Na presente pesquisa, utilizou-se a técnica molecular de Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) e microscopia óptica (contraste de fase e fluorescência) para caracterizar a comunidade procarionte estabelecida em quatro biometanizadores de 50 L e em três biometanizadores de 5 L, cujo substrato principal foi a fração orgânica dos resíduos sólidos urbanos (FORSU) acrescida de serragem (12% nos biometanizadores de 50 L e 20% nos de 5 L) e lodo de esgoto (9% e 18% nos biometanizadores de 50 L; 40% e 60% nos de 5L). Pela análise do perfil das bandas de DGGE, verificou-se uma alteração na estrutura da comunidade de bactérias presentes no chorume dos biometanizadores de 50 L entre 60 e 120 dias de operação, período caracterizado pelo acúmulo de ácidos graxos voláteis, consumo crescente de alcalinidade, queda de pH e aumento da demanda química de oxigênio, resultando na baixa remoção de sólidos totais voláteis e na ausência de metano no biogás. Pela análise de microscopia de fluorescência, não foram detectadas metanogênicas em nenhuma das amostras de chorume dos biometanizadores de 50 L, sendo que as principais morfologias e formas de agrupamento visualizadas foram: bacilo, diplobacilos, vibrião, espirilo, diplococos e cocos em cadeia. Os biometanizadores de 5 L, por serem inoculados com maiores proporções de lodo de esgoto do que os biometanizadores de 50 L, apresentaram um processo mais equilibrado. Um dos tratamentos de 5 L (ETE 2) obteve a maior similaridade para o domínio Archaea entre o digestato e o respectivo inóculo, demonstrando a adaptação das arqueas exógenas ao substrato principal (FORSU), sendo esse o único tratamento para o qual detectou-se metano no biogás. Os resultados sugeriram que monitorar a comunidade microbiana que se desenvolve e atua no processo de biometanização pode trazer maior sensibilidade e especificidade na detecção e confirmação de instabilidades do sistema, garantindo intervenções somente quando necessário. / This dissertation addresses the use of the molecular technique of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and light microscopy (phase contrast and fluorescence) for the characterization of the prokaryotic community established in four 50 L reactors and in three 5 L reactors whose main substrate was the organic fraction of municipal solid wastes (OFMSW) plus sawdust (12% in 50 L reactors and 20% in 5 L reactors) and sewage sludge (9% and 18% in 50 L reactors; 40% and 60% in 5 L reactors). The analysis of the profile of DGGE bands revealed a change in the structure of the bacterial community present in the slurry of 50 L reactors between 60 and 120 days of operation, a period characterized by the accumulation of volatile fatty acids, increasing consumption of alkalinity, decrease in pH and increase in the chemical oxygen demand, which resulted in a lower removal of volatile total solids and absence of methane in the biogas. The fluorescence microscopy analysis detected no methanogenics in the slurry samples from 50 L reactors and the main morphologies and grouping forms displayed were bacillus, diplobacilos, vibrio, spirillum, diplococci and coconuts in chain. The 5 L reactors, inoculated with higher proportions of sewage sludge than the 50 L reactors, showed a more balanced process. One of the treatments (ETE 2) displayed the highest similarity for the Archaea domain between the digestato and the respective inoculum, which demonstrates the adaptation of the exogenous archaea to the main substrate (OFMSW). It was the only treatment in which methane was detected in the biogas. The results suggest the monitoring of the microbial community that develops and acts in the biomethanization process can provide higher sensitivity and specificity for the detection and confirmation of instability of the system and ensure interventions only when necessary.

Este trabalho tem por objetivo investigar o comportamento da terapia fotodinâmica (PDT) em leveduras patogênicas. Tem sido proposto que a PDT pode inativar células microbianas e, um grande número de fotossensibilizadores e fontes de irradiação são reportados em diferentes parâmetros. Para melhor entendimento dos processos fotodinâmicos, a taxa de fluência, fluência e tempo de irradiação foram estudadas, bem como fluências iguais em parâmetros diferentes foram comparadas entre si. O papel da concentração de azul de metileno e do transporte desta droga pela membrana fúngica foram investigados. Diferentes cepas de Cryptococcus neoformans foram comparadas frente à ação fotodinâmica com fotossensibilizadores distintos. Após esta etapa, atividades metabólicas de processo de morte microbiana e produção de melanina foram avaliadas quanto a sua interferência na inativação fúngica. Por fim, um modelo de criptococose foi desenvolvido para avaliação in vivo da ação fotodinâmica. Foi observado que parâmetros de irradiação influenciam substancialmente os resultados da PDT em leveduras e que, fluências iguais em diferentes tempos de irradiação podem apresentar resultados diferentes. Em conclusão, a fluência não deve ser utilizada como parâmetro único para comparação dos resultados de fotoinativação de leveduras. Além disso, o transporte de azul de metileno pela membrana fúngica pode influenciar os efeitos da PDT. A ação fotodinâmica depende do sítio de ligação do fotossensibilizador na célula e não somente da quantidade de moléculas no interior do microrganismo. É importante ressaltar que características intrínsecas de cada cepa podem influenciar diretamente os efeitos da PDT. As células morrem geralmente por processo não lítico, e quando utilizada in vivo, a PDT mostrou-se capaz de reduzir a recuperação de células viáveis. / This study aimed to investigate the photodynamic therapy (PDT) behavior on pathogenic yeasts. It has been proposed in literature that PDT is able to inactivate microbial cells, and a number of photosensitizer (FS) agents and irradiation sources were reported with different parameters. The role of fluence rate, as well as fluence and irradiation time was studied to achieve a deep understanding of this subject and to compare equivalent fluences under dissimilar irradiation parameters. Methylene blue concentration and its transport through yeast membrane were also focused. Cryptococcus neoformans strains that present particular metabolic characteristics were used to investigate photosensitizers and their ability to inactivate yeast. Furthermore, the role of PDT in microbial death process and inhibition of killing effects by melanin production were analyzed. Thereafter, an in vivo model of cryptococcosis was developed to evaluate photodynamic effect. The main point of our results was that light parameters play an important role on yeast inactivation and the same fluence under different irradiation parameters present dissimilar quantity of cell death. In conclusion, fluence per se should not be used as the only parameter to compare photoinactivation effects on yeast cells. In addition, MB transport thought yeast membrane can change PDT effects, as well as the photosensitizer preferential bind site inside the cell. The quantity of PS uptake, under specific conditions, does not seem to present a direct relation with cell inactivation. In addition, microbial strain characteristics can directly interfere on PDT results and cells appear to be killed by an apoptotic-like effect. Finally, PDT can kill C. neoformans in vivo and reduces its recover from infected site.

