La traduction représente un processus central au sein de la cellule, elle assure le transfert de l’information génétique de l’ARNm vers les protéines. De nombreux acteurs y sont impliqués directement ou indirectement et parmi eux, chez les eucaryotes, la petite protéine Trm112. Celle-ci participe à la modification de plusieurs acteurs directs en interagissant et en activant quatre MTases. Le facteur de terminaison eRF1 est méthylé par le complexe Mtq2-Trm112, l’ARNr 18S par Bud23-Trm112 et certains ARNt par les complexes Trm9-Trm112 et Trm11-Trm112. Au cours de ce travail, les structures cristallographiques de Trm9-Trm112 et de Bud23-Trm112 de levure ont été résolues. L’étude comparative structurale de ces complexes et de la structure connue de Mtq2-Trm112, a permis de mettre en évidence que dans un même organisme, les séquences des trois protéines ont évolué de manière à conserver l’interaction avec Trm112. Même si les quatre partenaires présentent moins de 20% d’identité de séquence, les résidus clés pour l’interaction avec la petite protéine activatrice sont conservés ou partagent des caractéristiques identiques. En plus de l’analyse structurale, le complexe Trm9-Trm112 a fait l’objet d’une étude fonctionnelle chez S. cerevisiae ce qui a permis de cartographier le site actif de l’enzyme et de proposer un modèle de mécanisme d’action. Enfin, les premières études in vivo réalisées chez Haloferax volcanii suggèrent que cette plateforme serait également présente chez certains organismes procaryotes. / Protein synthesis is a central process in the cell; it ensures the transfer of genetic information from mRNA in to protein. A lot of actors are involved directly or indirectly in translation. In Eukaryotes, Trm112, a small protein, interacts with and activates four methyltransferases modifying direct actors of translation. The termination factor eRF1 is methylated by the Mtq2-Trm112 complex, the 18S rRNA by Bud23-Trm112 and some tRNA by the Trm9-Trm112 and Trm11-Trm112 complexes. During this work, the crystal structures of Trm9-Trm112 and Bud23-Trm112 complexes from yeast were solved. The comparative analysis of these two new structures with Mtq2-Trm112 structure highlights the structural plasticity allowing Trm112 to interact through a very similar mode with its partners although those share less than 20% sequence identity. In the same organism, the key residues for the interaction with Trm112 are conserved or share similar characteristics. In addition to the structural analysis, the function of the Trm9-Trm112 complex was studied in S. cerevisiae. This analysis allowed to map the active site of the enzyme and to propose a model of its mechanism of action. Finally, the first data obtained in vivo, with the Archaea Haloferax volcanii suggest that the Trm112 platform might also be present in some prokaryotic organisms.

La protéine L-isoaspartate méthyltransférase (PIMT) répare les protéines endommagées par la formation de résidus L-isoaspartates anormaux. Elle est majoritairement exprimée et active dans le cerveau. Or, la déficience en PIMT est largement associée à différentes maladies neurologiques tandis qu'une élévation de son niveau d'expression semble jouer un rôle protecteur. La PIMT est communément caractérisée comme une protéine monomérique du cytosol. Nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes qui régulent son expression et son activité. Les dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) peuvent agir comme des messagers secondaires des voies de signalisation physiologiques, par contre, l'accumulation de ceux-ci peut causer des dommages oxydatifs et contribuer fortement à l'altération des processus cellulaires. En raison de divers facteurs, les cellules cérébrales peuvent être plus vulnérables face à une augmentation des DRO (stress oxydatif). Pourtant, il existe peu d'information concernant la régulation de la PIMT par les DRO dans le cerveau. Par ailleurs, les mitochondries sont les principales sources de DRO intracellulaires et leur association avec les désordres neurologiques est de plus en plus rapportée. Malgré