A matriz extracelular e as células musculares lisas das vias aéreas estão intimamente interrelacionadas. Poucos estudos porém, avaliaram a composição dos diferentes componentes da matriz extracelular e seus reguladores na camada do músculo liso brônquico na asma. Utilizando um programa de análise de imagens, a área fracionada do colágeno total e das fibras elásticas foi quantificada no interior do músculo liso brônquico de 35 indivíduos que faleceram devido a um ataque de asma (Asma Fatal), e comparada com 10 casos de indivíduos com asma e que faleceram de outras causas (Asma Não Fatal), e com 22 indivíduos controles sem patologia pulmonar. Expressão dos colágenos I e III, fibronectina, versicam, metaloprotease (MMP)-1, 2, 9 e 12, e inibidores de metaloprotease 1 e 2 foram quantificados no interior do músculo liso brônquico de 22 casos de asma fatal e 10 controles. Nas grandes vias aéreas dos casos de asma fatal, a área fracionada das fibras elásticas foi significativamente maior na camada do músculo liso brônquico quando comparada com os grupos de Asma Não Fatal e Controle. Semelhantemente, fibronectina, MMP-9 e MMP-12 estavam aumentadas no músculo liso das grandes vias aéreas nos casos de asma fatal quando comparadas aos controles. Apenas aumento das fibras elásticas foi observado nas pequenas vias aéreas na Asma Fatal, e somente quando comparadas aos casos de Asma Não Fatal. O conjunto dos resultados mostra que há uma composição alterada dos elementos da matriz extracelular e um ambiente de degradação protéica no músculo liso brônquico de indivíduos que morreram por asma, o qual pode acarretar importantes conseqüências nas funções sintéticas e mecânicas do músculo liso das vias áreas. / There is an intimate relationship between the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle cells within the airways. Few studies have comprehensively assessed the composition of different ECM components and its regulators within the airway smooth muscle (ASM) in asthma. With the aid of image analysis, the fractional area of total collagen and elastic fibres was quantified within the ASM of 35 subjects with Fatal Asthma (FA) and compared with 10 Nonfatal Asthma (NFA) patients and 22 nonasthmatic control cases. Expression of collagen I and III, fibronectin, versican, matrix metalloprotease (MMP)-1, 2, 9 and 12 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 and 2 was quantified within the ASM in 22 FA and 10 control cases. In the large airways of FA cases, the fractional area of elastic fibres within the ASM was increased compared with NFA and controls. Similarly, fibronectin, MMP-9 and MMP-12 were increased within the ASM in large airways of FA cases compared with controls. Elastic fibres were increased in small airways in FA only in comparison with NFA cases. The results shower that, there is altered extracellular matrix composition and a degradative environment within the airway smooth muscle in fatal asthma patients, which may have important consequences for the mechanical and synthetic functions of airway smooth muscle.

