Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs found in most eukaryotic species. These RNAs regulate gene expression at post-transcriptional level by silencing target mRNAs through base-pairing of complementary sequences, thus acting on virtually all cellular processes. Although the structure and function of miRNAs are well understood, several aspects related to their genomic organization, evolution and involvement with diseases are largely underexplored. In this thesis, we employed computational methods to investigate such issues in three different studies. In the first one, we have processed and integrated a large amount of public data related to miRNAs and coding genes for five vertebrate species. Then, we developed a webtool to allow the analysis of the miRNA genomic context in inter and intragenic regions, the access of miRNA and gene expression data (classified as host and non-host genes), as well as other relevant information. We noticed that the webtool has been largely used by the scientific community, and we believe that it can facilitate hypothesis generation related to miRNA regulation, especially when they are within host genes. In the following study, we sought to understand how the genomic context and the evolutionary origin of host genes can affect the expression and evolution of human miRNAs. Our findings showed that intragenic miRNAs are preferentially embedded within old host genes (originated before the split of vertebrates). We observed that miRNAs within old genes are more broadly expressed than those within young genes. Surprisingly, young miRNAs within old genes were expressed in more tissues than their intergenic counterparts, suggesting an initial adaptive advantage which might be related to their hosts expression control, and as a consequence, exposing them to a more diverse cellular contexts and target genes. In the long run, we found that old host genes lead to expression constraints (lower expression divergence) between species for intragenic miRNAs, in respect to intergenic ones. We also showed possible functional associations related to miRNA genomic context, such as the enrichment of young intergenic miRNAs in testis, while young intragenic miRNAs were enriched in neural tissues. Thus, we propose that the genomic context and the age of the host genes are key factors in shaping the expression and evolution of miRNAs. Finally, we sought to establish associations between differential expression of miRNAs and chemoresistance in colorectal cancer using resistant and sensitive cell lines to 5-Fluoruracil and Oxaliplatin. Among differentially expressed miRNAs, miR-342 was highly expressed in sensitive cell lines to Oxaliplatin. Based on target prediction analysis, miR-342 is likely associated with apoptosis. The induced overexpression of miR-342 in SW620, a cell line resistant to Oxaliplatin, changed the expression levels of genes linked to the apoptosis pathway, notably the downregulation of PDGFB growth factor, which is a predicted target possibly subjected to direct regulation by miR-342.

MicroRNAs (miRNAs) são RNA de fita simples (22 nucleotídeos) que atuam como reguladores da expressão gênica celular. Estudos recentes têm demonstrado o papel dos miRNAs como moduladores da resposta celular frente às infecções virais. O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus que apresenta genes estruturais comuns aos demais, além dos genes tax e rex, os quais dão origem às proteínas regulatórias. Entre elas, destaca-se a oncoproteína Tax, que é capaz de modular a expressão de genes celulares e virais, além de estar associada ao desencadeamento de patologias. Destacam-se duas manifestações clínicas associadas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Fatores relacionados ao hospedeiro também estão correlacionados ao aparecimento das patologias. No intuito de estabelecer se miRNAs humanos podem influenciar em processos celulares que se encontram desregulados pela Tax (diferenciação, transdução de sinais, apoptose, proliferação celular e tumorigênese), o objetivo deste projeto foi analisar a expressão de miRNAs em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos infectados HTLV-1. Para tanto, realizamos análises in silico para mapear alvos de miRNAs humanos no gene tax do HTLV-1. Foram utilizados dois algoritmos (miRanda e RNAhybrid), com os seguintes parâmetros: score de 120 na região da semente; energia livre de até -15 kcal/mol. Assim, selecionou-se os hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Adicionalmente, foi observado que as regiões do gene tax, onde se ligam os miRNAs selecionados, são extremamente conservadas entre os diferentes subtipos de HTLV-1. Após estas análises in silico, realizou-se a validação dos miRNAs eleitos. Para tanto, foram isolados PBMC de 21 amostras de indivíduos-controle (CT), 10 portadores assintomáticos do HTLV-1 (HAC) e 12 com HAM/TSP (HAM). Do total de células, 1x106 tiveram seu DNA genômico extraído para quantificação da carga proviral (CPV) pela metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR); 1x106 foram criopreservadas para quantificação de Tax por citometria de fluxo; 1x 107células foram utilizadas na extração de RNA para validação dos miRNAs por qRT-PCR. A fase orgânica do Trizol® foi utilizada para extração de proteínas totais e posterior análise da expressão de Tax por Western blot. A CPV apresentou-se significativamente aumentada (p= 0,0046) no grupo HAM, quando utilizado teste de Mann-Whitney. A expressão de Tax apresentou correlação significativa (p=0,0128) com a CPV, pelo teste de Spearmann e auxiliou na caracterização dos pacientes. O nível de expressão dos miRNAs foi avaliado nos grupos: CT vs Pacientes e CT vs HAC vs HAM por testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-wallis, respectivamente. Os miRNAs se mostraram desregulados no grupo de pacientes quando comparado ao grupo CT. Dentre estes, o hsa-miR-125b encontra-se aumentado significativamente no grupo de pacientes em relação ao controle (p=0,0285). Utilizou-se o teste de correlação de Spearmann, para associar a expressão de Tax com os miRNAs, porém os resultados encontrados não foram significativos. Apesar de não estar correlacionado com expressão de Tax, o