Ma thèse porte sur l'étude des rôles régulateurs des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK sur l'expression de ligands du système immunitaire, sur des cellules de mélanomes murins et humains ainsi que les conséquences sur le développement tumoral de modulateurs de la voie RhoA/ROCK. A l'heure actuelle, les traitements du mélanome métastatique ont une efficacité limitée, c'est pourquoi les nouvelles stratégies s'orientent vers l'immunothérapie notamment en recherchant de nouvelles molécules pharmacologiques capables d'amplifier les réponses immunes anti mélanome. Mon travail a porté sur l'étude de trois ligands de l'immunité modulés par la voie RhoA/ROCK : - Nous avons étudié la régulation du ligand MICA qui est exprimé sur des mélanomes humains, mais qui est reconnu par les cellules NK humaines et murines du système immun inné. En utilisant des statines, qui sont des inhibiteurs de l'activité des Rho, nous avons induit une surexpression membranaire de MICA sans toxicité cellulaire. Cette surexpression s'accompagne d'une sensibilisation des mélanomes à la lyse par les cellules NK. Elle induit également un ralentissement de leur croissance tumorale sous-cutanée en souris NMRI nu/nu et une diminution de l'implantation des métastases pulmonaires. Nous avons aussi montré que cette régulation de MICA induite par les statines ne dépendait pas de l'inhibition des GTPases Ras ou Rho mais de la voie de PPAR?. - Nous avons ensuite étudié la régulation de la molécule de costimulation CD70 par les GTPases Rho sur des mélanomes humains et son rôle dans ces tumeurs. Nous avons montré que les mélanomes primitifs expriment CD70, que cette expression diminue au cours de la maladie et que la GTPase RhoA et la voie des MAPK contrôlent positivement l'expression de CD70 sur nos lignées de mélanome humain. De façon surprenante, nous avons aussi montré que CD70 possède une fonction non immunologique dans ces tumeurs. En effet, la trimérisation de CD70 favorise l'invasion tumorale et l'apparition de métastases en activant la voie de signalisation BRAF/MEK/ERK/RhoE et en inhibant les fibres de stress d'actine et des points focaux d'adhésion. - Enfin, nous nous sommes intéressés aux conséquences de la modulation de FasL sur le développement tumoral du mélanome murin B16F10. Des travaux précédents de l'équipe ont montré que la protéine RhoA et ses effecteurs ROCK régulent de façon négative l'expression de FasL à la membrane des cellules B16F10. Nous avons étudié le rôle in vivo de la surexpression de FasL induite par l'inhibition de ROCK par le H1152. Nous avons mis en évidence un ralentissement de la croissance tumorale in vivo chez les souris immunocompétentes. Ce contrôle du développement tumoral est dépendant de la voie Fas/FasL et de l'activité des lymphocytes TCD8+ et de l'IFN-?. De plus, l'inhibition de ROCK réduit le nombre de métastases pulmonaires sans intervention de la réponse immune adaptative. L'ensemble de mes travaux montre que le ciblage de la voie des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK constitue une approche nouvelle pour amplifier les réponses immunes protectrices innées et adaptatives anti mélanome, suggérant que des inhibiteurs de cette voie pourraient être envisagés dans de nouveaux protocoles d'immunothérapie du mélanome / My thesis focuses on the study of the regulatory roles of Rho GTPases and their effectors ROCK on the expression of immune system ligands in murine and human melanoma cell lines and the impact on tumor development of modulators of the RhoA/ROCK pathway. Current therapies for metastatic melanoma have poor efficiency. It is the reason why new immunotherapeutic strategies are developed for to find new pharmacological molecules that could improve anti-melanoma immune responses. My work is based on the study of three immune ligands: - We studied the regulation by Rho GTPases of MICA ligand expression in human melanoma cell lines and their recognition by NK cells. Using statins, inhibitors of Rho GTPases activity, we have induced MICA over-expression without any cell toxicity. This MICA over-expression enhanced melanoma cells sensitivity to NK cells lysis, then reduced subcutaneous tumor growth in NMRI nu/nu mice and also decreased pulmonary metastases implantation. We also showed that statins-induced MICA over-expression was not linked to Ras or Rho GTPases inhibition but to PPAR? pathway. - Then, we studied the expression and the function of a co-stimulatory molecule, CD70, and its regulation by the Rho pathway in human melanomas. We demonstrated that the RhoA GTPase and MAPK pathway positively regulate CD70 expression in our melanoma cell lines. Surprisingly, we observed a non-immunological function of CD70 in melanoma. Indeed, CD70 trimerization enhanced melanomas invasion and metastatic capacities through an activation of BRAF/MEK/ERK/RhoE pathway, which inhibited stress fibers and focal adhesions. - Finally, we analyzed the consequences of FasL over-expression on B16F10 murine melanoma development in vivo. Our previous studies have showed that RhoA/ROCK pathway negatively regulates membrane FasL expression on B16F10 cells. We studied in vivo the role of this FasL over-expression induced by ROCK inhibitor H1152, on melanoma cells. We showed tumor growth shrinkage in immunocompetent mice, when B16F10 cells were pretreated with H1152. The Fas/FasL pathway and the activity of TCD8+ cells and IFN- ? induced this tumor slowing down. Moreover, ROCK inhibition induced a reduction of pulmonary metastases implantation independently of T lymphocytes response. Altogether, my work showed that targeting Rho GTPases/ROCK pathway could be interesting in order to improve innate and adaptative anti melanoma immune responses, suggesting that inhibitors of this pathway could be envisaged in new melanoma immunotherapy protocols

