Le gène NR4A2 est un membre de la super famille des récepteurs nucléaires qui sont des facteurs de transcription activés par un ligand, tel que hormone stéroïde, rétinoïde ou hormone thyroïdienne. Cependant au sein de cette super famille, un groupe de facteurs, dont NR4A2 fait parti, ne possèdent pas de ligand identifié, c’est pourquoi ils sont dits orphelins. Le récepteur NR4A2, qui est un gène à réponse immédiate, induit par différents stimuli, est largement exprimé dans le cerveau. La description de son expression pendant le développement chez la souris montre que sa distribution anatomique va de pair avec certains neurones à dopamine. Afin d’étudier sa fonction, des souris (NR4A2 -/-) ont été générées. L’analyse de ces souris a montrée que l’absence de ce gène altère le développement et le maintien des neurones dopaminergiques de la substance noire et de l’aire tegmentaire ventrale, ainsi que l’expression de plusieurs gènes marqueurs du phénotype dopaminergique. Ces résultats ont placés NR4A2, au rang des gènes d’intérêt dans l’étude de la neuro-dégénérescence des neurones dopaminergiques impliquée dans la maladie de Parkinson. Pourtant, la description de l’expression de ce facteur chez le poisson, montre, que bien qu’il soit exprimé dans des régions dopaminergiques, il est aussi largement exprimé dans des régions qui ne sont pas dopaminergiques. L’analyse de NR4A2 par perte de fonction transitoire chez le poisson Danio rerio, sujet de ce mémoire, a permit de mettre en évidence certains aspects inconnus des fonctions de ce récepteur nucléaire. Ainsi, le gène NR4A2 régule l’expression d’un gène inhibiteur de CDK et l’expression d’un inhibiteur de neurogenèse. Par ce biais NR4A2 régule l’expression de gènes dits proneuraux, car exprimés dans les progéniteurs des neurones. Ces gènes proneuraux sont connus pour participer à la spécification cellulaire, à la sous spécification et à la différenciation de plusieurs phénotypes neuronaux. Ainsi, le gène NR4A2 induit chez Danio rerio le phénotype dopaminergique, mais il participe aussi à l’induction du neuro-phénotype NPY, du neuro-phénotype sérotoninergique et du neuro-phénotype Gabaergique. Ces nouvelles données in vivo font de NR4A2 un acteur important de la neurogénèse dont le rôle s’avère beaucoup plus large que ce qui était supposé jusqu’à présent. / The gene NR4A2 is a member of the great family of the nuclear receptors which are factors of transcription activated by a ligand, such as hormone steroid, rétinoide or thyroid hormone. However within this great family, a group of factors, NR4A2 of which makes left, does not possess an identified ligand, this is why they are said orphans. The receptor NR4A2, an immediate early gene, induced by different stimuli, is widely expressed in the brain. The description of its expression during the development to the mouse shows that its anatomical distribution goes together with certain dopaminergics neurons. To study its function, mice (NR4A2-/-) were generated. The analysis of these mice showed that the absence of this gene alters the development and the preservation of dopaminergics neurons in substancia nigra and in ventral tegmental area, as well as the expression of several genes markers of the dopaminergic phenotype. These results placed NR4A2, to the rank of the genes of interest in the study of the neuro-degeneration of dopaminergics neurons involved in the Parkinson's disease. Nevertheless, the description of the expression of this factor in fish, shows, that although it is expressed in dopaminergics regions, it is also widely expressed in regions which are not dopaminergic. The analysis of NR4A2 by loss of function in the fish Danio rerio, the subject of this thesis, has allowed bringing to light certain unknown aspects of the functions of this orphan nuclear receptor. So, the gene NR4A2 regulates the expression of an inhibitive gene of CDK and the expression of an inhibitor of neurogenesis. By this way NR4A2 regulates the expression of said proneuraux genes, because expressed in neuron’s progenitors. These proneural genes are known to participate in the cellular specification, in sub-specification and in the differentiation of several neuronal phenotypes. So, the gene NR4A2 leads to the dopaminergic phenotype in Danio rerio, but it also participates in the induction of the neuro-phenotype NPY, the serotoninergic neuro-phenotype and the neuro-phenotype Gabaergique. These new in vivo data make of NR4A2 an important actor of the neurogenesis whose role turns out much wider than what was supposed until now.

