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Papel dos microRNAs (miR-1, miR-133, miR-206, miR-208b, miR-499 e miR-223) no músculo esquelético de camundongos C57BL/6 durante o estado de resistência à insulina. / MicroRNAs role (miR-1, miR-133, miR-206, miR-208b, miR-499 e miR-223) in skeletal muscle of C57BL/6 mice during insulin resistance state.

Flávia de Toledo Frias 13 May 2016 (has links)
No músculo esquelético (ME) resistente à insulina, a disponibilidade elevada de ácidos graxos (AGs) livres observada na obesidade provoca alterações na função mitocondrial. Sendo os microRNAs (miRs) moléculas recentemente apontadas na regulação gênica de vias metabólicas, nosso objetivo foi investigar em ME de camundongos com resistência à insulina (RI) induzida por dieta hiperlipídica durante 8 semanas, tratados com fenofibrato (CF e HF) ou metilcelulose (veículo; grupos C e H) nas duas semanas antes do sacrifício, se os miRs-1a, 133a/b, 206, 208b, 499 e miR-223 participam da patogênese da RI. O quadro de RI foi induzido no grupo H e o fenofibrato reverteu parcialmente a RI (grupo HF) observada através das alterações em parâmetros metabólicos e enzimáticos, que parecem ser mediados pelo miR-1a regulando a proteína AMPKα2. O aumento na transcrição de AMPKα2 ativa processos catabólicos tais como a captação de glicose e oxidação de AGs, sendo considerada a principal enzima reguladora do metabolismo celular ao estimular a expressão de genes mitocondriais via PGC-1α. / In skeletal muscle (SM) tissue, evidences suggest that the high availability of free fatty acids (FFAs) observed in obesity plays a central role in the development of insulin resistance (IR) by causing changes in mitochondrial function. Since microRNAs (miRs) are recently identified molecules acting as gene regulators of metabolic pathways, we aimed to investigate in SM of insulin resistant mice induced by 8 weeks of high-fat diet (HFD) feeding, treated with fenofibrate (CF and HF) or metilcelulose (vehicle, C and H) two weeks before euthanasia, if miRs-1a, 133a/b, 206, 208b, 499 and 223 are involved in IR pathogenesis. IR was induced after 8 weeks of HFD (H), and fenofibrate treatment (HF) partially reverted this condition by causing alterations on metabolic and enzymatic parameters, which seems to be mediated by miR-1a regulating AMPKα2 protein. AMPKα2 increased translation active catabolic processes such as glucose uptake and FFAs oxidation, being considered the main regulator of cell metabolism by stimulating mitochondrial genes expression via PGC-1α.
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Expressão dos microRNAs miR-629-3p, miR-1202 e miR-1225-5p em amígdalas, hipocampos e sangue de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial / Expression of microRNAs miR-629-3p, miR-1202 and miR-1225 in amygdala, hippocampus and blood of patients with mesial temporal lobe epilepsy

Daniela Gattás 06 September 2017 (has links)
INTRODUÇÃO: Epilepsia do lobo temporal (ELTM) é a forma mais comum de epilepsia parcial, ocorrendo em cerca de 40% dos pacientes. Na ELTM as crises epilépticas podem ter origem na região cortical, o que é menos comum, porém ocorrem frequentemente em estruturas mesiais do lobo temporal, representadas basicamente pelo hipocampo e/ou amígdala. Com intuito de incluir novas possibilidades de tratamento e diagnóstico, torna-se necessário uma maior compreensão das bases moleculares da ELMT. Dentro desta perspectiva, um dos grandes desafios para a Neurociências na atualidade é o desenvolvimento de biomarcadores que facilitem o diagnóstico e prognóstico para a epilepsia. Recentemente, com o desenvolvimento de algumas pesquisas e novas técnicas no campo da biologia molecular demonstram que microRNAs circulantes no sangue são biomarcadores sensíveis e específicos para várias doenças, incluindo doenças neurológicas, podendo ser obtido de forma não invasiva, representando assim um método de eficiente detecção e custo baixo. OBJETIVOS: Analisar o perfil de expressão dos microRNAs miR-629-3p, miR-1202, miR1225-5p na amígdala, hipocampo e sangue de pacientes submetidos a cirurgia para tratamento da epilepsia do lobo temporal mesial refratários ao tratamento medicamentoso e investigar se os mesmos podem auxiliar como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para a epilepsia. PACIENTES E MÉTODOS: Foram utilizadas amostras de amígdalas, hipocampos e sangue de 20 pacientes com ELTM, sendo 10 com boa evolução pós-operatória (Engel I) e 10 com evolução pós-operatória insatisfatória (Engel III e IV), e para controle foram utilizados 10 amostras de amígdalas e 10 de hipocampos de necrópsias, assim como 10 amostras de sangue de indivíduos saudáveis. A análise de expressão dos miRNAs foi feita utilizando a técnica de RQPCR. RESULTADOS e CONCLUSÕES: Os miRNAs miR-629-3p, miR-1202 e miR- 1225-5p apresentaram-se hiperexpressos no sangue de pacientes com ELTM, podendo sugerir um possível papel de biomarcadores auxiliando no diagnóstico da ELTM. Os miRNAs-629-3p, 1202 e 1225-5p apresentaram aumento nos níveis de expressão sanguíneos progressivos entre os grupos controle, Engel I e Engel III e IV respectivamente, apresentando também possível potencial de biomarcadores no prognóstico cirúrgico entre Engel I e Engel III e IV. / INTRODUCTION: Epilepsy of the temporal lobe is the most common form of partial epilepsy, occurring in about 40% of patients. In TLE epileptic seizures may originate in the cortical region, which is less common. However they occur more frequently in temporal lobe mesial structures, represented primarily by the hippocampus and / or amygdala. A greater understanding of the epilepsy molecular basis is necessary when aiming to implement new treatments possibilities. Within this field of study, one of the major challenges for neuroscience today is the development of biomarkers that facilitate the diagnosis and prognosis for epilepsy. Recently, with the development of some researches and new techniques in the field of molecular biology, it demonstrate that microRNAs circulating in the blood are sensitive and specific biomarkers for various diseases, including neurological diseases and they can be obtained noninvasively, thus representing a low cost method of efficient detection. OBJECTIVES: To analyze the expression profile of miR-629-3p, miR-1202, miR1225-5p microRNAs in the amygdala, hippocampus and blood of patients operated to treat the mesial temporal lobe epilepsy refractory to drug treatment and investigate whether they can be used as biomarkers for epilepsy diagnosis and prognosis. PATIENTS AND METHODS: Amygdala, hippocampus and blood samples of 20 patients with MTLE were used; 10 with good postoperative outcome (Engel I) and 10 with poor postoperative outcome (Engel III and IV), and for the control group 10 amygdalas and 10 hippocampus of necropsy, as well as, 10 samples blood from healthy individuals. The analysisof the expression of miRNAs was performed using RQ-PCR. RESULTS AND CONCLUSION: MiRNAs miR-629-3P, miR-1202 and miR- 1225-5P were hyper-expressed in the blood of patients with MTLE, and may suggest a possible role of biomarkers in the diagnosis of MTLE. miR-629-3p, miR-1202 and miR-1225-5p were progressively expressed in the blood of patients in the control, Engel I and Engel III and IV groups respectively, representing also potential biomarkers for surgical prognosis between Engel I and Engel III and IV.