La mélanomagenèse est un processus complexe sous-tendu par des mécanismes cellulaires et moléculaires variés. L’ensemble de ces mécanismes moléculaires est impliqué dans les réseaux moléculaires permettant une signalisation coordonnée au sein de la cellule. De nombreuses publications montrent que les voies de signalisation MAPK et PI3K/AKT ont un rôle important dans la mélanomagenèse. NRAS et BRAF sont des oncogènes de la voie MAPK mutés respectivement dans 20% et 50% des mélanomes. PTEN est un gène suppresseur de tumeur inhibant la voie PI3K/AKT, dont la perte est souvent associée aux mutations de BRAF. Le traitement récent des mélanomes métastatiques avec les inhibiteurs spécifiques de BRAFV600E donne des résultats exceptionnels, mais ces résultats sont limités aux patients dont le mélanome est porteur de la mutation BRAFV600E, et il existe naturellement des échappements thérapeutiques, parfois lié à l’apparition de mutations NRAS. Nous avons choisi d’étudier le rôle de NRAS et de PTEN, qui sont des protéines majeures des voies MAPK et PI3K. Le but de ce travail est d’évaluer la coopération de NRAS et PTEN au cours de la mélanomagenèse. L’expression de PTEN est fréquemment altérée au cours du mélanome, mais le rôle de PTEN est mal connu. Au cours de ce travail, nous décrivons pour la première fois une mutation de NRAS concomitante à une perte de PTEN dans des prélèvements humains de mélanome et dans des lignées cellulaires humaines. Afin de comprendre l’effet de cette double mutation sur la mélanomagenèse, nous avons étudié des souris transgéniques avec expression d’une forme oncogénique de NRAS et/ou inactivation de PTEN dans le lignage mélanocytaire. L’inactivation isolée de PTEN n’a aucun effet sur la mélanomagénèse. En revanche, en association avec la mutation oncogénique de NRAS, la perte de PTEN accélère le développement des mélanomes, en réduisant le temps de latence et en provoquant l’apparition de métastases plus nombreuses en comparaison aux mélanomes présentant uniquement la mutation oncogénique de NRAS. Nous avons également démontré que la perte de PTEN induit un échappement au phénomène de sénescence. En conclusion, l’inactivation de PTEN coopère avec les mutations de NRAS pour l’initiation et la progression des mélanomes. / Melanomagenesis is a multistep process involving various cellular and molecular changes. The phospho-inositide-3-kinase (PI3K) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways have important roles in melanoma development. Treatment with BRAF inhibitors can be highly effective against metastatic melanomas, but the effects are limited to BRAFV600E patients, and resistance often develops. PTEN and NRAS, both major components of the PI3K and MAPK pathways, are potential alternative targets for melanoma therapy. The aim of this study was to evaluate the cooperation between NRAS and PTEN during melanomagenesis. PTEN expression is frequently altered in melanoma, but the role of PTEN is not yet fully understood. We found concomitant NRAS mutation and loss of PTEN in human melanoma samples and cell lines. Then, we studied transgenic mice with inactivation of PTEN and/or expression of an oncogenic form of NRAS in the melanocyte lineage. PTEN inactivation alone had no discernible effect on melanomagenesis. However, in melanomas initiated by oncogenic NRAS, inactivation of PTEN caused more rapid melanoma development and higher metastatic rate. We demonstrate that PTEN loss induces a senescence bypass. Thus, PTEN inactivation cooperated with oncogenic NRAS to promote melanoma initiation and progression

La métabolomique consiste en l'analyse exhaustive du métabolome d'un système biologique qui est réalisée par l'utilisation conjointe d'une ou plusieurs techniques analytiques et d'outils chimiométriques. Elle permet une mesure globale de la réponse métabolique grâce à la caractérisation et à la quantification de métabolites dans un échantillon donné. Ici, la technique analytique utilisée a été la RMN du proton. Ce travail de thèse a permis d'appliquer la démarche métabolomique à quatre pathologies en se focalisant sur un aspect précis de chaque maladie. Un large éventail d'échantillons a été étudié, allant de lignées cellulaires à des échantillons humains en passant par des cerveaux de souris. La première pathologie étudiée a été le mélanome. Pour cela, des études ont été effectuées sur une lignée cellulaire de mélanome dans laquelle la protéine HIF-1a a été réprimée et sur des tumeurs de souris xénogreffées avec et sans traitement au vémurafénib. Enfin, une étude préliminaire a été réalisée sur des mélanomes de patients. Ces trois études ont montré d'importants désordres au niveau du métabolisme bio-énergétique. Une étude métabolomique sur la maladie d'Alzheimer constitue la deuxième partie de notre travail. Les profils métaboliques de liquides céphalo-rachidiens de sujets sains et de patients ont été comparés afin de mettre en évidence d'éventuelles modifications métaboliques. Dans la troisième partie, nous nous sommes intéressés à une maladie orpheline, l'hypophosphatasie, à travers la première analyse métabolomique de cerveaux d'un modèle murin de cette pathologie. La dernière partie décrit les différences métaboliques provoquées par des modifications