Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T14:37:08Z No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T14:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, acomete entre 7 e 8 milhões de pessoas especialmente na América Latina e Caribe, apresentando manifestações em órgãos associados ao sistema digestivo e cardíaco. A principal manifestação na fase crônica determinada é a cardiopatia chagásica e pode acometer entre 10 e 30% dos indivíduos infectados. Diante da ineficiência do tratamento, estudos com ênfase na biologia de interação parasita-hospedeiro têm sido desenvolvidos na busca de moléculas inovadoras que possam ser usadas para a prevenção, tratamento e/ou diagnóstico. A aplicação da genômic a funcional na interação T. cruzi-célula hospedeira tem como desafio desvendar a regulação de genes na célula alvo, buscando estratégias que enfoquem mecanismos de sobrevivência e replicação do parasita. A abordagem cinética utilizada neste trabalho (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 24 horas de infecção) para analisar a expressão gênica global através da metodologia inovadora de RNA-Seq proporcionou um melhor entendimento dos eventos que culminam na ativação coordenada e temporal de moléculas durante a interação T. cruzi-cardiomiócito. Identificamos 572 genes modulados, sendo que 371 apresentavam expressão gênica induzida e 201 reprimidos. Nossos resultados revelam que o T. cruzi induz uma modulação gênica dinâmica com 18 genes alterados após uma hora de interação. No estágio inicial da infecção (1 a 4 horas), os genes modulados encontram-se relacionados com a estratégia de invasão do parasita e, principalmente, com a resposta de cardiomiócitos induzindo genes relacionados à resposta imune e atividade tripanocida. Neste contexto, evidenciamos a ativação de genes envolvidos com a resposta pró-inflamatória, estresse oxidativo e metabolismo de radicais livres indicativos da tentativa da célula cardíaca de conter a disseminação do parasita. Com o avanço da infecção, constatamos a modulação de genes integrados com o remodelamento do citoesqueleto e rigidez celular, provavelmente associado com a acomodação do parasita intracelular, e ainda repressão de genes relacionados com junções celulares e manutenção da arquitetura celular. Distúrbios na expressão de genes envolvidos em vias metabólicas mitocondriais apontam para uma deficiência energética e disfunção mitocondrial induzida pelo T. cruzi. Destacamos ainda alterações em genes associados à hipertrofia, principalmente relacionados à IL1 e IL6, receptor toll-like 2 e GSK3B, desde os tempos iniciais de infecção (1 a 4 horas). O remodelamento associado à matriz extracelular apresentou genes com padrão diminuído principalmente no ponto de 24 horas quando a taxa de infecção ultrapassa 75%, sendo as alterações relacionadas aos genes de colágeno e fibronectina. Genes associados à apoptose com perfil pró- e anti-apoptótico foram diferencialmente modulados nas diferentes fases da infecção, sugerindo que a indução ou repressão da apoptose pode estar diretamente relacionada a dispersão do parasita, controle da carga parasitária no hospedeiro e/ou escape da resposta imune Dessa forma, a identificação de genes importantes para adaptação do T. cruzi no microambiente da célula cardíaca aliada à modulação de genes envolvidos na resposta desta célula alvo contribuirá para aplicação de novas estratégias de controle deste parasita, possibilitando a seleção de potenciais alvos vacinais e/ou terapêuticos. / Chagas` disease, caused by Trypanosoma cruzi, affects between 7 and 8 million people especially in Latin America and Caribbean, presenting manifestations in organs associated with the digestive system and heart. The main clinical manifestation on symptomatic chronic phase is chagasic cardiophaty and may affect about 10 to 30% of infected individuals. Given the ineffectiveness of the treatment, studies with emphasis on biology of host-pathogen interaction have been carried out to search innovative molecules that can be used to prevention, treatment and/or diagnosis. The application of functional genomics in the T. cruzi-host cell interaction has as its goal to display the regulation of genes in the target cell, seeking strategies that focus on mechanisms of survival and replication of the parasite. The kinetic approach used on this research (1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24 hours of infection) to analyse the global gene expression by RNA-Seq, an innovative methodology, provide a better understanding of events that culminate in coordinated and temporal activation of molecules during T. cruzi-cardiomyocyte interaction. We identified 572 modulated genes, where 371 were induced and 201 repressed. Our results indicate that T. cruzi induces a dynamic gene modulation with 18 