Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Márcia Regina Brochetto / Resumo: Neste trabalho, uma linhagem de Penicillium chrysogenum foi utilizada para produzir xilanases utilizando um resíduo agroindustrial como substrato. O principal objetivo foi melhorar a produção da xilanase, verificando a influência de diferentes substratos, agitação, pH e temperatura de cultivo. A linhagem foi cultivada em meio líquido de Vogel suplementado com diversos substratos puros como a xilose, glicose, xilano de aveia, Avicel e carboximetilcelulose (CMC), e complexos como farelo de trigo, farelo de aveia, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de cevada, casca de laranja e sabugo de milho. Testes granulométricos com bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de cevada foram realizados para avaliar a influência dessa característica sobre a produção de xilanase. A melhor produção foi obtida com bagaço de cana-de-açúcar a 1% (m/v) com granulometria entre 2-1 mm. Nos ensaios cinéticos a melhor produção foi obtida em cultivos estáticos, por 8 dias, sendo produzida quantidade duas vezes maior de enzima do que em cultivos agitados. O melhor pH de cultivo para a produção de xilanases foi de 5,0 e a temperatura de 20 ºC. A enzima foi purificada por uma estratégia de duas etapas, sendo uma cromatografia de troca iônica e outra de filtração em gel, apresentando ao final uma recuperação de 18,8% com um fator de purificação de 24,9. As propriedades da enzima bruta e da purificada foram pH ótimo de 6,0 e 6,5, respectivamente, e a temperatura ótima para ambas de foi a 45 ºC. As meias vidas a 40, 45, 50, 55 e 60 ºC, para a xilanase bruta foram de 37, 28, 16, 2, e 1 minuto e para a xilanase purificada foram de 35, 31, 10, 3 e 2 minutos, respectivamente. A maior estabilidade ao pH da enzima bruta ocorreu em pH 6,0 e também se mostrou estável na região alcalina, entre 8,0 e 10,0; já a enzima purificada apresentou maior estabilidade na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work, a strain of Penicillium chrysogenum has been used to produce xylanases using agroindustrial waste as substrate. The main objective was to improve the production of xylanase, by checking the influence of substrate, agitation, pH and temperature of cultivation. The strain was cultivated in liquid Vogel's medium supplemented with various substrates as pure xylose, glucose, oat xylan, Avicel and carboxymethylcelullose (CMC), and complexes such as wheat bran, oat bran, sugar cane bagasse, brewers spent grain, orange peel and corncob. Granulometric tests with crushed sugar cane bagasse and brewers spent grain were conducted to evaluate the influence of this characteristic on production of xylanase. The best production was obtained with crushed sugar cane bagasse to 1% (w/v) with particle size between 2-1 mm. In kinetic experiments, the best production was obtained in static cultivation for 8 days, which is produced twice as much enzyme in agitated cultures. The bets pH cultivation for the production of xylanase was pH 5.0 and temperature of 20 °C. The enzyme was purified by a two-step strategy, being a ion exchange chromatography and a gel filtration, presenting the ultimate recovery of 18,8% with a purification factor of 24,9. The properties of the crude enzyme and purified were optimum pH of 6,0 and pH 6.5, respectively, and the temperature was great for both of 45 ºC. The half of 40, 45, 50, 55 and 60 ° C for xylanase crude were 37, 28, 16, 2, 1 minutes and for the xylanase purified were 35, 31, 10, 3 and 2 minutes, respectively. The increased stability at the pH of the crude enzyme was at pH 6,0 and also stable in the alkaline region, between 8.0 and 10.0, whereas the purified enzyme was most stable in the range of 4.5 to 10.0. The xylanase activity present in crude filtrate and purified enzyme, suffered inhibition... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Caio Antonio Carbonari / Coorientador: Edivaldo Domingues Velini / Banca: Fernando Tadeu de Carvalho / Banca: Marcus Barifouse Matallo / Banca: Cleber Daniel de Goes Maciel / Banca: Elza Alves Corrêa / Resumo: O glufosinate é derivado do fosfinotricina, uma toxina microbiana natural isolada a partir de duas espécies de fungos Streptomyces. Atua inibindo a atividade da enzima glutamina sintetase, que é necessária para a produção do aminoácido glutamina e para a desintoxicação da amônia pela planta. Objetivou-se neste trabalho avaliar a intoxicação e alterações fisiológicas e bioquímicas causadas pelo glufosinate em plantas de soja. O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, no Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia (Nupam), pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas - FCA/UNESP. Foi utilizado o cultivar de soja Nidera NS 7100 (RR) plantada em vasos de cinco de litros de solo. Foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro experimento instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio a 2,5 L p.c. ha-1 e glufosinate de potássio 2,5 L p.c. ha-1), três períodos de coleta de folhas dois, quatro e seis dias após aplicação e um tratamento testemunha sem aplicação. O segundo experimento foi instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio e glufosinate de potássio), três doses de cada produto (0,625 L p.c. ha-1; 1,25 L p.c. ha-1; 2,5 L p.c. ha-1) e um tratamento testemunha sem aplicação. As variáveis analisadas em ambos os experimentos foram, amônia, compostos pertencentes à rota metabólica de ação do glufosinate (glutamato, glutamina, serina, ácido aminolevulênico, glufosinate), análise visual de fitotoxicicidade