structurales de la protéine IRE1 dans une lignée cellulaire de glioblastome. / Metabolomics consists in the general analysis of the metabolome of a biological system which is achieved by the use of one or more analytical techniques combined with chemometric tools. It allows an overall measurement of the metabolic response through the characterization and quantification of metabolites in a given sample. Herein, proton NMR was chosen as the analytical technique. This work allowed us to apply metabolomic study to four diseases. Our research focused on a specific aspect of each disease. A wide range of samples has been studied here, from cell lines to human samples through biopsies mouse brain. The first chapter is dedicated to the study of melanoma and deals with a human melanoma cell line in which the HIF-1a protein was restrained. Melanoma tumors of xenograft mice were studied with and without vemurafenib treatment. Thanks to these results, we were able to start a preliminary study concerning the tumors of human patients. These three studies show melanoma disorders within the bioenergetic metabolism. The second part of this work is related to the metabolomic study of Alzheimer's disease. Cerebrospinal fluids of healthy and diseased patients were compared to highlight any metabolic modification. In the third part, we present the first metabolomic study of a rare disease: hypophosphatasia. Furthermore, unlike the previous work concerning this disease, we chose to use murine model to detect any metabolic modification within mice brain. In the last part, a study of glioblastoma was performed to show metabolic differences due to changes in IRE1 protein in a glioblastoma cell line.

Bien que le mélanome malin cutané (MMC) ne représente que 10% des cancers cutanés, il en est la forme la plus agressive et est responsable de 90% des décès dus aux cancers de la peau. Son incidence ne cesse d'augmenter ces dernières années et atteint 10.8 cas pour 100 000 habitants chez les hommes et 11 chez les femmes. La survie médiane des patients atteint de mélanome à un stade avancé est de 6.2 mois et seulement 1 patient sur 4 est encore en vie à 1an. Le diagnostic du mélanome est uniquement histopathologique et seul l'examen de la biopsie permet de le poser définitivement. De la même façon, il n'existe pas de marqueurs pronostiques associés au mélanome malin cutané. Seuls des facteurs histologiques tels que l'épaisseur de la tumeur, le degré d'invasion ou encore l'envahissement ganglionnaire ont été validés par l'American Joint Committee on Cancer et servent de facteurs pronostiques. Cependant, bien qu'ils permettent d'évaluer le risque métastatique, leur valeur pronostique est encore très insuffisante. L'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser les protéines associées à la progression tumorale du MMC. Grâce à une approche protéomique quantitative de type iTRAQ par nanoLC MS/MS, j'ai pu identifier et caractériser 2242 protéines dans un modèle cellulaire de progression tumorale du mélanome. La surexpression de huit de ces protéines dans les lignées tumorales par rapport à la lignée normale a été validée par western blot. Deux d'entre elles, TRAP1 et PDIA4 ont ensuite été validées en immunohistochimie comme marqueurs associés à la progression tumorale dans le MMC. Dans un second temps, l'implication de ces deux protéines dans les mécanismes de carcinogénèse du mélanome a été étudiée. L'inhibition de TRAP1 et de PDIA4 induit une diminution de la migration et de la viabilité de la lignée cellulaire métastatique de mélanome 1676. Enfin, la sous-expression dePDIA4 induit une inhibition du complexe Cycline D/CDK4 provoquant un blocage des cellules en phase G0/G1. Ce blocage passerait par la voie PERK liées au stress du réticulum endoplasmique. / Although cutaneous malignant melanoma (CMM) represents only 10% of skin cancers, it is the most aggressive form with 90% of deaths from skin cancer. The Incidence rate is increasing in recent years to 10.8 cases and 11 cases per 100000, in men and women respectively. The prognosis of metastatic melanoma is poor, with a median survival of only 6.2 months. Histopathologic examination remains the gold standard for melanoma diagnosis. There are no prognostic markers associated with CMM. Only histological factors such as tumor thickness, level of invasion, or lymph node involvement have been validated by the American Joint Committee on Cancer and are currently used as prognostic factors. However, although these histological factors are used to assess the risk of metastasis development, their prognostic value is still very low. The aim of my PhD work is to identify and characterize biomarkers associated with tumor progression of CMM. Using a quantitative proteomics approach (iTRAQ and nanoLCMS/MS), I was able to identify and characterize 2242 proteins in a cellular model of melanoma tumor progression. The overexpression of eight proteins in tumor cell lines compared to the normal cell line was validated by immunoblotting. Among these proteins, TRAP1 and PDIA4 were then validated by immunohistochemistry as markers associated with tumor progression in the CMM. Secondly, the involvement of these two proteins in the mechanisms of melanoma carcinogenesis has been studied. The inhibition of TRAP1 and PDIA4 induces a decrease in migration and viability of the metastatic melanoma cell line. Finally, PDIA4 under expression induce an inhibition of cyclin D/Cdk4 complex leading to G0/G1 cell-cycle arrest dependant of endoplasmic reticulum stress by the PERK pathway.