le fait que la PIMT est aussi présente et active dans les mitochondries, aucune étude n'a encore examiné la régulation de son express ion dans ces organites. L'objectif de cette thèse était de démontrer que les DRO régulent l'expression de la PIMT. Dans un premier volet, nous avons investigué les effets des DRO sur l'express ion de la PIMT. Le phénylarsine oxyde (PAO) est une molécule dérivée de l'arsenic qui altère les protéines en oxydant les résidus cystéines vicinales (voisines sur la chaîne polypeptidique). En premier lieu, nous rapportons que la synthèse de la PIMT est rapidement stimulée par le traitement des cellules d'astrocytomes humains U87 avec le PAO. Nous avons aussi confirmé que l'augmentation de l'express ion de la PIMT par le PAO était dépendante de protéines possédant des cystéines vicinales. De manière importante, nous avons observé que l'augmentation de l'expression de la PIMT corrélait avec la formation de DRO induite par le PAO. De façon convaincante, nous avons pu démontrer que la formation des DRO et la stimulation de l'express ion de la PIMT par la PAO étaient bloquées par l'agent antioxydant N-acétylcystéine ainsi que par l'inhibition de la NADH/NADPH oxydase avec le chlorure de diphenyleneiodonium. De plus, nous avons montré que l'inhibition de l'express ion de la PIMT par siRNA accroissait significativement la formation des DRO induits par le PAO, indiquant que la PIMT agissait indirectement comme une protéine antioxydante. Dans un deuxième volet, nous avons caractérisé la PIMT associée aux mitochondries. Nous avons trouvé que la PIMT est exprimée sous une forme monomérique, dimérique et multimérique dans les fractions mitochondriales des cellules de neuroblastomes humains, les SH-SY5Y. L'analyse par électrophorèse bidimensionnelle a révélé deux isoformes spécifiques de la PIMT dans les fractions mitochondriales. Lorsque nous avons traité les cellules avec le carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), un agent découplant qui perturbe l'activité mitochondriale, l'expression et l'activité des monomères de PIMT ont diminué alors que l'expression et l'activité des multimères de PIMT ont été stimulées. De manière significative, l'assemblage des multimères de PIMT est le résultat de monomères de PIMT liés par des ponts disulfures car le traitement des multimères avec un agent réducteur comme le dithiothréitol les transforme en monomères de PIMT. L'acide ascorbique, un antioxydant, bloque significativement la formation des multimères de PIMT induite par le CCCP, validant que les DRO contribuent à la multimérisation de la PIMT. De plus, on a trouvé que le CCCP conduit à l'accumulation des résidus aspartates endommagés sélectivement au niveau des protéines avec un haut poids moléculaire. Il est particulièrement intéressant de noter que l'élévation de l'activité catalytique des multimères de la PIMT par le CCCP a été drastiquement inhibée par l'agent réducteur dithiothréitol. Ces résultats indiquent que les monomères de PIMT sont généralement inactifs après les traitements au CCCP et que l'activation des multimères de PIMT est essentiellement dépendante de la formation des liens disulfures entre monomères de PIMT. Cette thèse rapporte la régulation de la PIMT par les DRO et démontre que cette enzyme de réparation est une nouvelle protéine antioxydante. En plus, elle met en évidence que les DRO contribuent à la multimérisation et l'activation de la PIMT dans les mitochondries. Ces travaux de recherche mettent en lumière un nouveau champ d'étude sur la PIMT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : protéine L-isoaspartate méthyltransférase, dérivés réactifs de l’oxygène, mitochondries, liens disulfures, multimères

