Un grupo de científicos de China ha encontrado un nuevo gen en las bacterias gram negativas, el MCR-1. Este gen ha sido responsable de otorgarle resistencia a estas bacterias patógenas ante la colistina, el antibacteriano que los médicos emplean como última arma para combatir ciertas infecciones multi-resistentes. Con este gen, las superbacterias serán potencialmente epidémicas y las enfermedades que se creían controladas, como la neumonía, la tuberculosis y las infecciones del tracto urinario, podrían ser nuevamente letales. / A group of Chinese scientists have found a new gene in gram negative bacteria, the MCR-1. This gene has given pathogenic bacteria resistance to colistin, which is the antibacterial that medical doctors use as last line of defense against multi-drug resistant infections. Superbacteria with MCR-1 will be potentially epidemic, and diseases that were believed to be controlled such as pneumonia, tuberculosis and urinary tract infections could be lethal again.

Thesis advisor: Jianmin Gao / Lipid reporters are key signaling molecules in a number of biological processes ranging from apoptosis in mammalian cells to novel resistance mechanisms in pathogenic bacteria. Developing probes to target these lipids is a worthy endeavor, especially when better reporters could mean lives saved. This is particularly true considering new antibiotic resistant pathogens emerge every year with evolving lipid compositions. To combat these pathogens and prevent a potential global pandemic, it is imperative to continue the development of novel and innovative probes/drugs to meet this daunting challenge. To fulfill this demand, we must continue to establish new strategies, enhance current technologies and advance scientific understanding. Only by pushing the boundaries of what is currently possible will we remain one step ahead of these diseases. Diseases like mcr-1 positive bacteria, first documented in 2016, remain largely uncontested. Herein, we seek to expand the available probes specific to key lipid reporters for phosphatidylserine, lysyl-phosphatidylglycerol, and phosphoethanolamine lipid A. Cyclic phage libraries were first utilized to target phosphatidylserine, ultimately producing weak binders. Refining our phage display libraries to include reversible covalent warheads allowed for the identification of more potent lipid reporters. In doing so, we have created the tools necessary to interrogate the unique resistance mechanisms expressed by these drug-resistant pathogens. A strong correlation was observed between peptides binding mcr-1 positive strains, LPS modification on the surface of these bacteria, and level of colistin resistance. To our knowledge, these peptides are the only probes capable of demonstrating this correlation. We surmise that the methods discussed here will pave the way for better diagnostic tools for these resistant pathogens. A recurring method of resistance among gram-positive and gram-negative bacteria has been to decorate their surface with positive amines to repel cationic antimicrobial peptides. As such, our current APBA library and the libraries in development in the Gao lab would be ideally suited to target these and other undiscovered resistance mechanisms. / Thesis (PhD) — Boston College, 2020. / Submitted to: Boston College. Graduate School of Arts and Sciences. / Discipline: Chemistry.

As grandes quantidades de antimicrobianos utilizados na produção de aves e suínos é um problema de saúde pública em todo mundo. O surgimento e disseminação de novos mecanismos de resistência a antibióticos de importância clínica em medicina humana e veterinária é fato que tem apontado a entrada de uma era \"pós-antibióticos\". Considerando a importância da avicultura e suinocultura na economia brasileira e os riscos para saúde humana e dos animais, o objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de genes emergentes de resistência aos antibióticos das classes dos β-lactâmicos, quinolonas, fosfomicina e colistina. Foram selecionados 1.152 isolados de Escherichia coli de origem clínica, fecal e de carne de suínos, frangos de corte, poedeiras e perus proveniente dos principais estados produtores e exportadores do Brasil (SP, RS, SC, PR, MG e GO). Através de métodos clássicos de biologia molecular e sequenciamento do genoma completo foi realizada a caracterização genotípica dos isolados, assim como a caracterização dos elementos genéticos móveis que carreavam esses genes. Dentre os isolados de aves (n=773), 103 (13,4%) foram produtores de ESBL: CTX-M-2 (n=61); CTX-M-55 (n=26); CTX-M-8 (n=12); CTX-M-2 + CTX-M-55 (n=3); CTX-M-2+CTX-M-8 (n=1); CTX-M-8+CTX-M-55 (n=1). 