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Hipertrofia cardíaca fisiológica e patológica : diferenças morfológicas e moleculares moduladas pela suplementação de vitamina E

Cohen, Carolina Rodrigues January 2015 (has links)
A hipertrofia cardíaca é um mecanismo de adaptação do coração ao aumento de demanda. De acordo com o estímulo, fisiológico ou patológico, a hipertrofia apresenta diferentes características morfológicas e moleculares. Compreender os mecanismos comuns e distintos entre os dois tipos de hipertrofia é um passo importante para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento da IC. Dentre os mecanismos distintos cabe ressaltar a participação das espécies reativas do oxigênio (EROs) que parecem estar presentes em altos níveis na hipertrofia cardíaca patológica e em baixos na fisiológica. Além disso, o papel regulatório dos microRNAs (miRs) tem sido demonstrado nas doenças cardiovasculares. No entanto, a influência das EROs no desenvolvimento da hipertrofia e nas adaptações decorrentes a ela ainda não está estabelecido. Assim, nosso objetivo foi avaliar as diferenças morfológicas e moleculares da hipertrofia cardíaca fisiológica, induzida pelo exercício, e da patológica, induzida por bandeamento aórtico (TAC), e sua modulação pela vitamina E. Os modelos de exercício e TAC desenvolveram hipertrofia cardíaca de forma compatível com o estímulo recebido. Essas adaptações ocorreram conjuntamente com alterações na expressão dos miRs-21, -26b, -150, -210 e -499. A vitamina E inibiu o estímulo angiogênicos, no modelo fisiológico, assim como a expressão dos miRs-21, -150 e -210. No entanto, esses efeitos não alteraram o fenótipo final da hipertrofia cardíaca fisiológica. No modelo patológico, por outro lado, a vitamina E reduziu a fibrose e o dano oxidativo, além de alterar a expressão de miRs já descritos no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica. Novamente, esse efeito não foi suficiente para reduzir a hipertrofia cardíaca. Em conjunto, os dados desse estudo sugerem que a vitamina E e/ou sua capacidade antioxidante têm a capacidade de influenciar de forma benéfica a hipertrofia patológica; no entanto, seus efeitos podem ser desfavoráveis no estímulo fisiológico. / Cardiac hypertrophy is an adaptive mechanism of the heart to the increased demand. According to the stimulus, physiological or pathological, cardiac hypertrophy present different morphological and molecular features. Understanding both the unique and the shared features in each type of hypertrophy is an important step to the development of novel approaches in the HF management. Among the unique mechanisms, the participation of reactive oxygen species (ROS) seems to be present at high levels in pathological and at low levels in physiological cardiac hypertrophy. Furthermore, the regulatory role of microRNAs (miRs) have been shown in cardiovascular diseases. However, ROS influence in cardiac hypertrophy development and their adaptations were not established yet. Thus, our objective was to evaluate morphological and molecular differences between physiological cardiac hypertrophy (physical exerciceinduced) and pathological cardiac hypertrophy (transverse aortic constrictioninduced), and its modulation by vitamin E. Exercise and TAC models developed cardiac hypertrophy in a manner consistent with the received stimulus. These adaptations occurred along with changes in miR-21, -26b, -150, -210 and -499 expression. Vitamin E inhibited angiogenic adaptations, as well as miR-21, -150 and -210 expression in physiological model. However, these effects did not change the final physiological cardiac hypertrophy phenotype. On the other hand, in the pathological model, vitamin E reduced oxidative damage and fibrosis, and altered the expression of miRs described in pathological cardiac hypertrophy development. Again, this effect was not sufficient to reduce cardiac hypertrophy. In conclusion, vitamin E and/or its antioxidant capacity have the capacity to influence the pathological hypertrophy in a beneficial way, but its effects can be unfavorable in the physiological stimulus.