Les virus appartenant à l’ordre des Mononegavirales possèdent une « large » protéine L, responsable du cycle réplication/transcription et de maturation des ARNs. Six domaines conservés portent les différentes activités de cette protéine dont le site catalytique d’une activité méthyltransférase (MTase) de la coiffe. La coiffe est une structure chimique constituée d’une guanosine méthylée en position N7 reliée à l’extrémité 5’ des ARNm par une liaison 5’-5’ triphosphate. Une seconde méthylation est également présente en position 2’O du ribose du premier nucléotide de l’extrémité 5’ de l’ARNm. Ces méthylations ont un rôle critique chez les virus car elles permettent la traduction efficace des ARNm mais permettent également aux ARNs viraux d’échapper à leur détection par l’immunité innée de l’hôte. Ainsi, la caractérisation de ce domaine chez le virus Ebola serait un point clé pour une meilleure compréhension de la réplication des filovirus et un pas vers l’élaboration d’une nouvelle stratégie thérapeutique. Nous avons donc produit le domaine MTase du virus Soudan (SUDV) afin de caractériser son activité. Il a été démontré que le domaine C-terminal de la protéine L joue un rôle dans le recrutement de l’ARN, crucial pour l’activité MTase. Nous avons pu identifier une activité A-2’O MTase interne originale. Le domaine MTase de SUDV est également capable de méthyler les positions N7 et 2’O de la coiffe mais une caractérisation plus approfondie est nécessaire. Enfin, nous avons identifié des molécules inhibant l’activité MTase des filovirus. Une analyse biochimique plus poussée permettra d’initier le développement d’une nouvelle stratégie antivirale contre le virus Ebola. / In the Mononegavirales order, viruses encode a large protein (L), which is responsible for replication/transcription and RNA modifications. This protein harbours six conserved domains accountable of these different activities. Among these domains, the conserved region VI (CRVI) has been predicted to support cap-methyltransferase (MTase) activity. The cap consists in a N7-methylated guanosine linked to the first nucleotide at the mRNA 5'-end by a 5'-5' triphosphate bond. This structure can also be methylated at the 2'O position of N1 ribose. These methylations play a critical role in virus life cycle as N7 methylation triggers efficient viral RNA translation and 2'O methylation hampers the detection of viral RNA by the host innate immunity. Thus, the characterization of this domain in Ebola virus is a key point to understand replication of mononegaviruses and design new antiviral strategies. We produced the MTase domain of Sudan ebolavirus (SUDV) to characterize its MTase activity. We demonstrated that the protruding C-terminal domain is essential for MTase activity as this domain is a key for the RNA recognition. Using synthetic short RNAs holding different cap structures, we discovered that SUDV MTase harbours an unconventional A-2’O MTase activity. Besides this, the MTase domain is able to methylate the cap structure at N7 and 2'O positions but further characterization would be necessary to fully understand the cap synthesis. Finally, we identified compounds limiting the Ebola virus MTase activity. Further biochemistry and compounds characterization results will thus pave the way towards the development of an innovative antiviral strategy.

Les chondrosarcomes sont des tumeurs malignes osseuses, considérés comme radio- et chimio-résistants, du fait de leur environnement hypoxique. Dans ce contexte, cette étude vise à mieux comprendre le rôle de l’hypoxie dans la résistance de ces tumeurs à la chimiothérapie (cisplatine) et à la radiothérapie (rayons X) et à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de sensibiliser les chondrosarcomes aux traitements, par un ciblage épigénétique de la méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27).Dans un premier temps, nous avons montré que, contrairement à ce qui est communément admis, l’hypoxie n’a pas d’effet sur la sensibilité au cisplatine ou aux rayons X dans certains chondrosarcomes alors qu’il augmente la résistance au cisplatine et la sensibilité aux rayons X uniquement dans une lignée de chondrosarcome. Dans un second temps, nous avons montré que le 3-deazaneplanocine A (DZNep) induit l’apoptose dans ces tumeurs, par un mécanisme indépendant de la méthylation de H3K27 et de sa méthylase EZH2 et semblerait agir par la voie Rhoβ/EGFR. Cependant, il provoque des effets secondaires sur la fertilité masculine. Par