La microscopie de molécule unique (single-molecule microscopy, SMM) regroupe un ensemble de techniques pour la biologie moléculaire et cellulaire permettant de visualiser le mouvement de molécules biologiques individuelles. Néanmoins, les techniques SMM imposent de fortes contraintes en ce qui concerne les luminophores utilisés. Récemment, un nouveau luminophore appelé «particule à conversion ascendante» (upconverting nanoparticles, UCNP) a attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de son émission efficace de lumière visible après une excitation par de la lumière infrarouge. Cette propriété fait des UCNPs un luminophore très intéressant pour les applications biologiques : l'excitation infrarouge permet d'éliminer l’autofluorescence, généralement associé à une excitation dans la gamme du visible. De plus, la photostabilité extrême des UCNP et l’absence de photoclignotement sont également de précieux atouts pour les expériences SMM. L’objectif de cette thèse était d’adapter les UCNPs aux applications SMM, avec le but ultime d’exploiter leurs propriétés uniques pour améliorer les performances des expériences SMM. Au cours du projet, les protocoles de dispersion des UCNPs dans des tampons aqueux ont été optimisées pour conserver une bonne monodispersité des particules; l'efficacité des UCNPs dans les expériences de transfert résonant d'énergie en particule unique a été estimée; des protocoles pour l'imagerie d'UCNPs uniques ont été développés; et la preuve de concept de l'utilisation des UCNPs dans des expériences de suivi de molécules uniques à la surface de cellules vivantes a été réalisée. Finalement, ces résultats forment une base solide pour de futures expériences SMM utilisant les UCNPs. / Single-molecule microscopy (SMM) is a powerful set of techniques for molecular and cell biology that allows visualizing the movement of individual biological molecules, but has strict requirements towards the utilized luminophores. Recently, a new luminophore called upconverting particles (UCNPs) gained attention of the research community due to their efficient emission of visible light upon excitation with infrared light. This property makes UCNPs a valuable luminophore for biological applications due to the elimination of autofluorescence background, commonly associated with regular visible light excitation. Extreme photostability of UCNPs and absence of sporadic photoswitching are also valuable for SMM experiments. The objective of this thesis was to adapt UCNPs to SMM applications, with the ultimate goal of exploiting their unique properties towards superior performance of SMM experiments. During the project, protocols for dispersing UCNPs in aqueous buffers were streamlined to provide superior particle monodispersity; the efficiency of UCNPs in single-molecule resonance energy transfer experiments was estimated; protocols for single-molecule imaging with UCNPs were developed; and a proof-of-concept system for targeted single-molecule tracking with UCNPs in live cells was demonstrated. Overall, these findings will serve as a foundation towards robust SMM assays based on UCNPs.

Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.

Nous avons développé les méthodes et instruments permettant de manipuler avec retour de force des objets de très petites dimensions (échelles micrométriques et nanométriques). L'utilisation de leviers de microscope à force atomique piézorésistifs permet de travailler dans un volume réduit et avec un minimum d'instruments extérieurs : l'introduction dans un microscope à balayage électronique de notre dispositif permet, en plus du retour de force traduisant la déflection du levier, d'avoir une rétroaction visuelle sur les manipulations opérées sur des billes de silice. Nous avons alors tenté de combiner ce manipulateur avec divers autres capteurs travaillant à des échelles différentes : plasmons de surface pour les échelles micrométriques, ondes acoustiques pour les échelles millimétriques. La réalisation d'instruments de mesure utilisant ces deux techniques nous a permis de mieux appréhender les difficultés à les combiner en un seul et même instrument de mesure simultanée sur un même échantillon. Nous nous sommes efforcés de décrire toutes les méthodes expérimentales mises en oeuvre : un nombre important d'annexes développent l'électronique et les logiciels mis en place lors de ces expériences. Un souci particulier a toujours été maintenu de rendre ces instruments aussi autonomes et transportables que possible.

Cette thèse est consacrée à l'étude des propriétés électroniques de nanostructures par microscopie à force atomique (AFM) en ultra-vide. La première partie de ce travail a consisté à caractériser localement des nanofils de silicium par technique d'AFM conducteur. Les expériences de conduction locale sur nanofils inclinés montrent que la conduction des nanofils intrinsèques est dominée par un transport en surface, associé à la présence de résidus catalytiques métalliques. Cette conduction peut être partiellement supprimée (par désoxydation) ou exaltée (par traitement thermique). Une caractérisation qualitative du dopage de ces nanostructures est présentée, par technique de microscopie à sonde de Kelvin. La deuxième partie de la thèse a consisté à étudier le transfert de charges et les propriétés d'ionisation de nanocristaux de silicium passivés hydrogène, dopés de type n (P) ou p (B), fabriqués par dépôt plasma. L'analyse des images de microscopie à sonde de Kelvin en modulation d'amplitude sous ultra-vide montre que le transfert de charges des nanocristaux de silicium correspond à un mécanisme de compensation d'énergie, exalté par le confinement quantique. Les résultats expérimentaux fournissent une mesure de l'ouverture de la bande interdite des nanocristaux due au confinement quantique, dans la gamme 2-50 nm, en accord quantitatif avec des calculs en liaisons fortes. Ils mettent en avant la possibilité d'utiliser des nanocristaux dopés comme sources d'électrons pour réaliser un dopage sélectif contrôlé de nanostructures ou nanodispositifs, avec des densités dans les gammes de 2×10^11-10^14 cm^-2 ou 8×10^5-2×10^7 cm^-1.