Durante a gestação, em varias espécies de mamíferos, os fibroblastos endometriais são alvos de profundas modificações morfofuncionais que levam a aquisição de um fenótipo epitelial e à expressão de novas moléculas, formando uma nova estrutura no útero denominada decídua. Em camundongos, a reação decidual pode ser estimulada artificialmente (na ausência de embrião), resultando na formação do deciduoma, um modelo de grande relevância para a identificação de fatores oriundos ou não do embrião necessários para a promoção da decidualização. A decidualização também promove uma profunda remodelação da matriz extracelular (MEC) do endométrio, e ambos os processo são fundamentais para o sucesso da gestação. Existem evidencias, muitas das quais são oriundas dos estudos do Laboratório de Biologia da Reprodução e Matriz extracelular (LBR-MEC), mostrando que a remodelação da MEC do útero não grávido é modulada pelos hormônios ovarianos estrógeno (E2) e progesterona (P4). Faltam, entretanto, na literatura, estudos consistentes sobre a regulação da MEC endometrial na ausência de sinais parácrinos provenientes do embrião. Além disso, não se conhece detalhes sobre a ação dos hormônios ovarianos sobre a produção de componentes da MEC por células deciduais. Nesse contexto, o presente estudo teve dois objetivos centrais: (i) caracterizar por imuno-histoquímica a composição e organização da MEC durante o desenvolvimento do deciduoma, (ii) estudar por qPCR, Western blot, e imunolocalização o efeito dos hormônios E2 e Medroxiprogesterona (MPA) na dinâmica da expressão de RNAm, síntese e secreção de moléculas da MEC em culturas primárias de células obtidas de deciduoma. Observamos que, a distribuição do colágeno tipo I, III, IV, V e dos proteoglicanos decorim, biglicam e versicam no deciduoma, foi semelhante ao já observado na decídua. As análises in vitro, mostram que o hormônio E2 aumenta a expressão gênica, a síntese e a deposição de decorim enquanto o MPA tem como alvo o biglicam. Ambos hormônios modulam a expressão de desmina, um marcador de decidualização. O presente estudo também mostra que o padrão de remodelação das moléculas alvo do presente estudo, é similar ao observado durante a decidualização da gestação normal, Conclui-se, portanto, que a remodelação da MEC é um evento intrínseco do processo de decidualização quer na gestação quer na pseudogestação. Ou seja, não foram identificadas diferenças que indicassem a existência de controle pelo embrião. Mostramos ainda que, in vitro, os hormônios E2 e MPA regulam de modo específico a expressão gênica e a secreção do proteoglicanos decorim e biglicam. / During pregnancy in several species of mammals, including humans and mice, endometrial fibroblasts undergo extensive morphofunctional changes acquiring an epithelial phenotype. Those new cells form a new structure in the uterus called decidua. In mice, the decidual reaction can be artificially induced in pseudopregnant females resulting in the formation of a structure morphologically similar to the decidua called deciduoma, a relevant model to study the putative role of the embryo upon decidualization. Endometrial decidualization is an essential event for the success of pregnancy. A notable remodeling of the extracellular matrix (ECM) organization and molecular composition occurs during this process. There are evidences, many of them coming from studies of the Laboratory of Reproductive and Extracellular Matrix Biology (LBR-MEC), that estrogen (E2) and progesterone (P4) modulate the remodeling of the uterine ECM. Nevertheless, there is no consistent information about the role, if it exists, of the embryo on the regulation of the endometrial ECM. Furthermore, it was not yet clarified how the ovarian hormones act on the production of ECM components by decidual cells. Thus, the objective of present study was to identify the composition and organization of the ECM during the development of the mouse deciduoma; and to study by qPCR, Western blot and immunolocalization methods, the effect of hormones E2 and medroxiprogesterone (MPA) on synthesis and secretion of ECM molecules by primary cultures of mouse decidual cells obtained from deciduoma. We found that the distribution of collagen types I, III, IV, V and proteoglycans decorin, biglycan and versican in deciduoma, was similar to that previously observed in the decidua. The in vitro assays showed E2 increases the gene expression for the core protein of Decorin, while MPA increases the expression of the core protein of Biglycan. In addition, was observed that both hormones increase the expression of desmin a marker of decidualization. These results showed that in the endometrium of both pregnant and pseudopregnant animals ECM molecules such as collagens and proteoglycans are similarly modulated by ovarian hormones. At from the present study we may conclude that ECM remodeling is an intrinsic event that happens during decidualization modulated by E2 and MPA and this modualation independ of the presence of the embryo in the uterus. In adition we showed that in decidual cells in vitro the gene expression and the secretion of proteoglycans decorin and biglycan are differentially regulated by hormones E2 and MPA.

