Orientador: Morgana Rodrigues Guimarães Stabili / Resumo: Curcumin é um composto ativo derivado da planta Curcuma longa que exibe uma variedade de atividades biológicas, potencial anti-inflamatório e imunomodulatório, que pode ser associado ao tratamento de uma série de condições, como doenças inflamatórias intestinais, artrite reumatoide, câncer, diabetes e periodontite. Recentemente, a literatura também tem demonstrado o potencial do composto sobre o reparo ósseo, entretanto, os dados ainda são contraditórios. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da administração tópica do curcumin veiculado em nanopartículas de PLGA sobre a formação/reparo ósseo de defeitos críticos in vivo, e investigar seu potencial biológico in vivo e in vitro. Defeitos ósseos confeccionados na calvária de ratos machos foram preenchidos com solução salina (controle), curcumin nanoparticulado 0,05mg/ml ou veículo utilizado na diluição do composto (nanopartícula vazia) por 7, 14 e 28 dias. A fração de volume ósseo no interior do defeito nos diferentes grupos foram avaliados por microtomografia óssea (μCT); expressão e imunolocalização dos marcadores do turnover tecidual (RANKL, OPG, PCNA e RUNX2) foram investigados por imuno-histoquímica, enquanto as características teciduais do tecido neoformado foram observadas através da análise histológica descritiva e estereometria. In vitro, o potencial do curcumin nanoparticulado em estimular a diferenciação osteogênica de células estromais derivadas da medula óssea (BMSCs) de ratos foi avaliado determinando-se a at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Curcumin is an active compound derived from the Curcuma longa plant that exhibits a variety of biological activities, anti-inflammatory and immunomodulatory potential, which can be associated with the treatment of a number of conditions, such as inflammatory bowel diseases, rheumatoid arthritis, cancer, diabetes and periodontitis. Recently, the literature has also demonstrated the potential of the compound on bone repair, however, the data are still contradictory. The aim of this study is to evaluate the effect of topical administration of curcumin-loaded PLGA nanoparticles on bone formation / repair of critical defects in vivo, and to investigate its biological potential in vivo and in vitro. Bone defects made in the calvaria of rats were filled with saline solution (control), nanoparticulate curcumin 0,05mg/ml, or vehicle used in the dilution of the compound (empty nanoparticle) for 7, 14 and 28 days. The fraction of bone volume within the defect in the different groups was assessed by microcomputed tomography (μCT); expression and immunolocation of tissue turnover markers (RANKL, OPG, PCNA and RUNX2) were investigated by immunohistochemistry, while the tissue characteristics of the newly formed tissue were observed through descriptive histological analysis and stereometry. In vitro, the potential of nanoparticulate curcumin in stimulating osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived stromal cells (BMSCs) was assessed by determining the activity of alkaline phospha... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A associação das células-tronco (CT) com os biomateriais prometem ser os protagonistas para o futuro da medicina regenerativa no tratamento de lesões de tecidos e órgãos. No presente trabalho, as células-tronco foram cultivadas em matrizes construídas pela técnica de electrospinning, usando o polímero poli-D,L-ácido láctico (PDLLA) associado ou não à biomassa da microalga Spirulina (PDLLA/Sp), que possui componentes bioativos de interesse para a engenharia de tecidos (ET). As análises físico-químicas realizadas foram a avaliação da morfologia, do diâmetro das fibras, da degradabilidade, da rugosidade, do teor de solvente residual, do ângulo de contato com água, entre outros. A adesão e a proliferação celular, bem como a citotoxicidade do biomaterial também foram avaliados. As nanofibras obtidas apresentaram-se sem beads e com características semelhantes às da matriz extracelular natural (MEC) em termos de propriedades mecânicas e topográficas. Nos testes biológicos, verificou-se que as CTs aderiram mais e tiveram maior viabilidade nos scaffolds de PDLLA/Sp, quando comparado com as matrizes de nanofibras de PDLLA. Ambos os biomateriais mostraram-se atóxicos para as CTs. Pode-se concluir que as matrizes desenvolvidas neste trabalho apresentam as características necessárias de um novo biomaterial adequado para uso na ET. / The association of stem cells (SCs) with biomaterials promises to be the protagonist for future regenerative medicine in the treatment of tissue and organ lesions. Stem cells were cultivated in