Le graphène, un feuillet élémentaire de graphite, est un matériau très étudié par la communauté scientifique car ses propriétés physiques sont nouvelles et uniques. Il apparaît comme un matériau très prometteur pour des applications technologiques. Nous présentons une étude des propriétés structurelles et électroniques du graphène épitaxial sur 6H-SiC(0001) au moyen d'un microscope STM/AFM combiné basé sur un diapason en quartz avec une pointe conductrice en Pt/Ir ou en fibre de carbone. Les pointes fabriquées par attaque électrochimique présentent un rayon d'apex de quelques nanomètres et ont été caractérisées par SEM, TEM et émission électronique par effet de champ. On s'est d'abord focalisé sur les propriétés d'un échantillon qui présente des terrasses partiellement recouvertes de graphène. Dans ce cas, l'image STM ne donne pas la topographie de la surface. Celle-ci est donnée par l'AFM en mode répulsif. Les différentes propriétés électroniques de chaque terrasse sont confirmées par des mesures spectroscopiques I=f(V). Puis, l'étude à haute résolution par FM-AFM sur une terrasse lisse a révélé la structure ondulée et périodique de la reconstruction 6√3x6√3R30° du SiC(0001) recouverte de graphène. Nous montrons que les maxima des nappes d'iso-densité locale d'états électroniques au niveau de Fermi observés dans l'image STM ne se superposent pas avec les zones associées aux maxima des nappes d'iso-densité d'états totaux (Topographie AFM). Ils apparaissent décalés de ~1 nm le long de la direction [11] de la quasi-maille 6x6 de la reconstruction 6√3x6√3R30°. Comme l'amplitude mesurée des ondulations de la surface augmente avec le gradient de force appliqué, on montre que la surface du graphène est déformée par la pointe AFM. Cette déformation qui modifie le couplage électronique entre le graphène et la couche tampon influence fortement le contraste des images STM/AFM. Les conséquences de cette déformation sur les images STM résolvant le réseau du graphène sont aussi discutées.

Bacillus anthracis, l'agent infectieux responsable de la maladie du charbon, est un agent pathogène majeur du risque biologique provoqué, notamment en raison de la sévérité de la forme respiratoire de la maladie. Celle-ci résulte de l'inhalation de spores dont les mécanismes de pénétration au niveau pulmonaire sont mal connus à l'heure actuelle. Cette thèse présente les apports des microscopies confocale et biphotonique à l'étude de ces mécanismes de pénétration des spores inhalées. Le modèle murin CX3CR1+/gfp, dont la sous-population CD11b+ de cellules dendritiques (DCs) exprime constitutivement la protéine de fluorescence verte (GFP), a été utilisé dans ces travaux. Une première partie présente le développement d'une méthode automatisée de discrimination des DCs parmi d'autres populations cellulaires exprimant le même fluorophore, en se basant sur le calcul d'un coefficient morphologique. Cette méthode a permis d'étudier dans un deuxième temps le comportement spécifique de la sous-population de DCs CD11b, après infection par des spores de B. anthracis. L'étude microscopique a été d'abord effectuée in situ, c'est-à-dire sur des explants pulmonaires maintenus dans des conditions favorables à la préservation de l'activité cellulaire, puis in vivo, sur des souris anesthésiées et ventilées. Le protocole d'imagerie tire profit d'une stratégie d'acquisition et de traitement a posteriori des données permettant de surmonter, sans contrainte mécanique appliquée à l'organe, les problèmes de focalisation liés aux mouvements thoraciques durant la ventilation de l'animal. Cette stratégie originale utilise un sur-échantillonnage de l'acquisition et profite du signal de seconde harmonique généré par le collagène comme référence spatiale ; elle a permis l'observation in vivo d'interactions entre DCs et macrophages au niveau pulmonaire. Ces interactions, de type synapse immunologique, sont favorisées par l'infection et présentent donc un rôle fonctionnel qui reste à définir. La formation de synapses immunologiques entre macrophages et DCs pourrait non seulement représenter un chaînon manquant à l'explication de la pénétration des spores de B. anthracis au niveau pulmonaire, mais pourrait aussi constituer un enjeu crucial dans la compréhension de la réponse immunitaire associée aux infections pulmonaires.