44 (5,7%) apresentaram CMY-2, presente em plasmídeos IncI1/ST12 e IncK. Em relação à resistência às quinolonas e colistina mediada por plasmídeos, os genes encontrados foram qnrA1 (1%), qnrB19 (6%) e qnrS1 (0,8%), além de 41 isolados positivos para mcr-1. A ocorrência de genes plasmidiais de resistência à fosfomicina ( fosA3) foi de 3,4%, que estiveram relacionados a plasmídeos epidêmicos IncN/F33:A-:B-. Dentre os isolados de E. coli patogênicas (ETEC, STEC), comensais e de carne de suínos ( n =378) foi encontrada uma alta prevalência de cepas positivas para mcr-1 (33,8%). Foram encontrados três isolados positivos para mcr-3 dentre os isolados de ETEC e comensais. O gene qnrS1 também teve alta prevalência (24,6%). Nos isolados de aves e suínos, o gene mcr-1 esteve presente em plasmídeos IncX4. Análises da sequência completa de DNA de vários plasmídeos mostrou relação com plasmídeos que circulam em criações animais na Ásia. Este estudo contribui para o estabelecimento de um cenário em relação à resistência antimicrobiana na produção animal no Brasil. Levando em conta que o Brasil está entre os maiores exportadores de carne de aves e suínos do mundo, é urgente a elaboração de estratégias para o controle da disseminação de bactérias resistentes a antibióticos clinicamente importantes. / The large amounts of antimicrobials used in the poultry and swine production is a public health concern worldwide. The emergence and spread of novel resistance mechanisms to important antibiotics in human and veterinary medicine is a fact that has pointed to entry into a \"post-antibiotic\" era. Considering the importance of poultry and pig farming in the Brazilian economy and the risks to human and animal health, the aim of this study was to determine the occurrence of emerging resistance genes to β-lactam, quinolones, fosfomycin and colistin antibiotics. A total of 1.152 of clinical, fecal and retail meat isolates of Escherichia coli from from swine, broilers, laying hens and turkeys from the main producing and exporting states of Brazil (SP, RS, SC, PR, MG and GO) were selected. Through classical molecular biology methods and whole genome sequencing, the characterization of the isolates was performed, as well as the characterization of the mobile genetic elements that carried these genes. Among avian isolates (n = 773), 103 (13.4%) were ESBL-producers: CTX-M-2 (n = 61); CTX-M-55 (n = 26); CTX-M-8 (n = 12); CTX-M-2 + CTX-M-55 (n = 3); CTX-M-2 + CTX-M-8 (n = 1); CTX-M-8 + CTX-M-55 (n = 1). 44 (5.7%) showed pAmpC CMY-2, present in IncI1/ST12 and IncK plasmids. An isolate belonging to ST117 harboring bla CMY2 and bla CTX-M-2 integrated into the chromosome. Regarding plasmid-mediated resistance to quinolones and colistin, the genes found were qnrA1 (1%), qnrB19 (6%) and qnrS1 (0.8%), in addition to 41 mcr-1 positive isolates. The occurrence of plasmid-mediated fosfomycin resistance ( fosA3) was 3.4%, which were related to the IncN/F33: A-: B- epidemic plasmids. A high prevalence of mcr-1 positive strains (33.8%) was found among pathogenic (ETEC, STEC) and commensal porcine E. coli isolates (n = 378). Three mcr-3 positive isolates were found among the ETEC and commensal isolates. The qnrS1 gene also had a high prevalence (24.6%). In avian and porcine isolates, the mcr-1 gene was present in IncX4 plasmids. Analyzes of the complete DNA sequence of various plasmids showed relation to plasmids circulating in animal production in Asia. This study contributes to the determination of a national scenario of antimicrobial resistance in animal production in Brazil. Taking into account that Brazil is among the largest exporters of poultry and pork in the world, it is urgent to devise strategies to control the spread of multidrug resistant bacteria to clinically important antibiotics.