scaffolds constructed by the electrospinning technique, using poly-D,L-lactic acid (PDLLA) associated or not with Spirulina biomass (PDLLA/Sp), which has bioactive components of interest for tissue engineering (TE). Physicochemical analyses were performed, such as morphology, fiber diameter, degradability, residual solvent, roughness, contact angle with water, among others. SC adhesion and proliferation and scaffold cytotoxicity were also evaluated. Nanofibers without beads and with characteristics similar to the natural extracellular matrix (ECM) in terms of mechanical and topographical properties were obtained. In biological tests it was found that SCs adhered more and had greater viability in the PDLLA/Sp molds, when compared to the PDLLA scaffolds. The scaffolds were shown to be atoxic for the SCs. It can be concluded that the scaffolds developed in this work have the characteristics to be a new biomaterial suitable for use in TE.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido o foco de diversos estudos nos últimos anos, devido ao seu alto potencial terapêutico. Muitos estudos in vitro tem demonstrado que essas células podem ser hipoimunogênicas, indicando a possibilidade de uso dessas células em transplantes alogênicos sem nenhum efeito colateral. No entanto, estudos in vivo demonstram que as CTMs podem gerar uma resposta imune quando transplantadas em hospedeiros imunocompetentes, inclusive com a formação de células T de memória. Isto indica que possívelmente as CTMs não sejam imunoprivilegiadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de CTMs pré-ativadas e não ativadas, quando transplantadas sob a cápsula renal de camundongos imunocompetentes. Células mesenquimais derivadas do tecido adiposo foram coletadas de camundongos transgênicos C57Bl/6-GFP. As células foram então caracterizadas por ensaios de diferenciação adipogênica e osteogênica, assim como por imunofenotipagem, realizada por citometria de fluxo. Os animais foram divididos em três grupos para o transplante. No grupo singênico, machos C57Bl/6 receberam células C57Bl/6-GFP. Nos grupos alogênicos, camundongos BALB/c foram transplantados com células C57Bl/6-GFP ou células C57Bl/6-GFP pré-ativadas através da incubação com 20 ng/mL IFN-γ e 30 ng/mL TNF-α antes do transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A quantificação de citocinas no plasma dos animais não demonstrou diferenças entre os grupos. Foi feito também um teste de proliferação de esplenócitos in vitro, co-cultivado com CTMs. O presente estudo demonstrou que as células alogênicas possuem a capacidade de provocar a proliferação dos esplenócitos, o que poderia explicar a rejeição ocorrida in vivo. / The immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells (MSCs) have been the focus of several studies over the past few years due to their therapeutic potential. Many in vitro studies have shown that these cells can be hypoimmunogenic, indicating the possibility of using them in allogenic transplants without any harmful effects. However, recent in vivo studies show that these cells can generate an immune response when transplanted into an immunocompetent host, with the formation of memory T cells. This indicates that MSCs may not actually be immune privileged. The main goal of this study has been to evaluate the role of activated and non-activated MSCs when transplanted to the renal subcapsular space of allogenic mice. Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from C57Bl/6-GFP transgenic mice. The cells were characterized by adipogenic and osteogenic differentiation assays and immunophenotyping was performed by flow cytometry. The animals were divided in three different groups for the transplant. Male C57Bl/6 mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells. In the allogenic groups, male BALB/c mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells or C57Bl/6-GFP cells pre-activated by incubation with 20 ng/mL IFN-γ and 30 ng/mL TNF-α for 20h before transplantation. Histological and immunofluorescence analysis of graft-bearing kidneys showed that no GFP+ cells were found in any allogenic transplant after 28 days. At 7 and 14 days, the transplant sites showed a massive proliferation of inflammatory cells, which vanished after 28 days, indicating complete rejection of the transplanted cells. The syngeneic transplant was not rejected, showing GFP+ cells through the whole period of study. Cytokine quantification in the blood plasma showed no difference between any of the groups. An in vitro splenocyte proliferation assay was performed, which indicates that MSCs alone can induce the activation of allogenic splenocytes. This could explain their rejection in vivo.