e ETR (taxa de transporte de elétrons). Para determinação de amônia foram desenvolvidas metodologias de extração para posterior quantificação em espectrofotômetro. Para determinação dos compostos, foram realizados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The glufosinate is derived from phosphinothricin, a natural microbial toxin isolated from Streptomyces of two species of fungus. Acts inhibits the activity of glutamine synthetase, which is necessary for the production of the amino acid glutamine and for the detoxification of ammonia by the plant. The objective of this study was to evaluate the toxicity and physiological and biochemical changes caused by glufosinate in soybean plants. The experiment was carried out in green-house, in Faculty of Agronomic Sciences at São Paulo State University. We used soybean the cultivar NS 7100 Nidera planted in vases containing 5 liters of soil. Two experiments were carried out, the first experiment set with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium 2.5 L c.p. ha-1 and glufosinate potassium 4 2.5 L c.p. ha-1), three periods of leaf collection two, for and six days after application and a control without application. The second experiment was carried out with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium and glufosinate potassium), three doses of each product (0.625 L c.p. ha-1, 1.25 c.p. ha-1 L, 2.5 L c.p. ha -1) and a control without application. The variables analyzed in both experiments were ammonia, compounds belonging to the metabolic pathway of action of glufosinate (glutamate, glutamine, serine, aminolevulenic acid, glufosinate), visual analysis of plant injury and ETR (electron transport rate). To determine the ammonia were developed extraction methodologies for a quantification in spectrophotometric and for determination of compounds, extraction tests were performed to choose the most appropriate methodology, and development of analytical methods in LC-MS/MS (liquid chromatography and mass spectrometry). Plant injury evaluations were based on visual criteria and ETR measurements are given... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-16Bitstream added on 2014-06-13T19:00:30Z : No. of bitstreams: 1 barberis_lrm_dr_botfca.pdf: 840865 bytes, checksum: 2158433b6e8b218bb15ad11592a60db9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O glufosinate é derivado do fosfinotricina, uma toxina microbiana natural isolada a partir de duas espécies de fungos Streptomyces. Atua inibindo a atividade da enzima glutamina sintetase, que é necessária para a produção do aminoácido glutamina e para a desintoxicação da amônia pela planta. Objetivou-se neste trabalho avaliar a intoxicação e alterações fisiológicas e bioquímicas causadas pelo glufosinate em plantas de soja. O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, no Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia (Nupam), pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas – FCA/UNESP. Foi utilizado o cultivar de soja Nidera NS 7100 (RR) plantada em vasos de cinco de litros de solo. Foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro experimento instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio a 2,5 L p.c. ha-1 e glufosinate de potássio 2,5 L p.c. ha-1), três períodos de coleta de folhas dois, quatro e seis dias após aplicação e um tratamento testemunha sem aplicação. O segundo experimento foi instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio e glufosinate de potássio), três doses de cada produto (0,625 L p.c. ha-1; 1,25 L p.c. ha-1; 2,5 L p.c. ha-1) e um tratamento testemunha sem aplicação. As variáveis analisadas em ambos os experimentos foram, amônia, compostos pertencentes à rota metabólica de ação do glufosinate (glutamato, glutamina, serina, ácido aminolevulênico, glufosinate), análise visual de fitotoxicicidade e ETR (taxa de transporte de elétrons). Para determinação de amônia foram desenvolvidas metodologias de extração para posterior quantificação em espectrofotômetro. Para determinação dos compostos, foram realizados... / The glufosinate is derived from phosphinothricin, a natural microbial toxin isolated from Streptomyces of two species of fungus. Acts inhibits the activity of glutamine synthetase, which is necessary for the production of the amino acid glutamine and for the detoxification of ammonia by the plant. The objective of this study was to evaluate the toxicity and physiological and biochemical changes caused by glufosinate in soybean plants. The experiment was carried out in green-house, in Faculty of Agronomic Sciences at São Paulo State University. We used soybean the cultivar NS 7100 Nidera planted in vases containing 5 liters of soil. Two experiments were carried out, the first experiment set with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium 2.5 L c.p. ha-1 and glufosinate potassium 4 2.5 L c.p. ha-1), three periods of leaf collection two, for and six days after application and a control without application. The second experiment was carried out with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium and glufosinate potassium), three doses of each product (0.625 L c.p. ha-1, 1.25 c.p. ha-1 L, 2.5 L c.p. ha -1) and a control without application. The variables analyzed in both experiments were ammonia, compounds belonging to the metabolic pathway of action of glufosinate (glutamate, glutamine, serine, aminolevulenic acid, glufosinate), visual analysis of plant injury and ETR (electron transport rate). To determine the ammonia were developed extraction methodologies for a quantification in spectrophotometric and for determination of compounds, extraction tests were performed to choose the most appropriate methodology, and development of analytical methods in LC-MS/MS (liquid chromatography and mass spectrometry). Plant injury evaluations were based on visual criteria and ETR measurements are given... (Complete abstract click electronic access below)