genes altered after one hour of interaction. On early stage of infection (1 to 4 hours), the modulated genes are related to immune response and trypanocydal activity. In this context, we observed the activation of genes involved in pro-inflammatory response, oxidative stress and free radical metabolism indicating that the cardiac cell attempts to control the dissemination of the parasite. With the progression of the infection, it was evident the modulation of genes involved in cytoskeleton remodeling and cell stiffness, probably associated with intracellular parasite accommodation and repression of cell junctions genes as well as cell architecture maintenance genes. Alterations in expression of genes involved in metabolic pathways point to a mitochondrial dysfunction and energy deficiency induced by T. cruzi. We also point out changes in genes associated with hypertrophy, mainly related to IL1, IL6, toll like receptor 2 and GSK3B from early times of infection (1 to 4 hours). Remodeling associated to extracellular matrix showed genes with decreased expression mainly at 24 hours when the infection exceeds 75%, specially collagen- and fibronectin-related genes. In addition, genes associated to apoptosis with pro- and anti- apoptotic activity were differentially modulated in different stages of infection, suggesting that induction or repression of apoptosis may be directly related to parasite spread, the parasite load control in the host and/or escape of immune response. Thus, the identification of genes important to adaptation of T. cruzi on the microenviroment of the cardiac cell combined with modulation of genes involved in the response of the target cell will contribute to implementation of new strategies to control this parasite, allowing the selection of potential vaccine and/or therapeutic targets.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290486.pdf: 1666475 bytes, checksum: bb23fc6e1b917c81adfeef1749eecfa9 (MD5) / O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente da parede de bactérias Gram-negativas capaz de induzir respostas inflamatórias sistêmicas pela capacidade de ativar o fator de transcrição nuclear .B (NF-.B). Além do LPS, a presença de citocinas como IFN-., também promovem a ativação do NF-.B. Uma vez que este fator é ativado, inúmeros genes pró-inflamatórios são transcritos, elevando a expressão de citocinas como TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-. e a enzima NOS-2. Um dos mecanismos endógenos anti-inflamatórios mais importantes é a ativação de receptores de glicocorticoides (GR). Utilizando um modelo in vitro baseado em aspectos relevantes da sepse, uma doença de cunho inflamatório, mostrou-se que células musculares lisas (CML) de aorta de rato da linhagem A7r5 são ativadas pelo estímulo LPS/IFN produzindo NO, dosado na forma do seu metabólito, nitrito. De forma inédita, observou-se que a ativação das CML depende de um pulso inicial de NO oriundo de NOS constitutivas, uma vez que a inibição do mesmo diminui substancialmente a ativação celular. Além do pulso de NO, ocorre também uma rápida produção de EROs após estimulação das células com LPS. A caracterização e presença de GR funcionais nestas células permitiram o acompanhamento da sua dinâmica após estimulação com LPS/IFN. Surpreendentemente, a estimulação com LPS/IFN induz um aumento na translocação nuclear destes receptores de forma concomitante com a translocação nuclear do NF-.B, cuja intensidade de translocação é parcialmente regulada pelo NO. Outro fator que parece intermediar a translocação nuclear de GR e NF-.B e exercer um papel fundamental no curso da ativação celular é o peroxinitrito, que pode estar sendo formado imediatamente após a estimulação das células pela reação do pulso de NO com o ânion superóxido. Os resultados mostram que o NO e seus derivados desempenham um papel fundamental no início da ativação celular e na translocação nuclear de GR, contribuindo para o entendimento do início do processo de ativação celular.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 4007869 bytes, checksum: 0e78144e6b2359cfeef2c86295e32ff0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é a principal causa de lesões cardíacas em jovens adultos economicamente produtivos em áreas endêmicas da América Latina. A cardiopatia chagásica (CC) se caracteriza como uma doença progressivamente debilitante, na qual o TGF-\03B2 desempenha papel fundamental para o desenvolvimento da fibrose e hipertrofia cardíacas, através da regulação de componentes da matriz extracelular (MEC), tais como a fibronectina, as metaloproteases (MMPs) e os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). No presente estudo, foi verificada a capacidade do inibidor farmacológico da via de TGF-\03B2, SB-431542, em restaurar o equilíbrio da MEC, rompido pela infecção