O transplante de Células Tronco Hematopoéticas alogênico é o tratamento curativo para diversas doenças hematológicas malignas, benignas e imunodeficiências, porém é acompanhado de grande morbidade e mortalidade. Uma das principais complicações é a doença do enxerto contra hospedeiro aguda que, se não controlada rapidamente, pode ser fatal. A Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda tem como tratamento o uso de esteróides, no entanto, em cerca de 30 a 50% dos casos se revela resistente à esta terapia, sendo considerados com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente. O tratamento para Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente à esteróides não está ainda estabelecido sendo alta a mortalidade desses pacientes. Nesse contexto, começou-se a pesquisar o papel das células-tronco mesenquimais em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides, devido a capacidade de imunomodulação que aquelas possuem. As células-tronco mesenquimais são células-tronco adultas, com capacidade de autorrenovação, proliferação e diferenciação em diferentes linhagens celulares. As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais ainda não são totalmente conhecidas, mas sabe-se por estudos in vitro que elas interagem com diversos tipos celulares e citocinas, sendo sua aplicabilidade terapêutica muito pesquisada em diversas doenças inflamatórias; ainda assim, poucos se conhece sobre o efeito modulador das células-tronco mesenquimais in vivo. Inúmeros estudos piloto ou séries de casos sobre a aplicabilidade de célula-tronco mesenquimal para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda foram publicados com resultados animadores, no entanto, não há até o momento na literatura estudo prospectivo randomizado em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária comparando célula-tronco mesenquimal com o tratamento padrão. Finalmente, dentre os problemas decorrentes da intensa imunossupressão necessária para controlar a Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides, se destacam o aumento da incidência de infecções graves e a possibilidade da diminuição do Efeito Enxerto Versus Leucemia, ao qual se atribui o poder curativo do transplante de células-tronco hematopoético alogênico. As células Natural Killer com sua capacidade anti-tumoral inata, parecem ser os principais linfócitos envolvidos no Enxerto Versus Leucemia. Esse estudo teve como objetivo determinar o papel das células-tronco mesenquimais no tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides comparando, de forma randomizada, com a terapia com anticorpos monoclonais padrão; e estudar aspectos relacionados à imunomodulação decorrente da terapia com célulatronco mesenquimal, in vivo, com particular atenção à citocinas a ao comportamento das células Natural Killer neste contexto. Nossos resultados confirmam que a infusão de célula-tronco mesenquimal levam a um aumento significativo da Interleucina 10 de efeito anti-inflamatório, e indicam pela primeira vez, que as células Natural Killer aumentam gradativamente durante e após as infusões de células-tronco mesenquimais tanto em proporção dentre os linfócitos, como no seu grau de ativação, resultando em uma atividade citotóxica significativamente elevada no 280 dia após o início das infusões. Postulamos, inclusive, que a ativação das células Natural Killer seria o mecanismo pelo qual não se observa aumento de recidiva ou das infecções com o emprego de infusões de células-tronco mesenquimais para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the curative therapy for several malignant and non-malignant hematological diseases as well as for immunodeficiences. Although curative, morbidity and mortality are high, been acute Graft versus Host Disease and infections amongst the most frequent life threatening complications. Treatment for acute Graft versus Host Disease is high dose steroids, however, 30 to 50% of the cases are resistant or refractory to it. Steroid resistant or refractory Graft versus Host Disease is a very difficult condition to treat and effective treatment strategies are still to be defined. In