hsa-miR-125b é responsável pela regulação de diversas proteínas, como TNF-, uma proteína inflamatória hiper-expressa em portadores do HTLV-1. Deste modo, acreditamos que este miRNA estaria aumentado proporcionalmente na tentativa de inibir a tradução desta proteína. Os resultados deste projeto sugerem a importância de esclarecer como os miRNAs humanos podem regular a infecção pelo HTLV-1 e gerar informações para o desenvolvimento de estratégias que possam interferir com a replicação e patogênese viral. / MicroRNAs (miRNAs) are simple strand RNA (22 nucleotides), which are regulators of cellular gene expression. Recent studies have been showed miRNAs role as modulators of cellular responses, when viral infection occurs. The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus that presents the same regular structural genes compared to the other retrovirus, besides tax and rex genes, which encode regulatory proteins. In regard to this, Tax oncoprotein is a major determinant of viral persistence and pathogenesis. Two major diseases are related to this virus adult T cell leukemia (ATLL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Host-related factors are also correlated with HAM/TSP development. To establish if human miRNAs could influence in the unregulated cellular process caused by Tax (differentiation, signal transduction, apoptosis, cellular proliferation and tumorigenesis), this study analyzed miRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HTLV-1 infected patients. For this purpose, we performed in silico analyses to find human miRNAs that could targeted HTLV-1 tax region. We performed two algorithms (miRanda e RNAhybrid) and we set up two distinct parameters: score more than 120 in the seed region and minimum free energy until -15 kcal/mol. So, we have selected these hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Besides this, we compared several HTLV-1 sub-types and we observed that regions, where miRNAs are regulating, are extremely conserved. After the in silico analysis, we validated miRNAs that we have been chosen. We isolated PBMC samples from 21 control-individuals (CT), 10 from asymptomatic carriers and 12 from HAM/TSP (HAM). After the procedure, genomic DNA were extracted from 1x106 cells, in order to quantify the proviral load (PL) performing quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Tax was measured by flow cytometry and for this procedure, we used 1x106 criopreserved cells. Amount 1x 107cells were used to total RNA extraction that was used to miRNAs validation by qRT-PCR. The organic phase from Trizol® was employed to extract total proteins, which were used to analyze Tax expression by Western blot. The PL was significantly higher in HAM group than HAC (p= 0,0046), when Mann-Whitney statistical test was employed. The Tax expression was significantly correlated to PL (p=0,0128) by Spearmann test and this finding provided us a better characterization of the patients. The miRNAs expression was detected in the following groups: CT vs Patients and CT vs HAC vs HAM by non-parametrical tests Mann-Whitney and Kruskal-wallis, respectively. The miRNAs presented unregulated themselves in the patient group, when we compared to CT group. We observed that hsa-miR-125b expression are significantly higher in patients group than controls (p=0,0285). We have tried to associate miRNAs with Tax expression, employing Spearmann test, but this analysis did not show significant values. Despite this, hsa-miR-125b is responsible for regulating several proteins, such as TNF-, which is an inflammatory protein overexpressed in HTLV-1 carriers. In conclusion, we propose that this miRNA could be increased as a way to inhibit TNF- translation. These results suggest the importance in understanding how human miRNAs could regulated the HTLV-1 infection. In addition to this, they could generate data to be used as therapeutic strategies for the control of viral replication and pathogenic processes.

Nosso grupo demonstrou que a captura de baixas doses de DNA plasmideal pode inibir a apresentação de antígeno e induzir um padrão de resposta anti-inflamatória, e que após a captação do DNA plasmideal por macrófagos, estas moléculas podiam prevenir a acidificação de vesículas endossomais, um passo essencial para a apresentação de antígenos para células T CD4+. Além disso, em modelos in vivo, a baixa dose de DNA foi suficiente para amenizar o quadro inflamatório e diminuir a produção de citocinas inflamatórias. Estes resultados estão em contraste com os modelos de vacinas gênicas comumente utilizadas. A baixa dose de DNA plasmideal, no contexto da indução da resposta imune, pode levar à modificação na apresentação do antígeno e ativação celular levando ao controle da resposta imune exacerbada desencadeada por outro antígeno, tornando o tratamento por DNA um importante foco de estudo para o combate de doenças autoimunes e inflamações. O objetivo deste trabalho foi identificar os microRNAs expressos em macrófagos tratados com alta ou baixa dose de DNA plasmideal e avaliar o papel destas moléculas na modulação da cascata de sinalização intracelular visando esclarecer o mecanismo imunomodulador observado. Macrófagos da linhagem J774 foram estimulados por 2 horas com o vetor plasmideal pcDNA3, nas concentrações de 10 g ou 100 g de pcDNA3/mL de RPMI. O RNA total foi extraído e o ensaio de microarray para microRNAs foi realizado. Os miRNAs diferencialmente expressos foram confirmados pela RT-qPCR, e o programa de bioinformática miRDB foi utilizado para predição de genes alvos. Os miRNAs e genes selecionados também foram dosados em macrófagos estimulados com LPS e tratados com pcDNA3. Foram detectados 6 miRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) diferencialmente expressos em macrófagos estimulados somente com pcDNA3. A expressão do miR-494-3p foi aumentado somente em células tratadas com DNA em baixa concentração tanto na ausência quanto presença de LPS. O gene IBk (IKK-) foi identificado como alvo do miR-494-3p, dosado e teve sua função detectada por western blot, mostrando que seu papel biológico foi alterado na presença deste miRNA. Além disso, os dados do tratamento com pcDNA3 em camundongos knockout para o receptor TLR9, sugerem