A busca por moléculas de origem natural que ocupem um espaço químico diferente daquelas já existentes tornou-se uma necessidade para atender às novas demandas das indústrias farmacêuticas. A pesquisa envolvendo transformações microbianas de metabólitos secundários de origem vegetal pode ser utilizada como uma nova ferramenta na biosíntese destas novas substâncias, favorecendo a criação de bibliotecas ricas em estruturas com o emprego em diversos alvos biológicos. A tagitinina C é uma lactona sesquiterpênica isolada da Tithonia diversifolia (Asteraceae). Essa substância possui diversas atividades biológicas descritas na literatura. Contudo, há certa ressalva no uso de lactonas sesquiterpênicas para fins terapêuticos devido à elevada toxicidade apresentada por essas substâncias. A biotransformação de substâncias naturais de elevado interesse farmacológico pode ser utilizada com o intuito de diminuir seus efeitos tóxicos ou ampliar sua capacidade terapêutica. Assim, esse trabalho teve como objetivo a utilização de fungos para a biotranformação da tagitinina C. Os resultados obtidos mostraram que os fungos de solo Aspergillus terreus e Mucor rouxii possuem a capacidade de biotransformar tagitinina C. O fungo Aspergillus terreus levou a formação de um produto biotransformado através de uma reação não usual de epoxidação entres os C4-C5 e ainda metoxilação do C1, formando então 1-metóxi-3-hidróxi-3,10-4,5-diepóxi-8-isobutiroilóxi-germacra-11(13)-en-6,12-olido. Os resultados obtidos nesse trabalho demostram que é possível a utilização de fungos na biotransformação da tagitinina C, levando a alterações na molécula que podem influenciar no seu potencial tóxico ou terapêutico. / The search for molecules of natural origin that place a chemical space which is different from the already existing has become that a need in process of discovery new chemical entities with pharmacological interest that support the demand of the pharmaceutical industries. Research involving microbial transformations the secondary metabolites from plants can be used as an alternative for the biosynthesis of such new compounds, thus facilitating the creation of libraries which are rich in structures to be screened against diverse biological targets. Tagitin C is a sesquiterpene lactone isolated from Tithonia diversifolia (Asteraceae) that displays several biological activities already described in the literature. Howeever, due to several reports describing toxic effects of sesquiterpenes lactones, there is a concern in its oral use. Thus, the biotransformation of pharmacologically interesting substances can be carried out with the aim to decrease their toxic effects or amplify their therapeutic properties. Therefore, this work aimed at using of fungi to perform biotransformations of tagitin C. The results showed that the soil fungi Aspergillus terreus and Mucor rouxii have the ability to carry out biological transformations of tagitinin C. The fungus A. terreus led to the formation of a different product through an unusual reaction of epoxidation between C4-C5 and metoxilation of C1 of tagitinin C, the derivative 1-methoxy-3-hydroxy-3,10-4,5-diepoxy-8-isobutiroyloxygermacr- 11 (13)-en-6 ,12-olide. The results of this work show that it is possible to use soil fungi in the biotransformation of tagitinin C, leading to changes in the chemical structure that may influence its toxic or therapeutic potential.

O processo de transformação microbiana de metabólitos secundários é uma técnica emergente no Brasil e que apresenta enorme potencial para obtenção de substâncias biotransformadas com novas e diferentes moléculas, as quais podem apresentar melhor desempenho de suas atividades biológicas. O objetivo do presente projeto foi efetuar transformações microbianas de metabólitos secundários oriundos da espécie vegetal Viguiera robusta Gardn. (família Asteraceae), com ênfase nas lactonas sesquiterpênicas (LSTs), para posterior avaliação de sua citotoxicidade frente a linhagens celulares. As etapas de isolamento e purificação de LSTs foram realizadas através de métodos cromatográficos e a elucidação estrutural através de métodos espectroscópicos. A avaliação da atividade citotóxica dos metabólitos biotransformados foi proposta em virtude de estudos iniciais indicarem potencial citotóxico da LST budleína A frente às linhagens SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama) e células leucêmicas JURKAT. / The microbial transformation of secondary metabolites is an emerging technique in Brazil with high potential to obtain biotransformed compounds with new and different molecules which can show enhanced biological activities. Herein, microbial transformations of secondary metabolites from Viguiera robusta Gardn. (family Asteraceae), with emphasis in sesquiterpene lactones (STLs), were proposed with the aim to evaluate their cytotoxic activity against tumor cells lines. Isolation and purification of STLs were carried out through chromatographic methods and structural elucidation by spectroscopic methods. The evaluation of cytotoxic activity of the biotransformed metabolites was proposed due to the fact that previous studies indicated potential cytotoxic activity of the STLs budlein A against SK-BR-3 and JURKAT cells lines.