this scenario, the intravenous infusion of Mesenchymal Stem Cells has emerged as a tool to rescue patients from that condition because of its immunomodulatory potential. Mesenchymal Stem Cells are adult stem cells with capacity for self-renewal, proliferation and differentiation in mesodermal tissues, particularly chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts. Its immunomodulatory proprieties and effectiveness in several inflammatory diseases are still a matter of intense debate and mostly studied in in vitro conditions. There are several published or ongoing studies on the role of Mesenchymal Stem Cells for steroid resistant acute Graft versus Host Disease, but none randomizing it with monoclonal antibody therapy frequently utilized as treatment with variable results, and complicated by an intense cellular immunodeficiency and severe infections. Since hematologic malignancies are the number one indication for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and the secondary Graft versus Leukemia effect mediated by immune effector cells recognized as responsible for its curative potential, an intense cellular immunodeficiency is not desirable in this scenario. In the last few years, Natural Killer cells have emerged as an effector involved in Graft versus Leukemia sparing the patient of Graft versus Host Disease, however, in vivo Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer crosstalk have not been studied although severe infections and relapse are not increased after Mesenchymal Stem Cells cellular therapy. Here we show that, in spite of the results of most of the in vitro studies suggesting that Mesenchymal Stem Cells inhibits Natural Killer cell activity, in vivo evidences points to an increment of Natural Killer cells number and activity during the several Mesenchymal Stem Cells infusions, particularly at the 28th day after the beginning of infusions, thereby explaining the apparent infection and relapse protection promoted by Mesenchymal Stem Cells.

A medicina regenerativa é um campo fascinante e tem chamado a atenção, nos últimos anos, pelo crescente esforço multidisciplinar em busca de metodologias adequadas para a reposição de tecidos danificados no corpo humano. Entre as técnicas utilizadas para desenvolver matrizes para o uso em engenharia tecidual está o electrospinning. Essa técnica que permite a produção de nanofibras através do uso de forças electrostáticas e tem sido empregado para a produção de matrizes fibrosas. As células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas com alta plasticidade e por isto alvo de muitos estudos terapêuticos. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos sendo que cada um tratou de um objetivo, como segue: (1) cultivar e diferenciar células-tronco mesenquimais em matrizes de nanofibras de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) produzidas através da técnica de electrospinning e investigar o envolvimento de receptores integrina- 1 no processo de adesão em matrizes de PLGA; (2) avaliar a viabilidade celular de células-tronco mesenquimais ou células mononucleares (CMNs) misturadas a uma solução de poli(álcool vinílico) (PVA) e submetidas a produção de fibras por electrospinning. No capítulo I, as CTM foram isoladas de camundongos da linhagem C57BL/6, cultivadas e submetidas a diferenciação condrogênica em matrizes de nanofibras de PLGA produzidas por electrospinning. Análises realizadas 24 horas após a semeadura demonstraram que as CTM eram responsívas e apresentavam morfologia semelhante a de fibroblastos com a presença de fibras de estresse de actina. O bloqueio dos receptores integrina- 1 reduziu (em cerca de 20%) a adesão celular e as observações demonstraram a perda das fibras de estresse de actina. Estes resultados demonstraram a habilidade das nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares mediadas por adesão via integrina. No capítulo II foi avaliada a viabilidade de CTM e CMNs após terem sido processadas pelo electrospinning. As CTM foram extraídas da parede de cordão umbilical e as CMNs do sangue de cordão umbilical. Ambas as células foram