Les mécanismes sous-tendant la neurodégénérescence aiguë (ischémie cérébrale) et chronique (maladie d'Alzheimer, maladie de Huntington, sclérose latérale amyotrophique), impliqueraient des altérations mitochondriales et des anomalies de transmission glutamatergique (excitotoxicité). La maladie de Huntington (MH) est caractérisée par une neurodégénérescence du striatum. Dans cette structure cérébrale, une diminution de l'activité du complexe II mitochondrial est observée chez les patients. Les mécanismes de la neurodégénérescence induite par l'inhibition du complexe II sont inconnus in vivo et nous les avons caractérisés dans un modèle de rat intoxiqué par l'acide 3-nitropropionique (3-NP). La calpaïne est la protéase majoritairement impliquée dans la mort striatale in vivo en parallèle d'une activation des caspases. De plus, les modèles murins transgéniques de la MH présentent une hyperactivation des récepteurs NMDA (R-NMDA). Les atteintes mitochondriales pourraient de manière synergique, potentialiser les effets toxiques de la dysfonction des R-NMDA. Cependant les mécanismes de cette synergie sont, in vivo, inconnus.<br />Dans la présente étude, nous avons cherché à comprendre comment la mort induite par l'injection intrastriatale de l'acide quinolinique (QA), agoniste des R-NMDA, était potentialisée par le 3-NP, inhibiteur du complexe II mitochondrial.<br />Le 3-NP subtoxique induit une potentialisation de la mort striatale lorsque l'inhibition du complexe II est supérieure à 35%. Le 3-NP seul (sans QA) produit des lésions au-delà de 50% d'inhibition. Entre 35 et 50% d'inhibition, l'utilisation de techniques biochimiques et immunohistochimiques, a permis de démontrer que le 3-NP potentialisait la mort excitotoxique par un facteur 10. Le mécanisme de la potentialisation met en jeu une activation importante de la calpaïne, protéase activée par le Ca2+. L'activation de la calpaïne traduit une élévation délétère de la concentration intracytoplasmique du Ca2+. L'origine du mécanisme calcique de la potentialisation excitotoxique par le 3-NP pouvait sous-tendre l'existence d'une hyperactivation des R-NMDA conduisant à une augmentation de l'influx calcique, et/ou une perturbation de l'homéostasie calcique. Le mécanisme d'augmentation de Ca2+ intracytoplasmique ne semble pas mettre en jeu une hyperactivation des R-NMDA. En effet, le 3-NP ne modifie pas l'entrée de glucose induite par le QA in vivo, ceci traduisant une activation similaire des R-NMDA avec ou sans 3-NP. De plus, l'entrée du 45Ca induite par le QA appliqué sur des cultures primaires de neurones striataux, n'est pas augmentée par le 3-NP, malgré un niveau de calcium intracellulaire augmenté, détecté par imagerie calcique. <br />D'après ces résultats, la potentialisation de mort induite par le QA lorsque le complexe II mitochondrial est inhibé, ne résulterait pas d'une entrée accrue de Ca2+ par les R-NMDA, mais résulterait plus probablement d'une incapacité des neurones à maintenir l'homéostasie calcique. Par ailleurs, la réduction de l'activité du complexe II mitochondrial combinée à l'excitotoxicité pourraient participer à la dégénérescence striatale dans la MH. Ainsi, l'homéostasie calcique constituerait une cible thérapeutique privilégiée.

Afin d'analyser le rôle de la plasticité striatale dans la perception temporelle, nous avons réalisé une étude comportementale et électrophysiologique d'un modèle rat transgénique de la maladie de Huntington impliquant la dégénérescence progressive du striatum. Pour ce faire, nous avons élaboré une étude longitudinale (4-15 mois) du suivi de la maladie de Huntington au niveau moteur, motivationnel et temporel, et une étude présymptomatique (4-5 mois) de l'estimation temporelle et électrophysiologique in vivo de la voie préfronto-striatale. Nous avons détecté un dysfonctionnement de la perception temporelle et de la plasticité synaptique de manière présymptomatique, suggérant une corrélation entre ces deux dysfonctionnements. En symptomatique, le comportement temporel discriminatif est plus fortement altéré, corrélat d'une dégénérescence du striatum.