ailleurs, son association avec le cisplatine potentialise ses effets toxiques sur les chondrosarcomes. Le GSK-J4, quant à lui ralentit la croissance cellulaire des chondrosarcomes et son association avec le cisplatine augmente cet effet. Cette étude souligne que les chondrosarcomes possèdent des mécanismes de régulation cellulaires différents, d’où l’importance de mener des études sur plusieurs lignées cellulaires afin de mieux prédire la réponse aux traitements. De plus, ces travaux démontrent les propriétés anti-tumorales du DZNep et du GSK-J4 dans le traitement de ces tumeurs. / Chondrosarcomas are bone malignant tumors, considered as radio- and chemo-resistant, due to their hypoxic environment. In this context, this study aimed to better understand the role of hypoxia in the resistance of these tumors to chemotherapy (cisplatin) and radiotherapy (X-rays) and to identify new therapeutic strategies to re-sensitize chondrosarcomas by epigenetic targeting of H3K27 methylation. First, we showed that, contrary to what is commonly accepted, hypoxia has differential effect on cisplatin or X-ray sensitivity in chondrosarcomas, while it increases cisplatin resistance and X-ray sensitivity only in one cell line. Secondly, 3-deazaneplanocin A (DZNep) induces apoptosis in these tumors by a mechanism independent of H3K27 methylation and its methylase EZH2 and seems to act through the Rhoβ / EGFR pathway. However, it causes side effects on male fertility. In addition, its association with cisplatin potentiates its toxic effects on chondrosarcomas. The GSK-J4, on the other hand, decreases cell growth and its association with cisplatin increases this effect.This study highlights that chondrosarcomas use different cellular regulation mechanisms, showing the importance of conducting studies on several cell lines in order to better predict the response to treatments. In addition, these studies demonstrate the anti-tumoral properties of DZNep and GSK-J4 in the treatment of these tumors.

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale. / This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism.

Différents rôles de l'hélicase Pif1 ont été décrit dont le plus documenté est de décrocher la télomérase des télomères en déroulant les hybrides ARN/ADN formés entre l'ARN de la télomérase et l'ADN télomérique. Plus récemment, une nouvelle voie de signalisation des dommages à l'ADN a été mise en évidence, qui inhibe l'action de la télomérase au niveau d'une cassure de l'ADN via la phosphorylation de l'hélicase Pif1. Cette phosphorylation, dépendante de la kinase ATR (Mec1), inhibe la réparation aberrante de la cassure d'ADN par la télomérase. Nous étudions au sein de l’équipe la protéine RPA (Replication Protein A), affine de l'ADN simple-brin, qui recrute à la fois la protéine de recombinaison homologue Rad52 et la protéine Mec1 impliquée dans la cascade de signalisation des dommages de l'ADN. Lors de l'étude de différentes fonctions de l'hélicase Pif1, j'ai mis en évidence une interaction robuste entre Pif1 et RPA. J'ai identifié un allèle de RFA1, rfa1-D228Y, affectant l'interaction Pif1/RPA et montré, grâce à cet allèle, que cette interaction est impliquée dans le recrutement de Pif1 au niveau d'une cassure double-brins (CDB) induite de l'ADN. Enfin, il a été récemment mis en évidence un nouveau rôle de Pif1 dans la stabilité des G-Quadruplexes durant la réplication du brin avancé. En effet, les cellules pif1 présentent un taux d'instabilité du minisatellite CEB1 inséré sur le brin avancé d'environ 56%, correspondant à des réarrangements de l'ADN de type contractions ou expansions. Lors de l'étude de l'interaction Pif1/RPA, j'ai montré que la mutation rfa1-D228Y entraîne une instabilité du minisatellite CEB1 présent sur le brin avancé, similaire à celle observée avec la délétion pif1∆. Nous suggérons un modèle selon lequel RPA recruterait Pif1 au cours de différents processus cellulaires tels que la réponse des dommages à l'ADN ou la réplication des structures particulières de l'ADN telles que les G-Quadruplexes.En parallèle de cette étude, j’ai