A água do equipo odontológico pode servir como meio de disseminação de microrganismos, uma vez que é a segunda maior fonte de contaminação na Odontologia. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o nível de contaminação por bactérias aeróbias totais em água de equipos odontolóicos (reservatórios, seringas tríplices e alta rotação) e torneiras de 5 Clínicas Odontológicas da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, por meio do método convencional (R2A Agar) e o sistema Petrifilm AC (3M St, Paul, MN, USA). Além disso, determinou-se o nível de contaminação por Pseudomonas spp. (Cetrimide Agar Base), coliformes (Endo Agar) e fungos (Petrifilm YM para bolores e leveduras), como também identificou-se as bactérias com série bioquimica na forma de kit comemial (API 20NE), detectou-se bactérias da boca pela técnica de Checkerboard DNA-DNA Hybridization e analisou-se o biofilme formado nas linhas dágua dos equipos (seringas tríplice e alta rotação), com auxilio de microscópio eletrônico de varredura (MEV). Por outro lado, foram sugeridas recomendações para a manutenção da qualidade microbiológica da água de equipos odontológicos. As comparações estatísticas mostraram que os níveis de contaminação bacteriana das águas de torneiras, bem como dos equipos foram mais elevados pelo método R2A Agar do que pelo sistema Petrifilm AC (p<0,001). Embora, as amostras de água das torneiras utilizadas para preencher os reservatórios dos equipos tivessem pequeno número de bactérias (908UFC/ml) - R2A e (2UFC/ml) Petrifilm AC, as dos 25 equipos apresentaram: reservatórios de 0 a 3.900.000 UFC/ml (média de 211.705 UFC/ml) - R2A Agar, e de 0 a 231.000 UFC/ml (média de 14.065 UFC/ml) Petrifilm AC; seringas tríplices de 0 a 5.200.000 UFC/ml (média de 509.068 UFC/ml) - R2A Agar, e de 0 a 610.000 UFC/ml (média de 30.842 UFC/ml) Petrifilm AC; e alta rotação de 0 a 6.300.000 UFC/ml (média de 862.279 UFC/ml) - R2A Agar, e de 0 a 730.000 UFC/ml (média de 61.817 UFC/ml) Petrifilm AC. As placas Petrifllm AC incubadas a 23°C por 7 dias demonstraram um nível maior de contaminação bacteriana do que aquelas incubadas a 35°C por 48h (p<0,001). De acordo com o método de cultura, Escherichia coli, coliformes totais e Pseudomonas spp. estavam ausentes das amostras de água das torneiras, embora 11 (44%) dos equipos tivessem apresentado E. coli e/ou coliformes totais e em 1 (4%) de alta rotação, Pseudomonas aeruginosa. Todavia, segundo o método molecular, 1 (50%) amostra de água de torneira e 36 (48%) de equipos mostraram contaminação por E. coli. Das águas de 10 torneiras e 25 equipos, 1 (10%) e 17 (68%) estavam contaminadas com fungos, respectivamente. As análises com MEV mostraram biofilmes nas linhas d\'água de todos os equipos, constituídos por uma diversidade microbiana embutida em densas e extensas matrizes de substâncias poliméricas extracelulares. As bactérias identificadas por meio do API 20 NE foram Acinetobacter Iwoffii, Brevundimonas vesicularis, Burkholderia cepacia, Moraxella spp., Oligel/a ureo/ytica, Pasteurella spp., P. aeruginosa e Sphingomonas paucimobi/is. Nas águas dos equipos, as bactérias mais prevalentes exclusivas da boca forem Streptococcus gordonii (35/46,7%), Treponema denticola (28/37,3%), e Aggregatibacter actinomycetemcomitans(b) (9/25,6%). Em conclusão, o BIOFILME formado nas linhas d\'água dos equipos funciona como um \"sistema amplificador\" do pequeno número de microrganismos das águas de torneiras, sendo a causa principal dessa alarmante contaminação das águas dos equipos. Assim, recomendações para a manutenção da qualidade microbiológica da água de equipos, bem como a avaliação de fungos deveriam ser acatadas pelos profissionais da Odontologia. / Dental unit water may serve as microorganism dissemination, since it is the second major source of contamination in dentistry. The aim of this research was to assess the contamination level of total aerobic bacteria in water from dental units (reservoirs, air-water syringes and high-speed handpieces) and taps from 5 Dental Clinics at the Faculdade de odontologia de Ribeirão PReto USP using conventional method (R2A Agar) and Petrifilm SYSTEM (3m, St Paul, MN, USA). Moreover, to evaluate the level of contamination by Pseudomonas spp. (Centrimide Agar Base), coliforms (Endo Agar) and fungi (Petrifilm YM for yeasts and molds) as well as to identify the bacteria by means biochemical test in form of kit (API 20NE), to detect mouth microorganisms by Checkerboard DNA-DNA Hybridization technique and to analyze the biofilm formed on dental unit waterlines (air-water syringes and high-speed handpieces) by scanning electron microscopy (SEM). The levels os bacteria in water from tap and dental unit were higher by R2A Agar than Petrifilm AC (p<0.001). Although, the tap water used to supply the dental unit reservoirs had few bacteria (908CFU/ml) R2A and (2CFU/ml) Petrifilm AC, water from 25 dental units showed: reservoir from 0 to 3,900,000CFU/ml (average of 211,705FCU/ml) R2A Agar, and from 0 to 610,000 CFU/ml (average of 30,842CFU/ml) Petrifilm AC; air water syringes from 0 to 5,200,000CFU/ml (average of 509,068CFU/ml) R2A Agar, and from 0 to 610,000CFU/ml (average of 30,842CFU/ml) Petrifilm AC; and high-speed handpieces from0 to 6,000,000CFU/ml (average of 862,279CFU/ml) R2A Agar, and from and0 to 730,000CFU/ml (average of 61,817CFU/ml) Petrifilm AC. The Petrifil AC plates incubated at 23ºC