Tese de mestrado integrado. Bioengenharia. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia.. 2011

A busca por técnicas alternativas para suprir a escassez de tecidos e órgãos danificados levou ao surgimento da engenharia de tecidos. Scaffolds biológicos criados a partir da matriz extracelular (MEC) de órgãos e tecidos tem sido uma promissora ferramenta aplicada para suprir esta necessidade. A matriz extracelular placentária descelularizada surge como uma potencial ferramenta para a produção de scaffolds biológicos para recelularização e implantação em áreas lesionadas. Para ser classificado como um scaffolds biológico ideal, a matriz extracelular deve ser acelular e ter preservada suas proteínas e características físicas para viabilizar a adesão celular. Neste contexto, desenvolvemos o scaffolds biológico descelularizado a partir de placentas caninas com 35 e 40 dias de gestação. A eficiência da descelularização foi confirmada pela ausência de conteúdo celular e quantidade de DNA remanescente. A arquitetura vascular e as proteínas da matriz extracelular, tais como, colágenos tipo I, III e IV, laminina e fibronectina, foram preservadas. Para o processo de recelularização, utilizamos células-tronco progenitoras endoteliais derivadas do saco vitelino canino (SVC) e células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas de medula óssea canina (CMOC) e de polpa de dente canina (CPDC). O processo de recelularização em placas não aderentes por 7 e 14 dias, na presença do scaffolds placentário secos em ponto crítico auxiliou na eficiência da recelularização, comprovada por imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura, evidenciando a adesão das células no scaffolds e comprovando ser um promissor biomaterial para utilização na medicina regenerativa tecidual. / The search for alternative techniques to address the scarcity of damaged tissues and organs has led to the emergence of tissue engineering. Biological scaffolds created from the extracellular matrix (ECM) of organs and tissues have been a promising applied tool to meet this need. The decellularized placental extracellular matrix appears as a potential tool for the production of biological scaffolds for recellularization and implantation in injured areas. To be classified as an ideal biological scaffold, the extracellular matrix must be acellular and have preserved its proteins and physical characteristics to enable cell adhesion. In this context, we developed the biological scaffold decellularized from canine placentas with 35 and 40 days of gestation. The efficiency of the decellularization was confirmed by the absence of cellular content and amount of DNA remaining. Vascular architecture and extracellular matrix proteins, such as collagens type I, III and IV, laminin and fibronectin, have been preserved. For the process of recellularization, we used stem cells derived from the canine yolk sac (CYSC) and mesenchymal stem cells (MSCs) derived from canine bone marrow (CBMC) and canine dental pulp (CDPC). The process of recellularization in non-adherent plaques for 7 and 14 days in the presence of placental scaffold dried at a critical point assisted in the efficiency of the recellularization, evidenced by immunocytochemistry and scanning electron microscopy, evidencing the adhesion of the cells in the scaffold and proving to be a promising biomaterial for use in tissue regenerative medicine.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas / The purpose of this study was to investigate the role of cells proliferation and extracellular matrix components expression in the process of bone fracture repair. To do so it used histological techniques, immunohistochemistry and morphometric analysis as well as a standardized experimental model for the induction of injury to the tibia of rats as proposed by Yuehuei and Friedman7. It is important to standardize a model of fracture induction for further investigation of the involvement of cells and extracellular matrix components in the fracture repair process, whereas the healing time depends significantly on the nature and type of lesion produced. Forty (n = 40) Wistar rats were subjected to fracture. The animals were divided into eight (n = 8) groups of five (n = 5). Each subgroup was observed after 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 and 240 hours of fracture (12 to 10 days). Immediately afterwards, the fractures were classified according to the system of international classification of fracture by Muller100, AO (Association for Osteosynthesis). Simple fractures were found in 86% of the total, among them, 68% were transverse and 18% were oblique. Complex fractures were found in 14% of the cases, among them 