étudié le rôle de l'histone méthyltransférase Set1 spécifique de la lysine 4 de l'histone H3 dans la régulation de la taille des télomères. J’ai mis en évidence que le raccourcissement des télomères observé dans un mutant set1 est lié à l'absence de di- et tri-méthylation de H3K4 alors que la perte de monométhylation n'a aucun effet. Cependant, le défaut de la taille des télomères dans les cellules set1∆ n'est pas uniquement lié au défaut de méthylation de H3K4 mais semble impliquer une autre activité de Set1 qu’il reste à déterminer. Etonnamment, nous avons observé que la délétion de SET1 aggrave le raccourcissement des télomères des mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation positive de la taille des télomères et inversement, aggrave le rallongement des télomères de mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation négative des télomères. Nous postulons que l’inactivation de Set1 pourrait à la fois inhiber l’activation précoce des origines de réplication des régions subtélomériques et conduire à un sur-raccourcissement de la taille des télomères, à la fois affecter la synthèse du brin complémentaire dans un contexte où celle-ci est affectée (mutant rif1) et conduire à un sur-allongement des télomères. Une seconde hypothèse propose que Set1 régulerait la transcription deTERRA dans des cellules ayant les télomères déprotégés (mutant rif) entraînant le sur-allongement des télomères. / Different roles of Pif1 helicase have been described, the best documented being to remove telomerase from telomeres by unwinding the RNA/DNA hybrid between telomerase RNA and telomeric DNA. Recently, it was shown that the DNA damage signaling down-regulates telomerase action at a DNA break via Pif1 phosphorylation. Pif1 phosphorylation is dependent of the checkpoint kinase ATR (Mec1) and prevents the aberrant healing of broken DNA ends by telomerase. In our laboratory, we study RPA (Replication Protein A), a single-strand DNA binding protein which recruits the proteins involved in the DNA damage response and checkpoint regulation, such as the homologous recombination protein Rad52 and Mec1 involved in the DNA damage response. I have identified an allele of RFA1, rfa1-D228Y, that affects the Pif1/RPA interaction and showed using this allele that this interaction is implicated in the Pif1 recruitment at an induced double-strand break. Recently, a new role of Pif1 in the stability of G-quadruplex DNA during the leading strand replication has been described. pif1 cells show an instability about 56% of the human minisatellite CEB1 inserted on the leading strand. During my study of the Pif1/RPA interaction, I showed that the rfa1-D228Y mutant induced a similar instability of CEB1 minisatellite on the leading strand. We suggested that RPA would recruit Pif1 for many cellular processes such as DNA damage response or replication of secondary DNA structures such as G-Quadruplexes.In parallel, I have studied the role of the Set1 Histone methyltransferase which catalyse the methylation of the lysine 4 of histone H3, in the regulation of telomere length. I showed that the telomere shortening observed in set1 mutant is due to the loss of di- and tri-methylation of H3K4 while the loss of monomethylation has no effect. However, the short telomeres in set1∆ cells is not only due to the methylation defect shedding light on a new Set1 activity that remains to be fully characterized.. The SET1 deletion aggravates the telomere shortening of mutants which genes are involved in positive regulation of telomere length and conversely, aggravates the lengthening of mutants which genes are involved in negative regulation of telomere length. We postulated that inactivation of Set1 could affect at once activation of early-replication origins and leads to a telomere shortening, and affect synthesis of complementary strand in a context where this one is affected (mutant rif1) and leads to a telomere lengthening. A second hypothesis propose that Set1 would regulate TERRA transcription in cells with deprotected-telomere (rif mutant) leading to the lengthening of telomeres.