for 7 days demonstrated a level of bacterial contamination higher than those at 35ºC for 48h (p<0.001). According to culture method, Escherichia coli, total coliforms and Pseudomonas spp. Were not detected in water from taps, but E. coli and/or total coliforms were presented in 11 (44%) high-speed handpiece water. However, according to molecular method, 1 (50%) water sample from a tap and 36 (48%) from dental units showed contamination with E. coli. Water from 10 taps and 25 dental units were contamined with fungi in 1 (10%) and 17 (68%) samples, respectively. The analysis by SEM showed in all dental unit waterlines biofilms constituted of a microbial diversity embedded in dense and extensive matrices of extracellular polymeric substances. The bacteria identified by API 20 NE were Acinetobacter iwoffiii, Brevundimonas vesicularis, Burkholderia cepacia, Morexella spp., Oligella ureolytica, Pasteurella spp., P. aeruginosa and Sphingomonas paulcimobilis. The oral bacteria prevalent in dental unit water samples were Streptococcus gordonii (35/46.7%), Treponema denticola (28/37.3%) and Aggregatibacter actiomycetemcomitansb (9/25.6%). In conclusion, BIOFILM formed in dental nit waterlines serve as an amplifier system of few microorganisms from tap water, being the major cause of high contamination of dental unit water. Besides, recommendations to maintain the microbiological quality of dental units as well as the fungal evaluation should be employed for Dentistry professionals

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2016-08-23T18:46:20Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Luciana Vaz.pdf: 1049223 bytes, checksum: 7b8585e4ce55dd9ce5bd29de12361d5a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:46:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Luciana Vaz.pdf: 1049223 bytes, checksum: 7b8585e4ce55dd9ce5bd29de12361d5a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-12-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / The majority of the Amazonian soils is acid with low concentration of nitrogen and phosphorus. The use of leguminosae-rizhobia symbiosis is an alternative for the development of a sustainable agriculture of low input. Reaserches have showed that some isolates of rhizobia, besides fixing the atmospheric N, can still solubilize phosphate, availabiliting more P for the plants, then it is necessary to develop research to select strains of rhizobia more efficient in several favorable characteristics for use by plants. This research work had as objectives, to laboratory evaluations about the tolerance to acidity and toxic Al, the capacity to solubilize calcium (P-Ca) and aluminum (P-Al) phosphates and the indole-acetic acid production (AIA). To test acidity and aluminum toxicity, Among the 100 isolates tested, 91 and 82 presented tolerance with growth scale above 3,06 at 15th days in the treatment with pH 6,5 and pH 4,5 + Al, respectively. The most limiting factor the growth of the isolates ones was acidity and the aluminum. As for phosphate solubilization of the 71 isolates, where 46 isolated solubilized P-Ca and 25 solubilized P-Al, and 19 solubilized P-Ca as well as P-Al. Among the isolates able to solubilize calcium phosphate, 46 were considered as precocious and 1 as delayers and all the isolate evaluated presented capacity to solubilize aluminum phosphate, 24 were considered as precocious and 1 as delayers, the other not shown solubilizers. For the production of aia, 38 of the 71 isolates induced growth rate of root system of cucumber greater than in non-inoculated plants with them. Among the isolates, which had the best result was the INPA R670 in time of 24h. / A maioria dos solos da Amazônia é ácida e com baixa concentração de nitrogênio e fósforo. A utilização da simbiose leguminosa-rizóbia é uma alternativa para o desenvolvimento de uma agricultura sustentável e de baixos insumos. Pesquisas têm mostrado que alguns isolados de rizóbio, além de fixarem o N atmosférico, podem ainda solubilizar fosfatos pouco solúveis existentes no solo, disponibilizando mais P para as plantas, faz-se necessário, desenvolver pesquisas para selecionar estirpes de rizóbios mais eficientes quanto às diversas características favoráveis para sua utilização pelas plantas. Este trabalho teve como objetivos, avaliar em laboratório, a tolerância à acidez e Al tóxico, a capacidade de solubilização de fosfato de cálcio (P-Ca) e alumínio (P-Al) e a produção de acido indol-acético (AIA). Para o teste de acidez e alumínio tóxico, entre os 100 isolados testados 91 e 82 apresentaram tolerância com crescimento acima de 3,06 aos 15 dias nos tratamento com pH 6,5 e pH 4,5 + Al, respectivamente. O fator mais limitante para o crescimento dos isolados foi a acidez e o alumínio. Já para solubilização de fosfatos, dos 71 isolados, onde 46 solubilizaram P-Ca e 25 solubilizaram P-Al, sendo que 19 isolados solubilizaram tanto P–Ca quanto P–Al. Dentre os que solubilizaram fosfato de cálcio, 46 se comportaram como precoces e somente 1 como tardio já nos solubilizadores de alumínio, 24 se comportaram como precoces e 1 como tardio, os outros não se mostraram solubilizadores. Para a produção de AIA, 38 dos 71 isolados induziram taxas de crescimento radicular das plantas de pepino maiores do que nas plantas não inoculadas com os mesmos. Dentre os isolados avaliados, o que obteve melhor resultado foi o INPA R670 no tempo de 24h.