Notre travail de thèse a porté sur la recherche des bactéries multirésistantes zoonotiques dans les fèces des animaux du bassin méditerranéen, région pour laquelle peu de données sont disponibles. Cette thèse s’articule autour de quatre objectifs principaux ; (1) épidémiologie et prévalence des bactéries productrices de β-lactamases et de carbapénèmases chez les poulets d’Algérie, (2) étude et détection de la résistance plasmidique à la colistine chez les animaux d’Algérie, (3) recherche de vecteur et/ou réservoirs de bactéries zoonotiques résistantes à la colistine, (4) épidémiologie des bactéries résistantes à la colistine chez les humains en France, au Laos et au Liban. A travers ces investigations nous avons montré l’émergence et la dissémination du gène mcr-1 chez les animaux (poulets et caprins) dans plusieurs sites en Algérie. Nous avons également rapporté la détection de souches résistantes à la colistine dans des isolats humains en France et au Liban. Ces travaux ont participé à la description de l’épidémiologie du gène mcr-1 dans le monde chez les animaux et les humains et soulèvent la question du devenir de l’usage de la colistine chez l’homme et l’animal. Pour faire face à ces risques, nous pensons que des mesures de restriction d’usage des antibiotiques (y compris de la colistine) chez les animaux doivent s’appliquer, notamment en Algérie, pour limiter la propagation de ces gènes de résistance à l’homme. Il apparait donc nécessaire et urgent de mettre en place des enquêtes de surveillance de l’usage des antibiotiques chez les animaux notamment en Algérie pour éviter la propagation de souches résistantes chez l’homme. / This thesis is divided into 6 chapters with four objectives; (1) the epidemiology and prevalence of β-lactamases in chickens from Algeria, (2) contribution to the study and detection of plasmid resistance to colistin in animals from Algeria, (3) vectors/ reservoirs of zoonotic bacteria resistant to colistin, and (4) Epidemiology of bacteria resistant to colistin in humans in France, Laos and Lebanon.Throughout these investigations, we can conclude that there is an emergence and spread of mcr-1 in animals (chickens and goats) in several sites in Algeria. We also noted the detection of colistin-resistant bacteria in human isolates in France and in Lebanon. This indicates a spread of mcr-1 and colistin resistance genes worldwide in animals and humans and raises the question on the colistin usage in animals. To prevent this end, we believe that restrictions on the use of antibiotics (including colistin) should be applied, particularly in Algeria, to limit the spread of these resistance genes. Use control of colistin should be routinely performed in humans and animals through colistin resistance surveys in animals and humans.

De nos jours, l'épidémiologie des bactéries multi-résistantes a évolué et ne se limite plus aux milieux hospitaliers. En effet, les animaux sont désormais considérés comme d’importants réservoirs de bactéries multi-résistantes, notamment des Bacilles à Gram négatif sécréteurs de bêta-lactamases et/ou résistant à la colistine. L'émergence de ces bactéries chez les animaux est due principalement à l’utilisation excessive d’antibiotiques en tant que prophylaxie et facteurs de croissance. Le transfert d’organismes multi-résistants aux antibiotiques provenant d’animaux vers les humains est un problème majeur pouvant entrainer de graves infections. La transmission zoonotique se fait par contact direct/indirect mais aussi par voie environnementale. Au Liban, plusieurs études ont été menées dans les hôpitaux et ont montré une prévalence élevée de bactéries multi-résistantes. En revanche, ces études sont rares dans le milieu vétérinaire. Le but de ce travail de thèse est de décrire l'épidémiologie des organismes multi-résistants dans les animaux d’élevage destinés à la consommation au Liban. Le typage des bactéries par MLST et le séquençage du génome entier ont été utilisés pour décrire la prévalence des organismes multi-résistants et les mécanismes de résistance chez les souches isolées. Nous pouvons ainsi conclure que les élevages de poulets et de porcs sont de puissants réservoirs de gènes de résistance BLSE et mcr-1 au Liban. La dissémination de la résistance semble être polyclonale et liée à la propagation de plasmides porteurs de gènes de résistance. Par conséquent, l'utilisation de la colistine en médecine vétérinaire au Liban doit être interdite. / Nowadays, the epidemiology of multi-drug resistance has changed and is no more confined to the hospital settings. Food producing animals are increasingly regarded as potent reservoirs of multi-drug resistant organisms i.e. beta lactamase producers and colistin-resistant Gram-negative bacilli. The emergence of multi-drug resistance in animals is thought to be mainly driven by the overuse of antibiotics as growth promoters and prophylaxis. The dissemination of resistant organisms in animals is sparked by the concern of being transferred to humans where they can be candidates for infections with limited therapeutic options. The zoonotic transmission of resistant organisms from animals to humans occurs mainly via direct/indirect contact but also via environmental routes. In Lebanon, several studies were conducted in hospitals and showed a high prevalence of multi-drug resistance; unlikely, these studies are scarce in animals. The aim of this thesis research was thus to describe the epidemiology of multi-drug resistant organisms in Lebanese Livestock Multi-locus sequence typing and whole genome sequencing were used to describe the prevalence of multi-drug resistant organisms and the corresponding mechanisms of resistance in the isolated strains from chicken, pigs, farmers and environment. Chicken and swine farms showed to be potent reservoirs of ESBL and mcr-1 genes in Lebanon. The dissemination of multi-drug resistance appears to be multi-clonal and related to the spread of plasmid carrying resistance genes. Colistin use in veterinary medicine in Lebanon should be banned.

INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.

Bactérias multirresistentes (MRs) pertencentes ao grupo ESKAPE (i.e., Enterococcus faecium resistente à vancomicina, VRE; Staphylococcus aureus resistente à meticilina, MRSA; Klebsiella spp., e Escherichia coli produtoras de β-lactamases de amplo espectro; Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos) são importantes patógenos de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), onde a sua endemicidade e prevalência tem sido decorrente da seleção de linhagens clonais. Embora, o fenótipo MR decorra da expressão de mecanismos mediados por genes intrínsecos e/ou adquiridos, o crescimento bacteriano na forma de biofilme contribui para um importante fenômeno fisiológico de resistência, o qual é inespecífico quanto ao substrato antimicrobiano. O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de agentes físicos e químicos contra biofilmes produzidos por clones de bactérias MRs de importância clínica e epidemiológica no Brasil. Cerdas de poliamida foram utilizadas como modelo de superfície de adesão para o crescimento de biofilmes, os quais foram monitorados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). In vivo, o modelo de biofilme foi avaliado pela inserção das cerdas na proleg de larvas de Galleria mellonella, enquanto que, diferentes tratamentos foram aplicados para inibir a formação do biofilme. Adicionalmente, mediante ao ensaio de bioluminescência, o modelo de biofilme produzido pela cepa de P. aeruginosa PAO1/lecA::lux foi avaliado na presença de soluções hipertônicas de cloreto de sódio (NaCl). In vitro, soluções hipertônicas de cloreto de sódio (> 6%) utilizadas de maneira profilática, apresentaram efeito bacteriostático (CIM90= 1,7 M) contra biofilmes produzidos por todos os isolados analisados. Além disso, através do uso profilático de soluções hipertônicas de NaCl, foi possível visualizar a inibição da motilidade dos isolados. Por outro lado, os compostos quaternários de amônio (CQAs) cloreto de benzalcônio (CBA) e cloreto de cetilpiridínio (CCP) apresentaram efeito bactericida (CBM90= 256 µg/mL) contra biofilmes previamente formados em 24h. A atividade de ambos os CQAs foi potencializada na presença de soluções salinas hipertônicas, como avaliado pela metodologia de checkerboard, tendo um efeito sinérgico contra E. coli (ST10, ST101) MCR-1 (∑FIC= 0,5); parcialmente sinérgico contra A. baumannii OXA-23 (ST79), E. cloacae CTX-M-8 (ST131), E. faecium VRE (ST478) e K. pneumoniae KPC-2 (ST340) (∑FIC= 0,75); e indiferente contra cepas de P. aeruginosa SPM-1 (ST277) e S. aureus MRSA (ST5). Adicionalmente, a CIM de carbapenêmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos contra biofilmes de bactérias Gram-negativas MRs foi potencializada na presença de solução salina hipertônica resultando em uma queda da CIM >=2. Finalmente, in vivo, para todas as espécies MRs estudadas, biofilmes formados em 08, 12 e 24h resultaram em 100% de morte das larvas de G. mellonella em até 96 horas pós-infecção. O mesmo comportamento foi observado para a cepa PAO1/lecA::lux, sendo possível detectar sinais intensos de bioluminescência nas larvas infectadas com os biofilmes. Entretanto, para os biofilmes previamente tratados com solução salina hipertônica, observou-se a diminuição dos sinais de bioluminescência em até 60%. Já para biofilmes formados em 24, 12 e 08h, o tratamento prévio em solução