Le virus de la dengue cause une maladie de type grippal qui peut dans certains cas évoluer vers des fièvreshémorragiques mortelles. Mon projet de thèse porte sur la réplication de ce virus. Je focalise sur la compréhension du mécanisme d'action de la protéine NS5 de ce virus. La protéine contient 2 domaines : 1) domaine méthyltransférase, essentiel pour la traduction des protéines virales, 2) domaine polymérase, synthétisant le génome ARN du virus. Premièrement, nous avons démontré que la polymérase joue un rôle principal dans la conservation de l'extrémité 3' et 5' du génome et de l'anti-génome. Puis, j'ai caractérisé l'influence du domaine méthyltransférase sur l'activité polymérase de la protéine NS5. J'ai développé un système d'études mécanistiques en utilisant des techniques biochimiques de cinétique pré-stationnaire pour la protéine NS5, et obtenu des paramètres cinétiques et thermodynamiques de cette protéine envers ses substrats. Avec ce même système, j'ai pu tester des activités de la polymérase NS5 avec des ARN coiffés et triphosphates de différente longueur, mimant les séquences à l'extrémité 5' du génome du virus de la dengue. L'activité polymérase de NS5 est influencée par la présence de la coiffe de l'ARN, ce qui m'a permis de proposer une distance physique correspondant à environ 13 nucléotides entre les sites actifs domaines méthyltransférase et polymérase. Mes travaux ouvrent la voie à la détermination de la structure 3D de NS5 avec ses ARN et des nucléotides 5'-triphosphate.Elucider son mécanisme d'action, c'est être capable d'inhiber son action et donc de pouvoir proposer des molécules capables d'arrêter la prolifération virale lors d'une infection. / Dengue virus causes dengue fever, which may evolve towards life-threatening hemorrhagic fever. My research projectfocuses on dengue replication, and more precisely on the mechanism of NS5 at the molecular/atomic level. NS5 is a bifunctionalenzyme containing two domains: 1) a methyltransferase domain essential for translation of viral proteins, 2) apolymerase domain synthesizing the viral RNA genome. First, we demonstrated the main role of the polymerase in theconservation of 5' and 3' ends of dengue genome and anti-genome RNAs. Next, I showed the influence of themethyltransferase domain on the activity of the polymerase domain. I also developed a system allowing mechanistic studiesusing pre-steady state kinetics to characterize NS5 in depth. I have made use of this system to determine the catalyticparameters of NS5 towards its substrates. Using the same pre-steady state system, I was able to test the polymerase activityof NS5 with capped and uncapped 5'-triphosphate RNAs of different lengths corresponding to the 5'-end of the dengue RNAgenome. The polymerase activity of NS5 is significantly affected by the presence of the 5'-cap, which allowed me to designan experimental set-up pointing to a minimal physical distance of around 13 nucleotides between the methyltransferase andpolymerase active sites. My work will be useful to characterize the biophysics of NS5 in complex with its RNA and NTPsubstrates, and then to determine the crystal structure of such complex at play during viral RNA synthesis. Knowing thedetailed NS5 mechanism paves the way to inhibit its action and thus design drugs aiming at stopping a viral infection.

La lysyl oxydase-like 1 (LOXL1) est une enzyme nécessaire à la maturation des fibres élastiques dans matrice extra-cellulaire lors des processus de réparation tissulaire à l'âge adulte. Chez l'Homme, le niveau d'expression de LOXL1 dans les fibroblastes dermiques diminue avec l'âge contribuant ainsi au relâchement cutané. Dans la pathologie génétique cutis laxa, pouvant être considérée comme un modèle de vieillissement accéléré, le promoteur du gène loxl1 est la cible de méthylation au niveau de sites riches en cytosines et guanosines, appelés îlots CpG, ce qui empêche l'initiation de la transcription. Dans ce travail de thèse, d'une part, nous avons voulu savoir si le déficit en fibres élastiques au cours du vieillissement du derme humain pouvait être la conséquence de l'hyperméthylation de loxl1 ; et d'autre part, nous avons recherché des actifs végétaux capables de contrer ce mécanisme. Pour cela, nous avons testé des modèles de vieillissement in vitro afin de corréler la perte en fibres élastiques et l'hyperméthylation de loxl1. Une méthode d'analyse de la méthylation nous a permis de déceler l'hyperméthylation spécifique de