Bactérias Gram-negativas não fermentadoras são frequentemente encontradas em águas superficiais, sendo muitas vezes carregadoras de múltipla resistência. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar a participação de Pseudomonas sp. e Acinetobacter sp. na manutenção da resistência a antimicrobianos em quatro pontos na laguna de Tramandaí e se a presença deles poderia contribuir para a sua permanência. As amostras de água superficial foram coletadas em quatro pontos de coleta na laguna e submetidas a tratamento com os antimicrobianos: ácido nalidíxico, ceftazidima, imipenem e tetraciclina na concentração de 20mg/L. Em cada ponto de coleta uma das alíquotas não foi suplementada com os mesmos sendo utilizada como controle. Os isolados de Pseudomonas sp. foram identificados por provas bioquímicas e MALDI-TOF MS, enquanto que os isolados de Acinetobacter sp. somente por provas bioquímicas. O perfil de suscetibilidade de ambos foi avaliado pela técnica de disco-difusão e a produção de ESBL pela técnica de disco combinado. Os pontos 3 e 4 foram os que exibiram maior número de isolados resistentes. Os maiores percentuais de resistência estiveram associados às amostras submetidas ao tratamento com antimicrobianos. Em todos os pontos de coleta foram encontrados isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter sp. multirresistentes. Ambas amostras (com e sem tratamento) exibiram diferentes padrões de resistência nos diferentes pontos de coleta e tanto isolados de P. aeruginosa como de Acinetobacter sp. exibiram isolados produtores de ESBL. A presença de P. aeruginosa e Acinetobacter sp. multirresistentes na Laguna de Tramandaí atenta para o risco de disseminação de resistência neste ambiente e que o mesmo pode estar atuando como reservatório de resistência. / Non-fermenting Gram-negative bacteria are often found in surface water, and are often carriers of multiple resistance to antimicrobials. The present work had as main objective to analyze the role of Pseudomonas sp. and Acinetobacter sp. in maintaining antimicrobial resistance at four points in the Tramandaí lagoon. The surface water samples were collected at four sampling points in the lagoon and treated with the antimicrobials: nalidixic acid, ceftazidime, imipenem and tetracycline at a concentration of 20mg/L. At each collection point, one of the aliquots was not supplemented with the antimicrobial and were used as the control for the treatment. The isolates of Pseudomonas sp. were identified by biochemical tests and MALDITOF MS, whereas the isolates of Acinetobacter sp. were identified only by biochemical tests. The susceptibility profile of both was evaluated by the disc diffusion method and the ESBL production by the combined disk method. Sampling points 3 and 4 showed the highest number of resistant isolates. The highest percentages of resistance were associated with the samples that were submitted to antimicrobial treatment. In all sampling points, multiresistant P. aeruginosa and Acinetobacter were isolated. Both samples (with and without treatment) showed different resistance patterns within the sampling points. P. aeruginosa and Acinetobacter sp. isolates exhibited ESBL producers. The presence of multiresistant P. aeruginosa and Acinetobacter sp. in the Tramandaí Lagoon attempted to the risk of spreading resistance in the aquatic environment, since it can act as a reservoir of resistance.