salina hipertônica e posteriormente com antibióticos resultou em um aumento de até 40, 70 e 80% da sobrevida de G. mellonella, respectivamente. / ESKAPE pathogens (ie, vancomycin-resistant (VRE) Enterococcus faecium; methicillin-resistant (MRSA) Staphylococcus aureus; extended spectrum β-lactamase-producing Klebsiella spp., and Escherichia coli; Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp. Resistant to carbapenems), represents an important group of multidrug-resistant (MDR) bacteria related to healthcare-associated infections (HAIs), whereas endemicity have been associated with selection and predominance of clones. Although the MR phenotype derives from the expression of mechanisms mediated by intrinsic and/or acquired genes, bacterial growth in the biofilm form contributes to an important physiological phenomenon of resistance, which is non-specific to the antimicrobial substrate. The present study aimed to evaluate the efficacy of physical and chemical agents against biofilms produced by clones of MDR bacteria of clinical and epidemiological importance, in Brazil. Polyamide bristles were used as adhesion surface model for the growth of biofilms, which were monitored by scanning electron microscopy (SEM). In vivo, the biofilm model was evaluated by the insertion of the bristles into the proleg of larvae of Galleria mellonella, while different treatments and physicochemical conditions were applied to inhibit biofilm formation. Additionally, the biofilm model produced by the P. aeruginosa PAO1/lecA::lux strain was evaluated in the presence of hypertonic solutions of sodium chloride (NaCl). In vitro, hypertonic solutions of sodium chloride presented a bacteriostatic effect (MIC90 = 1.7 M) against biofilm formation of all the isolates analyzed. Moreover, through the prophylactic use of hypertonic solutions of NaCl, it was possible to observe the inhibition of the motility of the isolates. On the other hand, the ammonium quaternary compounds (QACs) benzalkonium chloride (BAC) and cetylpyridinium chloride (CPC) had a bactericidal effect (CBM90 = 256 µg / mL) against previously formed biofilms in 24h. The activity of both QACs was potentiated in the presence of hypertonic saline solutions, as evaluated by the checkerboard methodology, having a synergistic effect against E. coli (ST10, ST101) MCR-1 (∑FIC = 0.5); (ST340) (∑FIC = 0.75), E. faecium VRE (ST478) and K. pneumoniae KPC-2 (ST340), E. cloacae CTX-M-8 (ST131); and indifferent effect against strains of P. aeruginosa SPM-1 (ST277) and S. aureus MRSA (ST5). Furthermore, the MIC of carbapenems, fluoroquinolones and aminoglycosides against biofilms of MDR Gram-negative bacteria was potentiated in the presence of hypertonic saline solution resulting in a decrease in MIC >=2-fold. Finally, for all MDR species studied, biofilms formed at 08, 12 and 24h resulted in 100% death of G. mellonella larvae within 96h post-infection. In fact, the same behavior was observed for the strain PAO1/lecA::lux, and it is possible to detect intense bioluminescence signals in the larvae infected with biofilms. However, for biofilms previously treated with hypertonic saline solution, bioluminescence signs decreased by up to 60%. As for biofilms formed at 24, 12 and 8h, pretreatment in hypertonic saline solution and later with antibiotics resulted in an increase of up to 40, 70 and 80% of the survival of G. mellonella, respectively.