Nous avons cherché à caractériser le phénotype de deux lignées de souris transgéniques pour lesquelles le lignage mélanocytaire est affecté.La lignée Tyr ::NRASQ61K ; Ink4a-/- est un modèle murin de mélanome cutané. Nous avons montré qu'il existait dans ce modèle un développement séquentiel avec au moins quatre types de lésions mélanocytaires cutanées. Nous avons également caractérisé des lésions mélanocytaires primitives dans des organes autres que la peau. Sur le plan morphologique, nous avons enfin montré que les lésions cutanées se rapprochaient plus de la famille des naevi bleus que des naevi et mélanomes conventionnels.La lignée Dct::Sbno2 surexprime le gène Strawberry Notch homolog 2 (Sbno2) sous contrôle du promoteur du gène de la Dopachrome tautomérase (Dct), spécifique du lignage mélanocytaire. Ces souris ont les extrémités des pattes et de la queue blanches, le ventre blanc et le reste de leur pelage blanchit prématurément, traduisant un défaut d'expansion du lignage mélanocytaire pendant l'embryogenèse et un défaut de maintien des cellules souches de mélanocytes en période postnatale. En outre, ces souris présentent des lésions histologiques des nerfs périphériques associant diminution du nombre d'axones et fibrose endoneurale. Cliniquement, elles montrent une hyperactivité locomotrice spontanée. Nos données expérimentales sont en faveur d'un biais de différenciation des cellules dérivées des crêtes neurales chez les souris Dct ::Sbno2, au détriment des mélanoblastes et en faveur des neurones et précurseurs gliaux pendant l'embryogenèse ; au détriment des neurones et en faveur des fibroblastes endoneuraux dans les nerfs périphériques en période postnatale. / In this work, we characterized the phenotype of two transgenic mouse strains for which the melanocytic lineage is affected. The Tyr ::NRASQ61K, Ink4a-/- strain is a murine model for cutaneous melanoma. We showed that, in this model, there was a sequential development with at least four types of melanocytic lesions. We also characterized primitive melanocytic lesions at extracutaneous sites. Finally, we showed that cutaneous lesions were, morphologically, closer to the blue naevi family than to the conventional naevi and melanoma. The Dct::Sbno2 strain overexpresses the Strawberry Notch homolog 2 (Sbno2) gene under control of the Dopachrome tautomerase (Dct) gene which is specific for the melanocytic lineage. These mice have white limb and tail extremities, a white belly, and the rest of the coat exhibits premature graying. These findings are related to defects in expansion of the melanocytic lineage during embryogenesis and maintenance of melanocyte stem cells post-natally. Furthermore, these mice have peripheral nerve lesions associating reduced number of axons and endoneural fibrosis. Clinically, they show spontaneous locomotor hyperactivity. Our data suggest an abnormal differentiation of neural crests-derived cells in Dct::Sbno2 mice: at the expanse of melanoblasts during and in favor of neurons and glial precursors during embryogenesis, at the expanse of neurons and in favor of endoneural fibroblasts in peripheral nerves post-natally.