Apesar da importância ambiental dos morcegos em ambientes urbanos, poucos estudos relatam a presença de enterococos nestes animais. Este estudo teve como objetivos: a) isolar, identificar as espécies e detectar a presença de genes de resistência e fatores de virulência em enterococos isolados de fezes de morcegos Tadarida brasiliensis; e b) avaliar a distribuição das espécies de enterococos por qPCR e dos genes de resistência por PCR nas amostras de fezes de morcegos T. brasiliensis. Quatro pools de fezes de morcegos foram coletados em três municípios do Estado do Rio Grande do Sul e foram analisados por metodologias utilizando técnicas de microbiologia e moleculares. A partir das análises dos enterococos isolados das fezes, foram identificadas 4 espécies, sendo Enterococcus faecalis a mais frequente (83,6%), seguida de E. casseliflavus (13,7%), E. gallinarum (1,35%) e E. mundtii (1,35%). As cepas apresentaram perfil de resistência para rifampicina, eritromicina, norfloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina. Dentre as 32 cepas resistentes à eritromicina, 28 apresentaram o gene ermC. Das 13 cepas resistentes à ciprofloxacina e norfloxacina nenhuma foi positiva para o gene gyrA. A única cepa resistente à tetraciclina apresentou o gene tetM. Os genes vanC1 e vanC2-3 foram observados em cepas de E. faecalis Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes gelE (97,3%) e ace (91,8%), seguido por agg (49,3%), cylA (5,5%) e esp (2,7%). A análise por qPCR permitiu identificar as espécies E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum e E. hirae nas fezes dos morcegos. Os genes de resistência ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 e vanC2-3 foram detectados por PCR. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos fazem parte da microbiota do trato gastrointestinal de morcegos T.brasiliensis e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionadas a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / Despite the environmental importance of bats in urban environments, few studies have reported the presence of enterococci in these animals. This study aimed: a) isolate, to identify the species and to detect the presence of resistance genes and virulence factors in enterococci isolated from feces of Tadarida brasiliensis bats; b) to evaluate the distribution of the enterococci species by qPCR and the resistance genes by PCR in the faecal samples of T. brasiliensis bats. Four pools of bats feces were collected in three places of the Rio Grande do Sul State and analyzed using microbiology and molecular methodologies. From the analysis of enterococci isolated from feces, 4 species were identified, being Enterococcus faecalis the most frequent (83.6%), followed by E. casseliflavus (13.7%), E. gallinarum (1.35%) and E. mundtii (1.35%). The strains showed a resistance profile to rifampicin, erythromycin, norfloxacin, ciprofloxacin and tetracycline. Of the 32 strains resistant to erythromycin, 28 presented the ermC gene. Of the 13 strains resistant to ciprofloxacin and norfloxacin, none were positive for the gyrA gene. The single tetracycline resistant strain showed the tetM gene. The vanC1 and vanC2-3 genes were observed in E. faecalis strains. As regards the presence of virulence genes, higher incidence was observed for to gelE (97.3%) and ace (91.8%) genes, followed by agg (49.3%), cylA (5.5%) and esp (2.7%). The qPCR analysis allowed to identify the E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum and E. hirae species in the bats feces. The ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 and vanC2-3 resistance genes were detected by PCR. In conclusion, different species of enterococci are part of the gastrointestinal tract microbiota of T. brasiliensis bats and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or originate from the environmental resistome.

A resistência antimicrobiana e fatores de virulência são importantes mecanismos de sobrevivência das bactérias, através deles elas se tornaram capazes de escapar da ação das adversidades do ambiente. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar os fatores de virulência e genes de resistência de isolados de Klebsiella sp. e sua participação na manutenção de populações bacterianas resistentes em pontos na Laguna de Tramandaí. As amostragens foram realizadas em agosto de 2014 e janeiro de 2015 em quatro pontos distintos com diferentes graus de impacto ambiental. Foram analisados 272 isolados bacterianos das amostras de água da laguna de Tramandaí. Estes isolados foram submetidos a testes bioquímicos e microbiológicos para identificação e foram encontrados 37 isolados de Klebsiella sp. Estes isolados foram submetidos a testes de susceptibilidade antimicrobiana por disco-difusão, análise fenotípica de fatores de virulência e genes de resistência e pesquisa de genes de resistência (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) através de PCR e similaridade através do ERIC-PCR. Através da análise por MALDI-TOF, os 37 isolados foram identificados como quatro K. oxytoca, seis K. pneumoniae e 27 K. variicola. Todos os isolados foram suscetíveis a imipenem, ertapenem, piperacilina/tazobactam e polimixina B Ampicilina e amoxacilina foram os antimicrobianos com maior índice de resistência, o gene blashv foi o mais encontrado dentre os genes pesquisados. Todos os isolados apresentaram cápsula polissacarídica, 56,7% dos isolados apresentaram fímbrias do tipo 1, 56,7% demonstraram serem capazes de produzir biofilmes, 78,4% foram capazes de inativar os fatores bactericidas do soro e 81,1% sintetizaram sideróforos. A análise por ERIC-PCR e MALDI-TOF geraram dendrogramas de alta heterogeneidade e baixos índices de similaridade, indicando que diferentes populações de Klebsiella estão se mantendo naquele ambiente. Ficou evidenciado neste estudo, através dos isolados encontrados e suas características genéticas e fenotípicas de resistência bacteriana, que eles podem estar contribuindo para a manutenção e disseminação da resistência aos antimicrobianos no ambiente. / Antimicrobial resistance and virulence factors are important mechanisms for the survival of bacteria, through which they have become capable of escaping from the adversities of the environment. The present work had as main objective to analyze the virulence factors and resistance genes of Klebsiella sp. And its participation in the maintenance of resistant bacterial populations in points in Tramandaí Lagoon. Samplings were carried out in August 2014 and January 2015 at four different points with different degrees of environmental impact. A total of 272 bacterial isolates from the Tramandaí lagoon water samples were analyzed. These isolates were submitted to biochemical and microbiological tests for identification and 37 isolates of Klebsiella sp. These isolates were submitted to antimicrobial susceptibility tests by disc-diffusion, phenotypic analysis of virulence factors and and resistance gene (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) search by PCR and similarity through ERIC-PCR. Through the use of MALDI-TOF, the 37 isolates were identified as four of K. oxytoca, six of K. pneumoniae and 27 of K. variicola. All the isolates were suscetible to imipenem, ertapenem, piperacilin/tazobactam e polimixin B Ampicillin and amoxicillin were the most resistant antimicrobials, the blaSHV gene was the most found among the genes studied. All isolates presented a polysaccharide capsule, 56.7% of the isolates had type 1 fimbriae, 56.7% were able to produce biofilms, 78.4% were able to inactivate serum bactericidal factors and 81.1% synthesized siderophores. Analysis by ERIC-PCR and MALDI-TOF generated dendrograms with high diversity and low similarity indexes, indicating that different populations of Klebsiella are remaining in that environment. It was evidenced in this study, through the isolates found and their genetic and phenotypic characteristics of bacterial resistance that they may be contributing to the maintenance and dissemination of antimicrobial resistance.