La découverte récente du premier gène de résistance plasmidique à la colistine mcr-1 a mis en évidence le besoin urgent d'améliorer la détection des isolats résistant à la colistine dans les laboratoires de microbiologie clinique afin de pouvoir rapidement isoler les patients porteurs. L’objectif de ma thèse a ainsi été de répondre à cette problématique par le développement et l’évaluation d’outils spécifiques. Une revue a été rédigée visant à résumer les nouveaux outils développés pour détecter la résistance aux polymyxines, y compris la présentation des méthodes actuelles phénotypiques, antibiogrammes et génotypiques. Le milieu de culture LBJMR a été développé pour détecter toutes les bactéries à Gram négatif résistantes à la colistine et également les souches d’entérocoques résistants à la vancomycine qui représentent un autre problème majeur de santé publique. LBJMR est polyvalent et a permis de dépister 3 bactéries d'intérêt clinique à partir d’un même échantillon: E. coli et K. pneumoniae résistantes à la colistine, et E. faecium résistant à la vancomycine. Un brevet a été déposé. Le kit UMIC Colistine est un dispositif commercial de détermination de la CMI basé sur la méthode de référence. Évalué conformément à la norme ISO 20776, sa sensibilité était excellente pour la détection des souches porteuses du gène mcr-1. Le kit UMIC Colistine constitue ainsi une méthode rapide et fiable pour évaluer la CMI des isolats cliniques dans les laboratoires de microbiologie clinique. Enfin, mes travaux de thèse ont compris l’analyse d’une souche de K. pneumoniae hétérorésistante à la colistine et la description d’une nouvelle espèce bactérienne : Pseudomonas massiliensis. / The recent discovery of mcr-1, the first plasmid-mediated colistin resistance gene, highlighted the urgent need to implement the detection of colistin-resistant isolates in clinical microbiology laboratories, in order to isolate carrier patients. My thesis aimed to address this issue by developing and evaluating specific tools. A review was redacted to summarize the new tools developed to detect polymyxin resistance including the current phenotyping, susceptibility testing and genotyping methods. The LBJMR culture medium has been developed to detect all colistin-resistant Gram-negative bacteria and also the vancomycin-resistant enterococci which represent another major problem of public health. The LBJMR medium allowed the detection of different bacteria of interest from the same clinical sample: colistin-resistant E. coli and K. pneumoniae and also a vancomycin-resistant E. faecium. This project led to a patent filing. The UMIC Colistine kit is a ready-to-use device based on the reference method to determine the polymyxin MIC. Evaluated in accordance with ISO 20776 standard, its sensitivity was excellent for the detection of colistin-resistant strains harboring the mcr-1 gene. The UMIC Colistin system is a rapid and reliable method to determine colistin MIC of clinical isolates in clinical microbiology laboratories. My thesis project also included the analysis of a colistin-heteroresistant Klebsiella pneumoniae strain, and the description of a new bacteril species, Pseudomonas massiliensis. These studies highlight the need to improve the detection of colistin-resistant strains by using reliable methods, suitable for diagnosis in clinical microbiology laboratories.

Bactérias multirresistentes (MRs) pertencentes ao grupo ESKAPE (i.e., Enterococcus faecium resistente à vancomicina, VRE; Staphylococcus aureus resistente à meticilina, MRSA; Klebsiella spp., e Escherichia coli produtoras de β-lactamases de amplo espectro; Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos) são importantes patógenos de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), onde a sua endemicidade e prevalência tem sido decorrente da seleção de linhagens clonais. Embora, o fenótipo MR decorra da expressão de mecanismos mediados por genes intrínsecos e/ou adquiridos, o crescimento bacteriano na forma de biofilme contribui para um importante fenômeno fisiológico de resistência, o qual é inespecífico quanto ao substrato antimicrobiano. O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de agentes físicos e químicos contra biofilmes produzidos por clones de bactérias MRs de importância clínica e epidemiológica no Brasil. Cerdas de poliamida foram utilizadas como modelo de superfície de adesão para o crescimento de biofilmes, os quais foram monitorados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). In vivo, o modelo de biofilme foi avaliado pela inserção das cerdas na proleg de larvas de Galleria mellonella, enquanto que, diferentes tratamentos foram aplicados para inibir a formação do biofilme. Adicionalmente, mediante ao ensaio de bioluminescência, o modelo de biofilme produzido pela cepa de P. aeruginosa PAO1/lecA::lux foi avaliado na presença de soluções hipertônicas de cloreto de sódio (NaCl). In vitro, soluções hipertônicas de cloreto de sódio (> 6%) utilizadas de maneira profilática, apresentaram efeito bacteriostático (CIM90= 1,7 M) contra biofilmes produzidos por todos