La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations

Les propriétés photoniques des tissus durs dentaires nous ont permis d’étudier l’email et la dentine a un niveau moléculaire (in vitro) en utilisant des techniques de microscopie optique non linéaires. La microscopie confocale Raman est technique d’imagine de haute résolution permettant d’analyse d’échantillon sans préparation spécifique ni marquage. Cette méthode nous a permis de reconstituer une cartographie de la réticulation du collagène et de la cristallinité au niveau de la jonction émail-dentine et cela avec une résolution spatiale non atteinte jusque-là. Cette analyse chimique de la jonction émail-dentine a permis de redéfinir la largeur de cette zone de transition. Cette largeur est nettement supérieure à celles proposées par les études précédentes. Par ailleurs, l’étude portant sur les changements de fluorescence intrinsèque entre les tissues dentaires sains et cariés suggèrent l’implication de la protoporphyrin IX et de la pentosidine dans l’expression de la fluorescence rouge des tissus cariés. La microscopie multiphotonique quant à elle nous a permis de détecter la lésion carieuse et de suivre son développement en utilisant la génération de seconde harmonique (SHG) et la fluorescence par excitation à deux photons (2PEF). Nos études ont démontré la validité du ratio SHG/2PEF comme paramètre fiable pour la détection de la lésion carieuse. Les études proposées par cette thèse montrent le potentiel des propriétés photoniques de l’émail et de la dentine en utilisant les microscopies Raman et multiphotoniques dans l’étude de ces tissus au niveau moléculaire. Cela offre de nouvelles perspectives en recherche et en applications cliniques. / Photonic properties of dental hard tissues allowed us to proceed to in vitro analysis of enamel and dentin on a molecular level. Confocal Raman microscopy has been used to produce a mapping of collagen cross-link and crystallinity of human dentin–enamel junction (DEJ) with a spatial resolution not achieved up to now. The method is a non-invasive, label-free and a high spatial resolution imaging technique. This chemical analysis of DEJ led us to redefine a wider width of this transition zone and advance our understanding of dental histology. A study on the intrinsic fluorescence changes of sound and carious tissues using conventional fluorescence microscopy suggests the involvement of protoporphyrin IX and pentosidine in the fluorescence red-shift observed in carious tissues. Multiphoton microscopy allowed to detect nonlinear optical signal changes during caries process using second harmonic generation (SHG) and two-photon excitation fluorescence (2PEF). Our studies led us to propose the ratio SHG/2PEF as valuable parameter to monitor caries lesion. Collectively, advances described in this thesis show the potential of photonic properties of enamel and dentin using Raman and multiphoton microcopies for molecular investigations on sound as much as on carious tissues. It opens new perspective in dental research and clinical applications.

Le domaine des nanomatériaux joue un rôle de plus en plus important dans de nombreuses applications, qu’elles soient de natures biologique, médicales électroniques etc… Dans ce travail, nous présenterons des résultats concernant deux types de nanoparticules, le premier genre traite de nanoparticules hybrides confectionnées chimiquement pour des fins biologiques, le deuxième concerne des nanocristaux de silicium fabriqués par pyrolise laser pour des applications potentielles en optoélectronique. Les études sont menées en mettant en œuvre deux différentes techniques optiques, l’une en champ lointain, l’autre en champ proche. Dans le cas des nanohybrides, nous nous intéresserons à une caractérisation par microscopie en champ proche, qu’elle soit de nature spectroscopique ou d’imagerie simple, en utilisant en particulier une configuration optique guidante. Nous ferons un premier point à propos de l’émission de ses nanoparticules, puis discuterons des problèmes d’artefacts et de la résolution des images que nous pouvons atteindre avec notre montage. Nous prouverons l’importance essentielle du rôle des nanohybrides en tant que marqueur biologiques, et ceci dans deux différentes types de configuration de capteurs biologiques. Les nanoparticules de silicium de petites tailles (< 3 nm) seront étudiées essentiellement par microscopie confocale. Plus précisément, nous nous intéressons aux différents procédés de luminescence qui ont lieu lors de l’excitation d’une nanoparticule unique, en tenant compte des effets de taille et de surface. Nous chercherons à étudier l’influence de l’environnement des nanoparticules sur leurs propriétés spectrales en les plaçant dans des couches minces de natures diélectriques différentes. Nous conclurons enfin sur une brève description des différents effets Sark qui prennent lieu dans un tel système. / The domain of nanomatrials plays an important role in many biological, medical and electronic applications. In this work, we present results concerning two types of nanoparticles : the first kind treats with hybrid nanoparitcls chemically synthesized for biological means, the second concerns silicon nanocrystals fabricated by laser pyrolisis for optoelectronic applications. The studies are done by using two different optical techniques, one in the far field, the other in the near field. In the nanohybrids case, we are interested by spectroscopic, and imaging near field characterization, by particularly using a waveguide configuration. We will first shed light about the emission properties of such nanoparticles, and then discuss artefact problems, in addition to the resolution of the images we can attain in our setup. We will prove the essential importance of the role of nanohybrids as biological markers with two different types of biosensors. The small sized silicon nanoparticles (< 3 nm) are essentially studied by confocal microscopy. More precisely, we will be interested by the different luminescence processes taking place during the excitation of a unique nanoparticle, by taking into consideration the surface effects. We will search to study the influence of the nanoparticles environment on their spectral properties by placing them in thin films having different dielectric properties. We will conclude with a small description of the stark effects which take place in such a system