A resistência antimicrobiana é um desafio atual à saúde públ ica. Agentes antimicrobianos são indispensáveis no controle de infecções bacterianas, não só em seres humanos, mas também em animais e plantas. A pressão seletiva imposta pela utilização sistemática de um antimicrobiano pode selecionar cepas com algum mecanismo de resistência e estas, disseminarem-se pelo ambiente. Muitas teorias e controvérsias existem a respeito da disseminação da resistência entre animais e humanos, além disso, a prevalência de genes que conferem resistência às cefalosporinas de espectro estendido, carbapenêmicos e col istina, em bactérias zoonóticas comensais é pouco conhecida. Este trabalho avaliou a prevalência dos principais genes de resistência de importância clínica (bla1MP -type, blav1M -type, blaNoM- 1. blaKPc -type, blaGEs -type, blaoXA-48, blarEM, blasHv, blacrx-M e mcr-1) em isolados de E. colí, originados de aves de produção. Foram coletados swab cloacal de frangos, em um abatedouro frigorífico localizado no Rio Grande do Sul. Foram obtidos 343 isolados de E. colí que cresceram em presença de ceftazidima. Entretanto, 57 isolados foram positivos para os genes que conferem resistência às cefalosporinas: 3 blasHv, 18 blacrx-M, 30 blarEM e 6 para blacrx-M e blarEM concomitantemente Destes, 25 isolados foram positivos no teste fenotípico para pesquisa de ESBL. De acordo com o perfil de susceptibilidade aos antibióticos, 56 (98%) isolados foram considerados m ultirresistentes. Quanto à pesquisa do gene mcr-1, 1 O isolados foram positivos (2,9%), sendo todos multirresistentes. Destes, 8 obtiveram valor de CIM para polimixina de 2mgiL, os outros dois isolados obtiveram CIM 0.25mg/L e 1mg/L. A 1 tipagem molecular realizada por PFGE demonstrou que 5 isolados do mesmo lote foram clonalmente re lacionados, enquanto outros 5 não tiveram relação clonal. A tipagem molecular real izada in silico a partir do sequenciamento completo do genoma bacteriano de 4 isolados positivos para o gene mcr-1 revelou a presença de 3 STs: ST38, ST58 e ST2491 . A ST38 é bastante disseminada e associada com infecções em humanos. Diante da emergência da propagação do gene mcr-1 a partir de bactérias comensais de animais, torna-se crucial a implementação de práticas interdisciplinares no controle do uso de antim icrobianos na medicina veterinária, humana e no ambiente, evitando a disseminação da resistência e o esgotamento das opções terapêuticas. Alternativas ao uso indiscriminado dos antibióticos na produção animal j unto a ações que procurem diminuir o potencial reservatório ambiental destes genes, devem ser implementadas. / Antimicrobial resistance is a current public health challenge. Antimicrobial agents are essential in lhe control of bacterial infections, not only in humans, but also in animais and plan ts. The pressure selection imposed by lhe systematic use of an antimicrobial, selects strains that harbor some resistance mechanism. The antibiotic resistance spread among animais and humans is controversial, furthermore, lhe prevalence of genes related to resistance to extended-spectrum cephalosporins, carbapenems and colistin in zoonotic commensal bacteria is no! completely known. This study evaluated lhe prevalence of important clinicai resistance genes (blatMP -type, b/avtM -type, b/aNoM- 1, b/aKPc -type, b/aGEs -type, b/aoXA-48, b/arEM, b/asHv, blacrx-M and mcr-1) in E. co/i isolates originated from poul try production. Cloacal swabs were collected from chickens in a slaughterhouse located in Rio Grande do Sul. A total of 343 E. co/i isolates were grown in the presence of ceftazidime. Genes encoding resistance to carbapenems, were not detected. However, 57 isolates were positive to cephalosporins resistance genes: 3 b/asHv, 18 b/acrx-M, 30 b/arEM and six isolates were co-producers of b/acrx-M and b/arEM. Phenotypic test for confirmation of ESBL, were positive for 25 isolates. According to lhe profile of susceptibility to antibiotics, 56 isolates were considered multiresistant (98%). Regarding the mcr-1 gene investigation, 10 isolates were positive, ali of them multiresistant. The polymixin MIC of 8 isolates was 2 mg/L, lhe other two isolates presented MIC = 0.25mg/L and MIC = 1 mg/L. The molecular typing analysis, performed by PFGE, showed that 5 isolates from lhe same batch were clonally related , while another 5 were not related. Molecular typing performed in silíco from complete sequencing of the bacterial genome of 4 mcr-1 positive isolates revealed the presence of 3 sequences type: ST38, ST58 e ST2491 . With lhe present data in our hands and lhe emergence of mcr-1 gene, detected in commensal bacteria, with animal origins, it is cru cial to implement interdisciplinary practices, to control lhe use of antimicrobials in veterinary medicine, human and the environment, avoiding lhe spread of resistance and depletion of therapeutic options. The indiscriminate use of antibiotics in animal production should be re-consider, as well as actions aiming to reduce lhe potential environmen tal reservoir of resistance genes, in order to prevent global spread.