por T. cruzi, e os prováveis mecanismos envolvidos neste processo. Para tal, utilizamos um modelo tridimensional (3D) de cultivo de células cardíacas (denominados esferóides cardíacos), capaz de mimetizar aspectos da arquitetura e fisiologia do tecido cardíaco. O tratamento dos esferóides cardíacos infectados por T. cruzi com SB-431542 resultou na redução parcial da hipertrofia e fibrose dos esferóides cardíacos, por mecanismos envolvendo a redução na expressão de TIMP-1, o aumento na atividade das MMPs 2 e 9, a redução na expressão da fibronectina e a redução da carga parasitária Através de uma abordagem proteômica, conseguimos ainda identificar outras proteínas possivelmente envolvidas no processo de reversão da fibrose e hipertrofia dos esferóides cardíacos a partir do tratamento com SB-431542, como as integrinas, fibulinas, proteínas de ligação ao selênio, a titina, entre outras. Além disso, as análises proteômicas nos permitiram identificar alguns dos componentes moleculares envolvidos no processo de remodelamento do tecido cardíaco disparado pela infecção por T. cruzi, auxiliando assim, na compreensão dos mecanismos associados à progressão da hipertrofia e da fibrose ao longo do desenvolvimento da CC. Dessa forma, nosso estudo fornece novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares através dos quais o composto SB-431542 é capaz de reverter a fibrose e a hipertrofia gerada pelo T. cruzi durante a CC, além de validar o modelo 3D de cultivo de células cardíacas como uma ferramenta eficaz para a avaliação in vitro de compostos anti-fibróticos e agentes tripanossomicidas / Chagas disease represents the leading cause of cardiac lesions in economically productive adults in endemic areas of Latin America. Chagasic cardiomyopathy (CC) is a progressive dysfunctional illness, in which TGF - β plays a central role in development of f ibrosis and hypertrophy through regulation of extracellular matrix (ECM) components, such as fibronectin, matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). In the present study we tested the efficacy of a pharmacological inhibitor of TGF - β signaling pathway, SB - 431542, in restoring ECM balance disrupted by T. cruzi infection and the possible mechanisms involved in this process. For that, we used a three - dimensional (3D) model of cardiac cells culture (named cardiac sphero ids) that can mimic aspects of architecture and physiology of living cardiac tissues better than conventional two - dimensional (2D) models. Treatment of T. cruzi - infected - cardiac spheroids with SB - 431542 resulted in a reduction of spheroids hypertrophy and fibrosis by mechanisms involving a decrease in the expression of TIMP - 1, an increase in the activities of MMP - 2 and MMP - 9, a reduction in the expression of fibronectin and a reduction of parasite load. Moreover, we identified through a proteomic approach , other proteins possibly involved in reversion of fibrosis and hypertrophy of cardiac spheroids after treatment with SB - 431542, such as integrins, fibulins, selenium binding proteins and titin, among others. In addition, the proteomic analysis allowed us to identify molecular components involved in tissue remodeling generated by T. cruzi infection, assisting in the comprehension of mechanisms related to fibrosis and hypertrophy progression during CC’s development. Thus, our study provides new insights over t he molecular mechanisms by which SB - 431542 reverts fibrosis and hypertrophy generated by T. cruzi during CC and also validates the 3D model of cardiac cells culture as a powerful tool to evaluate in vitro the effect of anti - fibrotic and trypanocidal agents

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 francisco_junior_ioc_mest_2007.pdf: 5291215 bytes, checksum: 88ec236330fd3ac74ad110315d9ceb1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)... (...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi... (...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of Trypanosoma cruzi to recognize molecules at the surface of both the phagocytic and non-phagocytic cells is essential to its survival in the vertebrate host. The role of the sulfated proteoglycans in the cell reco gnition process has been reported in several human pathogens, including T. cruzi . Data from our group have demonstrated the participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP G) of cardiomyocytes in the invasion for forms trypomastigotes. However, the structure of th e HSPG molecule involved in the receptor-ligand interaction and the role of other s ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the invasion process have not been elucidated yet. To evaluate the participation of GAGs in T. cruzi invasion, trypomastigotes, clone Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke ratan sulfate (KS) or three