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O papel dos microRNAs -221/-222 e -23b/-27b no câncer de próstata resistente à castração / The role of microRNAs -221/-222 and -23b/-27b in castration-resistant prostate cancer

Ruan César Aparecido Pimenta 15 December 2017 (has links)
Introdução: Com comportamento biológico heterogêneo e alta incidência, o Câncer de Próstata (CaP), apresenta uma grande variabilidade na agressividade da neoplasia. O CaP primário possuiu altas taxas de cura quando diagnosticado na sua forma inicial. Aproximadamente 35% dos pacientes acometidos pela neoplasia evoluem para a doença metastática. A aquisição de um fenótipo independente de andrógeno pelas células cancerosas da próstata é a alteração que apresenta o pior prognóstico para os pacientes. Uma investigação a respeito dos mecanismos de resistência ao tratamento hormonal bem como sobre possíveis mecanismos proporcionados por moléculas reguladoras, como os microRNAs, podem nos auxiliar na compreensão desse fenótipo resistente. Objetivos: Avaliar o perfil de expressão dos miR-221, miR-222, miR-23b e miR-27b e dos genes p27 Kip-1, CCNG1 e RA em amostras teciduais de pacientes com CaP primário que responderam ou não a terapia hormonal e correlacionar com os fatores prognósticos clássicos do CaP, além de avaliar o papel dos microRNAs anti-miR-221, anti-miR-222, miR-23 e miR-27b em experimentos in vitro utilizando ensaios de apoptose, ciclo e proliferação celular em ambientes exposto e não exposto a Flutamida (FLU) em linhagem celular sabidamente resistente à castração (PC-3). Materiais e Métodos: Selecionamos retrospectivamente 44 amostras de tumores primários de pacientes com CaP clinicamente localizado e que foram submetidos à prostatectomia radical. Dos 44 pacientes apenas nove continuaram a responder a hormônio terapia e 35 se mostraram resistente em menos de um ano de tratamento. O grupo controle foi constituído de dez espécimes cirúrgicos de pacientes que possuíam Hiperplasia Prostática Benigna (HPB). Para análise de expressão gênica e dos microRNAs os materiais genéticos foram obtidos utilizando protocolos convencionais de extração e técnica de qRT-PCR utilizando primers específicos para cada tipo de microRNA e gene. Os ensaios celulares de avaliação da apoptose, ciclo e proliferação celular foram realizados no citômetro MUSE utilizando linhagem celular PC-3 seguindo as recomendações do fabricante. Os grupos nos três ensaios eram constituídos das seguintes formas: controle, microRNA, FLU e microRNA+FLU. Resultados: Encontramos subexpressão dos miR-221, miR-222, miR- 23b e miR-27b no CaP em comparação com o HPB, em relação aos genes, foi observada superexpressão dos três genes analisados, p27 Kip-1, CCNG1 e RA. Encontramos correlação significativa entre a maior expressão do miR-23b e o grupo de pacientes que possuíam PSA > 10ng/mL. No ensaio de apoptose encontramos relações significativas entre as taxas de apoptose total nos grupos tratados com miR-23b+FLU e miR-27b+FLU em relação ao controle (p=0,0006 e p=0,003 respectivamente). No ensaio de ciclo celular, demonstramos que dentre os grupos já mencionados anteriormente, o que melhor demonstrou resultado foi o grupo tratado apenas com FLU, reduzindo o número de células na fase final, G2-M (p > 0,0001). Igualmente ao ciclo celular, o ensaio de proliferação demonstrou melhores resultados quando as células foram tratadas com FLU, ocorrendo uma diminuição discreta quando comparadas ao grupo controle (p < 0,05). Conclusão: Nossos resultados demonstram subexpressão dos 4 microRNAs estudados nas amostras dos pacientes com CaP e superexpressão dos três genes analisados nestes mesmos casos. Postulamos que exista um efeito sinérgico entre os microRNAs 23b/27b juntamente com a FLU no ensaio de apoptose, e demonstramos que apenas a FLU obteve resultado significativo no controle do ciclo celular e de células em proliferação em linhagem PC-3 / Introduction: Prostate Cancer (PCa) is a heterogeneous disease heterogeneous with high incidence, presents a great variability in the aggressiveness of the neoplasia. Primary PCa has high cure rates when diagnosed in its initial form. Approximately 35% of the patients affected by the neoplasia evolve to metastatic disease. The acquisition of an androgenindependent phenotype by prostate cancer cells is the change that presents the worst prognosis for patients. An investigation about mechanisms of resistance to hormone treatment as well as possible mechanisms provided by regulatory molecules, such as microRNAs, may help us to understand this resistant phenotype. Objectives: To evaluate the expression profile of miR-221, miR-222, miR-23b and miR-27b and p27 Kip-1, CCNG1 and AR genes in tissue samples from patients with primary PCa who have or have not responded to hormone therapy and to evaluate the role of anti-miR-221, antimiR- 222, miR-23 and miR-27b microRNAs in in vitro experiments using apoptosis, cycling and cell proliferation assays in environments exposed and not exposed to Flutamide (FLU) in cell line known to be resistant to castration (PC-3). Materials and Methods: We retrospectively selected 44 primary tumor samples from patients with clinically localized PCa and who underwent radical prostatectomy. Of the 44 patients, only nine continued to respond to hormone therapy and 35 were resistant in less than one year of treatment. The control group consisted of ten surgical specimens from patients who had Benign Prostatic Hyperplasia (BPH). For gene expression analysis and microRNAs the genetic materials were obtained using conventional extraction protocols and qRT-PCR technique using primers specific for each type of microRNA and gene. Cell assays of apoptosis, cycle and cell proliferation