Orientador: Fernando Broetto / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres / Banca: José Soares do Nascimento / Banca: Renato Mamede de C. Montini / Resumo: O cultivo de cogumelos comestíveis, em subprodutos energéticos, representa o principal exemplo da conversão direta de resíduos lignocelulósicos em um artigo com alto valor agregado, com benefício para o gênero humano e uma fonte de energia biosintética comercialmente importante. O objetivo do trabalho foi verificar a atividade de enzimas lignocelulolíticas do Lentinula edodes crescendo em resíduos agrícolas, utilizando-se três tipos de incubação: meio líquido, sistema estacionário e bioreator. As linhagens LE 95/17, LE 96/22 e Leax foram incubadas em substratos compostos de casca de arroz (CA), serragem de eucalipto (SE), bagaço de mandioca (BM) e bagaço de cana-de-açúcar (BC), suplementado com 20% de farelo de arroz e 1% de CaCO3. Foram avaliados a velocidade de crescimento miceliano e a atividade de enzimas oxidativas e hidrolíticas. As linhagens em meio de cultura líquido não apresentam atividades expressivas de manganês peroxidase e lacase. SE e BC, utilizados no sistema estacionário, mostraram ser os mais eficientes para as atividades de MnP, enquanto que para a atividade da lacase apenas SE. O sistema estacionário, em SE, foi melhor que o bioreator para atividade de enzimas hidrolíticas. O bagaço de mandioca pode ser uma alternativa viável como substrato, ou na forma de complemento à outros substratos, por propiciar um rápido crescimento miceliano. A lignina peroxidase não foi detectada em nenhum dos experimentos. / Abstract: The cultivation of mushrooms in by-products represents the main example of the direct conversion of lignocellulosic residues in an article with high attached value with benefit for the mankind and source of commercially important biosynthetic energy. The aim of this work was verify the activity of the Lentinula edodes lignocellulolitic enzymes growing in agricultural residues utilizing three kinds of incubation: liquid culture medium, solid static state and bioreactor. The LE 17/95, LE 22/96 and Leax strains were incubated in substrates composed of peel of rice (PR), eucalyptus sawdust (ES), cassava bagasse (CB) and sugar cane bagasse (SB), supplemented with 20% of rice brans and 1% of CaCO3. The mycelium growth velocity, the oxidative and hydrolytic enzymes activity were evaluated. The strains in liquid culture medium don't presented expressive activities of manganese peroxidase (MnP) and laccase. SE and BC utilized in solid static state system showed to be more efficient to MnP activity while laccase only SE. The solid static state system was better than bioreactor to hydrolytic enzymes activity in SE. The cassava bagasse can be a substrate alternative for having a fast mycelium growth. The lignin peroxidase was not detected in the experiments. / Doutor

Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Mario Tyago Murakami / Banca: Gabriela Salvador de Amo / Banca: Roberto Ruller / Resumo: Proteases são enzimas cuja função é a hidrólise de proteínas e peptídeos, gerando produtos de variados tamanhos. São produzidas pelos mais diversos organismos vivos e possuem um amplo espectro de aplicações. O objetivo desse trabalho foi promover a expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thermomucor indicae-seudaticae em Escherichia coli e Pichia pastoris, através da identificação do gene codificador da enzima. Para isso, foi realizada a comparação entre o genoma de T. indicae-seudaticae e Rhizomucor pusillus utilizado como referência. Os vetores pET 28ª (+) e pPICZαA foram sintetizados contendo o gene de interesse para a transformação em E. coli e P. pastoris respectivamente. Células competentes de cinco diferentes linhagens de E. coli foram transformadas e submetidas a teste de expressão em 20 °C e 37 °C por 24 horas, analisadas tanto a fração solúvel, quanto insolúvel, onde apresentaram, aparentemente, a expressão com maior quantidade em fração insolúvel. Células de P. pastoris foram transformadas e submetidas a expressão por 72 horas. O extrato enzimático bruto do produto gerado da expressão foi caracterizado bioquimicamente. A enzima recombinante produzida por E. coli apresentou máxima atividade de 250,89 U mL-1 utilizando caseína como substrato nas condições de pH 5,0 e temperatura de 50 °C, porém com estabilidade após 24 horas apenas nos pH 6,0 e 6,5, demonstrando assim ser sensível em pH alcalino. Enquanto que a enzima recombinante produzida por... / Abstract: Proteases are enzymes whose function is the hydrolysis of proteins and peptides, generating products of various sizes. They are produced by the most diverse living organisms and have a wide spectrum of applications. The objective of this work was to promote the heterologous expression of a coagulant protease produced by Thermomucor indicae-seudaticae in Escherichia coli and Pichia pastoris through the identification of the gene encoding the enzyme. For this, a comparison was made between the genome of T. indicae-seudaticae and Rhizomucor pusillus used as reference. The vectors pET 28a (+) and pPICZαA were synthesized containing the gene of interest for transformation in E. coli and P. pastoris respectively. Competent cells from five different strains of E. coli were transformed and submitted to the expression test at 20 ° C and 37 ° C for 24 hours, analyzed both the soluble and the insoluble fraction, where they apparently presented the expression with the highest amount in insoluble fraction. P. pastoris cells were transformed and submitted to expression for 72 hours. The crude enzyme extract of the expression product generated was biochemically characterized. The recombinant enzyme produced by E. coli presented maximum activity of 250.89 U mL-1 using caseine as substrate under conditions of pH 5.0 and temperature of 50 ° C, but with stability after 24 hours only at pH 6.0 and 6.5, thus demonstrating to be sensitive at alkaline pH. While the recombinant enzyme produced by ... / Mestre