distinct fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym atic (heparitinase I and II) and nitrous acid treatments. For competition assays, the untrea ted or soluble GAGs pre-treated parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca rdiomyocyte cultures and the percentage of infection was determined after Giemsa staining. Our results revealed a significant inhibition of the infection index of 84.8% and 45% after treatment of the parasites with heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment, respectively, suggesting the important role of the ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS] 3 -[GlcUA-GlcNAc] 4 [GlcNAc]) domain of the HS chain in the T. cruzi -cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm ent of the parasites with KS, N- acetylated or N-sulfated fragments did not display any effect in the invasion process. The role of sulfation in the recognition and invasion p rocess was evaluated by treating the cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ ent concentrations of sodium chlorate, followed by trypomastigotes infection (2h). The dec line of sulfation resulted in the reduction (dose dependent) of the infection index, achieving inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6% after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM , 50mM and 75mM of sodium chlorate, respectively, suggesting the participation of negat ive charge as modulator of the specific recognition with the NA/NS domain of HS chain. Additionately, biochemical assays were performed to characterize the heparin binding protein present at the surface of T. cruzi . Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa were identified in the total protein extract of all evolutive forms of T. cruzi by Western blotting , using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa te (CS) and -HS. The T. cruzi heparin ligand was isolated by association of Triton X-114 extraction method and heparin-Sepharose affinity chromatography. After metabolic labeling ( 35 S-Methionine), the hydrophobic proteins were isolated by affinity column and separated by S DS-PAGE, revealing a protein profile, similar to total protein extract, with two major ba nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r espectively. The isotopic analysis also revealed a higher expression of heparin ligand (1.3 -2X) in trypomastigotes when compared to epimastigotes. The heparin binding proteins were detected at membrane fraction of epimastigotes obtained by cell fractionation method ology associated to the affinity column purification. The detection of proteins eluted from heparin affinity column with biotinilated heparin, CS and HS by Western blotting revealed intense labeling mainly at the 59 kDa protein. In addition, the analysis of the proteins by denaturant electrophoresis revealed the presence of two protein band in both trypomastigote s and epimastigotes forms of T. cruzi . Complementary biochemical assays will be carried ou t to get more detailed information about the T. cruzi heparin binding protein.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:18:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torsoni_AdrianaSouza_D.pdf: 11780689 bytes, checksum: df0db8e2a1746ca552768be3fb477c68 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Uma variedade de estímulos, como a sobrecarga hemodinâmica, pode levar a um aumento de tensão mecânica em cardiomiócitos, que normalmente é compensado pelo desenvolvimento de um fenótipo hipertrófico. A resposta inicial à sobrecarga é caracterizada por uma rápida e coordenada ativação de vias de sinalização intracelulares que regulam a expressão gênica e culminam com o crescimento hipertrófico de cada cardiomiócito. A importância relativa de cada elemento que participa das vias de sinalização e sua contribuição para as alterações adaptativas observadas nos miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressora têm sido o foco de diversas pesquisas. No presente estudo, investigamos a ativação e localização subcelular da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos (MVRN) submetidos a ciclos de estiramento, além da sua participação na ativação do gene do fator natriurético atrial (ANF). O estiramento pulsátil dos cardiomiócitos, de 5 a 20%, por períodos de 10 a 120 minutos, levou a um aumento da fosforilação da FAK no seu resíduo de tirosina 397, conforme detectado pelo anticorpo fosfoespecífico. Tal ativação foi paralela com uma alteração na localização da Fak em MVRN que, da região perinuclear em miócitos não estirados, passou a distribuir-se ao longo dos miofilamentos, como agregados protéicos, em células estiradas. Além disso, 4 horas de estiramento pulsátil aumentou a atividade do gene repórter da luciferase contendo o promotor do ANF. A interrupção da sinalização pelo complexo endógeno Fak/Src, seja pela expressão de um mutante negativo de Fak, onde a tirosina foi substituída por fenilalanina no resíduo 397, ou pelo tratamento com um inibidor farmacológico da c-Src, diminuiu severamente a ativação da Fak e sua redistribuição ao longo dos miofilamentos, mediados pelo estiramento, além de inibir a ativação do gene do ANF. No entanto, a expressão de um mutante selvagem de Fak potencializou a fosforilação dessa quinase, induzida por estiramento, sem alterar a expressão gênica do ANF, em comparação aos MVRN não transfectados...