La maladie de Huntington (HD) est une maladie génétique neurodégénérative qui touche environ 6000 personnes en France. Les manifestations psychiatriques sont une des composantes majeures des symptômes précoces de la pathologie. Ainsi, des épisodes dépressifs parfois associés à de l'anxiété généralisée sont communément observés au cours des stades pré-symptomatiques de la maladie. On connaît mal à l'heure actuelle les raisons de cette prévalence élevée. L'allèle responsable de la maladie code une protéine appelée huntingtine (HTT) dont l'expansion polyglutaminique (polyQ) en N-terminal est plus longue que dans la HTT non pathogénique. La huntingtine est impliquée dans diverses fonctions cellulaires et notamment dans le transport et l'expression d'un facteur neurotrophique, le Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). Celui-ci est d'ailleurs connu pour son rôle dans la régulation des troubles de l'humeur, de la neurogénèse hippocampique chez l'adulte, ainsi que dans la réponse thérapeutique aux antidépresseurs. Nous avons émis l'hypothèse que la huntingtine, en plus de ses rôles connus dans le cortex et le striatum, puisse jouer également un rôle dans l'hippocampe. Ainsi, une altération du transport de BDNF dans l'hippocampe pourrait en partie expliquer les troubles de l'humeur observés chez les patients HD.Par une approche in vivo, en utilisant différents modèles de souris, nous avons ainsi démontré que la huntingtine stimule le trafic vésiculaire et la sécrétion de BDNF dans les neurones hippocampiques et que cette action peut être modulée par la mutation polyQ ou par le statut de phosphorylation de la protéine sur les sérines 1181 et 1201. Cela aboutit à des modifications des voies de signalisation (Akt, ERK, CREB) activées par le BDNF. Nous mettons également en évidence que la huntingtine sauvage est impliquée dans le soutien exercé par les neurones matures sur les nouveaux neurones, nécessaire à leur survie à long terme et à la formation d'une arborisation dendritique complexe. Le BDNF est l'intermédiaire idéal grâce à ses effets sur la neurogenèse hippocampique. Enfin, la huntingtine sauvage et ses formes mutées (polyQ et phosphorylation sur les sérines 1181 et 1201) sont impliquées dans le comportement anxio-dépressif des souris.

La distribution en taille, la concentration, ou la séquence des fragments d’ADN circulants dans le sang sont autant d’informations analytiques exploitables pour les cliniciens ou les spécialistes de la biologie moléculaire. Par exemple, l’ADN circulant, issu de cellules tumorales, peut servir de biomarqueur pour la détection et le suivi du cancer. L’accès à ces informations est d’autant plus difficile que la quantité d’ADN dans l’échantillon est faible. En pratique, pour atteindre des niveaux de sensibilité adaptés, la détection et l’analyse de résidus d’ADN requiert le développement et l’association de technologies d’analyses de type électrophorèse aux techniques de la biologie moléculaire telles que l’amplification PCR. Dans la perspective de simplifier et d’accélérer les procédures, nous avons développé et optimisé µLAS, un système microfluidique pour la concentration, la séparation et la détection simultanée de l’ADN résiduel. µLAS a ensuite été appliqué au diagnostic de la maladie de Huntington et à l’analyse de l’ADN résiduel circulant dans le sang. La maladie de Huntington, causée par l’expansion de répétitions CAG/CTG sur le gène Huntingtin, est à l’origine d’une dégénérescence neurologique. Le diagnostic de la maladie de Huntington consiste à amplifier et à mesurer la taille de cette expansion. L’amplification de répétitions trinucléotidiques étant peu fiable, nous profitons de la sensibilité de µLAS, pour réduire le nombre de cycles d’amplification, et donc le temps d’analyse. Par ailleurs, pour l’analyse sensible de l’ADN circulant par µLAS, nous avons proposé une approche originale, visant à réduire les manipulations pré-analytiques de l’échantillon sanguin à une simple digestion enzymatique suivie d’une centrifugation. Enfin le développement d’une fonction de détection spécifique de séquence a été réalisée par concentration sélective d’une cible d’intérêt hybridée à une sonde. Cette approche qui utilise des sondes marquées en fluorescence en volume, a notamment fait l’objet d’un brevet. / DNA fragments are circulating in the bloodstream. Circulating DNA fragments size, concentration or sequence are analytical information for the clinician or the molecular biology specialists. For instance, circulating DNA, stem from tumoral cells, can serve as biomarkers for cancer detection and follow up. Collecting those information may