenus chez la souris à l'homme afin de développer une stratégie d'immunothérapie anti-tumorale. Nous prévoyons de développer un modèle du cancer colo-rectal humain chez la souris NOD.SCID.gc-/- afin de pouvoir valider l'idée que la déplétion pharmacologique de lymphocytes T régulateurs avant transfert de lymphocytes T a un vrai impact sur la réponse contre la tumeur autologue. Nous avons par ailleurs montré que dans ce modèle de souris, le transfert de cellules souches hématopoietiques humaines conduisait à la génération de lymphocytes T CD4+ susceptibles à l'infection par le VIH. Nous prévoyons dans un second projet d'utiliser ce nouveau modèle animal de l'infection pour tout d'abord questionner la vision actuelle de l'immunopathologie de l'infection en déterminant (i) si la réponse des lymphocytes T CD8+ est bien responsable de la résolution du pic de virémie durant la phase primaire de l'infection par le VIH et (ii) si la population de lymphocytes T double négatifs est bien la population responsable de la production de la majorité des virions infectieux. Dans un second temps, nous prévoyons d'utiliser les souris humanisées pour valider une stratégie de thérapie génique de l'infection par le VIH. La spécificité des vecteurs lentiviraux envers les lymphocytes T CD4, gage de sécurité et d'efficacité maximum, a été validé chez la souris et chez l'homme. Aussi, nous avons construit des vecteurs exprimant une combinaison de gènes thérapeutiques inhibant la fusion du virion avec la membrane de la cellule, soit en entrant en compétition avec la gp41 virale, soit en modulant l'expression de CCR5 à la surface. Le suivi des souris traitées puis infectées sera réalisée en mesurant la charge virale et la fréquence des lymphocytes T CD4+ afin de juger de la qualité de la reconstitution immunitaire après thérapie génique. L'ensemble de ces travaux et projets vise à transposer les résultats de nos travaux de recherche les plus fondamentaux au service du patient.