misturadas a uma solução de PVA 10% e esta suspensão foi utilizada para produzir fibras pelo processo de electrospinning durante 30 minutos utilizando-se uma voltagem de 21 kV. Após o procedimento a viabilidade celular foi mensurada através de contagem celular com exclusão de células mortas por coloração com Trypan Blue. As CTM tiveram a viabilidade reduzida para 19.6%, e as CMNs para 8.38%. Os dados coletados sugerem a necessidade de mais estudos na busca de estratégias de proteção celular durante o electrospinning, uma vez que a elevada perda da viabilidade celular pode estar relacionada à alta viscosidade da solução polimérica, levando a redução do acesso ao meio nutritivo, associada aos efeitos do estresse mecânico e elétrico inerentes do procedimento. Os resultados gerais destes capítulos (1) demonstraram a habilidade das matrizes de nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares via receptores integrinas- 1; (2) sugerem que a incorporação de células em matrizes fibrosas durante a produção de fibras através da técnica de electrospinning é um procedimento viável e pode ser utilizado como estratégia para a melhor distribuição celular na matriz formada. Juntamente, estes dados contribuem para o entendimento do comportamento das CTM em matrizes biodegradáveis e biocompatíveis produzidas por electrospinning, as quais podem ser utilizadas como material carreador em tratamentos clínicos envolvendo transplante celular. / Regenerative medicine is an amazing field that has called attention, in the last years, due to the multidisciplinary efforts to find suitable methodologies to regenerate damage tissues. Electrospinning is an important technique used to produce nanofibers and is employed to develop fibrous scaffolds. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells with high plasticity and, for this reason, are widely studied in therapeutic approaches. The present study is composed by two chapters, with different aims, as follow: (1) culture MSC on poly(D, Llactide- co-glycolide) (PLGA) nanofiber scaffolds and induce them to condrogenic differentiation and, analyze the influence of the integrin- 1 receptor in the adhesion of MSC on PLGA scaffolds; (2) analyze the viability of MSC and mononuclear cells (MNCs) mixed to a PVA solution after electrospinning. In the Chapter I, MSCs were isolated from C57BL/6 mice, cultured on PLGA scaffold produced by electrospinning technique and differentiated into chondrogenic lineage. After seeding, MSCs were responsive and become flattened with fibroblast-like morphology demonstrated by the presence of actin stress fibers. Integrin- 1 receptor blockage reduced (about 20%) cell adhesion with loss of actin stress fibers, demonstrating the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion. In the Chapter II, the viability of MSC and MNC after electrospinning were analyzed. MSC were extracted from the wall of the umbilical cord, and MNC from the umbilical cord blood. Cells were resuspended in a solution of poly(vinil alcohol) (PVA) 10% and subjected to electrospinning during 30 minutes under a voltage of 21kV. Cell viability was assessed before and after the procedure by exclusion of dead cells by Trypan Blue staining. After electrospinning the MSC viability reduced to 19.6%, and the MNCs viability to 8.38%. These data suggest the need for more investigations looking for strategies to protect cell from the damages caused by electrospinning, as the loss of viability can be related to the high viscosity of the polymeric solution which reduced the access to nutrients associated to the electric and mechanical stress during electrospinning. The results of both chapters (1) demonstrated the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion; (2) suggested that the cellular incorporation into fibrous scaffolds produced by electrospinning is a viable process and can be used to improve the cellular distribution into scaffolds. The present data contribute to the understanding of MSCs´ behavior on these biodegradable and biocompatible scaffolds that can be used as carriers in treatments involving cell transplantation.