be difficult for samples presenting minute amount of DNA. In practice, detecting and analyzing residual DNA, with the relevant level of sensitivity, ask for the development and the association of analytical technologies, such as electrophoresis, to molecular biology techniques, such as PCR amplification. In the prospect of simplifying and speeding up the processes, we have developed and optimized µLAS, a microfluidic system for the simultaneous concentration, separation and detection of residual DNA. Furthermore, µLAS has been applied to the diagnostic of Huntington’s disease and the analysis of residual DNA circulating in the bloodstream. Huntington’s disease, is caused by the expansion of CAG/CTG repeats on the Huntingtin gene, and provoke neurological degeneration. The diagnostic of Huntington’s disease consist in amplifying and measuring this expansion. As the amplification of trinucleotide repeat is far from reliable, we benefit from µLAS sensitivity to reduce the number of amplification cycles, and the time to result. Additionally, for the sensitive analysis of circulating DNA by µLAS, we have proposed an original approach, aiming to reduce the blood sample pre-analytical steps to a simple enzymatic digestion followed by a centrifugation step. Finally, the development of a function for the detection of specific sequences has been made by the selective concentration of a target of interest hybridized to a probe. This approach which use some probes fluorescently labelled in volume, has been patented.

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle pas de traitement curatif. Afin de récolter des données cliniques, économiques et de qualité de vie, une étude internationale transversale, l’Euro-HDB (pour European Huntington’s Disease Burden) a été mise en place en France, Italie, Etats-Unis, Pologne, Allemagne et en Espagne. Un ensemble de questionnaires a été développé à l’occasion de cette étude. Cette thèse se focalise sur le développement et la validation de deux questionnaires spécifiques : un questionnaire de qualité de vie nommé H-QoL-I (pour Huntington Quality of life Instrument) et un questionnaire clinimétrique nommé H-CSRI (pour Huntington Clinical self-reported instrument). Des groupes de discussion et des entretiens semi-structurés avec des patients atteints de la maladie de Huntington, des aidants et des professionnels de santé spécialisés ont permis d’établir le cadre conceptuel et le développement de la première version de l’instrument de mesure de qualité de vie. Le questionnaire clinimétrique est une adaptation sous forme auto-reporté d’un outil standard habituellement utilisé par les cliniciens pour évaluer le statut clinique du patient (l’UHDRS). La théorie classique des tests et la théorie de réponse aux items sont employées pour l’évaluation des propriétés psychométriques (validité et fiabilité).Globalement, les deux outils ont démontré de bonnes propriétés psychométriques et une bonne validité transculturelle. H-QoL-I et HCSR-I sont désormais des outils disponibles et sont un moyen validé pour suivre la progression de la maladie du patient. / Huntington's disease is a neurological disease for which there is presently no cure. Huntington’s disease causes gradual physical, emotional and cognitive deterioration. In order to collect clinical, economic and quality of life data, an international cross-sectional study called the Euro-HDB (for European Huntington’s Disease Burden) was set in France, Italy, the United Sates, Poland, Germany and Spain. A set of questionnaires has been developed for that data collection. This thesis focus on the development and the validation of two specific questionnaires: a quality of life questionnaire named H-QoL-I (for Huntington Quality of life Instrument) and a clinimetric questionnaire named H-CSRI (for Huntington Clinical self-reported instrument). Discussion groups and semi-structured interviews with Huntington’s disease patients, caregivers and specialised health professionals allowed to establish the conceptual framework and the development of the first version of the questionnaire of quality of life. The clinimetric questionnaire was an adaptation to allow self-reporting of a tool usually used by clinicians to evaluate the clinical status of the patient (the UHDRS). Both classical test theory and item response theory were used to assess the psychometric properties of the questionnaires (validity and reliability). Globally, both tools demonstrated good psychometric properties and a good cross-cultural validity. H-QoL-I and H-CSRI are now available and are a validated mean to follow patient's disease progression.