que a expressão do miR-494-3p é independente deste tipo de receptor, porém é inibida na presença do mesmo quando no tratamento com alta dose de DNA. Os dados sugerem que quando macrófagos são tratados com baixa dose de DNA plasmideal (10 g/mL), o miR-494-3p age como regulador negativo do fator de transcrição NF-B, por meio da inibição da expressão e função da proteína IKK-. / Our group demonstrated that the capture of low doses of plasmid DNA can inhibit antigen presentation and induce an anti-inflammatory response pattern together with the decrease of pro-inflammatory cytokines expression, as observed in in vivo experimental models. Moreover, we observed that after the uptake of plasmid DNA by macrophages, these molecules could prevent endosomal vesicles acidification, an essential step for antigen presentation to CD4+ T cell. These results are in contrast with the usual DNA vaccines models commonly used. The low dose of plasmid DNA, in the context of immune response induction, can take to a modification in antigen presentation leading to the control of the response already established, what can be a potential treatment in auto-immune diseases and inflammation. The objective of this work is to identify expressed microRNAs on J774 macrophages triggered by different concentrations of plasmid DNA stimuli in order to evaluate the observed immunomodulatory mechanism. J774 macrophages were treated with low (10 µg/mL) and high (100 µg/mL) doses of pcDNA3 for 2 hours. Total RNA was extracted and microarray (Agilent plataform) was performed for detection of differentially expressed microRNAs. All obtained data was normalized in Genespring GX11.5 software. The microRNAs expression was confirmed by RT-qPCR and their mRNA targets were predicted by miRDB software. The miRNAs and their respective targets were also evaluated on DNA and LPS-treated macrophages. We detected 6 differentially expressed microRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) between the two conditions (fold change 2, p-value 0,05). The miR-494-3p expression increased only in cells treated with low dose of pcDNA3, on either previously LPS-stimulated cells or not. IBk (IKK-) was one of the predicted targets for miR-494-3p. RT-qPCR was performed to calculate its expression and its biological function was assessed by western blot. Besides, results from pcDNA3-treated cells from TLR9 knockout mice suggest that miR-494-3p expression is TLR9 independent although the receptor presence impaired miR-494-3p expression on high dose of pcDNA3-treated cells. Together, the data indicate that when macrophages are treated with low dose of plasmid DNA, miR-494-3p expression is increased, acting as negative regulator of the transcription factor NF-B, through IKK- inhibition.

Submitted by Suzana Dias (suzana.dias@famerp.br) on 2018-11-09T18:31:25Z No. of bitstreams: 1 JessicaHelenaPires_dissert.pdf: 3617808 bytes, checksum: 1df14ad1ee40275580d520f969311d14 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-09T18:31:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JessicaHelenaPires_dissert.pdf: 3617808 bytes, checksum: 1df14ad1ee40275580d520f969311d14 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Breast cancer represents the second type of tumor that has the highest mortality rates, being the most common among women. The causes of these high mortality rates are related to high proliferation and metastasis, and for tumor progression, the growth of new blood vessels, angiogenesis is required. This event can be stimulated by several factors, such as insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R), hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Several molecules are involved in the control of angiogenesis such as melatonin and microRNAs (miRNAs). The miRNAs can induce the gene silencing of genes related to angiogenesis by pairing with certain specific messenger RNA (mRNA), resulting in the degradation of this molecule. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine), the main hormone produced and secreted by the pineal gland, has several physiological functions and a proven antiangiogenesis action. This hormone can regulate miRNAs and genes related to this process. Objective: To evaluate the ability of melatonin to modulate miR-152-3p and its targets in triple-negative breast cancer cells. Material and Method: After the determination of the melatonin concentration to be used, the differential expression of the miRNAs in the MDA-MB-468 strain after the melatonin treatment was evaluated using the plate RT² Profiler™ PCR Array Human Breast Cancer containing 84 miRNAs related to breast cancer. An in-silico analysis was performed to select a miRNA involved in angiogenesis and its potential target genes. Overexpression of miR-152-3p was performed on MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells by transient transfection and after relative quantification of their expression and their target genes IGF-1R, VEGF and HIF-1α was evaluated by real-time PCR. Quantification of the protein expression of the genes was verified by immunocytochemistry. Results: The cell viability assay in the MDA-MB-468 cell line demonstrated that cells treated with 1 mM melatonin had the lowest viability (p <0.05). Analysis of the miRNAs by PCR Array in the MDA-MB-468 cell line showed six positively regulated miRNAs and seven negatively regulated miRNAs after treatment with melatonin. Evaluation of gene expression demonstrated that miR-152-3p overexpression was influenced by melatonin, leading to increased expression of the genes IGF-1R, HIF-1α and VEGF in MDA-MB-468 cells. In the MDA-MB-231 cell line, melatonin did not influence the expression of miR-152-3p and decreased the expression of the target genes. Finally, immunocytochemistry revealed that melatonin and overexpression of miR-152-3p were able to decrease the protein expression of IGF-1R, HIF-1α and VEGF in the MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells. Conclusions: Melatonin was able to modulate the expression of miR-152-3p and its target genes involved in angiogenesis in triple-negative breast cancer. Therefore, this study confirms the action of melatonin on the important cellular event of angiogenesis, a