Le mélanome, la tumeur cutanée la plus agressive, est devenu un problème majeur de santé publique dans de nombreux pays. Diagnostiqué précocement, il peut être traité par excision chirurgicale, mais le pronostic pour les mélanomes plus avancés est très mauvais car cette tumeur est résistante à toutes les thérapies utilisées à ce jour. Dans le but de développer de nouvelles thérapies pour traiter cette tumeur, nous étudions les voies de signalisation qui jouent un rôle prépondérant dans la prolifération, la survie et la différenciation des mélanocytes et des mélanomes. Il s’agit de la voie des MAPK, la voie PI3K et la voie de l’AMP cyclique (AMPc). Nous avons tout d’abord démontré que certaines phosphodiestérases (PDE ; les inhibiteurs physiologiques de la voie de l’AMPc) sont surexprimées dans les lignées de mélanomes et inhibent ainsi la différenciation de ces cellules. La surexpression des PDEs est nécessaire à la transformation des mélanocytes par l’oncogène Ras alors que la réactivation de la voie de l’AMPc dans les lignées de mélanome inhibe leur prolifération. Ces données suggèrent qu’une stratégie thérapeutique qui aurait pour objectif de stimuler la différenciation des mélanomes en réactivant la voie de l’AMPc pourrait permettre d’inhiber leur prolifération. Nous avons par ailleurs montré que la protéine kinase B-Raf, qui est fréquemment mutée dans les mélanomes, était cependant inactivée dans les mélanomes contenant une mutation de Ras. Nous avons démontré que cette inhibition était due à une régulation négative de B-Raf par son substrat Erk. En effet, Erk phosphoryle B-Raf sur sa partie amino-terminale pour empêcher son interaction avec Ras. Ce mécanisme de régulation négative de B-Raf force ces lignées de mélanomes à utiliser l’isoforme C-Raf. Ce travail a des conséquences sur le traitement du mélanome. En effet, si B-Raf n’est pas utilisé pour l’activation de la voie des MAPK dans les mélanomes mutés N-Ras, les inhibiteurs de B-Raf en développement clinique seront inefficaces dans ces cancers. Nous avons par ailleurs démontré qu‘un inhibiteur des kinases B-Raf et C-Raf, en développement clinique (Sorafenib), induisait l’activation de ces kinases par hétérodimérisation en régulant leur phosphorylation. Ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de régulation des proto-oncogènes B-Raf et C-Raf qui pourraient jouer un rôle important dans la résistance des mélanomes aux inhibiteurs de Raf qui sont actuellement en développement clinique. / Melanoma, the most aggressive skin tumor, has become a major public health problem in many countries. Diagnosed early, it can be treated by surgical excision, but the prognosis for advanced melanoma is very poor because the tumor is resistant to all therapies used today. In order to develop new therapies to treat this tumor, we study the signaling pathways that play a major role in the proliferation, survival and differentiation of melanocytes and melanoma. These are the MAPK, PI3K pathway and the cyclic AMP (cAMP). We first demonstrated that some phosphodiesterases (PDEs; physiological inhibitors of cAMP pathway) are overexpressed in melanoma lines and thus inhibit the differentiation of these cells. Overexpression of PDEs is necessary for melanocyte transformation by oncogenic Ras when the reactivation of the cAMP pathway in melanoma lines inhibits their proliferation. These data suggest a therapeutic strategy that would aim to stimulate the differentiation of melanoma by reactivating the cAMP pathway could help to inhibit their proliferation. We have also shown that the protein kinase B-Raf, which is frequently mutated in melanoma, however, was inactivated in melanomas containing a mutation of Ras. We demonstrated that this inhibition was due to a downregulation of B-Raf by Erk substrate. Indeed, Erk phosphorylates B-Raf on its amino-terminal to prevent its interaction with Ras. This negative regulatory mechanism of B-Raf melanoma is forcing these lines to use isoform C-Raf. This work has implications for the treatment of melanoma. Indeed, if B-Raf is not used for the activation of MAPK in N-Ras mutated melanoma, the B-Raf inhibitors in clinical development will be ineffective in these cancers. We also demonstrated that a kinase inhibitor of B-Raf and C-Raf, which is in clinical development (Sorafenib), induces the activation of these kinases by heterodimerization in regulating their phosphorylation. These results reveal new mechanisms of regulation of proto-oncogene B-Raf and C-Raf, which could play an important role in the resistance of melanoma to Raf inhibitors, which are currently in clinical development.

La progression tumorale en cancer métastatique implique la perte de fonctions oncosuppressives, comme c'est le cas dans le mélanome. Une migration cellulaire aberrante est caractéristique de la progression du mélanome. SYK (Spleen tyrosine kinase) est une tyrosine kinase cytoplasmique impliquée dans la suppression tumorale du cancer du sein et du mélanome. Dans la peau, SYK est exprimée dans les mélanocytes mais est fréquemment réprimée épigénétiquement dans le mélanome. Nous avions pu montré que cette perte était associée à un échappement de la sénescence. Qu'elle puisse réguler la migration des cellules tumorales et la formation des métastases reste peu connu. Dans mes travaux j'ai utilisé des approches gain et perte de fonction pour analyser l'effet de SYK sur les mélanomes humains et murins. Respectivement, la réexpression et l'extinction de SYK diminue et augmente la migration, l'invasion et les métastases des cellules de mélanome. L'extinction de SYK induit notamment un phénotype et une signature mésenchymateuse. Notre étude dévoile ce rôle pour SYK dans la répression d'une adhérence dépendante des intégrines, points de tractions et plateforme de signalisation de la migration, et souligne l'importance la perte de SYK dans la formation de métastases. Pour clarifier le rôle de SYK dans la progression du mélanome, j'ai généré un modèle murin de KO conditionnel de SYK spécifique des mélanocytes concomitants à une perte de Pten et de l'activation de BrafV600E. Des résultats préliminaires suggèrent que la perte de SYK n'accélère pas la formation de mélanome dans ce contexte mutationnel mais mène à une invasion plus profonde des cellules tumorales dans le derme. / The progression of tumors to metastatic disease involves the loss of metastatic suppressor functions, as it is the case in melanoma. Thus, aberrant cell migration is a key feature of melanoma progression, and is required for metastasis. SYK (Spleen tyrosine kinase) is a cytoplasmic tyrosine kinase that has been implicated in tumor suppression of breast cancer and melanoma. In skin cells, SYK is found expressed in melanocytes but SYK is frequently downregulated in melanoma by epigenetic silencing. We showed previously that its loss has been associated with senescence escape. Whether it also regulates tumor cell migration and subsequent metastasis remains poorly understood. In this work we used gain- and loss-of-function approaches to analyze SYK’s effects on metastatic abilities of human and murine melanoma cells. Respectively, the reexpression or knockdown of SYK results in decreased or increased migration, invasion and metastasis of melanoma cells. Notably, SYK knockdown cells displayed a mesenchymal-like phenotype with upregulation of mesenchymal markers. Our study unveils a novel role for SYK in suppressing integrin-mediated adhesion, both a points of traction and a signaling platform during cell migration, and outlines the importance of SYK inactivation in acquisition of a metastatic phenotype. To clarify the role of SYK in melanoma formation and progression, we have generated a conditional Syk KO mouse model in melanoma based on melanocyte-specific Pten loss and BrafV600E activating mutation. Preliminary results suggest that Syk loss does not accelerate Pten/Braf-driven melanoma formation but leads to deep invasion of Braf/Pten tumor cells into the dermis.