La maladie de Huntington est neurodégénérative, génétique, rare, multifacette et de durée d'évolution longue, induisant une grande. Les biothérapies en cours d'essai sont réalisées sur des petits effectifs, avec un effet mesurable à long terme et hétérogène. Identifier des marqueurs d'évolution de la maladie et de réponse au traitement permettrait de mieux comprendre et d'améliorer les résultats des futurs essais cliniques. Nous avons développé une méthode de clustering pour l'efficacité d'un traitement dans le cadre de données longitudinales afin de définir des répondeurs et non répondeurs au traitement. Notre méthode, robuste pour les petits effectifs, combine un modèle linéaire mixte à deux pentes et un algorithme de clustering. Le modèle mixte génère des effets aléatoires, associés à la réponse au traitement, propres à chaque patient. L'algorithme de clustering permet de définir des sous-groupes selon la valeur des effets aléatoires. Trouver des sous-groupes de patients répondeurs permet de définir des marqueurs prédictifs de la réponse au traitement qui seront utilisés pour donner le traitement le mieux adapté à chaque patient. Nous avons discuté de l'intégration (i) des marqueurs prédictifs dans les plans expérimentaux des essais cliniques, en évaluant leur impact sur la puissance de l'étude; et (ii) des marqueurs pronostiques, en étudiant l¿impact du polymorphisme COMT sur le déclin cognitif des patients. Enfin, nous avons évalué l'effet d'apprentissage des tests neuropsychologiques, et montré comment une double évaluation à l'inclusion dans un essai clinique permettait de s'en affranchir quand le critère de jugement principal est le déclin cognitif. / Huntington's disease is neurodegenerative, genetic, rare, multifaceted and has a long evolution, inducing heterogeneity of conditions and progression of the disease. Current biotherapy trials are performed on small samples of patients, with a treatment effect measurable in the long-term that is heterogeneous. Identifying markers of the disease progression and of the treatment response may help to better understand and improve results of biotherapy studies in Huntington's disease. We have developed a clustering method for the treatment efficacy in the case of longitudinal data in order to identify treatment responders and nonresponders. Our method combines a linear mixed model with two slopes and a classical clustering algorithm. The mixed model generates random effects associated with treatment response, specific to each patient. The clustering algorithm is used to define subgroups according to the value of the random effects. Our method is robust in case of small samples. Finding subgroups of responders may help to define predictive markers of treatment response which will be used to give the most appropriate treatment for each patient. We discussed integration of (i) the predictive markers in study design of future clinical trials, assessing their impact on the power of the study; and (ii) the prognostic markers of disease progression by studying the COMT polymorphism as a prognostic marker of cognitive decline in Huntington's disease. Finally, we evaluated the learning effect of neuropsychological tasks measuring cognitive abilities, and showed how a double baseline in a clinical trial could take it into account when the primary outcome is the cognitive decline.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative avec une transmission dominante, qui entraîne la mort dans les 15 à 20 ans suivant les premiers signes pathologiques. Le gène muté dans la MH contient une répétition de trinucléotide CAG instable qui code pour une expansion de polyglutamine (polyQ) dans la protéine huntingtine (HTT). Lorsque le gène code pour une protéine avec plus de 35 glutamines, il déclenche un dysfonction puis une mort neuronale notamment dans le striatum et le cortex, entrainant l'apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs. HTT est exprimée dans de nombreux tissus et est impliquée dans diverses fonctions cellulaires. Il est admis que dans la MH, l'expansion polyQ conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, mais également à une perte des fonctions neuroprotectrices de HTT sauvage. Avant même l'apparition des premiers symptômes, des dysfonctions existent au sein du réseau neuronal corticostriatal. Cependant, les études in vivo des dysfonctions précoces au sein de ce réseau sont techniquement difficiles à l’échelle cellulaire.Le premier enjeu de ma thèse a été de reconstituer et de caractériser in vitro le réseau corticostriatal. Pour cela nous avons