8% were irregular and 6% were segmental. These results demonstrated that the device enables researchers to standardize the type of fracture by X-ray, marked by the line separating the bone fragments. The qualitative results of the cells and extracellular matrix components of TGF-β, VEGF, PCNA, collagen I and II, osteopontin, proteoglycans, elastic fibers system with resorcin funcsin of Weigert, as well as the morphometric results suggest that the repair process of the fracture is not homogeneous for all components. Expression of the extracellular matrix components and cell proliferation modulation significantly depends on the local stresses generated by the type of the fracture. Such type can be decisive in determining time duration for bone regeneration and quality of the biomechanical properties restoration. Our findings may contribute to better understanding of bone fracture repair and for new therapeutic approaches that consider the biomechanical properties of bone tissue in repair in its different stages

Orientador: Marilza Vieira Cunha Rudge / Coorientador: Angélica Mércia Pascon Barbosa / Coorientador: Débora Cristina Damasceno / Banca: Maeli Dal Pai / Banca: José Tadeu Nunes Tamanini / Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Marlise Inês Klein / Resumo: A cárie representa a doença humana mais prevalente no mundo, sua etiologia é dependente de biofilme e da dieta. Os biofilmes são comunidades altamente dinâmicas e estruturadas de células microbianas que se encontram embebidas em uma matriz extracelular tridimensional (MEC). Esta estrutura age como uma barreira que limita a difusão e fornece estabilidade e proteção aos microrganismos. Streptococcus mutans tem um potencial acidogênico e acidúrico, orquestra a construção do biofilme e modula sua virulência, produzindo ácidos lipoteicóicos (LTA), DNA extracelular (eDNA) e exopolissacarídeos (EPS), promovendo assim a adesão e coesão microbiana. Ao mesmo tempo a MEC produzida dificulta a difusão de metabólitos no biofilme. O objetivo do estudo foi determinar por meio de RT-qPCR a dinâmica da expressão de genes de S. mutans associados ao metabolismo de LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) e exopolissacarídeos (gtfBCD, gbpB, dexA), durante o desenvolvimento da MEC de biofilmes mistos em um estudo longitudinal. Biofilmes mistos de S. mutans UA159 (cepa parental) ou ΔgtfB (mutante com deleção do gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 e Streptococcus gordonii DL-1 foram formados em discos de hidroxiapatita revestidos de película salivar, e cultivados a 37° C e 5% de CO2 em caldo triptona e extrato de levedura contendo 25% de saliva e alternando 0,1% de sacarose (escassez) e 0,5% de sacarose + 1% de amido (abundância). O pH do meio de cultura manteve-se ácido durante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dental caries represents the most prevalent human disease worldwide, its etiology is biofilm-diet dependent. Biofilms are highly dynamic and structured communities of microbial cells that are enmeshed in a three-dimensional extracellular matrix (ECM). This structure acts as a diffusion-limiting barrier providing stability and protection to the microorganisms. Streptococcus mutans is acidogenic, aciduric, and orchestrates the biofilm build-up process. It modulates the biofilm’s virulence by producing lipoteichoic acids (LTA), extracellular DNA (eDNA) and exopolysaccharides (EPS), thereby promoting microbial adhesion and cohesion. The resulting ECM hinders diffusion in the biofilm. The aim of the study was to determine via RT-qPCR the dynamics of expression of S. mutans genes associated with LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) and exopolysaccharides (gtfBCD, gbpB, dexA) metabolism, during ECM development in mixed-species biofilm by time-lapse studies. Mixed-species biofilms of S. mutans UA159 (parental strain) or ΔgtfB (mutant with deletion of the gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 and Streptocsoccus gordonii DL-1 were formed onto saliva-coated hydroxyapatite discs. These biofilms were cultivated at 37°C and 5% CO2 in triptone with yeast extract containing saliva 25% and alternating 0.1% sucrose (scarcity) and 0.5% sucrose + 1% starch (abundance). The pH of the spent media remained acid during the experimental periods, and was lower after prolonged inc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Abstract: Biofilmes formados por Candida estão relacionados a infecções bucais, como a candidíase. Embora a resistência do biofilme seja multifatorial, a proteção exercida por sua matriz extracelular (MEC) é importante para os altos níveis de resistência a drogas antifúngicas. O conhecimento dos princípios