Le mélanome cutané est le cancer de la peau le plus agressif. Il représente moins de 5% des cancers de la peau mais sa forme métastatique est responsable de 60 à 80% des décès. La médiane de survie des patients atteints d’un mélanome métastatique n’est que de 6 à 9 mois avec les chimiothérapies classiques ou ciblées. L’immunothérapie a été un grand progrès thérapeutique, néanmoins la prise en charge du mélanome métastatique souffre encore de trois points négatifs, tous les patients ne répondent pas aux différents traitements, l’efficacité des chimiothérapies ciblées est limitée par l’apparition rapide de résistances, les cliniciens manquent de marqueurs prédictifs de l’évolution dès les stades précoces pour la prise en charge. Dans ce contexte, notre groupe s’intéresse à la méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome. La méthylation est catalysée par les méthyltransférases de l’ADN (DNMTs). Lorsque celle-ci est présente au niveau d’îlots CpGs localisés dans les promoteurs des gènes, elle empêche la machinerie transcriptionnelle de se mettre en place et inhibe l’expression du gène correspondant. Le profil de méthylation globale de l’ADN étant altéré dans le cancer, elle a donc un rôle fonctionnel dans le processus tumoral mais peut aussi être utilisée en tant que biomarqueur, chaque cancer ayant un profil de méthylation différent. De plus, au sein d’un même cancer, ce profil évolue avec la progression de la tumeur. Au cours de cette thèse, j’ai identifié des modifications du profil de méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome et j'ai sélectionné 9 loci hyperméthylés candidats biomarqueurs. J’ai d’abord comparé les profils de méthylation au niveau du génome entier de lignées cellulaires de mélanome correspondant à des stades d’agressivité différents. À partir de ces informations, des loci candidats ont été choisis par une analyse de la répartition de ces loci hyperméthylés sur le génome couplée à une analyse bioinformatique des fonctions et interactions des gènes associés. Ensuite, leur statut de méthylation a été validé par une technique différente (collaboration avec le Dr. J. Tost, CNG, Evry). Une fois leur hyperméthylation confirmée, j’ai entrepris l’analyse de la méthylation de l’ADN au niveau de ces gènes dans des échantillons de tumeurs primaires issues de patients montrant des survies différentes (Collaboration : L. Lamant, N. Meyer, IUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italie). Notre étude confirme le statut hyperméthylé des gènes retenus dans les échantillons métastatiques par rapport aux échantillons de tumeurs primaires. De plus il apparaît un lien entre le niveau de méthylation de la tumeur primaire et le délai d’apparition de métastases ainsi que la survie globale des patients. Parmi les loci sélectionnés, j’ai déterminé si le statut hyperméthylé de ces loci est corrélé à leur sous- expression dans le but d’étudier leur rôle dans l’agressivité du mélanome, et si ces loci peuvent être déméthylés et ré-exprimés par un inhibiteur de DNMTs. Cela a amené à l’identification d’un gène et d'un miR peu décrits dans la littérature, dont les expressions sont corrélées au statut de méthylation et modulées par un traitement déméthylant l'ADN. J’ai entrepris de comprendre leur rôle dans l’agressivité du mélanome et évaluer leur intérêt potentiel en tant que cibles anti-tumorales. Pour cela, j’ai utilisé des tests fonctionnels pour étudier les conséquences de la surexpression dans la lignée métastatique ou de l’inhibition dans la lignée primaire. Les résultats suggèrent une régulation épigénétique fine de ce miR et de ce gène pendant la progression du mélanome, retrouvée indépendamment par notre analyse des tumeurs de patients de la banque TCGA. / Cutaneous melanoma is the most aggressive skin cancer and represents less than 5% of skin cancers but its metastatic form is responsible for 60-80% of the deaths. The median survival for patients with metastatic melanoma is only 6 to 9 months with conventional chemotherapy or targeted therapy. Despite recent therapeutic advances with the immune-therapies, the treatment of metastatic melanoma still suffers from three negatives drawbacks: 1) All patients do not respond to the different treatments. 2) The effectiveness of the targeted chemotherapy is limited by the rapid emergence of resistance. 