Submitted by SARAH MARIA BARNEZE COSTA null (sarahbarneze@hotmail.com) on 2017-04-27T05:04:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final para o Repositório da Unesp - Aluna Sarah Barneze.pdf: 2655925 bytes, checksum: 922eb75a13d7d9ff08b061e4361675e1 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-05-03T14:13:29Z (GMT) / Submitted by SARAH MARIA BARNEZE COSTA null (sarahbarneze@hotmail.com) on 2017-05-03T16:11:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final para o Repositório da Unesp - Aluna Sarah Barneze.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-03T16:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_smb_me_bot.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T16:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_smb_me_bot.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A regulação da remodelação óssea ocorre por meio de fatores locais e sistêmicos. Entre os fatores locais estão as citocinas: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), presente nos osteoblastos, e Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B (RANK), presente nos osteoclastos, além de outras citocinas como o Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) que podem agir no processo de deposição e/ou reabsorção óssea in vivo. Entre os fatores sistêmicos que participam da remodelação óssea estão os hormônios estrógeno (E2) e triiodotironina (T3). O objetivo do trabalho foi verificar a ação do E2, infrafisiológico (simulando a menopausa) e T3, suprafisiológico (simulando hipertireoidismo) em osteoblastos humanos derivados de células troncos mesenquimais (CTMs) na síntese proteica de RANKL e TNF-α. Os osteoblastos foram incubados por 72 horas na presença de E2 em dose fisiológica (E2F/10-8M) e infrafisiológica (E2I/10-9M), e T3 em dose fisiológica (T3F/10-9M) e suprafisiológica (T3S/10-8M), e quantificada a matriz mineralizada óssea e a síntese proteica de RANKL e TNF-α por Western Blot. A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste de variância ANOVA complementada pelo teste de Tukey, sendo o nível de significância considerado p<0,05. O tratamento de E2 em dose E2F (1,96± 0,48; p<0,05) e E2I (3,18±0,31; p<0,001) elevou a síntese proteica de RANKL comparado ao controle (C) (1,00±0,32), e de TNF-α em dose de E2F (3,61±0,45; p<0,05) e E2I (2,45±0,07; p<0,05) também aumentou em relação ao C (1,13±0,19). Assim como o E2, o T3 elevou os níveis proteicos de RANKL em T3F (1,18±0,10; p<0,05) e T3S (1,14±0,004; p<0,05) comparado ao controle (1,00±0,02), porém, TNF-α diminui em dose de T3S (0,82±0,09; p<0,05) relacionado ao T3F (1,00±0,09) e C (0,99±0,04). Com isso, E2I diminuiu a matriz mineralizada óssea e aumentou a síntese de ambas as proteínas estudadas, o que nos leva a especulação de que a reabsorção óssea observada na menopausa seja via RANKL e TNF-α. Por outro lado, na mimetização de hipertireoidismo com o T3S, observamos diminuição da matriz mineralizada óssea, supressão da síntese proteica de TNF-α e aumento de RANKL, o que nos leva a inferir que o mecanismo de reabsorção óssea no hipertireoidismo seja via RANKL. / The regulation of bone remodeling is intermediated by local and systemic factors. The cytokines are among the local factors: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), present in osteoblasts, and Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B (RANK), present in osteoclasts, in addition to other cytokines such as Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) that can act in the process of bone deposition and/or resorption in vivo. Hormones are among the systemic factors involved in bone remodeling, estrogen (E2) and triiodothyronine (T3). The aim of the study was to verify the action of E2, infraphysiological (simulating menopause) and T3, supraphysiological (simulating hyperthyroidism) in human osteoblasts derived from mesenchymal stem cells (CTMs) in the protein synthesis of RANKL and TNF-α. Osteoblasts were incubated during 72 hours in the presence of E2 at physiological dose (E2F/10 -8 M) and infraphysiological (E2I/10 -9 M), and T3 at physiological (T3F/10 -9 M) and supraphysiological (T3S/10-8 M) and quantified the bone mineralized matrix and the protein synthesis of RANKL and TNF-α by Western Blot. Statistical analysis of the data was performed by the ANOVA variance test complemented by the Tukey test, and the significance level was considered p<0.05. The treatment of E2F in E2F dose (1.96 ± 0.48, p<0.05) and E2I (3.18 ± 0.31; p <0.001) increased RANKL protein synthesis compared to control (C) (1.00 ± 0.32), and TNF-α in the dose of E2F (3.61 ± 0.45; p<0.05) and E2I (2.45 ± 0.07; p <0.05) also increased in relation to C (1.13 ± 0.19). As with E2, T3 increased RANKL protein levels in T3F (1.18 ± 0.10, p <0.05) and T3S (1.14 ± 0.004; p <0.05) compared to control (1 , 00 ± 0.02), but TNF-α decreased in dose T3S (0.82 ± 0.09; p <0.05) related to T3F (1.00 ± 0.09) and C (0, 99 ± 0.04). Thus, E2I decreased the bone mineralized matrix and increased the synthesis of both proteins studied which leads to speculation that bone resorption observed at menopause by RANKL and TNF-α pathway. On the other hand, in the mimicry of hyperthyroidism with T3S, we observed a reduction of the bone mineralized matrix, suppression of TNF-α protein synthesis and increase of RANKL, which leads us to infer that the mechanism of action for bone resorption in hyperthyroidism is by RANKL. / FAPESP: 2014/15529-0