El manejo de los suelos puede impactar sobre la composición y actividad de las comunidades microbianas, en consecuencia existe preocupación sobre el uso responsable y mantenimiento de la diversidad microbiana de los suelos agrícolas para un manejo sustentable del agroecosistema. En esta tesis se trabajó en un ensayo de sistemas de labranza en sistemas mixtos del Sur-Oeste Bonaerense iniciado en el año 1999. Ante la falta de antecedentes a nivel microbiológico en el ensayo, siendo que los microorganismos cumplen un rol fundamental en los agroecosistemas, se decidió evaluar cómo afectan los sistemas de manejo agrícola a la abundancia de grupos funcionales microbianos (Bacterias Nitrificantes [BN], Reductoras de Nitrato [BRN] y Desnitrificantes [BD]) y a la actividad microbiana a través de la liberación de dióxido de carbono. Paralelamente se evaluó en los suelos la presencia del gen amoA que codifica para el sitio activo de la enzima Amonio Monooxigenasa, y de los genes que codifican para las enzimas de las diferentes etapas de la desnitrificación, y se aislaron y caracterizaron bacterias potencialmente desnitrificantes. Además, en esta tesis se diseñó un ensayo de degradación de rastrojo en microcosmos, para evaluar el efecto de diferentes niveles de humedad y de fertilización en el suelo sobre la actividad microbiana, analizando la actividad enzimática y la biomasa activa. Los primeros dos años de muestreo (2009 y 2010) se caracterizaron por tener escasez de lluvia. Mostraron baja abundancia de la microbiota y en general en cada fecha individual de muestreo no se detectaron efectos de los sistemas de manejo, sino que la variación estuvo dada entre fechas de muestreos. En el caso de las BN no se pudo estimar el número, lo cual se adjudica a la dificultad para cultivar estas bacterias, y su alta dependencia a una adecuada humedad en el suelo. El tercer año (2011), hubo mayores precipitaciones, sin embargo, en pocas ocasiones se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos de una misma fecha de muestreo, y tal como sucedió en los primeros años, la variación se dio entre fechas. La respiración basal del suelo en general fue mayor en los primeros 5 cm del suelo y bajo siembra directa; y en el caso del manejo del verdeo, se detectó mayor respiración en los suelos no pastoreados. Los estudios con tecnología independiente de cultivo revelaron la presencia de BN con secuencia del gen amoA altamente conservada, a diferencia de las BD que mostraron mayor variación en la secuencia del gen nosZ. Se caracterizaron morfológicamente los aislamientos potencialmente desnitrificadores, los cuales presentaron diferentes modelos de crecimiento. De los cincuenta y siete aislamientos obtenidos, en más de la mitad se confirmó la presencia tanto del gen nirK como nosZ (que codifican para las enzimas nitrito reductasa de cobre y óxido nitroso reductasa, respectivamente), mientras que en el resto solo se detectó el primero de ellos, lo que indica la presencia de bacterias desnitrificadoras parciales (presencia de nirK) y completas (presencia de nirK y nosZ). Además, las cepas desnitrificadoras completas mostraron variaciones fisiológicas, tanto en formas de crecimiento como en el consumo de sustratos carbonados; y se secuenciaron e identificaron tres aislamientos (Cellulosimicrobium sp. NEAU-Z02, Bacillus pumilus strain UFV-E34 y Stenotrophomonas sp. CK6), que ya han sido encontrados en suelos, y han sido estudiados por su capacidad reductora de nitrato y desnitrificante. Finalmente, el estudio en microcosmos, mostró que las variables evaluadas son sensibles a los niveles de humedad en el suelo y que la degradación de rastrojo en este tipo de suelos es lenta. En conclusión, en estos ambientes frágiles las condiciones ambientales generadas por la marcada estacionalidad influyen en la dinámica microbiana, e incluso pueden superar los efectos de manejo del suelo. En los suelos semiáridos bonaerenses evaluados es factible la incorporación de la siembra directa, mientras que la incorporación de animales para pastoreo puede generar condiciones favorables para el desarrollo de BRN y BD, lo que puede provocar pérdidas de nitrógeno. / Soil management can impact on microbial communities's composition and activity, therefore there is concern about the responsible use and maintenance of the microbial diversity of agricultural soils for a sustainable management of the agroecosystem. This Thesis was done on a trial of tillage systems in mixed systems of the South-West of Buenos Aires started in 1999. Given the absence of microbiological antecedents, being that microorganisms play a fundamental role in agroecosystems, it was decided to evaluate how agricultural management systems affect the abundance of microbial functional groups (Nitrifying Bacteria [BN], Nitrate Reducing Bacteria [BRN] and Denitrifying Bacteria [BD]) and microbial