loxl1 au cours du vieillissement chronologique. Des analyses transcriptomiques en PCR en temps réel, des expériences de précipitation de la chromatine ainsi que des analyses d'activités de promoteurs ont permis de mettre en évidence l'importance de l'ADN méthyltransférase 3a (DNMT3a) dans la régulation du promoteur loxl1. Cette enzyme a été clonée en système eucaryote et deux nouveaux partenaires ont été identifiés: la protein arginin methyltransferase 5 (PRMT5) et la methylosome protein 50 (MEP50). Enfin, ce mécanisme de régulation a été testé lors d'un criblage d'actifs végétaux à des fins cosmétiques. Nous avons trouvé deux actifs ayant la capacité de contrer de façon directe ou indirecte l'activité de la DNMT3a et de supprimer la méthylation de loxl1 dans des fibroblastes âgés / Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) is an enzyme required for the maturation of elastic fibres in the extracellular matrix during tissue repair process at adulthood. In human dermal fibroblasts, LOXL1 expression decreases with age, thus contributing to sagging skin. In the genetic disease cutis laxa, which can be regarded as a model of accelerated ageing, the loxl1 gene promoter has been shown to undergo DNA methylations in a cytosine-guanine rich region, known as CpG Island, which prevented the initiation of transcription. In this thesis, firstly, we wanted to know whether the deficit in elastic fibres in the dermis of human during ageing could be the result of loxl1 hypermethylation; and secondly, we sought plant extracts capable of counteracting this mechanism. Different in vitro ageing models were assessed to correlate the loss of elastic fibres and hypermethylation of loxl1. A particular methylation analysis method allowed us to identify specific hypermethylation of loxl1 during chronological ageing. Transcriptomic analyses by real-time PCR, precipitation of chromatin experiments and analysis of promoter activity led to highlight the importance of DNA methyltransferase 3a (DNMT3a) in the regulation of loxl1 promoter. This enzyme has been cloned in an eukaryotic system and two new partners have been identified: protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) and methylosome protein 50 (MEP50). Finally, this regulatory mechanism has been tested as a screening tool for cosmetic purposes. We selected two plant extracts with the ability to counteract, directly or indirectly, the activity of DNMT3a and remove methylation from loxl1 promoter in aged fibroblasts

Les médicaments thiopuriniques que sont l'azathioprine, la 6-mercaptopurine et la 6-thioguanine sont utilisés depuis des décennies pour leurs propriétés cytotoxiques et immunosuppressives dans le traitement de certaines leucémies, de maladies inflammatoires chroniques ou auto-immunes ainsi que dans la prévention du rejet de greffe. Certains patients, traités par des doses conventionnelles de ces molécules, développent cependant des effets indésirables parfois très sévères. Le déficit d'activité, d'origine génétique, de la thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), enzyme impliquée dans le métabolisme des thiopurines, constitue l'un des facteurs majeurs de la myélotoxicité de ces médicaments. La détermination du phénotype TPMT par génotypage, qui est une mesure préventive avant l'introduction d'un traitement thiopurinique, repose sur l'identification des mutations inactivatrices les plus fréquentes du gène TPMT. Une partie de ce travail a consisté en l'analyse fonctionnelle de quatre variants alléliques rares du gène TPMT dans un système d'expression hétérologue, la levure S. cerevisiae. Le caractère non-fonctionnel de deux d'entre eux a ainsi été démontré. Cependant, le déficit d'activité de la TPMT ne permet d'expliquer qu'environ 30 % des cas de myélotoxicité sous thiopurines, ce qui laisse supposer l'existence d'autres anomalies génétiques affectant d'autres gènes impliqués dans la réponse de l'organisme à ces molécules. Ainsi, nous avons étudié le polymorphisme génétique de deux autres protéines candidates, celui de l'inosine monophosphate déshydrogénase de type 2 (IMPDH2), enzyme-clé de la formation des métabolites actifs des thiopurines, et celui de la RhoGTPase RAC1, qui est l'une des cibles pharmacologiques de ces molécules. Certains des polymorphismes que nous avons identifiés dans ces deux gènes semblent affecter in vitro l'expression et/ou l'activité de ces protéines et pourraient, par conséquent, contribuer aux variations inter-individuelles de réponse aux thiopurines