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O câncer é o nome dado a um conjunto de doenças relacionadas responsáveis pelas maiores taxas de morte ao redor do mundo, tanto em países mais ou menos desenvolvidos. Dentre eles está o Glioblastoma Multiforme (GBM), originado nas células gliais e classificado como um astrocitoma de grau IV, caracteristicamente agressivo e invasivo. Sabendo da baixa expectativa de vida dos pacientes com esta condição, terapias alternativas têm sido incentivadas de forma a tentar combater o tumor com as mais diversas estratégias, visando atingir todas as células da massa tumoral. O uso de células mesenquimais (MSCs) como carreador de terapias à tumores já vem sendo investigado e tem apresentado bons resultados, entretanto, estabelecer um protocolo de administração efetivo é essencial. Uma das estratégias que se tem usado para entender esse potencial migratório é sua marcação com nanopartículas magnéticas. Por isso, este estudo teve como objetivo investigar e comparar a administração de MSCs por via intranasal e endovenosa em um modelo murino de glioma. Para tal, as MSCs foram isoladas de lipoaspirado humano e marcadas com nanopartículas magnéticas para visualização e quantificação in vivo. Foi feita a transdução lentiviral da linhagem tumoral U87MG com luciferase para facilitar o estabelecimento do modelo animal de glioma por meio de acompanhamento de sua bioluminescência. Posteriormente, as MSCs marcadas com nanopartículas foram administradas pelas vias intranasal e endovenosa em camundongos imunodeficientes previamente enxertados com células U87MG e, ao final, sua capacidade migratória foi avaliada por meio de analise histológica e determinação da biodistribuição de ferro por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente. Os dados obtidos foram analisados conforme o teste estatístico apropriado e apresentados como média e erro padrão. Observamos por meio dos ensaios in vitro que a marcação das MSCs com nanopartículas foi eficiente, visto que foi possível evidenciar o ferro na célula e estas tiveram tendência migratória em direção ao campo magnético. O estabelecimento da linhagem tumoral modificada com luciferase foi efetivo, porém a transdução com GFP não foi efetiva, visto que poucas células se mostraram fluorescentes. Já nos ensaios in vivo, a administração das MSCs marcadas após o estabelecimento do modelo murino de glioblastoma demonstrou uma maior eficiência da via intranasal, pois teve um maior acúmulo de ferro no cérebro e menor concentração nos pulmões, em comparação com a via endovenosa. Dessa forma, a via intranasal se mostrou mais eficaz e deve ser priorizada quando o objetivo é atingir o cérebro e reduzir possíveis efeitos associados ao acúmulo do tratamento nos pulmões. / Cancer is the name given to a set of related diseases responsible for highest death rates around the world, both in underdeveloped or developed countries. Among them, is Glioblastoma Multiforme (GBM), which originates in glial cells and is classified as a grade IV astrocytoma, characteristically aggressive and invasive. Knowing low life expectancy of patients with this condition, alternative therapies have been encouraged in order to try to fight tumor with most diverse strategies, aiming to reach all cells of the tumor mass. The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) as a carrier of tumor therapies has been investigated and has shown good results, however, establishing an effective administration protocol is essential. One of the strategies that has been used to understand this migratory potential is labbeling the cells with magnetic nanoparticles. Therefore, this study aimed to investigate and compare intranasal and intravenous administrations routes for MSCs in a murine model of glioma. For this, human MSCs were isolated from liposuction and labeled with magnetic nanoparticles for visualization and quantification in vivo. Transduction of the U87MG tumor cell line with luciferase lentiviral particles was performed to facilitate establishment of the animal model of glioma by monitoring bioluminescence. Subsequently, MSCs labeled with magnetic nanoparticles were injected intravenously and intranasally in immunodeficient glioblastoma mice model with U87MG cells and, ultimately, their migratory capacity was evaluated by both histological analysis and biodistribution of iron analised by optical emission spectrometry with inductively coupled plasma. Data were analyzed by using appropriate statistical tests and reported as mean and standard error. We observed through in vitro assays that labelling and further tracking of MSCs with nanoparticles was efficient, since it was possible to evidence the iron into the cell and these had a migratory tendency towards the magnetic field. Establishment of luciferase-expressing tumor line was effective, but the GFP transduction was not effective, since few cells were fluorescent. In the in vivo assays, after established of glioblastoma murine model, we observed a higher efficiency of intranasal administration route when comparing to endovenous route. Higher accumulation of iron in brain and a lower concentration in lungs were found in intranasal group, in comparison with intravenous route group. Thus, intranasal route has proven to be more effective and should be prioritized when the goal is to reach brain and reduce possible effects associated with accumulation of treatment in lungs.