Orientador: André Rodrigues / Banca: Italo Delalibera Júnior / Banca: Fernando Carlos Pagnocca / Resumo: Os jardins de fungo das formigas da tribo Attini abrigam uma microbiota diversa, além do fungo mutualista cultivado como alimento por esses insetos. Fungos do gênero Escovopsioides foram recentemente descritos como membros dessa microbiota. Relacionado filogeneticamente com os fungos parasitas Escovopsis, nada se sabe sobre a biologia e o potencial parasita de Escovopsioides nos jardins de fungo das formigas atíneas. Neste contexto, acessamos a diversidade genética de 21 isolados de Escovopsioides obtidos de colônias de formigas cortadeiras (gêneros Atta e Acromyrmex) e não cortadeiras (gêneros Trachymyrmex e Apterostigma), provenientes de diferentes regiões do Brasil. Independente da origem dos isolados, foi observada uma baixa diversidade genética entre 20 dos 21 isolados de Escovopsioides examinados, o que permitiu identifica-los como Escovopsioides nivea (a única espécie descrita para o gênero). Em contrapartida, o isolado obtido da colônia de Apterostigma megacephala apresentou baixa similaridade genética em relação à E. nivea, o que aponta para uma nova espécie filogenética. Segundo os marcadores moleculares tef1 e ITS, Escovopsioides ocupa uma posição intermediária na filogenia de Escovopsis, o que sugere a possível reclassificação do gênero Escovopsioides como Escovopsis. Adicionalmente, nosso estudo confirmou o antagonismo de Escovopsioides frente ao fungo mutualista de formigas cortadeiras (Leucoagaricus gongylophorus). Esse resultado sugere que Escovopsioides seja um micoparasita do fungo cultivado pelas formigas. Baseado em dados de crescimento de Escovopsioides em jardim de fungo, tanto na ausência, quanto na presença de operárias podemos apontar fortes evidências do parasitismo de Escovopsioides frente ao jardim de fungo das formigas / Abstract: Fungus gardens of attine ants harbor a rich microbiome, besides the mutualistic fungus cultivated by these insects for food. Fungi in the genus Escovopsioides were recently described as members of this microbiome. Closely related to the parasitic fungal genus Escovopsis, nothing is known about the biology and the parasitic potential of Escovopsioides in the fungus gardens of attine ants. In this sense, we accessed the genetic diversity of 21 Escovopsioides isolates obtained from leafcutting ants (Atta and Acromyrmex genera) and no leaf cutting ant colonies (Trachymyrmex and Apterostigma genera), originated from distinct regions of Brazil. Independent of the origin of the isolate, we observed a low genetic diversity among 20 out of 21 isolates, which prompted the identification of these isolates as Escovopsioides nivea (the only described species for the genus). In contrast, the isolate obtained from the colony of Apterostigma megacephala showed low genetic similarity in relation with E. nivea, indicating a new phylogenetic species. According to the tef1 and ITS molecular markers, Escovopsioides exhibit an intermediate placement in the Escovopsis phylogeny, suggesting the putative reclassification of the genus Escovopsioides as Escovopsis. In addition, our study confirmed the antagonism of Escovopsioides towards the mutualistic fungus of leaf cutting ants (Leucoagaricus gongylophorus). This indicate that Escovopsioides is a mycoparasite of the ant fungal cultivar. Based in growth experiments of Escovopsioides in the fungus gardens, in the absence and in the presence of ant workers, we provide strong evidences of Escovopsioides parasitism in the fungus gardens of attini ants / Mestre

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 italo.pdf: 843750 bytes, checksum: 971dc2983746976f9e3b4bd789755fb5 (MD5) Previous issue date: 2010-03-04 / Yeasts were isolated from different Amazon habitat: beetles gut (Carabidae), midgut and hindgut of Nasutitermes sp., soil samples from savanna (Boa Vista city, Roraima state) and Amazon rain forest. The yeasts were selected according to the capability of metabolize sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate (HACA) as one carbon source, assimilate and fermenting D-xylose. To selective medium preparation, HACA was diluted until reducing sugar concentration was 1% and supplemented with Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Xylose assimilating ability was investigated using replica-plating, as described by Barnett et al. (1990), using D-xylose (50 mM), YNB (6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Fermenting capability was evaluated using flasks with 10 mL of YUKX medium (Yeast extract 1,5 g/L; Urea 1,25 g/L; KH2PO4 1,1 g/L and D-xylose 50 g/L), containing a Durham tube. Another fermentation test was performed using Falcon® tubes (50 mL) with 10 mL of YUKX, sealed with rubber stopper. A valve allowed CO2 liberation as fermentative evidence. A number of 76 colonies were isolated (2 from savanna, 8 from rain forest, 12 from Carabidae and 54 from Nasutitermes sp.), among these were detected 28 that have ability to growth on D-xylose as unique carbon source and 3 were able to ferment