were performed on the MUSE cytometer using PC-3 cell line following the manufacturer\'s recommendations. The groups in the three trials were composed of the following forms: control, microRNA, FLU and microRNA+FLU. Results: We found subexpression of the miR-221, miR-222, miR-23b and miR-27b in PCa compared to BPH, in relation to the genes, overexpression of the three genes analyzed, p27 Kip-1, CCNG1 and AR was observed.We found a significant correlation between the greater expression of miR-23b and the group of patients who had PSA > 10ng/mL. In the apoptosis assay we found significant relationships between total apoptosis rates in the groups treated with miR-23b+FLU and miR-27b+FLU in relation to the control (p=0.0006 and p=0.003 respectively). Similarly to the cell cycle, the proliferation assay showed better results when the cells were treated with FLU, in this case a discrete decrease occurring when compared to the control group (p < 0.05). Conclusion: Our results demonstrate subexpression of the 4 microRNAs studied in the samples of patients with PCa. An anarchic expression of the p27 Kip-1 gene, overexpression of CCNG1 and AR genes in cases. We postulated that there is a synergistic effect between -23b/-27b microRNAs along with FLU in the apoptosis assay, and we demonstrated that only FLU had a significant effect on cell cycle control and proliferating in PC-3 cell line
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Estudo funcional de microRNAs na infecção pelo HTLV-1 / miRNAs functional study in HTLV-1 infection

Katia Kaori Otaguiri 14 March 2013 (has links)
O vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus descrito e está etiologicamente ligado a duas principais doenças: a leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 0,3 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem essas doenças associadas, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Atualmente, uma abordagem promissora no entendimento de mecanismos, bem como na fisiopatogênese das infecções virais tem sido a avaliação da função de microRNAs (miRNAs). Há poucos dados na literatura envolvendo estas moléculas na infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+ bem como no estabelecimento da doença HAM/TSP. No presente estudo, foi avaliada a expressão de miRNAs dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores sem HAM/TSP (HAC), pacientes HAM/TSP e indivíduos sadios (CT) por meio de PCR em tempo real. A análise do perfil de expressão dos miRNAs nessas células revelou que 56 e 10 miRNAs apresentavamse mais 1,5 vezes aumentados no grupo HAM/TSP e HAC, respectivamente. O miR- 125b-1-1 apresentou expressão significamente maior no grupo HAC e o miR-146a, no grupo HAM/TSP. A análise in silico de predição de alvo demonstrou que o gene IFNG era potencialmente alvo do miR-125b-1-1 e os genes IRAK1 e TRAF6 do miR- 146a. Foi demonstrado que a expressão do IFNG no grupo HAC era 1,3 vezes mais elevado que o grupo CT e 1,8 vezes mais elevado no grupo HAM que no grupo CT. Houve um aumento na expressão de TRAF6 de 15,7 e 1,5 vezes nos grupos HAM/TSP e HAC, respectivamente. Não foi observada diferença na expressão de IRAK1 entre os três grupos. O ensaios de superexpressão do miR-125b-1-1 alterou a expressão do IFNG e do miR-146a alterou a expressão do gene IRAK1 e sua proteína. Os resultados evidenciados neste trabalho ressaltam a importância dos miRNAs na modulação de genes e proteínas importantes durante a infeção pelo HTLV-1. A correlação entre o miR-125b-1-1 e gene IFNG sugere que este miRNA esteja envolvido nos mecanismos de desenvolvimento de HAM/TSP. Além disso, a interação entre o miR-146a e os genes IRAK1 e TRAF6 sugerem que este miRNA esteja relacionado a mecanismos de persistência viral da infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) was the first human retrovirus discovered and it is related with two major diseases: adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and HTLV-1 -associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TS). About 0.3 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1 related diseases, while the majority will remain life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is noy well elucidated. Currently, a promising approach on understanding the mechanisms as well as physiopathogenesis of viral infections has been the evaluation of the role of microRNAs (miRNAs) roles. There are few data involving CD4+ T cells miRNA expression in HTLV-1 infection as well as HAM/TSP establishment. To identify miRNAs differentially expressed in CD4+ T cells among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied quantitative real time PCR. The analysis of miRNA expression profile in these cells showed 56 and 10 miRNAs upregulated 1.5 times in HAM/TSP and HAC groups, respectively. miR- 125b-1-1 was upregulated in HAC group and miR-146a in HAM/TSP. In silico analysis of target prediction showed that IFNG was a potentially miR-125b-1-1 target and IRAK1 and TRAF6 were miR-146a targets. IFNG expression was 1.3 higher in HAC than CT group and 1.8 higher in HAM/TSP than CT group. It was observed that TRAF6 expression was 15.7 and 1.5 times higher in HAM/TSP and HAC groups, respectively. There was no difference of IRAK1 expression among the three groups. Overexpression assays of miR-125b-1-1 altered IFNG expression and overexpression of miR-146a altered IRAK1 gene and protein expression. The results revealed that miRNAs modulate genes and proteins during HTLV-1 infection. miR- 125b-1-1 and IFNG gene correlation suggests that miR-125b-1-1 seems to contribute to HAM/TSP development. Besides, miR-146a and IRAK1 and TRAF6 interaction suggests that miT-146a seems to contribute to HTLV-1 establishment in CD4+ T cells.