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: A variety of stimuli, such as hemodynamic overload, can lead to an increase in mechanical stress on cardiomyocytes that can be compensed by the development of a hypertrophyc phenotype. The hypertrophyc response is characterized by a rapid and coordinate activation of intracellular signaling pathways that regulate gene expression and results in a hypertrophyc growth of cardiac myocyte. The relative importance of each element that participate of signaling pathway and its contribution for the adaptative changes observed in cardiac myocyte in response to pressure overload, has been the focus of diverse researches. In the present study we investigated the Fak activation and subcellular localization in neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) submitted to pulsatile stretch, instead its participation in the atrial natriuretic factor (ANF) gene activation 5% to 20% (10-120 minute) pulsatile stretch of NRVMs lead to an increase of Fak phosphorylation at Tyr-397, as detected by phosphospecific antibody. This activation was accompanied by a change in Fak localization in NRVMs that, of the perinuclear regions in nonstretched cells change to aggregates regularly distributed along the myofilaments in stretched cells. Furthermore, a 4-hour cyclic stretch enhanced the activity of the ANF promoter-luciferase reporter gene. Disrupting endogenous FaklSrc signaling either by expression of a dominant-negative Fak mutant with phenylalanine substituted for Tyr-397 or by treatment with a c-Src pharmacological inhibitor markedly attenuated stretchinduced Fak activation and its redistribution at myofilaments and inhibited stretch-induced ANF gene activation...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kobarg_ClaudiaBandeira_D.pdf: 12392053 bytes, checksum: 66c2ce6a08c2f6b19b841868e0e5815d (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As proteínas da família MEF2 são fatores de transcrição do tipo MADS-box que desempenham papéis importantes na regulação da miogênese e da morfogênse do miocárdio. Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratório anteriormente, demonstraram que a rápida ativação de MEF2 por estímulo hipertrófico exerce um papel principal na ativação de c-jun, sugerindo sua importância na regulação da expressão de genes de resposta imediata por estímulo hipertrófico. o presente trabalho teve como objetivo estudar a expressão e regulação dos fatores MEF2 frente à sobrecarga mecânica. Foi demonstrado que os fatores MEF2 são ativados em resposta à sobrecarga mecânica em coração de rato. Essa ativação não ocorreu por um aumento na expressão de MEF2, mas provavelmente, por alguma modificação póstranscricional na proteína, aumentando assim a afinidade ao seu DNA consenso em ensaio de EMSA o método de duplo-híbrido em levedura foi utilizado para encontrar proteínas que interajam com MEF2 e atuem na sua regulação em resposta ao estímulo mecânico. Numa triagem de biblioteca de coração de rato previamente submetido à coarctação da aorta com uma "isca" de MEF2C, foram encontrados 4 c1ones de cDNA contendo a região C-terminal de miosina de cadeia pesada e 4 c1onescontendo a região Nterminal da proteína regulatória Ki-1I57. A interação entre MEF2C e miosina foi confirmada por imunoprecipitação em coração de rato e a interação entre MEF2C e Ki-1I57 foi confirmada por imunoprecipitação, ensaio de co-precipitação e análise microscópica de imunolocalização. A interação entre MEF2 e Ki-1I57 é dependente de estímulo mecânico no coração. Um ensaio de imunoprecipitação com anticorpo anti-MEF2 demonstrou uma associação basal entre essas duas proteínas no ventrículo esquerdo de ratos controle. No entanto, o estímulo mecânico causou uma redução significativa nesta associação. Ki-l/57 se apresentou co-Iocalizado com MEF2 no núcleo de miócitos de ratos controle. Porém, ao submeter ratos a coarctação da aorta, essa co-Iocalização não foi mais observada no núcleo dos miócitos. Ki-1I57 também exerce um efeito inibitório sobre a ligação de MEF2 a sua região consenso de DNA em ensaio de EMSA Esses resultados sugerem que a interação de Ki-l/57 com :MEF2é inibitória e que esteja envolvida com a regulação de MEF2 em resposta ao estímulo mecânico no coração / Abstract: The MEF2 proteins family is composed of MADS box transcription factors that plays important roles in the regulation of myogenesis and morphogenesis of myocardium. Previous work developed in our laboratory showed that the early activation of MEF2 proteins by mechanical overload plays a main role in the actívation of c-jun, suggestíng its importance in the regulation of irnmediate early genes response to mechanical overload The present work objective was to study the expression and regulatíon of MEF2 factors in face of mechanical overload. 