determinant process for the progression of the disease and also indicates it as a potential therapeutic protocol for triple-negative breast cancer. / O câncer de mama representa o segundo tipo tumoral que possui os maiores índices de mortalidade, sendo o mais comum entre as mulheres. As causas desses altos índices de mortalidade têm relação com a alta proliferação e formação de metástases, e para a progressão tumoral, é necessário o crescimento de novos vasos sanguíneos, a angiogênese. Este evento pode ser estimulado por diversos fatores, como o receptor tipo 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R), o fator induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-1α) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os miRNAs podem induzir o silenciamento de genes relacionados com a angiogênese pelo pareamento com determinado RNA mensageiro (RNAm) específico, resultando na degradação desta molécula. A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), principal hormônio produzido e secretado pela glândula pineal, possui diversas funções fisiológicas e comprovada ação antitumoral, inclusive ação antiangiogênica. Esse hormônio pode regular miRNAs e genes relacionados a esse processo. Objetivo: Avaliar a capacidade da melatonina em modular o miR-152-3p e seus alvos, em células de câncer de mama triplo-negativo. Material e Método: Após a definição da concentração de melatonina a ser utilizada pelo ensaio de viabilidade celular, foi avaliada a expressão diferencial dos miRNAs na linhagem MDA-MB-468, após o tratamento com melatonina, utilizando-se a placa RT² Profiler™ PCR Array Human Breast Cancer que contêm 84 miRNAs relacionados ao câncer de mama. Uma análise in silico foi realizada para seleção de um miRNA envolvido na angiogênese e seus potenciais genes-alvo. A superexpressão do miR-152-3p foi realizada nas células MDA-MB-468 e MDA-MB-231 por transfecção transiente e após, a quantificação relativa de sua expressão e de seus genes-alvo IGF-1R, VEGF e HIF-1α foram avaliadas por PCR em tempo real. A quantificação da expressão proteica dos genes foi verificada por imunocitoquímica. Resultados: O ensaio de viabilidade celular na linhagem MDA-MB-468, demonstrou que as células tratadas com 1 mM de melatonina tiveram os menores valores de viabilidade (p<0,05). A análise dos miRNAs por PCR Array na linhagem MDA-MB-468 apontou seis miRNAs regulados positivamente e sete miRNAs regulados negativamente, após o tratamento com a melatonina. A avaliação da expressão gênica demonstrou que a superexpressão do miR-152-3p foi influenciada pela melatonina, levando ao aumento da expressão dos genes IGF-1R, HIF-1α e VEGF na linhagem MDA-MB-468. Já na linhagem MDA-MB-231 a melatonina não influenciou a expressão do miR-152-3p e diminuiu a expressão dos genes-alvo. Por fim, a imunocitoquímica revelou que a melatonina e a superexpressão do miR-152-3p foram capazes de diminuir a expressão proteica de IGF-1R, HIF-1α e VEGF nas linhagens MDA-MB-468 e MDA-MB-231. Conclusões: A melatonina foi capaz de modular a expressão do miR-152-3p e de seus genes-alvo envolvidos com a angiogênese no câncer de mama triplo-negativo. Portanto, este estudo confirma a ação da melatonina no importante evento celular de angiogênese, processo determinante para a progressão da doença e ainda indicá-la como potencial protocolo terapêutico para o câncer de mama triplo-negativo.

Questiona-se um possível papel deletério da endometriose sobre a qualidade oocitária (QO), que é, em grande parte, condicionada pelo papel das células do cumulus. A função dessas células envolve a expressão de diversas moléculas codificadas por genes específicos, regulada a nível de transcrição, pós-transcrição e tradução. Os microRNAs atuam como reguladores póstranscricionais da expressão gênica, de modo que qualquer alteração nesse mecanismo pode levar a anormalidades no desenvolvimento oocitário. Desta forma, propusemos um estudo inédito da análise de microRNAs em células do cumulus (CC) de mulheres inférteis com e sem endometriose com o objetivo de evidenciar processos biológicos e vias de atuação correlacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição da competência oocitária. Foram incluídas no estudo 15 pacientes inférteis (5 controles com fator tubário e/ou masculino, 5 com endometriose estágios I/II e 5 com endometriose estágios III/IV) submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI). Imediatamente após a captação oocitária, as CCs foram isoladas e armazenadas para extração dos miRNAs. O perfil de 754 miRNAs foi analisado por meio da técnica de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards. Considerou-se significativo p<0,05. Os miRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose I/II comparadas às controles. Os miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsamiR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação às controles. Ao comparar-se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre si, os miRNAs hsa-miR-187-3p e hsa-miR-532- 3p foram menos expressos e os miRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p mais expressos nas pacientes com endometriose III/IV. A análise de enriquecimento identificou os genes regulados pelos miRNAs e as respectivas vias metabólicas em que estão envolvidos, sugerindo aumento de apoptose, diminuição de proliferação celular, alterações no controle do ciclo celular e no metabolismo energético das CCs de mulheres com a doença inicial e avançada. Os dados apontam para alterações na regulação pós-transcricional em CCs de mulheres inférteis com endometriose inicial e avançada, o que pode afetar processos e vias essenciais à aquisição de competência oocitária e estar envolvido na infertilidade associada à doença. Este estudo contribui para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose identificando mecanismos pós-transcricionais relacionados à piora da qualidade gamética nestas mulheres. / It is questioned a possible deleterious role of endometriosis on oocyte quality (OQ), which is largely conditioned by the function of cumulus cells. The role of these cells involve the expression of several molecules encoded by specific genes, regulated at transcription level, post-transcription and