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Identificação dos microRNAs expressos em macrófagos estimulados com alta ou baixa dose de DNA plasmideal e avaliação dos seus papéis na cascata de sinalização / Identification of expressed microRNAs on high or low dose plasmid DNA-stimulated macrophages and their potential role in the intracellular signaling cascade

Bernardo Pereira Moreira 27 June 2012 (has links)
Nosso grupo demonstrou que a captura de baixas doses de DNA plasmideal pode inibir a apresentação de antígeno e induzir um padrão de resposta anti-inflamatória, e que após a captação do DNA plasmideal por macrófagos, estas moléculas podiam prevenir a acidificação de vesículas endossomais, um passo essencial para a apresentação de antígenos para células T CD4+. Além disso, em modelos in vivo, a baixa dose de DNA foi suficiente para amenizar o quadro inflamatório e diminuir a produção de citocinas inflamatórias. Estes resultados estão em contraste com os modelos de vacinas gênicas comumente utilizadas. A baixa dose de DNA plasmideal, no contexto da indução da resposta imune, pode levar à modificação na apresentação do antígeno e ativação celular levando ao controle da resposta imune exacerbada desencadeada por outro antígeno, tornando o tratamento por DNA um importante foco de estudo para o combate de doenças autoimunes e inflamações. O objetivo deste trabalho foi identificar os microRNAs expressos em macrófagos tratados com alta ou baixa dose de DNA plasmideal e avaliar o papel destas moléculas na modulação da cascata de sinalização intracelular visando esclarecer o mecanismo imunomodulador observado. Macrófagos da linhagem J774 foram estimulados por 2 horas com o vetor plasmideal pcDNA3, nas concentrações de 10 g ou 100 g de pcDNA3/mL de RPMI. O RNA total foi extraído e o ensaio de microarray para microRNAs foi realizado. Os miRNAs diferencialmente expressos foram confirmados pela RT-qPCR, e o programa de bioinformática miRDB foi utilizado para predição de genes alvos. Os miRNAs e genes selecionados também foram dosados em macrófagos estimulados com LPS e tratados com pcDNA3. Foram detectados 6 miRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) diferencialmente expressos em macrófagos estimulados somente com pcDNA3. A expressão do miR-494-3p foi aumentado somente em células tratadas com DNA em baixa concentração tanto na ausência quanto presença de LPS. O gene IBk (IKK-) foi identificado como alvo do miR-494-3p, dosado e teve sua função detectada por western blot, mostrando que seu papel biológico foi alterado na presença deste miRNA. Além disso, os dados do tratamento com pcDNA3 em camundongos knockout para o receptor TLR9, sugerem que a expressão do miR-494-3p é independente deste tipo de receptor, porém é inibida na presença do mesmo quando no tratamento com alta dose de DNA. Os dados sugerem que quando macrófagos são tratados com baixa dose de DNA plasmideal (10 g/mL), o miR-494-3p age como regulador negativo do fator de transcrição NF-B, por meio da inibição da expressão e função da proteína IKK-. / Our group demonstrated that the capture of low doses of plasmid DNA can inhibit antigen presentation and induce an anti-inflammatory response pattern together with the decrease of pro-inflammatory cytokines expression, as observed in in vivo experimental models. Moreover, we observed that after the uptake of plasmid DNA by macrophages, these molecules could prevent endosomal vesicles acidification, an essential step for antigen presentation to CD4+ T cell. These results are in contrast with the usual DNA vaccines models commonly used. The low dose of plasmid DNA, in the context of immune response induction, can take to a modification in antigen presentation leading to the control of the response already established, what can be a potential treatment in auto-immune diseases and inflammation. The objective of this work is to identify expressed microRNAs on J774 macrophages triggered by different concentrations of plasmid DNA stimuli in order to evaluate the observed immunomodulatory mechanism. J774 macrophages were treated with low (10 µg/mL) and high (100 µg/mL) doses of pcDNA3 for 2 hours. Total RNA was extracted and microarray (Agilent plataform) was performed for detection of differentially expressed microRNAs. All obtained data was normalized in Genespring GX11.5 software. The microRNAs expression was confirmed by RT-qPCR and their mRNA targets were predicted by miRDB software. The miRNAs and their respective targets were also evaluated on DNA and LPS-treated macrophages. We detected 6 differentially expressed microRNAs (miR-494-3p, miR-21-3p, miR-1897-5p, miR-1894-3p, miR-294-3p e miR-483-5p) between the two conditions (fold change 2, p-value 0,05). The miR-494-3p expression increased only in cells treated with low dose of pcDNA3, on either previously LPS-stimulated cells or not. IBk (IKK-) was one of the predicted targets for miR-494-3p. RT-qPCR was performed to calculate its expression and its biological function was assessed by western blot. Besides, results from pcDNA3-treated cells from TLR9 knockout mice suggest that miR-494-3p expression is TLR9 independent although the receptor presence impaired miR-494-3p expression on high dose of pcDNA3-treated cells. Together, the data indicate that when macrophages are treated with low dose of plasmid DNA, miR-494-3p expression is increased, acting as negative regulator of the transcription factor NF-B, through IKK- inhibition.
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Análise do Processo de Ativação dos Ovários de Apis mellifera, Aspectos Morfológicos e Expressão Gênica / Analysis of the Activation Process of Ovaries in Apis mellifera, the Morphological Aspects and Gene Expression

Liliane Maria Fróes de Macedo 26 March 2014 (has links)
Inúmeros aspectos da reprodução em Apis mellifera já foram extensamente divulgados, no entanto, os mecanismos reguladores da manutenção do estado estéril das operárias, bem como aqueles que permitem a ativação de seus ovários, ainda estão para serem descobertos. Por exemplo, a organização dos folículos ovarianos em crescimento e a arquitetura e papel das células foliculares neste processo. Além disso, para compreender o processo de ativação dos ovários em um contexto mais amplo, também é necessária uma investigação da síntese e maturação de diferentes classes de RNAs as quais modelam redes de interações gênicas extremamente complexas. Portanto, neste doutorado, tivemos como objetivo realizar 1- uma análise morfológica dos ovários ativos de operárias de A. mellifera obtidos em condições orfandade, com ênfase nas células foliculares e 2- um estudo aprofundado da regulação da expressão gênica (genes estruturais e reguladores) que é de fundamental importância para ligar os genótipos aos fenótipos. A análise morfológica dos ovários de operárias de A. mellifera foi realizada em microscópio de fluorescência ou confocal (priorizou a contagem das células foliculares) e microscópio eletrônico de transmissão, que permitiu a descrição e caracterização, pela primeira vez, da patência em ovários de operárias A. mellifera. Paralelamente, por meio da técnica de RNAseq, foi possível analisar o transcriptoma (miRNAs e mRNAs) de amostras específicas de ovários, em diferentes estados fisiológicos, em rainhas e operárias. Os mRNAs e miRNAs que se destacaram em nossas análises in silico foram validados experimentalmente por RT-PCR com alto grau de reprodutibilidade e em harmonia com o estado fisiológico dos ovários. Os transcritos altamente expressos nos ovários ativados foram: fpps5, cad, obp7, yellow-g e aqueles representados pelo GB42182 e GB44975. Acreditamos estes genes possam fazer parte da rede que regula o processo de ativação dos ovários em A. mellifera. Os miRNAs que se destacaram em nossas análises foram: A) miR-306 e miR-317 - altamente expressos nas amostras de ovários funcionais e B) miR-71 pelo fato de, nas análises in silico, ser o mais forte candidato a alvejar a vitelogenina, e na análise experimental, apresentarem, microRNAs e mRNAs, perfis de expressão antagônicos. A construção de bibliotecas de microRNAs e mRNAs a partir de ovários funcionais e não funcionais de abelhas operárias e rainhas, a análise de expressão, bem como a predição de uma rede de integração nos deu um retrato do sensível equilíbrio reprodutivo que mantém ambas as castas em aparente harmonia dentro da colônia aonde elas assumem, no momento certo, seus papéis nesta sofisticada sociedade empreendendo ou não a reprodução. / Countless aspects of reproduction in Apis mellifera have been widely published, however, the regulatory mechanisms for the maintenance of the sterile state of workers as well as those that allow the activation of their ovaries are still to be discovered, as much as the organization of growing ovarian follicles, the architecture and the role of follicular cells during this process. Furthermore, to understand the activation process of the ovaries in a broader context, it is also necessary to investigate the synthesis and maturation of different classes of RNAs which exemplify networks of gene interactions, extremely complex. Therefore, PhD project, we aimed to approach: 1 - A morphological analysis of active ovaries of A. mellifera workers obtained in queenless conditions, with emphasis on the follicular cells and 2 - A detailed study of the regulation of gene expression (structural and regulatory genes) that is crucial for linking genotypes to phenotypes. Morphologic analysis of workers ovaries of A. mellifera was performed under a fluorescence microscope or confocal (prioritized follicular cell count) and transmission electron microscope, which allowed, for the first time, a description and characterization of the patency of worker ovaries in A. mellifera. Similarly, by RNAseq technique, it was possible to analyze the transcriptome (miRNAs and mRNAs) of specific samples of ovaries at different physiological states, in queens and workers. mRNAs and miRNAs that stood out in our in silico analysis were experimentally validated by RT-PCR with high reproducibility and in harmony with ovaries physiologic state. Transcripts highly expressed in activated ovaries were fpps5, cad, obp7, yellow-g and those represented by GB42182 and GB44975. We believe these genes may be part of the network that regulates ovaries activation process in A. mellifera. miRNAs that stood out in our analysis were: - a) - miR-306 and miR-317 - highly expressed in samples of active ovaries and b) -miR-71 by the fact that the in silico analysis, was the strongest candidate to target vitellogenin, and in experimental analysis, presented antagonistic profile of expression when microRNAs and mRNAs were contrasted. The construction of microRNAs and mRNAs libraries from active and inactive ovaries of worker bees and queens, the analysis expression, as well as the prediction of a integrative network has given us a portrait of the sensitive reproductive balance that keeps both castes of bees in apparent harmony within the colony, where they take each one, at the right time, their roles in this sophisticated society, undertaking or not the reproduction.
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Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana / Differential profile of microRNAs in Cumulus oophorus cells from infertile women with and without endometriosis submitted to ovarian stimulation

Liliane Fabio Isidoro da Silva 27 September 2017 (has links)
Questiona-se um possível papel deletério da endometriose sobre a qualidade oocitária (QO), que é, em grande parte, condicionada pelo papel das células do cumulus. A função dessas células envolve a expressão de diversas moléculas codificadas por genes específicos, regulada a nível de transcrição, pós-transcrição e tradução. Os microRNAs atuam como reguladores póstranscricionais da expressão gênica, de modo que qualquer alteração nesse mecanismo pode levar a anormalidades no desenvolvimento oocitário. Desta forma, propusemos um estudo inédito da análise de microRNAs em células do cumulus (CC) de mulheres inférteis com e sem endometriose com o objetivo de evidenciar processos biológicos e vias de atuação correlacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição da competência oocitária. Foram incluídas no estudo 15 pacientes inférteis (5 controles com fator tubário e/ou masculino, 5 com endometriose estágios I/II e 5 com endometriose estágios III/IV) submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI). Imediatamente após a captação oocitária, as CCs foram isoladas e armazenadas para extração dos miRNAs. O perfil de 754 miRNAs foi analisado por meio da técnica de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards. Considerou-se significativo p<0,05. Os miRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose I/II comparadas às controles. Os miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsamiR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação às controles. Ao comparar-se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre si, os miRNAs hsa-miR-187-3p e hsa-miR-532- 3p foram menos expressos e os miRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p mais expressos nas pacientes com endometriose III/IV. A análise de enriquecimento identificou os genes regulados pelos miRNAs e as respectivas vias metabólicas em que estão envolvidos, sugerindo aumento de apoptose, diminuição de proliferação celular, alterações no controle do ciclo celular e no metabolismo energético das CCs de mulheres com a doença inicial e avançada. Os dados apontam para alterações na regulação pós-transcricional em CCs de mulheres inférteis com endometriose inicial e avançada, o que pode afetar processos e vias essenciais à aquisição de competência oocitária e estar envolvido na infertilidade associada à doença. Este estudo contribui