estruturais da MEC possibilita maior compreensão de como atuar para desorganizá-la e melhorar a difusão de agentes antifúngicos para que atinjam mais eficientemente o biofilme, além de, futuramente, possibilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o controle da formação de biofilmes. Sendo assim, os objetivos principais deste estudo foram: (1) verificar a influência da inativação de genes envolvidos na filamentação (EFG1 e TEC1) em características estruturais dos biofilmes e na produção de componentes da MEC; (2) verificar a influência do fluconazol (FLZ) na MEC de biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 (susceptível a fluconazol- CaS), C. albicans ATCC 96901 (resistente a fluconazol- CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (susceptível a fluconazol- CgS) e C. glabrata ATCC 200918 (resistente a fluconazol- CgR) e (3) estudar a ação de enzimas hidrolíticas (DNase, Dextranase e β-glucanase individualmente ou em diferentes combinações) sobre a MEC de biofilmes de CaS e CaR. Biofilmes maduros (48 horas) foram analisados através de contagem de unidades formadoras de colônia (ufc/mL), peso seco total, peso seco insolúvel e proteínas insolúveis. Os componentes da MEC- polissacarídeos... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Biofilms formed by Candida are related to bucal infections, such as candidiasis. Although the biofilm resistance is multifactorial, the protection exerted by its extracellular matrix (ECM) is essential for its high levels of resistance to antifungals. The knowledge of the structural principles of the ECM permits a better understanding of how to disorganize the ECM and improve the diffusion of antifungal drugs to reach the biofilm. Moreover, the study of the ECM may enable the development of more effective therapies to control biofilm formation. Thus, the main objectives of this study were: (1) to verify the influence of the inactivation of genes involved in filamentation and structural characteristics of the biofilms (EFG1 and TEC1) on the production of ECM components; (2) to verify the influence of fluconazole (FLZ) on the biofilms' ECM of Candida albicans ATCC 90028 (fluconazole-susceptible: CaS), C. albicans ATCC 96901 (fluconazole-resistant: CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (fluconazolesusceptible: CgS) and C. glabrata ATCC 200918 (fluconazole-resistant: CgR) and (3) to study the action of hydrolytic enzymes (DNase, Dextranase and β-glucanase individually or in different combinations) on the ECM of CaS and CaR biofilms. Mature biofilms (48 hours) were analyzed by colony counting forming units (cfu/mL), total dry weight, insoluble dry-weight and total proteins. ECM components- alkali-soluble polysaccharides (ASPs), water-soluble polysaccharides (WSPs), extracellular DNA (e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T05:23:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 251623.pdf: 3842753 bytes, checksum: 675419ecff620ee00a69fd1fb9444d11 (MD5) / O hormônio da tireóide (T3) exerce uma importante influência no desenvolvimento e maturação do SNC de mamíferos. Os efeitos do T3 no desenvolvimento neuronal são mediados pelos astrócitos, que secretam fatores solúveis e outras moléculas, como proteínas de MEC, modulando o crescimento de neuritos, proliferação e migração neuronal. Os astrócitos também participam ativamente do metabolismo neuronal. Por exemplo, os transportadores de glutamato astrocitários, GLAST e GLT-1, têm papel essencial na retirada de glutamato do espaço extracellular e na manutenção deste neurotransmissor em níveis fisiológicos no cérebro. No presente estudo, demonstramos que o T3 aumentou significativamente a captação de glutamato por astrócitos cerebelares, quando comparados às culturas sem o tratamento. A adição de LPDC e DL-TBOA, inibidores da captação de glutamato, aboliu a captação de glutamato tanto nos astrócitos tratados com T3 como nos controles. Além disto, os níveis de RNA mensageiro e de proteína para GLAST e GLT-1 em astrócitos foram aumentados após o tratamento com T3, embora não tenhamos observado diferenças significativas na distribuição destes transportadores. O efeito gliotóxico do glutamato nas culturas de astrócitos cerebelares foi abolido pelo tratamento com T3. Além disto, neurônios cerebelares cultivados sobre monocamadas de astrócitos tratados com T3 permaneceram viáveis em uma maior proporção após a adição de glutamato do que os cultivados sobre monocamadas astrocitárias controle, demonstrando um efeito neuroprotetor do T3. A expressão de sindecanas (1-4) em culturas de astrócitos de cerebelo, córtex cerebral e hipocampo de ratos neonatos foi analisada por RT-PCR. Nossos resultados demonstraram que as sindecanas 