translation. The microRNAs act as transcriptional regulators of gene expression, thus any alteration in this mechanism can lead to abnormalities in oocyte development. In this way, we proposed an unpublished study of the microRNAs analysis in cumulus cells (CC) of infertile women with and without endometriosis, aiming to evidence the biological processes and pathways of action correlated with the presence of endometriosis in infertility and its possible impact on the acquisition of oocyte competence. Fifteen infertile patients (5 controls with tubal factor and/or male, 5 with stage I/II of endometriosis and 5 with stages III/IV of endometriosis) submitted to the controlled ovarian stimulation (EOC) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were included in the study. Immediately after oocyte uptake, CCs were isolated and stored for miRNA extraction. The 754 miRNAs profile was analyzed using the TaqMan®Array Human MicroRNA Cards technique. Significant values were considered when p <0.05. The hsa-miR-218, hsa-miR-301 and hsa-miR-629-5p miRNAs were identified as less expressed in the patients with endometriosis I/II compared to controls. The miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p and hsa-miR- 629-5p were identified as less expressed in patients with endometriosis III/IV compared to controls. Comparing the groups with endometriosis I/II and endometriosis III/IV, hsa-miR-187- 3p and hsa-miR-532-3p miRNAs were less expressed and hsa-let-7f-1# and hsa-miR-362-3p more expressed in patients with endometriosis III/IV. The enrichment analysis identified the genes regulated by the miRNAs and the respective metabolic pathways in which they are involved, suggesting apoptosis increase, decreased cell proliferation, alterations in the cell cycle control and energetic metabolism of the CCs of women with initial and advanced disease. The data point to changes in post-transcriptional regulation in CCs of infertile women with early and advanced endometriosis, which may affect processes and pathways essential for acquiring oocyte competence and resulting in infertility associated with the disease. This study contributes to the understanding of the etiopathogenesis of infertility related to endometriosis by identifying post-transcriptional mechanisms related to the deterioration of quality of gametes in these women.

A hipertrofia cardíaca é um mecanismo de adaptação do coração ao aumento de demanda. De acordo com o estímulo, fisiológico ou patológico, a hipertrofia apresenta diferentes características morfológicas e moleculares. Compreender os mecanismos comuns e distintos entre os dois tipos de hipertrofia é um passo importante para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da IC. Dentre os mecanismos distintos cabe ressaltar a participação das espécies reativas do oxigênio (EROs) que parecem estar presentes em altos níveis na hipertrofia cardíaca patológica e em baixos na fisiológica. Além disso, o papel regulatório dos microRNAs (miRs) tem sido demonstrado nas doenças cardiovasculares. No entanto, a influência das EROs no desenvolvimento da hipertrofia e nas adaptações decorrentes a ela ainda não está estabelecido. Assim, nosso objetivo foi avaliar as diferenças morfológicas e moleculares da hipertrofia cardíaca fisiológica, induzida pelo exercício, e da patológica, induzida por bandeamento aórtico (TAC), e sua modulação pela vitamina E. Os modelos de exercício e TAC desenvolveram hipertrofia cardíaca de forma compatível com o estímulo recebido. Essas adaptações ocorreram conjuntamente com alterações na expressão dos miRs-21, -26b, -150, -210 e -499. A vitamina E inibiu o estímulo angiogênicos, no modelo fisiológico, assim como a expressão dos miRs-21, -150 e -210. No entanto, esses efeitos não alteraram o fenótipo final da hipertrofia cardíaca fisiológica. No modelo patológico, por outro lado, a vitamina E reduziu a fibrose e o dano oxidativo, além de alterar a expressão de miRs já descritos no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica. Novamente, esse efeito não foi suficiente para reduzir a hipertrofia cardíaca. Em conjunto, os dados desse estudo sugerem que a vitamina E e/ou sua capacidade antioxidante têm a capacidade de influenciar de forma benéfica a hipertrofia patológica; no entanto, seus efeitos podem ser desfavoráveis no estímulo fisiológico. / Cardiac hypertrophy is an adaptive mechanism of the heart to the increased demand. According to the stimulus, physiological or pathological, cardiac hypertrophy present different morphological and molecular features. Understanding both the unique and the shared features in each type of hypertrophy is an important step to the development of novel approaches in the HF management. Among the unique mechanisms, the participation of reactive oxygen species (ROS) seems to be present at high levels in pathological and at low levels in physiological cardiac hypertrophy. Furthermore, the regulatory role of microRNAs (miRs) have been shown in cardiovascular diseases. However, ROS influence in cardiac hypertrophy development and their adaptations were not established yet. Thus, our objective was to evaluate morphological and molecular differences between physiological cardiac hypertrophy (physical exerciceinduced) and pathological cardiac hypertrophy (transverse aortic constrictioninduced), and its modulation by vitamin E. Exercise and TAC models developed cardiac hypertrophy in a manner consistent with the received stimulus. These adaptations occurred along with changes in miR-21, -26b, -150, -210 and -499 expression. Vitamin E inhibited angiogenic adaptations, as well as miR-21, -150 and -210 expression in physiological model. However, these effects did not change the final physiological cardiac hypertrophy phenotype. On the other hand, in the pathological model, vitamin E reduced oxidative damage and fibrosis, and altered the expression of miRs described in pathological cardiac hypertrophy development. Again, this effect was not sufficient to reduce cardiac hypertrophy. In conclusion, vitamin E and/or its antioxidant capacity have the capacity to influence the pathological hypertrophy in a beneficial way, but its effects can be unfavorable in the physiological stimulus.

