L'α-synucléine est reconnue comme une protéine clé dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson ainsi que d'autres troubles neurodégénératifs appelés synucléinopathies. Dans ces maladies, la surexpression de l’α-synucléine entraîne la formation d'agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques (DA). Dans cette thèse, nous avons exploré l’effet de la régulation de microARN (miARN) sur l’expression de l’α-synucléine. Pour se faire, des études ont été menées avec la lignée cellulaire humaine SH-SY5Y qui peut être différenciée pour créer un modèle de neurones DA et ensuite traitée avec une neurotoxine pour induire des caractéristiques cellulaires de la maladie de Parkinson. Des observations importantes ont été supportées dans des modèles cellulaires plus avancés, notamment les neurones induits par reprogrammation directe de fibroblastes humains (iNs) et les neurones DA primaires de souris purifiés. Le premier objectif était de mieux comprendre comment la surexpression aberrante de l'α synucléine dans les synucléinopathies pourrait être due à une dérégulation de la maturation des miARN qui ciblent son ARN messager. Tout d’abord, nous avons sélectionné les miARN les plus susceptibles d'avoir un effet régulateur sur l’expression de l’α-synucléine à partir de recherche de la littérature et d’analyse de bases de données spécialisées. Nous avons observé que l’augmentation de l'expression de l'α-synucléine associée à l’ajout de neurotoxine est accompagnée d’une diminution concomitante de l'expression de plusieurs miARN sélectionnés. Sur la base de ces résultats, l'impact de ces miARN sur l'expression de l'α-synucléine a été évalué dans plusieurs types de cellules humaines, notamment les HEK 293T, les SH-SY5Y différenciées et les iNs. À cette fin, nous avons utilisé des cibles de miARN exogènes pour réprimer l'activité régulatrice des miARN et avons mesuré leur effet sur l'expression de l'α synucléine. Ainsi, nous avons démontré que la répression de miR-7, miR-93, miR-140, miR 153 et miR 214 mène systématiquement à la surexpression de l’α-synucléine dans les différents types de cellules. De plus, nous avons démontré que certains miARN sont régulés de manière post-transcriptionnelle en mesurant les niveaux des formes immatures et matures des miARN dans différents contextes cellulaires. Le deuxième objectif était d’identifier des protéines potentiellement aptes à réguler la maturation post-transcriptionnelle de miARN. Des études de purification par affinité et de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les protéines qui s’associent avec la tige-boucle des formes immatures des miARN et régulent potentiellement leur maturation. Quelques protéines candidates ont été sélectionnées sur la base d’analyse informatique pour examiner l’effet de leur surexpression dans différents essais cellulaires. À ce jour, nous avons identifié quatre protéines (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) qui, en plus de répondre à certains critères de bases (lient l’ARN, sont présentes dans le cerveau et impliquées dans des maladies associées au système nerveux), ont un effet sur l’activité et l’expression de miR-153 ainsi que sur l’expression de l’α-synucléine. Ces travaux ont permis d’établir de solides bases dans notre compréhension de la régulation de l'α-synucléine par les miARN et d’ouvrir la voie à des études plus élaborées qui permettront d’établir les mécanismes de régulation des niveaux de miARN qui ciblent l’α-synucléine. À plus long terme, cet axe de recherche pourrait fournir des pistes pour le développement d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour les synucléinopathies. / Alpha-synuclein is a key protein in the pathophysiology of Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders called synucleinopathies. In these diseases, overexpression of α-synuclein leads to the formation of toxic aggregates in dopaminergic (DA) neurons. In this thesis, we explored the effect of microRNA (miRNA) regulation on α-synuclein expression. To do so, studies were conducted with the human SH-SY5Y cell line, which can be differentiated to create a model of DA neurons and then treated with a neurotoxin to induce cellular features of Parkinson's disease. Important observations were supported in more advanced cell models, including neurons induced by direct reprogramming of human fibroblasts (iNs) and purified primary mouse DA neurons. The first objective was to better understand how aberrant overexpression of α-synuclein in synucleinopathies results in the deregulation of the maturation of miRNAs that target its messenger RNA. First, we selected the miRNAs most likely to have a regulatory effect on α-synuclein expression based on literature searches and specialized database analyses. We observed that the increase in α-synuclein expression associated with neurotoxin addition is accompanied by a concomitant decrease in the expression level of several selected miRNAs. Based