Upon activation, T cells shift towards a metabolic program characterized by increased glucose metabolism in order to sustain proliferation and effector function. Surprisingly, while resting T lymphocytes degrade glucose aerobically to CO2, proliferating T cells metabolize glucose almostentirely to lactate in the presence of oxygen through aerobic glycolysis (the Warburg effect). This metabolic switch comprises the upregulation of glycolytic enzymes and glucose transporters to the cell membrane, leading to an increase of glycolytic flux and the concomitant production of lactate. Despite many decades of research, we still do not fully understand the mechanisms that make proliferating T cells choose glycolysis rather than oxidation of glucose to produce energy. Since activated T lymphocytes depend on a glycolytic metabolism, they must release lactate, which inthese cells is facilitated by the proton-linked monocarboxylate transporter MCT1. The transporter is part of a protein family of 14 members among which MCT1–4 facilitate the passive transmembrane transport of monocarboxylates such as lactate, pyruvate and ketone bodies. The observation that pharmacological MCT1 inhibition has shown anti-proliferative effect on T cells suggests that lactate transport is essential to T cell expansion triggered after antigen recognition. The aim of our research is to investigate the importance of MCT1-dependent regulation in T cellmetabolism. Following TCR stimulation, MCT1 was expressed early in T cells unlike MCT4 whose significant expression was detected at later time point. To investigate the role played by MCT1 in the early steps of T cell activation, we generated a transgenic mouse model where conditional deletion of the MCT1 gene was achieved specifically in T cells. Phenotype and T cell distribution in thymus and peripheral organs were normal in MCT1fl/fl CD4Cre mice. However, lack of MCT1 expression decreased the proliferative capacity of in vitro activated CD4+ or CD8+ T cells without altering their viability. We observed that the IL-2 production was also affected by the lack of MCT1 expression, in line with decreased proliferative ability. Moreover, in vivo, T cell expansion that followed antigenic stimulation as well as T cell-mediated immune response to infection were deficient in MCT1fl/flCD4Cre mice. Our data indicate that this situation resulted from a cellular energy shortage caused by reduced glycolytic activity soon after activation. Moreover, energy crisis was amplified by the necessity to use ATP-consuming mechanisms for excluding H+ protons from the cytosol of activated MCT1-deficient T cells. Thus, in T cells, early MCT1 expression after activation ensures an energy saving mechanism for regulating cytoplasm acidification. Our observations also indicate that a high glycolytic flux is required in dividing T cells to maintain pH homeostasis. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le nombre de lymphocytes T (LT) présents dans l’organisme est contrôlé de manière étroite et maintenu constant. En réponse à une chute de ce nombre, par exemple suite à une infection, un traitement de chimiothérapie ou lors d’une greffe de moelle osseuse, les LT résiduels ou transférés se divisent activement et repeuplent les compartiments lymphoïdes, rétablissant ainsi un nombre «normal» de cellules immunes périphériques. Ce processus, appelé prolifération homéostatique, est soutenu par l’IL-7 ainsi que les signaux TCR et mène à la génération de LT effecteurs/mémoire. Ces cellules effectrices/mémoire peuvent favoriser le développement d’une réponse anti-tumorale mais sont aussi impliquées dans le développement de maladies auto-immunes et inflammatoires.Des changements métaboliques sont étroitement liés à la différenciation et aux fonctions des LT. De plus, un nombre grandissant de données suggère qu’une modulation du métabolisme permet d’influencer le cours d’une réponse immune. L’AMP-activated protein kinase (AMPK) est un senseurmajeur du stress métabolique qui régule l’homéostasie des mitochondries, la glycolyse et l’équilibre rédox. Si l’AMPK est activée lors de la stimulation du TCR, son implication dans la biologie des LT reste confuse.Au cours de cette thèse, nous avons entrepris une série d’expériences afin d’évaluer le rôle de l’AMPK sur la biologie des LT et plus particulièrement au cours de leur prolifération homéostatique. Grâce à différents modèles in vivo et in vitro, nous avons montré que l’AMPK, bien que dispensable pour les étapes précoces de l’activation