1t was demonstrated that the MEF2 factors are activated in response to mechanical overload in rat heart This activation did not occur by an increase in MEF2 expression, but probably by some kind of post-transcriptíonal modification in the protein, raising the affinity ofMEF2 to its DNA in EMSA experiments. The yeast two-hybrid system was used to find proteins that interact with MEF2 and act in its regulation in response to mechanical overload In a rat heart library screening witb MEF2C as bait, four cDNA c1ones encoding a C-terminal region of Myosin Heavy Chain were isolated, as well as four c1ones encoding the N-terminaI region of the regulatory protein Ki-l/57. Tbe interaction between MEF2C and myosin was confirmed by irnmunoprecipitation in rat beart and the interactíon between MEF2C and Ki-1I57 was confirmed by immunoprecipitation, pull down assay and immunlocalization by laser confocaI microscopic analysis. The interactíon of :MEF2with Ki-l/57 is dependent on mechanical overload in the beart. An immunoprecipitation assay using anti-MEF2 antibody sbowed a basal association between these two proteins in left ventric1eof control rats. However, the mecbanical overload caused a significant reduction in this association. Ki-l/57 co-Iocalizes with MEF2 in the nuc1eusof myocytes of control rats. On the other hand, after submitting the animais to transverse aortic constriction, this co-Iocalization in the nucleus was no longer observed. Ki-1I57 also exerts an inhibitory effect upon MEF2C's DNA binding activity. These results suggest that the interaction between MEF2 and Ki-l/57 is inhibitory and that it may be involved in the regulation ofMEF2 in response to mechanical stimulus in the heart / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

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Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Victorio_SheilaCristinadaSilva_M.pdf: 1499738 bytes, checksum: 1208b4b617e591a974a869b7fa20a388 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O crescimento e função prostática dependem da estimulação androgênica e interação epitélio-estroma. Além dos andrógenos, outros fatores interagem com a próstata e são igualmente importantes para sua fisiologia. Sabe-se que os estrógenos exercem um importante papel no desenvolvimento prostático e que, combinados com andrógenos, podem contribuir para o aparecimento de patologias. A insulina é outro hormônio que afeta a atividade destes hormônios sexuais nos tecidos, inclusive na próstata. Os níveis séricos de esteróides sexuais estão intimamente relacionados com a sensibilidade a insulina, embora esta relação ainda seja pouco esclarecida. No estroma prostático, as células musculares lisas são o tipo celular predominante, influenciando a atividade do epitélio por mecanismos parácrinos e modificando a matriz extracelular em situações de remodelação, como no crescimento, na regressão e na invasão tumoral. Sabe-se que estas células apresentam receptores de andrógeno (AR) e que respondem à privação androgênica, alterando sua morfologia. O presente estudo buscou verificar a influência da testosterona, estradiol e insulina sobre a expressão e localização do AR em células musculares lisas da próstata ventral de ratos Wistar cultivadas in vitro. Os resultados mostraram que o estradiol causou alterações nos níveis protéicos, os níveis de RNAm do AR foram pouco afetados e a localização do AR foi predominantemente nuclear independente da dose de estradiol. Os tratamentos feitos com insulina mostraram que a sua presença causou uma queda da expressão da proteína e uma localização predominante nuclear do AR na situação em que os dois hormônios, insulina e testosterona, foram administrados juntamente. Os resultados permitem sugerir que a expressão do AR pode ser modulada por outros fatores como estrógeno e insulina / Abstract: The prostate function and growth depends on the androgenic stimulation and epitheliumstroma interaction. Besides androgens, other factors interact with the prostate and are also important for its physiology. It is known that estrogens exert an important role in prostate development, and combined with androgens they can contribute for the appearance of pathologies. The insulin is another hormone that