that sugar. These results agree with Breznak (1982) and Blackwell et al. (2004), which consider that insect gut (as termites and beetle) is a rich source of microorganisms that metabolize hemicelluloses for biotechnology purpose. Three D-xylose fermenting strains isolated from Amazon insects (LC27, IB04 and IB09) were cultivated at HACA and YUKX medium. The cell growth and sugar consumption were evaluated using OD600 and DNS methods, respectively. Thermo tolerance and ethanol tolerance were investigated using heat-shock (52 ºC, 9 minutes) and ethanol-shock (YPD + 20% ethanol during one week), evaluating cell viability. A fermenting assay was performed, monitoring CO2 releasing to estimate ethanol production. Sugar consumption was 78,3% at HACA medium, while at YUKX was 55,9%. Both strains are able to do hemicellulosic hydrolysate saccharification, raising reducing sugar from 42,5 g/L up to 63 g/L. The cell viability after heat-shock was upper 85% for IB04 and IB09 strains, but LC27 had a cell-viability lower than 40%. The cultivation after ethanol shock shows tolerance by all tested strains. The fermenting assay allows estimate low ethanol yield, average about 3,34 g/L. These results indicate potential for biotechnological using of hemicellulosic derived. / Foram isoladas leveduras a partir de diferentes habitats amazônicos, a saber, intestino de besouros da família Carabidae, conteúdo abdominal de cupins (Nasutitermes sp.), amostras de solos coletados em áreas de savanas (formação geomorfológica Boa Vista RR) e em matas de terra firme (Manaus AM). As leveduras foram isoladas segundo a capacidade de crescer invitro usando hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (HACA) como fonte única de carbono, sendo selecionadas aquelas que fossem capazes de assimilar e fermentar D-xilose. Para tanto se utilizou meio de cultura composto por hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (concentração de açúcar redutor total ajustada para 1%), suplementado por Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade de assimilar D-xilose foi atestada pela técnica replica-plating, descrita por Barnett et al. (1990), cultivando as colônias isoladas em placas de Petri contendo D-xilose (50 mM), YNB (6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade fermentativa foi testada em tubos de ensaio contendo meio YUKX líquido, composto por extrato de leveduras (1,5 g/L), uréia (1,25 g/L), KH2PO4 (1,1 g/L) e D-xilose (50 g/L). Em cada tubo de ensaio foi adicionado um tubo de Durham para retenção de gás liberado pela fermentação. Outro teste qualitativo de fermentação foi efetuado, cultivando as leveduras em tubos Falcon® de 50 mL contendo 10 mL de YUKX. Os tubos foram vedados com rolhas de borracha contendo um orifício fechado por uma mangueira. Após sete dias de cultivo, a mangueira foi aberta dentro de uma coluna de água, para evidenciar o desprendimento de gás pela atividade fermentativa. Foram isoladas ao todo 76 colônias de leveduras, sendo duas associadas a solos de savana, oito associadas a solos de florestas de terra firme, 12 associadas a besouros da familia Carabidae e 54 associadas à Nasutitermes sp. Dentre estas, 28 foram capazes de assimilar D-xilose e três capazes de fermentar o referido açúcar, sendo duas associadas à Carabidae e uma a Nasutitermes sp. Estes resultados concordam com o que foi escrito anteriormente por Breznak (1982) e Blackwell (2004), os quais consideram que o trato digestivo de insetos xilófagos é uma rica fonte de microrganismos de interesse biotecnológico. As três linhagens de leveduras, fermentadoras de D-xilose (LC27, IB04 e IB09) foram cultivadas em YUKX e em HACA, a fim de caracterizá-las quanto ao crescimento celular (mensurando a densidade ótica / λ = 600 nm) e o consumo de açúcar redutor (quantificado pelo método DNS). O ensaio em fermentômetro foi executado para avaliação da perda de massa por desprendimento de CO2 a fim de se estimar a produtividade de etanol. Avaliou-se ainda a termotolerância (choque térmico a 52 ºC por 9 minutos) e tolerância ao etanol (cultivo estacionário por 7 dias em YPD + 20% etanol). Todos os experimentos foram feitos em duplicata, com pH inicial 5,5 e temperatura a 35 ºC. O consumo de açúcar redutor total em HACA foi em média de 78,3%, enquanto que em YUKX o consumo médio foi de 55,9%. Quando cultivadas em HACA, as linhagens demonstraram ainda potencial de sacarificação, elevando a concentração de ART em até 48% durante as primeiras 8 horas de cultivo. As linhagens IB04 e IB09 são termotolerantes, apresentando viabilidade celular superior a 85%, enquanto que LC27 esses valores foram inferiores a 40%. O teste de tolerância ao etanol demonstrou resistência pelas três linhagens, com média de 81 unidades formadoras de colônia nas primeiras 24 horas, tornando-se incontáveis a partir das 48 horas. A evolução de CO2 (valor médio de 3,2 g/L) permite estimar produção de etanol, mas com baixo rendimento, com estimativa de 3,34g/L. Todas apresentam potencial para utilização em processos biotecnológicos usando hidrolisado hemicelulósico como substrato.