du TCR, est requise pour soutenir la viabilité et l’expansion des LT au cours de proliférations de longues durées. L’AMPK promeut l’accumulation de LT effecteurs/ mémoire au cours d’une prolifération homéostatique. En accord avec ces données, la transplantation de LT AMPK-KO dans un hôte allogénique conduit au développement d’une réaction du greffon contre l’hôte de moindre gravité.D’un point de vue métabolique, l’AMPK soutient le potentiel de membrane mitochondrial, permet une plus grande flexibilité métabolique, limite la production de dérivés toxiques de l’oxygène (ROS) et protège les LT contre le stress oxydant. En outre, la neutralisation des ROS par un traitement antioxydant restaure partiellement la prolifération des LT AMPK-KO.Nos données suggèrent qu’en limitant l’accumulation de dégâts mitochondriaux et oxydatifs au cours de cycles de divisions prolongées, l’AMPK soutient la viabilité, la prolifération et les fonctions effectrices des LT. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les petits ARN régulateurs bactériens, généralement de 50 à 300 nt de long, agissent en appariant les bases avec des cibles d'ARNm spécifiques, affectant ainsi leur traduction et/ou leur stabilité, sont des éléments importants qui régulent divers processus. V. tasmaniensis LGP32 est un pathogène de l'huître facultatif. Un ARNs Vsr217 s'est révélé être conservé dans les vibrions et fortement régulé à la hausse lors de l'infection des huîtres. J'ai trouvé que vsr217 et le gène en aval malK (codant pour une sous-unité du transporteur principal de maltose) sont tous deux exprimés à partir d'un promoteur en amont régulé par l'activateur de maltose MalT, Vsr217 étant généré à partir de la longue 5' UTR de l'ARNm de malK. Outre un effet cis sur l’expression du malK, qui diminue chez le mutant Δvsr217, nous avons constaté que l’absence de cet ARNs entraînait, lors de la croissance de cellules dans du maltose, l’augmentation de deux enzymes importantes impliquées dans la voie de la glycolyse/néoglucogenèse, Fbp et PpsA et cet ARNm de fbp étaient une cible directe de Vsr217. J'ai également exploré la régulation de la biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA: Leucine, Valine et Isoleucine) chez V. alginolyticus, un agent pathogène des poissons et mollusques et des poissons de mer et un agent pathogène humain émergent opportuniste. Nous avons constaté que l'opéron ilvGMEDA (codant la voie principale pour la biosynthèse des BCAAs) est régulé par un peptide leader traduit. Ainsi, la traduction d'un peptide riche en BCAA codé en amont des gènes de structure fournit une réponse adaptative par un mécanisme similaire au modèle canonique de E. coli. Cette étude portant sur un organisme non modèle à Gram-négatif met en évidence la conservation mécanistique de l'atténuation de la transcription malgré l'absence de conservation de la séquence primaire. / Bacterial regulatory small RNAs, usually 50-300 nt long, act by base-pairing with specific mRNA targets, affecting their translation and/or stability, are important elements which regulate a variety of processes. V. tasmaniensis LGP32 is a facultative oyster pathogen. A sRNA Vsr217 was found to be conserved within vibrios and highly upregulated during oyster infection. I found that vsr217 and the downstream gene malK (encoding a subunit of the major maltose transporter) are both expressed from an upstream promoter regulated by the maltose activator MalT with Vsr217 being generated from the long 5' UTR of the malK mRNA. Beside a cis-effect on malK expression, which decreases in the Δvsr217 mutant, we found that the absence of this sRNA resulted, when cells grown in maltose, in the increase of two important enzymes involved in the glycolysis/neoglucogenesis pathway, Fbp and PpsA and that fbp mRNA was a direct target of Vsr217. I also explored the regulation of the biosynthesis of branched-chain amino acids (BCAAs: Leucine, Valine and Isoleucine) in V. alginolyticus, a marine fish and shellfish pathogen and an emerging opportunistic human pathogen. We found that the ilvGMEDA operon (encoding the main pathway for biosynthesis of BCAAs) is regulated by a translated leader peptide. Thus, the translation of a BCAA rich peptide encoded upstream of the structural genes provides an adaptive response by a mechanism similar to the E. coli canonical model. This study with a non-model Gram-negative organism highlights the mechanistic conservation of transcription attenuation despite the absence of primary sequence conservation.