1-4 são expressas em astrócitos de cerebelo e córtex cerebral, enquanto que astrócitos de hipocampo expressam apenas as sindecanas 2 e 4. A análise por RT-PCR semiquantitativa demonstrou que a expressão das sindecanas 1, 2 e 4 foi reduzida e a expressão da sindecana 3 foi aumentada em cerebelos de ratos hipotireoideos, comparados aos tecidos normais. Observamos também redução na expressão das sindecanas 2 e 3 em astrócitos cerebelares tratados com T3, quando comparados às culturas não tratadas. Este balanço de PGs pode estar envolvido na ação do T3, mediada pela sinalização por FGF2. Demonstramos também, neste trabalho, que astrócitos hipotireoideos apresentam alterações na expressão e organização de fibronectina e laminina. Monocamadas de astrócitos hipotireoideos corresponderam a um microambiente pobre para o desenvolvimento neuronal do que astrócitos normais. O tratamento de astrócitos hipotireoideos com T3, recuperou o microambiente hipotireoideo, aumentando a área de cobertura por fibronectina e laminina. Em co-culturas de neurônios hipotireoideos sobre astrócitos hipotireoideos tratados com T3 foi observado maior número de neurônios e estes apresentando maior neuritogênese do que quando cultivados sobre astrócitos hipotireoideos não tratados. O meio condicionado de astrócitos hipotireoideos tratados com T3 também promoveu sobrevivência e neuritogênese em neurônios hipotireoideos. Nossos resultados demonstram que os efeitos do T3 na morfogênese astrocitária podem modular o desenvolvimento neuronal por diferentes mecanismos, como regulação dos níveis extracelulares de glutamato, e modulando contatos diretos célula-célula e célula-MEC. Thyroid hormone (T3) has a significant influence on the development and maturation of the mammalian SNC. T3 modulates neuronal development in an astrocyte-mediated manner, secreting soluble factors and other molecules, as ECM proteins, and regulating neurite outgrowth, neuron proliferation and migration. Astrocytes also participate actively in the neuronal metabolism. For example, astrocytic glutamate transporters, GLAST and GLT-1, play an essential role in the clearance of the neuronal-released glutamate from the extracellular space and are essential for maintaining physiological extracellular glutamate levels in the brain. In the present study, we showed that T3 significantly increased glutamate uptake by cerebellar astrocytes when compared to control cultures. Inhibitors of glutamate uptake, such as L-PDC and DL-TBOA, abolished glutamate uptake on control or T3-treated astrocytes. T3-treatment of astrocytes increased both mRNA levels and protein expression of GLAST and GLT-1, although no significant changes on the distribution of these transporters were observed. The gliotoxic effect of glutamate on cultured cerebellar astrocytes was abolished by T3-treatment of astrocytes. In addition, the neuronal viability against glutamate challenge was enhanced on T3- treated astrocytes, showing a putative neuroprotective effect of T3. We also analyzed the modulation of sindecans expression by thyroid hormone via RT-PCR in astrocytes cultures from cerebellum, cortex and hippocampus of newborn rats. Our results showed that syndecans (1-4) are expressed in astrocytes of cerebellum and cortex, whereas in hippocampus only syndecans 2 and 4 were detected. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed reduced expression of syndecans 1, 2 and 4, and increased expression of syndecan 3 in hypothyroid cerebellum, when compared to the euthyroid tissue. Furthermore, we observed a reduced expression of syndecans 2 and 3 in T3-treated cerebellar astrocytes, when compared to non-treated culture. This balance of PGs may be involved in T3 action mediated by FGF2 signaling. Moreover, we demonstrated that hypothyroid astrocytes showed an altered expression and organization of fibronectin and laminin. As expected, astrocytes hypothyroid represented a poor microenvironment to neuronal development than the normal ones. The T3-treatment recovered the microenvironment hypothyroid, increasing the covered area by fibronectin and laminin. In addition, hypothyroid neurons cultivated on T3-treated hypothyroid astrocytes had an increase in the number of cells and presented longer neurites than the cells cultured on astrocytes monolayers without T3. The conditioned medium of T3-treated hypothyroid astrocytes also promoted survival and neuritogenesis in hypothyroid neurons. Taken together our results demonstrate that the T3 effects on astrocytic morphogenesis may influence neuronal development by different mechanisms as regulating the glutamate extracellular levels and secreting ECM proteins modulating direct cell to cell or cell to ECM contacts.