utilisé une plateforme microfluidique, compatible avec de la vidéomicroscopie haute résolution, dans laquelle chaque compartiment est identifié et où la progression de la croissance axonale à la formation des synapses est régulée. Nous avons observé des défauts majeurs au sein des différents compartiments du réseau corticostriatal, de la dynamique présynaptique à des défauts de structure et de transmission synaptiques, ainsi que des dysfonctions du trafic et des voies de signalisation post-synaptique. De manière intéressante, nous avons montré que le statut génétique du compartiment présynaptique était nécessaire et suffisant pour altérer ou restaurer le réseau corticostriatal.Le second aspect de ma thèse a été d’étudier la dynamique intracellulaire, depuis le réticulum endoplasmique jusqu’au compartiment final, au sein de cellules modèles de la MH. Pour cela nous avons utilisés le système RUSH (Retention Using Selective Hooks) couplé à une molécule utilisant la voie standard de biosynthèse des protéines. Au sein de cellules modèles de la MH, la dynamique intracellulaire est perturbée. L’utilisation de molécules inhibitrices d’une classe d’enzyme au sein de cellules modèles de la MH, est capable de restaurer une dynamique intracellulaire. En particulier, grâce au système microfluidique, nous avons montré qu’une molécule a la capacité de restaurer un réseau corticostriatal sauvage. Les études pharmacologiques de passage ont montré que cette molécule a un haut pouvoir de passage de la barrière hémato encéphalique. Le traitement pendant un mois de souris modèles de la MH et l’analyse de leur coordination motrice et de leur état anxiodépressif suggère que cette molécule est capable d’améliorer les symptômes chez les souris MH.Ces travaux ont permis de mettre en évidence 1/ l’importance du cortex comme région d’intérêt thérapeutique dans la MH, et 2/ le trafic de protéines comme une nouvelle cible thérapeutique. / Huntington Disease (HD) is a mid-life onset inherited neurodegenerative disorder that leads to death within 15 to 20 years after appearance of the first symptoms. The defective gene in HD contains an unstable trinuocleotide CAG repeat which encodes for a polyglutamine stretch (polyQ) in the huntingtin (HTT) protein. When the number of glutamines coded by the gene exceeds 35 repeats, it triggers neuronal dysfunction and death, affecting in particular the striatum and the cortex, causing cognitive, psychiatric, and motor symptoms. HTT is widely expressed and it is involved in numerous functions. In HD, it is accepted that, the polyQ strech leads to a gain of toxic functions, and converselyto a loss of neuroprotective functions of wild-type HTT. Long before the appearance of the first symptoms, dysfunctions exist within the corticostriatal neuronal network. However, in vivo studies of early cell dysfunction in this network are technically difficult, especially at the subcellular resolution.The first objective of my thesis was to reconstitute and characterize the corticostriatal network in vitro. We used a microfluidic device in which each neuronal compartment is identified and in which the progression from axonal growth to synapse regulation is controlled. We observed major defects in the different compartments of the corticostriatal circuit, from presynaptic dynamics to synaptic structure and transmission and to postsynaptic traffic and signaling. Importantly, the genetic status of the presynaptic compartment was necessary and sufficient to alter or restore the circuit.The second aspect of my thesis was to study the intracellular dynamics, from the endoplasmic reticulum to the final compartment, in cellular models of HD. For this we used the RUSH system (Retention Using Selective Hooks) coupled to a molecule using the standard pathway of protein biosynthesis. In cellular models of HD, intracellular dynamics are disrupted. We found that molecules targeting enzyme protein trafficking restore intracellular dynamics in HD cells. In particular, thanks to the microfluidic system, we showed that a given molecule has the capacity to restore a HD mutant corticostriatal network. Pharmacological studies showed that this molecule has a high power of passage of the blood brain barrier. One month treatment of HD mouse models and their behavioral tests for motor and anxiety-depressive symptoms suggest that the molecule is able to ameliorate symptoms.These studies made it possible to highlight 1 / the importance of the cortex as a key region of therapeutic interest in HD, and 2 / protein trafficking as a new therapeutic target in HD.