La production cyclique d'adénosine monophosphate (AMPc) régule certains aspects de la fonction mitochondriale des cardiomyocytes de rongeurs, tels que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, les importations de calcium et la transition de perméabilité mitochondriale (MPT), mais le contrôle de ce pool d'AMPc n'est pas bien connu. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'expression, la localisation et l'activité de plusieurs enzymes dégradant l'AMPc, les phosphodiestérases (PDEs), dans des mitochondries cardiaques isolées de rongeurs. L'expression de la PDE2 a été principalement détectée dans les mitochondries sous-sarcologiques, et l'activité de la PDE2 stimulée par le GMPc était plus importante que celle de la PDE3 et de la PDE4; leurs activités ont ensuite été confirmées dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés par analyse FRET en temps réel. De plus, l’inhibition pharmacologique ou la surexpression cardiaque spécifique de la respiration mitochondriale modulée par la PDE2, la perte de potentiel de la membrane mitochondriale, le MPT et l’importation de calcium. Ainsi, la dégradation de l'AMPc par les PDE représente un nouveau mécanisme de régulation de la fonction mitochondriale et devient une cible potentielle dans le traitement des maladies cardiovasculaires.En outre, l'amélioration récente du traitement anticancéreux entraîne une augmentation du nombre de patients survivants, mais un risque de cardiotoxicité à long terme. Ainsi, dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons identifié des molécules cardioprotectrices à partir de bibliothèques chimiques en développant un test de criblage à haut débit. Nous avons identifié 6 molécules à effets puissants et spécifiqies et les avons validés dans 3 modèles cellulaires. Nous avons étudié les mécanismes d'action de chaque molécule en utilisant l’extinction par siARN, l'analyse par western blot, l'imagerie par fluorescence et les analyses métaboliques en temps réel. Trois molécules pourraient entrer rapidement dans les études précliniques et cliniques en association avec des agents de radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques pour le développement thérapeutique, tandis que les trois autres molécules pourraient nécessiter une optimisation chimique supplémentaire. / Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production regulates certain aspects of mitochondria function in rodent cardiomyocytes, such as ATP production, oxygen consumption, calcium imports and mitochondrial permeability transition (MPT), but how this cAMP pool is controlled is not well known. In the first part of this thesis, we investigated the expression, localization and activity of several cAMP-degrading enzymes, phosphodiesterases (PDEs), in isolated rodent cardiac mitochondria. PDE2 expression was mainly detected in subsarcolemmal mitochondria, and cGMP-stimulated PDE2 activity was largest than PDE3 and PDE4, their activities were further confirmed in neonatal rat cardiomyocytes by real time FRET analysis. Moreover, the pharmacological inhibition or the cardiac-specific overexpression of PDE2 modulated mitochondrial respiration, mitochondrial membrane potential loss, MPT and calcium import. Thus, cAMP degradation by PDEs represents a new regulatory mechanism of mitochondrial function, and becomes a potential target in cardiovascular diseases therapy.In addition, the recent improvement of anticancer treatment results in an increase in surviving patients, but with a risk of long-term cardiotoxicity. Thus, in the second part of this thesis, we identified cardioprotective molecules from chemical libraries by developing a high throughput screening assay. We identified 6 potent and specific hits and validated them in 3 cellular models. We investigated the mechanisms of actions of each molecule and their cellular impact by using siRNA silencing, western-blot analysis, fluorescent imagery and real-time metabolic analyses. Three molecules could enter rapidly in preclinical and clinical studies in combination with radiation or chemotherapeutic agents for therapeutic development, while other three molecules may require further chemical optimization.