activity through carbon dioxide´s release. At the same time, the presence of the amoA gene that codes for the active site of the enzyme Ammonium Monoxygenase, and of the genes that code for the enzymes of the different denitrification stages was evaluated, and potentially denitrifying bacteria were isolated and characterized. In addition, it was designed a trial of degradation of stubble in microcosms, to evaluate the effect of different levels of moisture and fertilization in the soil on microbial activity, analyzing the enzymatic activity and active biomass. The first two years of sampling (2009 and 2010) were characterized by low rainfall. They showed low abundance of the microbiota and in general, on each individual sampling date, no effects of the management systems were detected, but the variation was given between sampling dates. Abundance of BN could not be estimated, which is attributed to the difficulty in cultivating these bacteria, and their high dependence on adequate soil moisture. The third year (2011), there was greater rainfall, however, in few occasions significant differences were found between the treatments of the same sampling date, and as it happened in the first years, the variation occurred between dates. The basal respiration of the soil in general was greater in the first 5 cm of the soil and under zero-tillage; and in the case of greening management, greater respiration was detected in ungrazed soils. The studies with independent culture technology revealed the presence of BN with sequence of the highly conserved amoA gene, unlike the BD that showed greater variation in the sequence of the nosZ gene. Potentially denitrifying isolates, which presented different growth models, were morphologically characterized. Of the fifty-seven isolates obtained, more than half confirmed the presence of both nirK and nosZ genes (which encode the copper nitrite reductase and nitrous oxide reductase enzymes, respectively), while in the rest it was only detected the first one, which indicates the presence of partial denitrifying bacteria (presence of nirK) and complete bacteria (presence of nirK and nosZ). In addition, the complete denitrifying strains showed physiological variations, both in growth forms and in the consumption of carbon substrates; and three isolates, which have already been found in soils and have been studied for their nitrate-reducing and denitrifying capacity, were identified (Cellulosimicrobium sp. NEAU-Z02, Bacillus pumilus strain UFV-E34 and Stenotrophomonas sp.CK6). Finally, the study in microcosms showed that the evaluated variables are sensitive to soil moisture levels and that the stubble degradation in this type of soil is slow. In conclusion, in these fragile environments the environmental conditions generated by the marked seasonality influence the microbial dynamics, and can even overcome the effects of soil management. In the evaluated semi-arid soils of Buenos Aires, the incorporation of zero-tillage is feasible, while the incorporation of animals for grazing can generate favorable conditions for the development of BRN and BD, which can cause nitrogen losses.

Las planicies de marea son ambientes altamente productivos y pueden proveer más del 50% de la productividad primaria y secundaria en los estuarios. Son sitios importantes donde se produce la acumulación, el procesamiento y re-mineralización de la materia orgánica tanto de origen autóctono como alóctono. El microfitobentos (MPB) es el mayor componente de la comunidad microbiana de los sedimentos intermareales en términos de biomasa y producción, constituyendo una fuente primaria para la fijación de carbono en la cadena trófica, y una fuente sustancial para los invertebrados bentónicos. Estos organismos pueden colonizar diferentes tipos de hábitats e interactuar unos con otros, formando comunidades más o menos complejas como biofilms y matas microbianas. Estos consorcios microbianos se desarrollan en una amplia variedad de ambientes marino-costeros incluyendo los sistemas estuariales. Se caracterizan por su capacidad para proteger y bioestabilizar los sedimentos de la erosión y desecación causadas por el viento, las olas y la marea, mediante la segregación de sustancias poliméricas extracelulares (EPS). El Estuario de Bahía Blanca (EBB) es un ambiente costero eutrófico, localizado en la zona sur la provincia de Buenos Aires (Argentina) y caracterizado por extensas planicies de mareas que tienen una gran importancia en los ciclos biogeoquímicos y principalmente en el ciclo del carbono (C), ya que el MPB que las conforma fija el C inorgánico a través del proceso de fotosíntesis y al mismo tiempo puede exudar enormes cantidades de EPS involucradas en diferentes procesos como la motilidad de los microorganismos. En esta tesis se abordó el estudio de la dinámica de clorofila a (Cla), materia orgánica (MO) y de los nutrientes, conjuntamente con los parámetros fisicoquímicos que pueden influenciar dichas variables. Como zona de estudio se seleccionaron las planicies de marea de Puerto Rosales (zona media) dentro del EBB donde se desarrollan matas microbianas. Se estudió la distribución espacial y temporal de la concentración de Cla y feopigmentos y fueron empleadas como un estimador de la biomasa del MPB y el estado fisiológico de los microorganismos. Los sedimentos de la zona media del EBB presentaron valores máximos de Cla principalmente durante la época invernal, al igual que en la columna