La maladie de Huntington (MH) est causée par une expansion de répétitions CAG sur l’exon 1 du gène huntingtine (htt), codant pour une protéine mutée. Il a été montré que la diminution d’expression de cette protéine est une piste thérapeutique très prometteuse. Dans ce projet, nous avons étudié et comparé trois approches dites «antisens» : une stratégie allèle non-spécifique, visant à diminuer de manière générale l’expression de htt ; une stratégie allèle spécifique ciblant les répétitions CAG afin d’impacter préférentiellement l’allèle muté ; et enfin une stratégie de saut d’exon permettant d’enlever des sites de clivage à l’origine d’une forme raccourcie et toxique de la protéine htt. Nous avons évalué ces approches grâce à deux outils différents : les tricyclo-DNA (TcDNA), qui sont une nouvelle classe d’oligonucléotides antisens (AON) plus performante que les chimies précédentes, et le système U7snRNA vectorisé, permettant d’induire une expression stable des séquences antisens. Dans un premier temps, ces différentes molécules ont été évaluées in vitro dans des lignées de fibroblastes de patients en quantifiant le niveau d’ARNm et de protéines htt par RTqPCR et Western blot respectivement. Par la suite, les séquences les plus efficaces in vitro ont été sélectionnées et les AON et AAV-U7snRNA correspondants ont été injectés en intracérébroventriculaire (ICV) dans un modèle murin de la MH (souris YAC128). Les résultats les plus encourageants ont été obtenus avec le TcDNA-NS (pour allèle Non Spécifique), permettant une diminution significative de l’expression de htt dans le cortex, l’hippocampe et le striatum 2 et 6 semaines après une injection ICV. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel des TcDNA comme nouvel outil thérapeutique pour la MH. / Huntington’s disease (HD) is caused by a CAG repeat expansion in the exon 1 of huntingtin gene (htt), encoding for a mutant protein. It has been shown that the silencing/down regulation of huntingtin protein is a promising therapeutic lead. In this project, I have explored and compared three strategies using the antisense approach: a non-allele specific strategy, aiming to silence the global expression of htt; an allele specific strategy targeting CAG repeats to silence preferentially the mutant allele; and an exon-skipping strategy in order to remove cleavage sites which originally cause a shorter and toxic form of the htt protein. These strategies have been evaluated using two different tools: tricyclo-DNA (TcDNA), a new class of antisense oligonucleotides (AON) more efficient than the previous chemistries, and a vectorized approach using U7snRNA system allowing a stable expression of antisense sequences. Firstly, these different molecules have been assessed in vitro in HD fibroblasts quantifying mRNA and htt protein levels with RTqPCR and Western blot respectively. Subsequently, the most efficient sequences have been selected and intracerebroventricular (ICV) injections have been performed with corresponding AON and AAV-U7snRNA in a HD mouse model (YAC128). The most encouraging results have been obtained with the TcDNA-NS (for Non Specific allele), allowing a significant decrease of htt expression in cortex, hippocampus and striatum 2 and 6 weeks after ICV injection. These promising results suggest the potential of TcDNA as a new therapeutic tool for HD.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les récepteurs du glutamate sont impliqués dans les maladies neurodégénératives telles que le dommage cérébral caractéristique des maladies de Huntington, Alzheimer et Parkinson, en plus d'être associés à l'ischémie, aux traumatismes crâniens, à l'encéphalopathie liée au SIDA et à l'épilepsie. Ils sont donc importants dans les mécanismes du système nerveux central et son bon fonctionnement. Parmi les récepteurs du glutamate, on retrouve le récepteur kaïnate. Ce mémoire présente une nouvelle approche synthétique des kaïnoïdes et la synthèse de trois nouveaux analogues des kaïnoïdes à partir de la trans-4-hydroxyproline. Les étapes comprennent la protection du carbonyle et de l'amine, l'oxydation de l'alcool, l'alkylation régiospécifique de la cétone en position 3, la formation d'un énol triflique, le couplage à un acide arylboronique et enfin la déprotection pour obtenir les acides (2S)-A-arylkaïniques. Les trois kaïnoïdes générés varient par le groupement aryle qui est soit le phényle, le 2-méthoxyphényle ou le 2-naphtyle.