TRBP (TAR RNA Binding Protein), est un facteur activateur de la réplication du Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Cette protéine cellulaire qui interagit avec les ARN double brins est connue pour son rôle crucial dans la voie des miRNA. Isolée pour sa capacité à interagir avec la séquence leader TAR présente à l'extrémité 5' de tous les ARN du VIH-1, TRBP favorise la réplication du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel, en partie via l'inhibition de la PKR (Protéine Kinase ARN dépendante).Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels TRBP facilite la réplication du VIH-1, le complexe protéique associé à TRBP a été purifié par immunoprécipitation par double affinité et identifié par spectrométrie de masse. En plus des facteurs déjà connus, un nouveau partenaire à activité ARN 2'-O-méthyltransférase (2'-OMTase) potentielle a été copurifié : la protéine FTSJ3. Chez les eucaryotes supérieurs, deux 2'-OMTases permettent la méthylation des ARNm cellulaires au niveau de la position ribose 2'-O- du premier (coiffe 1) et du deuxième nucléotide (coiffe 2). Cette coiffe 1/2 est une signature moléculaire permettant de discriminer les ARNm endogènes et exogènes. Dans la cellule, MDA5, un senseur cytoplasmique, reconnait les ARN exogènes non coiffés et déclenche la production d'interférons (IFNs) de type I pour établir un état antiviral. Pour échapper à la réponse immune innée, certains virus ont développé des mécanismes leur permettant de mimer une coiffe 1/2.Le VIH ne code pas pour une activité 2'-OMTase. Cependant FTSJ3, de par son interaction avec TRBP, se retrouve à proximité de l'extrémité 5' de l'ARN viral. Cette 2'-OMTase méthyle l'ARN TAR in vitro, qui, transfecté dans les cellules monocytaires humaines U937 n'induit plus la production d'IFNs de type I. A l'inverse, le virus VIH-1 produit en l'absence de FTSJ3 déclenche une induction de l'expression des IFNs de type I dépendante de MDA5 dans les cellules U937. L'expression de ce virus est atténuée suite à un défaut d'import nucléaire. Ainsi, ces travaux montrent que la protéine FTSJ3, recrutée au niveau de l'extrémité 5' de l'ARN du VIH-1 par TRBP, facilite la réplication du VIH-1 en assurant la synthèse d'une coiffe 1/2 qui permet au VIH-1 d'échapper à la reconnaissance par le senseur MDA5 et à l'induction des IFNs de type I. Cette étude met en évidence un nouveau mécanisme permettant au VIH-1 d'échapper à la détection par le système d'immunité innée cellulaire. / TRBP (TAR RNA Binding Protein) is a cellular RNA binding protein that facilitates the replication of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1). Isolated for its ability to bind HIV-1 TAR sequence present at the 5' end of all HIV-1 RNA, TRBP promotes HIV-1 replication at a post-transcriptional level by counteracting the antiviral activity of the protein kinase R (PKR).To gain more insight on how TRBP enhances HIV-1 replication, TRBP associated factors were purified using tandem immunoaffinity purification and identified by mass spectrometry. In addition to already known associated factors, a new protein with a putative RNA 2'-O-methyltransferase activity (2'OMTases) was copurified: FTSJ3. In higher eukaryotes, cellular mRNA are methylated on 2'-O ribose position on the first (Cap 1) and second nucleotide (Cap 2). This capping provides a molecular signature for the discrimination of endogenous versus exogenous mRNA. In the cell, MDA5, a cytoplasmic sensor, recognizes exogenous uncapped RNA and activate type I interferons (IFNs) production to establish an antiviral state. To evade innate immune response, some viruses have evolved mechanisms to mimics cap 1/2.HIV-1 does not encode a 2'O-MTase activity. However, owing to its interaction with TRBP, FTSJ3 is recruited at the 5' end of the viral genome and methylates TAR RNA in vitro. When capped by FTSJ3, TAR does not induce type I IFNs anymore when transfected in monocytic cell line U937. Conversely, HIV-1 viruses produced in FTSJ3 knock-down cells triggers type I IFNs expression through MDA5 sensing. This virus is attenuated, expressed in low amounts because of a block at the level of HIV-1 nuclear import. This study shows that FTSJ3 is recruited to HIV-1 5' end TAR sequence by TRBP and facilitates HIV-1 replication. HIV-1 RNA capping allows HIV-1 escape from MDA5 sensing and type I IFN induction. This study highlights a new way of HIV-1 escape from innate immune system.