de agua, donde el fitoplancton presenta un florecimiento. Con el fin de analizar la variabilidad espacio-temporal de las EPS en la planicie de marea bajo estudio, se determinó la concentración del componente mayoritario de las EPS, que son los carbohidratos. Los carbohidratos coloidales (solubles en agua, FC) y los capsulares (solubles en EDTA, FCAP) representaron respectivamente el 43% y 57% en la capa superficial del sedimento, indicando una mezcla de carbono lábil y refractario, mientras que en la capa subsuperficial la FCAP fue la predominante (75%). La máxima concentración FC y FCAP fueron registradas cuando la concentración de Cla fue alta, indicando la estrecha relación que existe entre el MPB y la segregación de exopolisacáridos. Además, el alto contenido de humedad y el menor tamaño de grano favorecieron la producción de carbohidratos extracelulares. Los nutrientes inorgánicos disueltos analizados fueron considerablemente mayores en agua intersticial que en agua superficial, sugiriendo que la planicie de marea podría estar aportando nutrientes desde los sedimentos hacia la columna de agua por difusión vía agua intersticial. Los nitratos (NO3-) y el amonio (NH4+) fueron el componente principal de los nutrientes nitrogenados. La evaluación de los g13C, g15N y relación C:N (~ 6,9) indicaron un origen principalmente autóctono de la MO de las planicies de marea de Puerto Rosales asociado a una alta producción primaria y excreción de las EPS. La alta disponibilidad de nutrientes y materia orgánica que existe en el área estudiada conforma el ambiente propicio para el desarrollo de matas microbianas, las cuales pueden incorporar nutrientes de nitrógeno, fósforo y silicio para llevar a cabo la producción primaria. / Tidal flats are highly productive environments and can provide more than 50% both primary and secondary productivity within estuaries. They are important sites where the accumulation, the processing and re-mineralization of the organic matter, both autochthonous and allochthonous, takes place. Microphytobenthos (MPB) is the major component of the microbial community of intertidal sediments in terms of biomass and production, constituting a primary source for the fixation of carbon in the trophic chain; and a substantial source for benthic invertebrates. These organisms can colonize different types of habitats and interact among each other, forming rather complex communities such as biofilms and microbial mats. These microbial consortia are developed in a wide variety of marine-coastal environments including estuary systems. They are characterized by their ability to biostabilize and protect sediments from erosion and desiccation caused by wind, waves and tide, through the segregation of extracellular polymeric substances (EPS). The Bahía Blanca Estuary (EBB) is an eutrophic coastal environment, located in the south of the province of Buenos Aires (Argentina) and characterized by extensive tidal plains that are of great importance in biogeochemical cycles and mainly in the carbon cycle (C), since their constituent MPB fixes the inorganic C through photosynthesis and at the same time exudes enormous quantities of EPS involved in different processes like the motility of microorganisms. This thesis addresses the study of the dynamics of chlorophyll a (Cla), organic matter (OM) and nutrients, together with the physicochemical parameters that can influence them. As a study area, the tidal flats of Puerto Rosales (middle zone) were selected within the EBB where microbial mats are developed. The spatial and temporal distribution of Cla and phaeopigments concentrations were studied and used as estimators of the microfitobentos biomass and the physiological state of the microorganisms. The sediments of the middle zone of the EBB presented maximum values of Cla mainly during the winter season, as well as in the water column, where the phytoplankton presents a bloom. IX In order to analyze the spatial-temporal variability of EPS in the studied tidal flats, the concentration of the major ESP component, the carbohydrates, was determined. Colloidal (water soluble, FC) and capsular carbohydrates (EDTA soluble, FCAP) represented 43% and 57% respectively in the surface layer of the sediment, indicating a mixture of labile and refractory carbon, while in the subsurface layer the FCAP was the predominant one (75%). The maximum concentration of FC and FCAP were recorded when the Cla concentration was high, indicating a close relationship between MPB and segregation of exopolysaccharides. In addition, the high moisture content and the smaller grain size favored the production of extracellular carbohydrates. The dissolved inorganic nutrients analyzed were considerably higher in interstitial water than in surface water, suggesting that the tidal flat could be providing nutrients from the sediments to the water column by diffusion via interstitial water. Nitrates (NO3 -) and ammonium (NH4 +) were the main component of nitrogenous nutrients. The evaluation of g13C, g15N and C:N ratio (~6,9) indicated a predominantly autochthonous origin of OM of the tidal flats from Puerto Rosales associated with high primary production and excretion of EPS. The high availability of nutrients and organic matter in the studied area creates the appropriate environment for the development of microbial mats, which can incorporate nutrients of nitrogen, phosphorus and silicon to carry out the primary production.