A anemia falciforme (AF) é a doença hereditária monogênica mais prevalente no Brasil, caracterizada pelo alto índice de morbimortalidade. Uma mutação de ponto no gene da globina beta da hemoglobina é a causa da doença. Características genéticas dos indivíduos além da possível heterogeneidade das moléculas associadas à hemólise e vasculopatia são responsáveis por uma variedade de manifestações e complicações clínicas. Os tratamentos disponíveis atualmente consistem no objetivo de amenizar as manifestações clínicas e reduzir o número de crises para uma melhor qualidade de vida destes pacientes. Considerando a importância dos MicroRNAs na regulação da expressão gênica e na fisiopatologia de diversas doenças, este estudo tem por objetivo a elucidação do mecanismo de ação destes potenciais reguladores na fisiopatologia da AF. Caracteriza-se por um estudo prospectivo comparativo, do tipo de pesquisa clínica transversal. Foram incluídos neste estudo 50 indivíduos, dos quais, 25 indivíduos normais sem a patologia, doadores do banco de sangue do Hospital de Clinicas de Porto Alegre (HCPA), e 25 pacientes homozigóticos SS, em acompanhamento médico no Centro de Referência em Doença Falciforme do HCPA A obtenção dos dados se deu pela reação da polimerase em cadeia em tempo real, com a seleção de quatro microRNAs candidatos selecionados de acordo com a predição de suas funções alvo já disponíveis na literatura (hsa-mir-15a, hsa-mir-210, hsa-mir-144 e hsa-mir-223). Foram comparadas as diferenças dos perfis de expressão de cada microRNA com a média do grupo controle, além das correlações entre as variáveis hematológicas, bioquímicas e manifestações clínicas, com a finalidade de avaliar a influência entre as variáveis positivamente ou negativamente. Resultados: Três dos quatro microRNAs tiveram seus níveis de expressão estatisticamente significativos em relação ao grupo controle (mir- 15a, mir-210 e mir-223). As correlações positivas identificadas foram do microRNA 15a com o microRNA 144, do microRNA 210 com o microRNA 223, além do microRNA 223 com as manifestações de úlceras. As correlações negativas identificadas foram do microRNA 15a em relação às plaquetas e síndrome torácica aguda, e do microRNA 144 em relação aos reticulócitos. Conclusão: Tal conhecimento poderá possibilitar estabelecer novos tratamentos e possíveis abordagens terapêuticas através do controle da expressão de genes específicos e sua interação direta com RNAs alvo. / Sickle cell anemia (FA) is the most prevalent monogenic hereditary disease in Brazil; it is characterized by variable and sometimes severe symptoms and high morbi-mortality. A point mutation of the beta globin gene is a cause of the disease. Genetic characteristics of individuals and the heterogeneous possibility of molecules associated with hemolysis and vasculopathy are responsible for the variability of clinical manifestations. The available treatments are aimed at mitigating the clinical manifestations and reducing the number of crisis for a better quality of life of these patients. This study aims to elucidate the mechanism of action of regulatory molecules in the pathophysiology of FA. It is characterized by a prospective comparative study, type of cross-sectional clinical research. Fifty individuals, 25 normal subjects, from the blood bank of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), and 25 homozygous SS patients, from the Reference Center on Sickle Disease of HCPA. Real-time polymerase chain reaction measuring four microRNAs selected according to the predictions of their target functions in the literature (hsa-mir-15a, hsa-mir-210, Hsa-mir -144 and hsa-mir-223) Differences in the expression profiles of each microRNA with a mean of the control group were compared, as well as the correlations between hematological, biochemical and clinical manifestations, with the purpose of evaluating positive or negative influence between variables. Results: Three of the four microRNAs had their expression levels statistically significant in relation to the control group (mir- 15a, mir-210 and mir-223). A positive correlation was identified between microRNA 15a with the microRNA 144, the microRNA 210 with the microRNA 223, and microRNA 223 with positively correlated with leg ulcers. As for negative correlation we identified for microRNA 15a in relation to platelets and acute thoracic syndrome, and for microRNA 144 in relation to reticulocytes. Conclusion: Such knowledge may enable new treatments and possible therapeutic approaches by controlling the expression of specific genes and their direct interaction with target RNAs.