S’appuyer sur le métabolisme pour lutter contre la prolifération tumorale est une démarche qui commence à montrer de nombreux résultats. Notamment, il a été montré que la privation en nutriments ou jeûne permettait de ralentir l’incidence et la croissance de plusieurs modèles tumoraux en préclinique, effet d’autant plus important quand il est combiné aux agents chimiothérapeutiques. Notre laboratoire a identifié des agents capables de mimer certains effets biochimiques du jeûne. Ces composés, nommés Caloric Restriction Mimetics, permettent également d’améliorer l’effet antitumoral de plusieurs chimiothérapies. De façon importante, le système immunitaire était nécessaire à l’efficacité de ces différentes combinaisons thérapeutiques. Mon projet de thèse avait donc pour objectifs de comprendre en quoi ces traitements impactaient les populations immunitaires infiltrées dans la tumeur et si ces modulations métaboliques pouvaient être mises à profit en combinaison d’autres thérapies anticancéreuses. / Taking advantage of metabolism to fight against tumor proliferation begin to show several results. Indeed, it has been demonstrated that fasting had the potential to reduce the incidence and the proliferation of differents preclinical tumor models. This effect could be further enhanced when combined with chemotherapeutics agents. Thus, our laboratory has pinpointed compounds that have the ability to mimic some of the biochemical properties of nutrient deprivation. Those compounds, named Caloric Restriction Mimetics, can also improve the antitumor effect of several chemotherapies. Importantly, immune system is necessary to the efficiency of those therapeutics combinations. Accordingly, my thesis project was to understand in which manner tumor immune infiltrated populations were impacted by those treatments, and if those metabolic modulators could benefit to others anticancer therapies.

L'hepcidine est un petit peptide jouant un rôle clef dans le métabolisme ferrique. Dans la première partie de cette thèse, une méthode de quantification de l'hepcidine sérique et urinaire est développée par spectrométrie de masse en tandem avec évaluation des critères de fiabilité analytique et maitrise des paramètres pré-analytiques. La deuxième partie est centrée sur l'identification d'un agent stabilisateur pour la mesure de l’hepcidine urinaire et l'évaluation de l’efficience diagnostique de l’hepcidinurie sur collecte de 24h pour l’identification d’une carence martiale. Dans la troisième partie, l’intérêt de la détermination de l’hepcidine sérique basale ou de sa cinétique quatre heures après un test d’absorption en fer oral est évalué dans le cadre du diagnostic différentiel des anémies du sujet âgé. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La répression de la traduction des ARN messagers (ARNm) par les microARN est un processus qui régule environ 60% de tous les gènes chez l’humain et module la quasi-totalité des processus biologiques cellulaires. La ribonucléase Dicer étant l’enzyme responsable de la conversion des précurseurs de microARN en microARN matures, nous nous attendons à ce que le maintien de l’homéostasie cellulaire dépende d’une régulation fine des niveaux d’expression et de l’activité enzymatique de Dicer. L’utilisation du double-hybride chez la levure nous a permis d’identifier la protéine Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK), comme un partenaire potentiel de la forme humaine de Dicer. TWEAK est un membre de la famille des TNF qui a été découvert récemment et qui est impliqué dans de nombreux processus biologiques, dont l’inflammation. Produit majoritairement par les leucocytes, son expression protéique est altérée dans de nombreuses maladies, dont l’arthrite rhumatoïde. L’objectif de notre étude vise donc à déterminer la nature, l’implication et le rôle de l’interaction entre Dicer et TWEAK dans le processus inflammatoire. Nous avons confirmé l’interaction Dicer-TWEAK par co-immunoprécipitation et leur colocalisation par immunofluorescence dans la lignée cellulaire HEK293. Nous avons également documenté un effet inhibiteur de TWEAK sur la capacité enzymatique de Dicer à produire des microARN matures in vitro et dans les cellules HEK293. Cette étude permet de mieux comprendre les mécanismes régulatoires de l’activité de Dicer et de l’expression des microARN dans le processus inflammatoire.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Notre groupe de recherche a récemment démontré que des apports très élevés en acides gras trans naturels (AGTn) et industriels (AGTi) avaient des effets comparables sur les lipides et lipoprotéines plasmatiques. L'impact des différents AGT sur les processus impliqués dans l'homéostasie du cholestérol demeure toutefois inconnu et il nous est apparu important d'investiguer dans cette voie. Ce mémoire présente les résultats d'une étude dont l'objectif était de comparer l'impact des AGTi et des AGTn sur les marqueurs de la synthèse endogène et de l'absorption intestinale du cholestérol. Les résultats démontrent que le niveau d'absorption du cholestérol est modifié de façon plus importante suite à la consommation d'AGTn que d'AGTi, mais cette différence ne se reflète pas dans les concentrations de LDL-C entre les deux sources d'AGT. Il semble également que la consommation d'AGT n'affecte pas la synthèse endogène de cholestérol, peu importe leur origine.