3) Predictive biomarkers of the evolution of the disease are lacking for the clinicians. In this context, we studied the epigenetic regulations associated with the aggressiveness of melanoma, particularly in DNA methylation. DNA methylation is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs). When CpGs islands are methylated and located in the promoters of genes, expression of the corresponding gene is inhibited. Commonly, DNA methylation profile is altered in cancer and plays a role in tumorigenesis and tumor maintenance. In addition, the alterations of the DNA methylation profile can be used as biomarkers for prognostic and diagnostic. Here, I identified changes in the DNA methylation profile associated with the aggressiveness of melanoma and selected 9 candidates loci that are hypermethylated in the most aggressive forms of melanoma. First, I compared the methylation patterns genome-wide (450K BeadChip methylation) of melanoma cell lines bearing different aggressiveness. The loci biomarker candidates were selected by combining an analysis of the distribution of these hypermethylated loci on the genome and a bioinformatic analysis of the functions and interactions of the associated genes. Their methylation status was validated by a different technique in collaboration with Dr. J. Tost, CNG, Evry. Once confirmed their hypermethylation, I started to analyze the DNA methylation of the selected genes in the pairs of cell lines of different aggressiveness, such as the primary tumor compared to the metastasis from the same patient, and in patients samples of primary tumors (Collaboration L. Lamant, N. Meyer, iUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italy). A total of twenty samples were analyzed. Our study confirms the status of selected hypermethylated genes in metastatic samples compared to primary tumors. Moreover there is a link between the level of methylation of the primary tumor and the overall survival. A patent is being filed in and new samples are collected in order to extend the patient cohort to validate the biomarkers in prognosis of the evolution of the disease. Among the selected loci, I determined whether their hypermethylated status is correlated with their under-expression. For this, I measured their level of expression in a couple of cell lines WM115 / WM266-4 by RT-PCR and RT-qPCR. Then, I chose the loci for which I observed a correlation between methylation and expression. In addition, I studied whether these loci can be demethylated and re-expressed by a DNMTs inhibitor. This led to the identification of a microRNA and gene not fully described in the literature, of which the expression is correlated to DNA methylation status and are reactivated upon treatment with demethylating agents. I explored the role of the microRNA and the gene in the aggressive features of the metastatic melanoma suggesting a tumor suppressive function. These data were further comforted by the data analysis of patient samples.

La protéine SHP2 est une tyrosine phosphatase cytosolique impliquée dans la régulation des phénomènes de prolifération, migration et survie cellulaire. Elle contrôle l'état d'activation des voies de signalisation des récepteurs à tyrosine kinase faisant intervenir en particulier les protéines kinases MAPK/ERK, PI3K/AKT. Des mutations germinales et somatiques de SHP2 sont à l'origine de syndromes et de néoplasies. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence une nouveau partenaire pour SHP2: la protéine CDCP1. CDCP1 est une protéine transmembranaire dont la surexpression et la tyrosine phosphorylation par les kinases de la famille de SRC dans de nombreux carcinomes permet une augmentation des propriétés métastatiques des cellules. Nous avons de plus mis en évidence la régulation de la phosphorylation de CDCP1 et sa présence à la membrane cellulaire par SHP2. Dans une seconde partie de ce travail de thèse, notre attention s'est portée sur la protéine adaptatrice GAB2, partenaire et substrat principal de SHP2, dont la surexpression dans les mélanomes primaires et métastatiques commence à être décrite. Nous mettons en évidence la présence d'une boucle de régulation entre GAB2, dont l'expression est régulée par le facteur de transcription MITF et le récepteur KIT, dont l'activation, dépendante de l'expression de GAB2 régule l'activation de MITF et la motilité des cellules de mélanome.L'ensemble de ce travail met ainsi en évidence la présence d'un nouvel interacteur de SHP2, et d'une nouvelle boucle de régulation dans les cellules de mélanome. / SHP2 is a protein tyrosine phosphtase which regulates cell proliferation, mirgration and survival. It controls MAPK/AKT and PI3K/AKT signaling pathways activated by tyrosine kinase receptors. Germinal and somatic mutations in SHP2 lead to syndromes and neoplasia. We show a novel interaction between SHP2 and the protéine CDCP1. CDCP1 is a transmembrane protein which overexpression and tyrosine phosphorylation by SRC family kinases in carcinomas lead to an increase of the tumor cells metastatic properties. We also demonstrated that SHP2 regulates CDCP1 tyrosine phosphorylation level and its presence at the cell membrane.In a second part of this work, we focused on GAB2 anchor protein, which is one of the most important partner and substrate for SHP2. GAB2 is overexpressed in primary and metastatic melanoma. We show the presence of a regulation loop, involving GAB2 regulation by the transcription factor MITF, KIT receptor and its activation depending on GAB2, which controls MITF activation and melanoma cell motility.This thesis work demonstrate the presence of a novel partner for the protein SHP2 and of a new regulation pathway in melanoma cells.