para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose identificando mecanismos pós-transcricionais relacionados à piora da qualidade gamética nestas mulheres. / It is questioned a possible deleterious role of endometriosis on oocyte quality (OQ), which is largely conditioned by the function of cumulus cells. The role of these cells involve the expression of several molecules encoded by specific genes, regulated at transcription level, post-transcription and translation. The microRNAs act as transcriptional regulators of gene expression, thus any alteration in this mechanism can lead to abnormalities in oocyte development. In this way, we proposed an unpublished study of the microRNAs analysis in cumulus cells (CC) of infertile women with and without endometriosis, aiming to evidence the biological processes and pathways of action correlated with the presence of endometriosis in infertility and its possible impact on the acquisition of oocyte competence. Fifteen infertile patients (5 controls with tubal factor and/or male, 5 with stage I/II of endometriosis and 5 with stages III/IV of endometriosis) submitted to the controlled ovarian stimulation (EOC) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were included in the study. Immediately after oocyte uptake, CCs were isolated and stored for miRNA extraction. The 754 miRNAs profile was analyzed using the TaqMan®Array Human MicroRNA Cards technique. Significant values were considered when p <0.05. The hsa-miR-218, hsa-miR-301 and hsa-miR-629-5p miRNAs were identified as less expressed in the patients with endometriosis I/II compared to controls. The miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p and hsa-miR- 629-5p were identified as less expressed in patients with endometriosis III/IV compared to controls. Comparing the groups with endometriosis I/II and endometriosis III/IV, hsa-miR-187- 3p and hsa-miR-532-3p miRNAs were less expressed and hsa-let-7f-1# and hsa-miR-362-3p more expressed in patients with endometriosis III/IV. The enrichment analysis identified the genes regulated by the miRNAs and the respective metabolic pathways in which they are involved, suggesting apoptosis increase, decreased cell proliferation, alterations in the cell cycle control and energetic metabolism of the CCs of women with initial and advanced disease. The data point to changes in post-transcriptional regulation in CCs of infertile women with early and advanced endometriosis, which may affect processes and pathways essential for acquiring oocyte competence and resulting in infertility associated with the disease. This study contributes to the understanding of the etiopathogenesis of infertility related to endometriosis by identifying post-transcriptional mechanisms related to the deterioration of quality of gametes in these women.
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Identificação e caracterização de microRNAs das espécies Cochliomyia hominivorax e Cochliomyia macellaria (Diptera: Calliphoridae) / Identification and characterization of microRNAs from Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria (Diptera: Calliphoridae)

Paulo, Daniel Fernando, 1990- 25 August 2018 (has links)
Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo Espin, Ana Carolina Martins Junqueira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T08:05:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo_DanielFernando_M.pdf: 4089154 bytes, checksum: f604296d2e31ee6a5dd7e3aa8f517f69 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codantes que agem como moduladores pós-transcricionais da expressão gênica em todos os eucariotos investigados até o momento. Em animais, a complementariedade imperfeita de bases entre o miRNA e o sítio alvo do RNA mensageiro (mRNA) inibi sua tradução, tornando-os genes chaves no controle da expressão gênica. A identificação de miRNAs pode fornecer uma melhor compreensão de diversos processos biológicos e evolutivos das diferentes espécies. A família Calliphoridae é um grupo que compreende dípteros causadores de miíases, incluindo as espécies Cochliomyia hominivorax (mosca da bicheira) e Cochliomyia macellaria (mosca varejeira). A mosca da bicheira é uma das principais pragas na região Neotropical. Na fase larval, esta espécie causa infestações e alimenta-se de tecidos vivos de vertebrados de sangue quente, acarretando severas perdas na indústria pecuária. Diferentemente, a mosca varejeira, apresenta um hábito saprófago, se alimentando e reproduzindo em carcaças e tecidos em decomposição, ressaltando sua importância para a entomologia forense e para a saúde pública. Por serem filogeneticamente próximas e possuírem diferentes hábitos alimentares e reprodutivos, estas espécies representam modelos para estudos sobre as bases moleculares do parasitismo em Calliphoridae. Para identificar e caracterizar os miRNAs destas duas espécies, o transcriptoma de pequenos RNAs de adultos (macho e fêmea) e larva (terceiro instar) foram sequenciados em plataforma de nova geração MiSeq-Illumina. Os 6.2 milhões de reads gerados foram mapeados contra o genoma de Drosophila melanogaster e o banco de dados miRBase. Foram identificado 84 miRNAs evolutivamente conservados, dos quais 80 foram encontrados em C. hominivorax e 78 em C. macellaria. Também foi investigada a presença dos precursores em forma de grampo (pre-miRNAs) nos dados genômicos e transcriptômicos disponíveis para estas espécies. Foram preditos 10 pre-miRNAs conservados e outros 5 que não apresentaram similaridade com nenhum miRNA já descrito para outras espécies de animais. A caracterização evolutiva dos miRNAs identificados mostrou que essas sequências são altamente conservadas desde Nephrozoa (641 MA), na base de bilatéria, até Brachycera (195 MA). Substituições nucleotídicas observadas foram enviesadas na região 3¿-final com raras mutações na região seed. Análises preliminares de expressão revelaram 79 miRNAs diferentemente expressos entre as espécies e os estágios de desenvolvimento investigados. Os resultados deste trabalho irão contribuir para uma melhor compreensão sobre os hábitos de parasitismo nas espécies C. hominivorax e C. macellaria, com perspectivas para estudos evolutivos e funcionais na família e no controle de insetos-praga / Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that act as post-transcriptional modulators of gene expression in all eukaryotes investigated so far. The imperfect complementarity between miRNA and the target site of messenger RNA (mRNA) inhibits their translation in animals, being key genes for the control of expression in cells. The identification of miRNAs can provide a better understanding of biological processes and evolution of traits in different species. The family Calliphoridae is a group of myiasis-causing flies with different feeding habits, which includes the species Cochliomyia hominivorax (screwworm fly) and Cochliomyia macellaria (secondary screwworm). The