Orientador: Célia Regina Nogueira / Resumo: A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, resultado da expansão clonal de células tronco progenitoras hematopoiéticas, caracterizada pelo gene de fusão BCR-ABL1, resultado da translocação recíproca t (9;22) (q34; q11) que dá origem ao cromossomo Philadelphia (Ph). Com todo o conhecimento acumulado sobre os mecanismos de ação do BCR-ABL1 foi possível o desenvolvimento de uma droga alvo-específica muito eficiente. Porém, alguns pacientes não respondem ou desenvolvem mutações que levam a resistência ao tratamento e as células tronco leucêmicas da LMC também são resistentes ao tratamento. Tais fatores renovaram o interesse na fisiopatologia da LMC, incluindo o papel dos microRNAs (miRNAs).miRNAs são pequenos RNAs não codificantes (ncRNAs) que controlam a expressão gênica e desempenham um importante papel no desenvolvimento e progressão do câncer. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar um perfil global de expressão de miRNAs circulantes em pacientes com LMC-FC (Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica) recém diagnosticada e LMC-FC tratados com imatinibe, correlacionar o perfil de expressão de miRNAs entre os dois grupos de pacientes e, por fim, detectar redes de interação entre miRNAs e BCR-ABL1.RT-qPCR array foi utilizado para a análise de 768 miRNAs. Os resultados indicam que dos 768 miRNAs analisados, 43 miRNAs caracterizam a LMC-FC recém diagnosticada versus LMC-FC tratada com imatinibe. Destes, 39 miRNAs apresentam níveis de expressão ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder, result of clonal expansion of hematopoietic stem cells progenitor, characterized by BCR-ABL1 fusion gene as a result of reciprocal translocation t (9;22) (q34;q11) called chromosome Philadelphia (Ph). With the acquired knowledge about the BCR-ABL1 action mechanisms has been possible to develop a target specific drug very efficient. However, some patients have refractoriness to treatement or develop mutations which induce drug resitence and also CML leukemia stem cells can be resistant to treatment. Such factors renewed interest in the pathophysiology of CML, including the role of microRNAs (miRNAs).miRNAs are small non-coding RNAs (ncRNAs) that control the gene expression, and play an important role in cancer development and progression. The aims of this study were to identify a global expression profile of circulating miRNAs in patients CML-CP (Chronic Myeloid Leukemia – chronic phase) newly diagnosed and CML-CP treated with imatinib, correlating the profile of miRNA expression between the two groups of patients, and finally, detect networks of interactions between miRNAs and BCR-ABL1.RT-qPCR array was used for analysis of 768 miRNAs. The results indicated that the 768 miRNAs analyzed, 43 miRNAs characterize CML-CP newly diagnosed versus CML-CP treated with imatinib. Of these, 39 miRNAs are downregulated – miR-16-5p, miR-1-3p, miR-291a-3p and miR-27a-3p – and 4 miRNAs are upregulated – miR-150-5p and miR-45... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A anemia falciforme (AF) é a doença hereditária monogênica mais prevalente no Brasil, caracterizada pelo alto índice de morbimortalidade. Uma mutação de ponto no gene da globina beta da hemoglobina é a causa da doença. Características genéticas dos indivíduos além da possível heterogeneidade das moléculas associadas à hemólise e vasculopatia são responsáveis por uma variedade de manifestações e complicações clínicas. Os tratamentos disponíveis atualmente consistem no objetivo de amenizar as manifestações clínicas e reduzir o número de crises para uma melhor qualidade de vida destes pacientes. Considerando a importância dos MicroRNAs na regulação da expressão gênica e na fisiopatologia de diversas doenças, este estudo tem por objetivo a elucidação do mecanismo de ação destes potenciais reguladores na fisiopatologia da AF. Caracteriza-se por um estudo prospectivo comparativo, do tipo de pesquisa clínica transversal. Foram incluídos neste estudo 50 indivíduos, dos quais, 25 indivíduos normais sem a patologia, doadores do banco de sangue do Hospital de Clinicas de Porto Alegre (HCPA), e 25 pacientes homozigóticos SS, em acompanhamento médico no Centro de Referência em Doença Falciforme do HCPA A obtenção dos dados se deu pela reação da polimerase em cadeia em tempo real, com a seleção de quatro microRNAs candidatos selecionados de acordo com a predição de suas funções alvo já disponíveis na literatura (hsa-mir-15a, hsa-mir-210, hsa-mir-144 e hsa-mir-223). Foram comparadas as diferenças dos perfis de expressão de cada microRNA com a média do grupo controle, além das correlações entre as variáveis hematológicas, bioquímicas e manifestações clínicas, com a finalidade de avaliar a influência entre as variáveis positivamente ou negativamente. Resultados: Três dos quatro microRNAs tiveram seus níveis de expressão estatisticamente significativos em relação ao grupo controle (mir- 15a, mir-210 e mir-223). As correlações positivas identificadas foram do microRNA 15a com o microRNA 144, do microRNA 210 com o microRNA 223, além do microRNA 223 com as manifestações de úlceras. As correlações negativas identificadas foram do microRNA 15a em relação às plaquetas e síndrome torácica aguda, e do microRNA 144 em relação aos reticulócitos. Conclusão: Tal conhecimento poderá possibilitar estabelecer novos tratamentos e possíveis abordagens terapêuticas através do controle da expressão de genes específicos e sua interação direta com RNAs alvo. / Sickle cell anemia (FA) is the most prevalent monogenic hereditary disease in Brazil; it is characterized by variable and sometimes severe symptoms and high morbi-mortality. A point mutation of the beta globin gene is a cause of the disease. Genetic