The traffic of T cells, that occur when bone marrow-derived T cell precursors penetrate the thymus, with a phenotype of immature cells, and its subsequent output, as mature cells, depends of the thymic blood vessels that consists mainly of thymic endothelial cells. The expression of ligands and receptors of ECM in thymic endothelial cells, as well as its role in the processes of migration and emigration of the T cells from the thymus remains unclear. Our goal was to evaluated the expression of some of ECM ligands and their respective receptors in the strain of thymic endothelial cells tEnd.1. In addition, we aimed to study the role of the components of the ECM in the tEnd.1 cells and thymocytes interaction. First, it was detected by confocal immunofluorescence the presence of ECM proteins fibronectin and laminin, which were also observed through flow cytometry. The presence of their respective receptors, VLA5 and VLA6, were highlighted by immunoperioxidase and flow cytometry. Assays of adhesion showed that the use of antibodies anti-VLA5 and anti-VLA6 seems to block at least partially, the adhesion of thymocytes to endothelial cells. In addition, the transendothelial migration assay showed less migration in absolute cell number of the thymocytes pre-treated with antibodies anti-receptors of ECM, although this migration was not statistically significant. Finally, when the phenotype of the transmigrated thymocytes was observed, there was not difference in the migration pattern among them. This investigation shows that the thymic endothelial cells are able to express fibronectin and laminin proteins, as well as, their respective receptors VLA5 and VLA6, and suggests that these molecules could participate in the processes of intrathymic lymphocytes migration. / Os precursores das células T sofrem diferenciação e seleção intratímica através das interações com os componentes do microambiente tímico. Este é constituído em sua grande maioria por células epiteliais tímicas (TEC), macrófagos, células dendríticas, fibroblastos e os produtos de secreção dessas células, tais como hormônios, interleucinas e moléculas de matriz extracelular (ECM). O tráfego de células T, que a princípio penetram no timo provenientes da medula óssea, com fenótipo de células imaturas e, a sua posterior saída, como células maduras, depende terminantemente dos vasos sanguíneos que irrigam o órgão. Tais vasos são constituídos principalmente de células endoteliais tímicas. Tendo em vista que a expressão de ligantes e receptores de ECM em células endoteliais tímicas, assim como sua função nos processos de migração e emigração de células T do timo permanece pouco estudada, neste trabalho foi avaliada a expressão de alguns ligantes de ECM e seus respectivos receptores em uma linhagem de células endoteliais tímicas, tEnd.1. Além disso, estudou-se também o papel destes componentes de ECM na interação entre as células tEnd.1 e os timócitos. A princípio, foi detectado por imunofluorescência confocal a presença das proteínas de ECM fibronectina e laminina, que foram também observadas através de citofluorimetria, enquanto a presença de seus respectivos receptores, VLA5 e VLA6, foram evidenciados por imunoperoxidase e citofluorimetria. Ensaios de adesão sugeriram que o uso de anticorpos anti-receptores de ECM, anti-VLA5 e anti-VLA6, inibem pelo menos parcialmente, a adesão de timócitos às células endoteliais tEnd.1. Por fim, ensaios de migração transendotelial demonstraram claramente uma menor migração em números absolutos dos timócitos pré-tratados com anticorpos anti-receptores de ECM, embora essa diminuição não tenha sido estatisticamente significativa. Tomando em conjunto, os dados neste trabalho demonstraram que as células endoteliais tímicas da linhagem tEnd.1 são capazes de expressar tanto ligantes de ECM, como seus respectivos receptores, sugerindo ainda, a participação destas moléculas nos processos de migração de linfócitos intratímicos.