Tese de Mestrado Integrado. Bioengenharia. Área de Especialização de Biotecnologia Molecular. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Tese de programa doutoral. Engenharia Biomédica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000425136-Texto+Completo-0.pdf: 6824100 bytes, checksum: a0f00fc5697ef7ef0055b9577b7dbbbe (MD5) Previous issue date: 2010 / Type I diabetes mellitus (DM1) is an organ-specific autoimmune syndrome characterized by the selective destruction of insulin-producing β cells in the pancreatic islets. The search for therapeutic alternatives for DM1, the β cell mass and consequently the reconstitution of physiological secretion of insulin have been extensively done. Among different treatments strategies studied, cell therapy based on mesenchymal stem cells is one of the most extensively studied. Searching for a product that mimics qualitative and quantitatively the characteristics of pancreatic β cells, protocols must be improved and the capacity of (trans) differentiation of new sources of tissue-specific must be explored. In this way, the aim of this work was to compare the capacity of expansion and differentiation in vitro of murine mesenchymal stem cells, isolated from kidney, pancreas and bone marrow, evaluating its capacity of differentiation into insulin-producing cells (IPCs). From the results, it was evident that these cell populations were able to (trans) differentiate into the pancreatic endocrine cell-like phenotype. When cultured in vitro in a rich inducing-media, cells were characerized by cluster formation with spherical morphology, positive dithizone staining and expression of insulin-1 at the mRNA and protein level. Moreover, IPCs derived from mesenchymal stem cells reversed the pancreatic hyperglycemic state when transplanted into the kidney capsule of chemically induced diabetic mice, indicating that in vitro they are able to differentiate into functional IPCs. / O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome auto-imune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas. A busca por alternativas terapêuticas para o DM1, voltadas à preservação e/ou regeneração da massa de células β e, consequentemente, à reconstituição do padrão fisiológico de secreção de insulina, tem sido exaustivamente realizada. Dentre as estratégias de tratamento estudadas, destaca-se a terapia celular baseada na utilização de células-tronco mesenquimais. Na busca por um produto que mimetize qualitativamente e quantitativamente as características das células β pancreáticas, protocolos devem ser aperfeiçoados e a capacidade de (trans)diferenciação de novas fontes celulares tecido-específicas devem ser exploradas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade de expansão e diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais murinas, isoladas do rim, pâncreas e medula óssea, avaliando sua capacidade de diferenciação em células produtoras de insulina. Evidenciou-se que estas populações celulares são capazes de se (trans) diferenciar em células com fenótipo pancreático endócrino, quando cultivadas em meio rico em indutores, incluindo morfologia esférica, formação de clusters, secreção de insulina (com a conseqüente coloração positiva para ditizona) e expressão in vitro do gene e da proteína da insulina-1. Além disso, células produtoras de insulina (CPIs) derivadas de células-tronco mesenquimais pancreáticas reverteram o estado hiperglicêmico quando transplantadas em cápsula renal de camundongos diabéticos, indicando que são capazes de diferenciarem-se in vitro em CPIs funcionais e de manterem esta funcionalidade in vivo.