Le mélanome métastatique est un des cancers les plus agressifs avec une croissance constante du nombre de nouveaux cas par an dans le monde.Deux mutations sont principalement à l’origine de ce cancer : BRAF(V600) et NRAS(Q61). Les principaux traitements sont des thérapies ciblant BRAF lui-même ou MEK, prescrites en monothérapie ou en combinaison. La moitié des patients répondent à ce traitement mais malheureusement rechutent dans les 6 mois à 1 an après le début du traitement. Les mécanismes de résistance décrits passent par une réactivation de la voie des MAPK, de la voie PI3K/Akt/mTOR ou par une dérégulation de l’apoptose.Les deux premières voies de signalisation permettent la régulation d’un complexe : le complexe d’initiation de la traduction eIF4F. Ce complexe est composé de 3 protéines : eIF4E, une protéine qui s’associe à la coiffe 7-methyl-guanosine, eIF4A une hélicase et eIF4G une protéine échafaudage dont un des rôles est de maintenir la cohésion de ce complexe.Le complexe eIF4F étant en aval de deux voies dérégulées dans le mélanome, le but de ma thèse a été de mettre en évidence une potentielle implication de ce complexe dans la résistance aux thérapies ciblant BRAF et MEK.Pour cela, dans un premier temps, nous avons traiter des lignées cellulaires de mélanome BRAF(V600) sensibles et résistantes aux anti-BRAF et anti-MEK. Nous avons ensuite quantifié les interactions eIF4E-eIF4G, synonymes d’activation du complexe eIF4F, et les interactions eIF4E-4EBP1, synonymes d’inhibition de la traduction par une technique de Proximity Ligation Assay (PLA). Ces expériences ont permis de conclure que les inhibiteurs de BRAF et de MEK induisaient une dissociation du complexe dans les lignées sensibles, alors qu’il reste maintenu dans les lignées résistantes. Ces résultats ont été confirmés sur des tumeurs de patients répondeurs et non répondeurs à ces mêmes traitements. Par la suite, nous avons reproduits ces expériences avec un panel de lignées cellulaires mutées en NRAS(Q61) et avons observé les mêmes résultats.Nous avons donc pu mettre en évidence l’implication du complexe eIF4F dans la résistance aux thérapies ciblant la voie des MAPK dans les mélanomes mutés en BRAF et en NRAS, mais également découvert une nouvelle cible thérapeutique potentielle.La seconde partie de cette thèse a consisté au test de plusieurs inhibiteurs connus et spécifiques d’eIF4A (silvestrol, flavaglines, hippuristanol, patéamine A) ou de l’interaction eIF4E-eIF4G (4EGI1). Tous ces inhibiteurs ont sensibilisé les lignées résistantes aux thérapies ciblées mais aucun ne pouvait être potentiellement utilisable en clinique.L’utilisation d’un vecteur bicistronique dans le cadre d’un criblage de drogue a permis d’identifier 4 flavaglines qui inhibent significativement le complexe d’initiation de la traduction. L’une d’entre elles (FL3) a été testé in vivo dans un modèle de xénogreffes issues de lignées cellulaires de mélanomes résistantes. Les résultats ont montré un effet synergique de cette drogue en combinaison avec le vemurafenib (anti-BRAF) ainsi qu’une inhibition de la croissance tumorale. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle cible thérapeutique et un nouveau biomarqueur de résistance aux thérapies ciblées dans deux contextes mutationnels de mélanome différents : BRAF et NRAS. / In BRAF(V600) or NRAS(Q61)-mutant tumours, most mechanisms of resistance to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases rely on reactivation of the RAS–RAF–MEK–ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathway or on activation of the alternative PI(3)K–AKT–mTOR pathway (which is ERK independent). These two pathways converge to regulate the formation of the eIF4F eukaryotic translation initiation complex. By using an in situ method to detect the eIF4E-eIF4G and eIF4E-4EBP1 interactions, we recently showed that the persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap-binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF and/or anti-MEK in BRAF(V600)-mutant cancer cell lines. We next focused on NRAS-mutant cancer cell lines and found that this complex is also involved in the resistance to anti-MEK compounds. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex in BRAF or NRAS-mutated cell lines is able to overcome resistance and to synergize with drugs targeting BRAF or MEK kinases. As a result, eIF4F appears to be a promising therapeutic target in a BRAF or NRAS-mutation context.