screwworm fly is one of the major pests in the Neotropical region. Their larvae infest and feed on live tissues of warm-blooded vertebrates, resulting in severe losses for livestock industry. Differently, the close-related secondary screwworm shows a saprophagous habit, feeding and breeding on carcasses and dead tissues, being crucial for forensic entomology and public health. Because of their close evolutionary relationship and contrasting feeding habits, they represent worthy models to study the molecular basis of parasitism and feeding specialization in the family Calliphoridae. To characterize the miRNAs from both species, the small-RNA transcriptomes of adults (male and female) and larvae (third instar) were sequenced using Illumina-MiSeq next generation sequencing platform. The 6.2 million reads generated were mapped against the Drosophila melanogaster genome and screened in miRBase. We identified 84 evolutionary conserved miRNAs which 80 was founded in C. hominivorax and 78 in C. macellaria. We also investigated the presence of hairpin precursors (pre-miRNAs) in the available genomic and transcriptomic data of these species, and predicted 10 conserved pre-miRNAs and others 5 that show no similarity with previously described animal miRNAs. The evolutionary characterization of identified miRNAs showed that their sequences were highly conserved since the Nephrozoa ancestor (641 MYA) in the basis of Bilaterian clade, until Brachycera ancestor (195 MYA), with nucleotide substitutions biased to 3¿-end portion of the miRNAs with rare substitutions in the seed region. The preliminary expression profile revealed 79 differentially expressed miRNAs between species, gender and life stages, given by hierarchical clustering and statistically significant change fold analysis. The results presented here will provide new information about the genetic background of parasitic habits in C. hominivorax and C. macellaria, with prospects to functional and evolutionary studies in Calliphoridae and pest control / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular
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Expressão ectópica de miR-34a em células de melanoma metastático humano = efeitos sobre vias de sinalização relacionadas com sobrevivência, proliferação e morte celular = Ectopic expression of miR-34a in human metastatic melanoma cells: effects on signaling pathways related to survival, proliferation and cell death / Ectopic expression of miR-34a in human metastatic melanoma cells : effects on signaling pathways related to survival, proliferation and cell death

Abrantes, Julia Laura Fernandes, 1984- 22 August 2018 (has links)
Orientador: Carmen Veríssima Ferreira Halder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T16:08:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrantes_JuliaLauraFernandes_D.pdf: 4562084 bytes, checksum: fba9dbca16cd31c006b311ff23a0b41b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele. Seu tratamento permanece como um grande desafio, já que em estágio avançado torna-se extremamente refratário aos tratamentos convencionais. miR-34a é um microRNA supressor de tumor com expressão normalmente reduzida em células cancerosas. A fim de investigar o papel de miR-34a como supressor do melanoma, o principal objetivo deste estudo foi identificar alvos moleculares modulados pela expressão ectópica de miR-34a na linhagem celular de melanoma metastático humano SK-mel-103. miR-34a reduziu significativamente a viabilidade das células de melanoma, o que deve estar relacionado, pelo menos em parte, com o aumento na expressão da proteína pró-apoptótica Bax, ativação da caspase-3 e clivagem da PARP-1. Estes dados sugerem que miR-34a foi capaz de induzir apoptose nas células de melanoma. Além disso, houve redução na expressão de CDK4, CDK6, E2F3 e pRb, proteínas relacionadas com a progressão do ciclo celular. Aumento na expressão de p21, um inibidor de CDKs, também foi observado nessas células. Algumas moléculaschave envolvidas com os processos de proliferação celular e apoptose, como proteínas oncogênicas (Axl, AKT, ERK 1/2, ?-catenina e c-myc) e proteínas supressoras de tumor (p53 e PTEN), foram "down- e upreguladas" por miR-34a, respectivamente. Interessantemente, o fluxo autofágico foi aumentado por miR-34a, efeito que não foi correlacionado com alterações adicionais na viabilidade das células de melanoma. O aumento no fluxo autofágico ocorreu, provavelmente, como uma resposta celular ao estresse de retículo e a agregação de proteínas induzidos por miR-34a, fenômenos que também podem ter contribuído para a indução de apoptose nesse contexto. Os dados obtidos neste estudo trouxeram novos aspectos moleculares da ação de miR-34a como supressor tumoral, e permitem apontar este microRNA como um potencial alvo terapêutico contra o melanoma metastático humano / Abstract: Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Its treatment remains a big challenge, since in advanced stage it is extremely refractory to conventional treatments. miR-34a has emerged as an important tumor suppressor, and its expression is normally reduced in cancer cells. To provide more information about the role of miR-34a as a melanoma suppressor, the main goal of this study was to identify key molecular players modulated by ectopic expression of this microRNA in the metastatic melanoma cell line SK-mel-103. miR-34a caused a reduction of melanoma cells viability, what may be related, at least in part, with the increased expression of pro-apoptotic marker, Bax, activation of caspase 3 and PARP-1 cleavage, which indicates that miR-34a triggered apoptosis in melanoma cells. In addition, the expression of CDK4, CDK6, E2F3 and pRb, proteins related to the cell cycle progression, was reduced. An increase in p21 expression, a CDK inhibitor, was also detected in these cells. Some key molecules involved with proliferation and apoptosis processes, such as oncogenic proteins (Axl, AKT, ERK 1/2 kinases, ?- catenin and c-myc) and tumor suppressor proteins (p53 and PTEN), were down- and upregulated by miR-34a, respectively. Interestingly, the autophagic flux was stimulated by miR-34a, but this effect was not correlated with further alterations in cell viability. The increased autophagy occurred probably as a cellular response against the reticulum stress and the protein aggregation induced by miR-34a in melanoma cells, which can also be contributing to the cell death by apoptosis in this context. Our findings brought up novel molecular aspects about the role of miR-34a as melanoma suppressor. The broad action of this microRNA on key molecular players of melanoma aggressiveness was crucial for reprogramming these cells in favor of apoptosis. Altogether, this study pointed out miR-34a as a potential therapeutic agent against advanced melanoma / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

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