interacts with these sexual hormones in tissues, and also in the prostate. The serum levels of sexual steroids are closely related with the sensitivity to the insulin, even though this relation is not yet clear. In prostatic stroma, smooth muscle cells are the predominant cell type. They influence the activity of the epithelium through paracrine mechanisms and modify the extracellular matrix in remodeling situations, such as gland growth and regression, and during tumor invasion. It is known that these cells express androgen receptor (AR) and respond to androgen deprivation by modifying its phenotype. The present study was undertaken to verify the influence of testosterone, estradiol and insulin on the expression and localization of the AR in the smooth muscle cells from the Wistar rat ventral prostate cultured in vitro. The results showed that estradiol caused alterations in the AR protein levels, the mRNA level was less affected and AR localization was predominantly nuclear irrespective of the estradiol dose. Insulin treatments caused a decrease in the expression of the protein and a predominant nuclear localization of AR in the presence of testosterone. The results suggest that AR expression and regulation might be modulated by others factors such as estrogen and insulin / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T18:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonioli_Eliane_D.pdf: 2188815 bytes, checksum: f2d0da35f06c89ebb912a05bcce1dc39 (MD5) Previous issue date: 2007 / resumo: As células musculares lisas (CML) são o principal componente do estroma prostático e desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia do órgão, atuando na contração durante a ejaculação, na sua remodelação frente a neoplasias e/ou privação androgênica, na produção de fatores parácrinos e na síntese/degradação/reorganização da matriz extracelular, segundo um intrincado mecanismo de comunicação com as células epiteliais. Além disso, tem sido também proposto que a invasão tumoral depende de uma participação ativa das células estromais, inclusas as CML, na produção de metaloproteinases de matriz (MMPs) e/ou seus inibidores dentre outros fatores. O presente estudo investigou a expressão dos marcadores de músculo liso na próstata ventral de ratos após longo período de castração. Em outra frente de investigação foi analisado o efeito do estiramento mecânico no comportamento das CML in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que as CML são afetadas pela privação androgênica. Embora demonstrem mudanças morfológicas, estas células expressam marcadores de músculo liso em nível de proteína (a-actina e cadeia pesada da miosina de músculo liso) e de RNAm (smoothelin, sm22 e calponina). Estes resultados suportam a idéia de que CML prostática pode modular o seu fenótipo (contrátil vs. sintético) sem alterar o estado de diferenciação. Sabe-se que a função primária das CML prostáticas está relacionada à contração do órgão e que isto impõe uma deformação mecânica sobre estas células. Por esta razão, resolveu-se investigar se haveria modulação do seu comportamento frente ao estiramento in vitro, sob condições controladas. Foi demonstrado que as CML diminuem a atividade proliferativa em resposta ao estiramento cíclico da mesma forma que ao estiramento estático. Em relação à expressão de proteínas relacionadas à atividade contrátil (a-actina e cadeia pesada da miosina de músculo liso), os resultados obtidos indicam que as CML respondem ao estiramento cíclico com um aumento na concentração destas proteínas o que poderia indicar hipertrofia celular, o que foi confirmado pela quantificação do conteúdo de F-actina por citometria de fluxo. Este efeito não foi observado frente ao estiramento estático. Os dois conjuntos de dados confirmam que as CML apresentam grande versatilidade fenotípica, respondendo de formas diferentes não somente a estímulos hormonais, mas também a variação na demanda funcional / Abstract: Smooth muscle cells (SMC) are the main component of the prostatic stroma and play important roles in the organ physiology, acting on the contraction associated with ejaculation and on the remodeling related to neoplasias or androgen deprivation, on the production of paracrine factors and the synthesis/degradation/reorganization of extracellular matrix components, after an intricate mechanism of intercommunication with epithelial cells. Besides, it has been proposed that tumor invasion depends on the active participation of stromal cells, including SMC, on the production of MMPs and/or their inhibitors among other factors. The present study investigated the expression of smooth muscle markers on the rat ventral prostate after long term androgen deprivation. Another set of experiments were designed to study the effect of mechanical stretching on SMC behavior