os isolados analisados. Além disso, através do uso profilático de soluções hipertônicas de NaCl, foi possível visualizar a inibição da motilidade dos isolados. Por outro lado, os compostos quaternários de amônio (CQAs) cloreto de benzalcônio (CBA) e cloreto de cetilpiridínio (CCP) apresentaram efeito bactericida (CBM90= 256 µg/mL) contra biofilmes previamente formados em 24h. A atividade de ambos os CQAs foi potencializada na presença de soluções salinas hipertônicas, como avaliado pela metodologia de checkerboard, tendo um efeito sinérgico contra E. coli (ST10, ST101) MCR-1 (∑FIC= 0,5); parcialmente sinérgico contra A. baumannii OXA-23 (ST79), E. cloacae CTX-M-8 (ST131), E. faecium VRE (ST478) e K. pneumoniae KPC-2 (ST340) (∑FIC= 0,75); e indiferente contra cepas de P. aeruginosa SPM-1 (ST277) e S. aureus MRSA (ST5). Adicionalmente, a CIM de carbapenêmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos contra biofilmes de bactérias Gram-negativas MRs foi potencializada na presença de solução salina hipertônica resultando em uma queda da CIM >=2. Finalmente, in vivo, para todas as espécies MRs estudadas, biofilmes formados em 08, 12 e 24h resultaram em 100% de morte das larvas de G. mellonella em até 96 horas pós-infecção. O mesmo comportamento foi observado para a cepa PAO1/lecA::lux, sendo possível detectar sinais intensos de bioluminescência nas larvas infectadas com os biofilmes. Entretanto, para os biofilmes previamente tratados com solução salina hipertônica, observou-se a diminuição dos sinais de bioluminescência em até 60%. Já para biofilmes formados em 24, 12 e 08h, o tratamento prévio em solução salina hipertônica e posteriormente com antibióticos resultou em um aumento de até 40, 70 e 80% da sobrevida de G. mellonella, respectivamente. / ESKAPE pathogens (ie, vancomycin-resistant (VRE) Enterococcus faecium; methicillin-resistant (MRSA) Staphylococcus aureus; extended spectrum β-lactamase-producing Klebsiella spp., and Escherichia coli; Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp. Resistant to carbapenems), represents an important group of multidrug-resistant (MDR) bacteria related to healthcare-associated infections (HAIs), whereas endemicity have been associated with selection and predominance of clones. Although the MR phenotype derives from the expression of mechanisms mediated by intrinsic and/or acquired genes, bacterial growth in the biofilm form contributes to an important physiological phenomenon of resistance, which is non-specific to the antimicrobial substrate. The present study aimed to evaluate the efficacy of physical and chemical agents against biofilms produced by clones of MDR bacteria of clinical and epidemiological importance, in Brazil. Polyamide bristles were used as adhesion surface model for the growth of biofilms, which were monitored by scanning electron microscopy (SEM). In vivo, the biofilm model was evaluated by the insertion of the bristles into the proleg of larvae of Galleria mellonella, while different treatments and physicochemical conditions were applied to inhibit biofilm formation. Additionally, the biofilm model produced by the P. aeruginosa PAO1/lecA::lux strain was evaluated in the presence of hypertonic solutions of sodium chloride (NaCl). In vitro, hypertonic solutions of sodium chloride presented a bacteriostatic effect (MIC90 = 1.7 M) against biofilm formation of all the isolates analyzed. Moreover, through the prophylactic use of hypertonic solutions of NaCl, it was possible to observe the inhibition of the motility of the isolates. On the other hand, the ammonium quaternary compounds (QACs) benzalkonium chloride (BAC) and cetylpyridinium chloride (CPC) had a bactericidal effect (CBM90 = 256 µg / mL) against previously formed biofilms in 24h. The activity of both QACs was potentiated in the presence of hypertonic saline solutions, as evaluated by the checkerboard methodology, having a synergistic effect against E. coli (ST10, ST101) MCR-1 (∑FIC = 0.5); (ST340) (∑FIC = 0.75), E. faecium VRE (ST478) and K. pneumoniae KPC-2 (ST340), E. cloacae CTX-M-8 (ST131); and indifferent effect against strains of P. aeruginosa SPM-1 (ST277) and S. aureus MRSA (ST5). Furthermore, the MIC of carbapenems, fluoroquinolones and aminoglycosides against biofilms of MDR Gram-negative bacteria was potentiated in the presence of hypertonic saline solution resulting in a decrease in MIC >=2-fold. Finally, for all MDR species studied, biofilms formed at 08, 12 and 24h resulted in 100% death of G. mellonella larvae within 96h post-infection. In fact, the same behavior was observed for the strain PAO1/lecA::lux, and it is possible to detect intense bioluminescence signals in the larvae infected with biofilms. However, for biofilms previously treated with hypertonic saline solution, bioluminescence signs decreased by up to 60%. As for biofilms formed at 24, 12 and 8h, pretreatment in hypertonic saline solution and later with antibiotics resulted in an increase of up to 40, 70 and 80% of the survival of G. mellonella, respectively.

INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.