characteristics of individuals and the heterogeneous possibility of molecules associated with hemolysis and vasculopathy are responsible for the variability of clinical manifestations. The available treatments are aimed at mitigating the clinical manifestations and reducing the number of crisis for a better quality of life of these patients. This study aims to elucidate the mechanism of action of regulatory molecules in the pathophysiology of FA. It is characterized by a prospective comparative study, type of cross-sectional clinical research. Fifty individuals, 25 normal subjects, from the blood bank of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), and 25 homozygous SS patients, from the Reference Center on Sickle Disease of HCPA. Real-time polymerase chain reaction measuring four microRNAs selected according to the predictions of their target functions in the literature (hsa-mir-15a, hsa-mir-210, Hsa-mir -144 and hsa-mir-223) Differences in the expression profiles of each microRNA with a mean of the control group were compared, as well as the correlations between hematological, biochemical and clinical manifestations, with the purpose of evaluating positive or negative influence between variables. Results: Three of the four microRNAs had their expression levels statistically significant in relation to the control group (mir- 15a, mir-210 and mir-223). A positive correlation was identified between microRNA 15a with the microRNA 144, the microRNA 210 with the microRNA 223, and microRNA 223 with positively correlated with leg ulcers. As for negative correlation we identified for microRNA 15a in relation to platelets and acute thoracic syndrome, and for microRNA 144 in relation to reticulocytes. Conclusion: Such knowledge may enable new treatments and possible therapeutic approaches by controlling the expression of specific genes and their direct interaction with target RNAs.

A hipertrofia cardíaca é um mecanismo de adaptação do coração ao aumento de demanda. De acordo com o estímulo, fisiológico ou patológico, a hipertrofia apresenta diferentes características morfológicas e moleculares. Compreender os mecanismos comuns e distintos entre os dois tipos de hipertrofia é um passo importante para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da IC. Dentre os mecanismos distintos cabe ressaltar a participação das espécies reativas do oxigênio (EROs) que parecem estar presentes em altos níveis na hipertrofia cardíaca patológica e em baixos na fisiológica. Além disso, o papel regulatório dos microRNAs (miRs) tem sido demonstrado nas doenças cardiovasculares. No entanto, a influência das EROs no desenvolvimento da hipertrofia e nas adaptações decorrentes a ela ainda não está estabelecido. Assim, nosso objetivo foi avaliar as diferenças morfológicas e moleculares da hipertrofia cardíaca fisiológica, induzida pelo exercício, e da patológica, induzida por bandeamento aórtico (TAC), e sua modulação pela vitamina E. Os modelos de exercício e TAC desenvolveram hipertrofia cardíaca de forma compatível com o estímulo recebido. Essas adaptações ocorreram conjuntamente com alterações na expressão dos miRs-21, -26b, -150, -210 e -499. A vitamina E inibiu o estímulo angiogênicos, no modelo fisiológico, assim como a expressão dos miRs-21, -150 e -210. No entanto, esses efeitos não alteraram o fenótipo final da hipertrofia cardíaca fisiológica. No modelo patológico, por outro lado, a vitamina E reduziu a fibrose e o dano oxidativo, além de alterar a expressão de miRs já descritos no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica. Novamente, esse efeito não foi suficiente para reduzir a hipertrofia cardíaca. Em conjunto, os dados desse estudo sugerem que a vitamina E e/ou sua capacidade antioxidante têm a capacidade de influenciar de forma benéfica a hipertrofia patológica; no entanto, seus efeitos podem ser desfavoráveis no estímulo fisiológico. / Cardiac hypertrophy is an adaptive mechanism of the heart to the increased demand. According to the stimulus, physiological or pathological, cardiac hypertrophy present different morphological and molecular features. Understanding both the unique and the shared features in each type of hypertrophy is an important step to the development of novel approaches in the HF management. Among the unique mechanisms, the participation of reactive oxygen species (ROS) seems to be present at high levels in pathological and at low levels in physiological cardiac hypertrophy. Furthermore, the regulatory role of microRNAs (miRs) have been shown in cardiovascular diseases. However, ROS influence in cardiac hypertrophy development and their adaptations were not established yet. Thus, our objective was to evaluate morphological and molecular differences between physiological cardiac hypertrophy (physical exerciceinduced) and pathological cardiac hypertrophy (transverse aortic constrictioninduced), and its modulation by vitamin E. Exercise and TAC models developed cardiac hypertrophy in a manner consistent with the received stimulus. These adaptations occurred along with changes in miR-21, -26b, -150, -210 and -499 expression. Vitamin E inhibited angiogenic adaptations, as well as miR-21, -150 and -210 expression in physiological model. However, these effects did not change the final physiological cardiac hypertrophy phenotype. On the other hand, in the pathological model, vitamin E reduced oxidative damage and fibrosis, and altered the expression of miRs described in pathological cardiac hypertrophy development. Again, this effect was not sufficient to reduce cardiac hypertrophy. In conclusion, vitamin E and/or its antioxidant capacity have the capacity to influence the pathological hypertrophy in a beneficial way, but its effects can be unfavorable in the physiological stimulus.