in culture. The results demonstrated that SMC are affected by androgen deprivation. Even though the SMC exhibited morphological changes, they kept the expression of smooth muscle markers at the protein (SM a-actin and SM-MHC) and mRNA levels (smoothelin, sm22 and calponin). These results reinforce the idea that prostatic SMC modulate their phenotype (contractile vs. synthetic) without compromise the differentiation state. It is well known that the primary function of the SMC is the organ contraction and that it subjects the cells to mechanical deformation. For this reason, it was decided to test whether SMC modulate their behavior in response to mechanical stretching in vitro under controlled conditions. It was demonstrated that both cyclic and static mechanical stretches decrease SMC proliferation. On the other hand, cyclic stretching increased the concentration in SM-MHC and SM a-actin that could be associated with cell hypertrophy. To confirm this hypothesis, the F-actin content was measured through the intensity of FITC-phalloidin labeling by flow cytometry at the single cell level. The results confirmed that cyclic stretching caused a significant increase in cytoskeleton mass, what is compatible with cell hypertrophy. This effect was not observed after static stretching. The two sets of results confirm that SMC exhibit great phenotypical versatility, responding not only to hormonal stimuli, but also to functional demands / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Pedro Xavier de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prado_LuizaNaiaraSiqueirado_M.pdf: 1448858 bytes, checksum: 14894261e1f5acfa5c112a5bd731af13 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Apesar de a aplicação de campos elétricos de alta intensidade ser atualmente a única terapia disponível para interromper a fibrilação ventricular, esse processo pode causar lesões às células cardíacas, prejudicando sua contratilidade. Neste estudo, aplicamos pulsos elétricos de alta intensidade a miócitos isolados de ratos Wistar adultos. Obtivemos as curvas de letalidade por meio de análise de sobrevivência, que foram usadas para determinar a intensidade de campo necessária para matar 50% das células (EL50) e com esses valores obtivemos a curva de intensidade-duração (IxD) para letalidade para 10 durações diferentes: 0,1; 0,2; 0,5; 1; 3; 5; 10; 20; 35 e 70 ms. Também obtivemos a curva IxD para excitação celular, por meio dos valores de média ± erro padrão da média para a intensidade de campo limiar de excitação para todas as durações, e obtivemos uma relação entre letalidade e excitação em função da duração do pulso, chamada de Fator de Segurança (FS), um indicador de segurança estimulatória. Essa curva foi determinada a partir da divisão entre os pontos das curvas IxD de letalidade e excitação. Observamos que quanto me-nor a duração de pulso, maior a intensidade de campo que causa morte celular. Ao contrário do que se esperava, o maior valor de FS não correspondeu à menor duração utilizada (0,1 ms), mas sim à duração de 0,5 ms. Como o limiar de desfibrilação foi descrito como dependente da duração do pulso aplicado, nossos resultados indicam que o uso de estímulos com duração mais curta - em vez da duração tipicamente usada na clínica, de 10 ms - pode diminuir as lesões celulares, e, portanto, aumentar a efetividade da desfibrilação / Abstract: Although high intensity electric fields application is currently the only effective therapy available to terminate ventricular fibrillation, it may cause injury to cardiac cells, impairing their contractility. In this study we applied high electric field pulses with different durations to isolated rat ventricular myocytes. We obtained lethality curves by survival analysis, which were used to determine the value of applied electric field necessary to kill 50% of cells (EL50) and plotted a strength-duration (IxD) curve for lethality with 10 different durations: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 35 and 70 ms. For the same durations we also obtained an IxD curve for excitation and established an indicator for stimulatory safeness, named Safety Factor (FS), as the ratio between the points on the IxD curve for lethality and the one for excitation. We found that the lower the pulse duration, the higher the electric field intensity required to cell death. Contrary to expecta-tions, the highest FS value does not correspond to the lowest pulse duration but to the one of 0.5 ms. As defibrillation threshold has been described as duration dependent, our results imply that the use of shorter stimulus duration - instead of the one typically used in the clinic (10 ms) - may decrease electric cell damage, therefore increasing defibrillation effectiveness / Mestrado / Engenharia Biomedica / Mestra em Engenharia Elétrica