La polarimétrie de Mueller est une technique optique qui mesure la réponse polarimétrique complète d’un milieu sous la forme d’une seule matrice de Mueller afin de remonter à ses propriétés optiques comme le dichroïsme, la biréfringence et la dépolarisation. Le couplage avec la microscopie non-linéaire (SHG par exemple) permet d’avoir accès à des informations précises sur un milieu biologique (structure, organisation, . . .). Cela impose de passer à une modalité d’imagerie à balayage laser, qui nécessite de mesurer la réponse polarimétrique du milieu pixel-par-pixel en des temps relativement courts (de l’ordre de la microseconde). Le but de cette thèse est de mettre en oeuvre un polarimètre de Mueller dont les cadences d’acquisition sont compatibles avec l’imagerie à balayage laser. Dans un premier temps, un polarimètre de Mueller inédit est proposé, basé sur le codage spectral de la polarisation dont toute l’information polarimétrique de l’échantillon est mesurée sous la forme d’un seul signal d’intensité en un temps record (10 μs). Ce dispositif est constitué d’une source à balayage rapide en longueur d’onde à 100 kHz (ou swept-source), de lames de phase d’ordre élevé et d’un détecteur monocanal. Les erreurs systématiques qui entachent la mesure sont évaluées et des méthodes de correction permettent de les prendre en compte dans une étape d’étalonnage qui utilise la réponse de deux milieux étalons.Ensuite, le polarimètre est implémenté dans un microscope commercial à balayage laser, utilisé initialement pour réaliser de l’imagerie non-linéaire (SHG). Cela requiert un redimensionnement du montage, ainsi que la synchronisation entre les deux systèmes. Par ailleurs, un protocole de calibration du dispositif est développé et permet de tenir compte de l’ensemble des erreurs systématiques du polarimètre indépendamment des anisotropies optiques engendrées par le microscope. Enfin, les premières images polarimétriques de Mueller en microscopie à balayage laser ont été acquises sur des échantillons inhomogènes spatialement (rubans adhésifs et cristaux de roches). La potentialité de la microscopie multimodale est démontrée sur des échantillons de fibroses de foie, en couplant l’imagerie polarimétrique de Mueller et la microscopie non-linéaire au sein d’un seul instrument. / Mueller polarimetry is an optical technique allowing the acquisition of the full polarimetric signature of a medium with a single Mueller matrix, and leading to its polarimetric parameters such as dichroism, birefringence and depolarization. Coupling Mueller polarimetry with nonlinear microscopy techniques (SHG for example), more precise information about the medium could be obtained (structure, organization . . .). This imaging technique uses a laser scanning system to measure the Mueller matrix of a medium point-to-point quickly (of the order of the microsecond). The aim of this thesis is to develop a Mueller polarimeter compatible with the laser scanning system. First, a new Mueller polarimeter is proposed using spectral encoding of the polarization and measuring the full polarimetric signature of a sample with a single channeled spectrum in a fast way (10 μs). This setup is composed of a 100 kHz swept-source laser, high order retarders and a single channel detector. Systematic errors on the Mueller matrix measurement are evaluated and correction methods take into account these errors in a calibration step that uses polarimetric signature of two references medium. Then, the polarimeter is implemented on a commercial laser scanning microscope that usually images non-linear contrasts (SHG). The update needs to reduce the dimension of the polarimeter and ensure an electronic synchronization between these two systems. However, a new calibration step is proposed and takes into account all the systematic errors of the polarimeter, independently of the optical anisotropy induced by the microscope. Finally, the images with the first Mueller scanning microscope are obtained with spatially inhomogeneous samples (cellophane tapes, rocks). The potentiality of the multimodal scanning microscopy Mueller/SHG on the same instrument is demonstrated in the case of hepatic fibrosis.