A B-lapachona é uma orto-naftoquinona consagrada por suas atividades farmacológicas, principalmente pela antitumoral, porém não há descrição de estudos de biotransformação microbiana da ?-lapachona. Tais estudos podem propiciar a obtenção de novos derivados dessa naftoquinona, além de fornecerem informações importantes sobre seu metabolismo. Muitos trabalhos descrevem que micro-organismos podem catalisar reações mimetizando enzimas humanas. Para o desenvolvimento dessa pesquisa, a ?-lapachona foi obtida por semissíntese a partir do lapachol. Nos processos de biotransformação foram utilizados os fungos filamentosos Mucor rouxii, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata, Penicillium crustosum e Papulaspora immersa e as bactérias gastrointestinais Escherichia coli, cultivada em aerobiose e anaerobiose, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. e cultura mista composta por Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. e Streptococcus salivarius subesp. thermophilus. Com o intuito de estabelecer uma comparação entre o metabolismo microbiano da ?-lapachona com o do seu isômero ?-lapachona, estudos de biotransformação utilizando o fungo M. rouxii foram também conduzidos com a ?-lapachona. Sete derivados de biotransformação da ?-lapachona com o fungo M. rouxii foram identificados, sendo um inédito, cinco já descritos na literatura em um trabalho de metabolismo dessa naftoquinona utilizando sangue de mamíferos e humanos e uma espirobenzolactona relatada em um trabalho de síntese. Outros dois derivados inéditos da ?-lapachona, os quais são regioisômeros conjugados com glicose, foram produzidos após formação de hidroquinona no processo coduzido com o fungo C. elegans. O fungo P. immersa forneceu duas lactonas isoméricas também obtidas com a biotransformação com o fungo M. rouxii. Houve resultados positivos, com detecção de possíveis produtos de biotransformação da ?-lapachona por CLAE-DAD, com as bactérias E. coli em aerobiose e Bifidobacterium sp. No entanto, esses processos apresentaram um baixo rendimento, sendo possível a identificação de apenas um derivado com a E. coli, que também foi obtido com a biotransformação com o fungo M. rouxii. Um derivado glicosilado da ?-lapachona foi produzido após 24 horas de incubação no processo desenvolvido com o fungo M. rouxii, sendo posteriormente convertido em hidroxilapachol, que por sua vez originou a ?-lapachona novamente e também a ?-lapachona, a qual foi metabolizada também. O derivado glicosilado majoritário, obtido da biotransformação com a ?-lapachona com o fungo C. elegans, foi submetido à avaliação da atividade citotóxica frente à linhagem de câncer de mama humano SKBR-3 apresentando IC50 igual a 312,5 ?M, sendo o IC50 da ?-lapachona frente à mesma linhagem igual a 5,6 ?M. O derivado majoritário não apresentou citotoxidade frente à linhagem de fibroblastos normais humanos GM07492-A, enquanto a ?-lapachona foi altamente citotóxica (IC50 igual a 7,25 ?M). Esse mesmo derivado inédito foi também produzido em pequena quantidade no processo desenvolvido com o fungo C. echinulata. Na metabolização microbiana da ?-lapachona ocorreram tanto reações de fase I como de fase II, havendo mimetização do metabolismo de mamíferos, inclusive de humanos, como relatado em trabalhos da literatura. / B-lapachone is considered an important ortho-naphthoquinone by their pharmacological activities, mainly antitumor, but there is no description of microbial biotransformation studies of ?-lapachone. These researches may furnish new derivatives and significant information on its metabolism. Many studies describe that microorganisms can catalyze reactions mimicking human enzymes. ?-lapachone was obtained by semisynthetic procedure from lapachol. Biotransformation processes were carried out using the filamentous fungi Mucor rouxii, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata, Penicillium crustosum and Papulaspora immersa and the gastrointestinal bacteria Escherichia coli grown aerobically and anaerobically, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and mixed culture with Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. In order to establish a comparison between ?-lapachone microbial transformation and those of its isomer ?-lapachone, biotransformation studies of ?-lapachone were also carried out using M. rouxii. Seven derivatives of ?-lapachone were produced in the process performed by M. rouxii, including one unpublished, five already described in a study of metabolism by mammalian and human blood and one spirobenzolactone reported in a syntetic study. Other two unpublished derivatives of ?-lapachone, which are regioisomers conjugated with glucose, were produced after formation of hydroquinone in the process carried out by C. elegans. P. immersa provided two isomeric lactones also obtained by biotransformation with M. rouxii. Possible biotransformation products were detected by using HPLC-DAD in the processes carried out by the bacteria E. coli under aerobic condition and Bifidobacterium sp. However, these processes exhibited a low yield, and it was possible to identify only one derivative produced by E. coli, which was also obtained in the process performed by M. rouxii. A glycosylated derivative of ?-lapachone was produced by biotransformation with M. rouxii after 24 hours of incubation and subsequently was converted in hydroxylapachol, which in turn gave rise to ?-lapachone again and also to ?-lapachone, which was also metabolized. The major derivative produced in the process carried out by C. elegans was submitted to cytotoxic activity evaluation using human breast cancer cell line SKBR3 showing IC50 312.5 ?M, being the ?-lapachone IC50 5.6 ?M against the same cell line. The major derivative did not show cytotoxicity to normal human fibroblast GM07492-A cell line, while ?-lapachone was highly cytotoxic (IC50 7.25 ?M). The same major derivative was also produced in smaller yield in the process performed by C. echinulata. In the ?-lapachone microbial transformation studies occurred phase I and phase II reactions, mimicking the metabolism of mammals, including humans, as reported in literature.