on these results, the impact of these miRNAs on αsynuclein expression was evaluated in several human cell types, including HEK 293T, differentiated SHSY5Y, and iNs. To this end, we used exogenous miRNA targets to repress miRNA regulatory activity and measured their effect on α-synuclein expression. Thus, we demonstrated that repression of miR-7, miR-93, miR-140, miR-153, and miR-214 consistently leads to overexpression of α-synuclein in different cell types. In addition, we demonstrated that some miRNAs are regulated in a posttranscriptional manner by measuring the levels of immature and mature forms of miRNAs in different cellular contexts. The second objective was to identify proteins potentially able to regulate the post-transcriptional maturation of miRNAs. Affinity purification and mass spectrometry studies were used to identify proteins that associate with the stem-loop of immature forms of miRNAs and potentially regulate their maturation. A few candidate proteins were selected based on computational analysis to examine the effect of their overexpression in different cell-based assays. To date, we have identified four proteins (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) that, in addition, to fitting basic criteria (known to bind RNA, are present in the brain and associated with nervous system-related diseases) affect miR-153 activity and expression as well as α-synuclein expression. This work has established a solid foundation in our understanding of the regulation of α-synuclein by miRNAs and has paved the way for more elaborate studies that will establish the mechanisms of regulation of miRNA levels that target α-synuclein. In the longer term, this line of research could provide avenues for the development of diagnostic and therapeutic tools for synucleinopathies.

[ES] En un contexto de calentamiento global, el estrés abiótico se ha convertido en una de las mayores amenazas para la productividad agrícola. El estrés por frío es uno de estos factores limitantes. Por lo tanto, estudiar a nivel molecular la respuesta de la planta a este tipo de estrés e identificar los genes o los microRNAs cuya función es determinante en la resistencia a este tipo de estrés puede aportar información fundamental para desarrollar plantas tolerantes a frío y así poder aumentar la producción de alimentos en condiciones ambientales adversas. En esta tesis pretendemos dar un enfoque transversal para poder identificar genes implicados en la respuesta a estrés. Por un lado utilizamos un enfoque de biología molecular clásica, y por otro una visión basada en la biología de sistemas y en la secuenciación a gran escala. Mediante esta estrategia hemos sido capaces de identificar y caracterizar el gen BvCOLD1 de Beta vulgaris que codifica una aquaporina localizada en el retículo endoplásmico y que al ser sobrexpresado en plantas de Arabidopsis thaliana confiere tolerancia a frío y a condiciones limitantes de Boro (B). Por lo que demostramos que es un gen fundamental para el transporte de este oligoelemento esencial. En paralelo desarrollamos un abordaje de biología de sistemas a partir de plantas de melón (Cucumis melo) sometidas a estrés por frío. Lo que nos permitió identificar 20 familias de miRNA implicadas en la respuesta en condiciones de frío. En el tercer capítulo profundizamos en la regulación de uno de estos miRNA (miR319) y descubrimos que el frío induce el procesamiento de una forma alternativa de esta molécula. / [CA] En un context d'escalfament global, l'estrès abiòtic s'ha convertit en una de les majors amenaces per a la productivitat agrícola global. L'estrès per fred és un d'aquests factors limitants. Per tant, Estudiar a nivell molecular la resposta de la planta a fred i identificar els gens o els microRNA la funció dels quals és determinant en aquestes condicions pot aportar informació fonamental per desenvolupar plantes tolerants a aquest estrès i així poder augmentar la producció d'aliments en condicions adverses. En aquesta tesi hem utilitzat un enfocament transversal per poder identificar gens implicats en la resposta a estrès. D'una banda hem fet servir mètodes de biologia molecular clàssica, que ens ha permès identificar i caracteritzar el gen BvCOLD1 de Beta vulgaris que codifica una aquaporina localitzada en el reticle endoplasmàtic i que en ser sobrexpresada en plantes d'Arabidopsis thaliana conferia tolerància a fred i a condicions limitants de bor. Pel que hem demostrat que és un gen fonamental per al transport d'aquest oligoelement essencial. En paral·lel hem desenvolupat un abordatge de biologia de sistemes a partir de plantes de meló (Cucumis melo) sotmeses a estrès per fred. El que ens va permetre identificar 20 famílies de miRNA implicades en la resposta en condicions de fred. Hem aprofundit en la regulació d'un d'aquests miRNA (el mi319) i hem descobert que el fred indueix la formació d'una forma alternativa d'aquesta molècula. / [EN] In a context of global warming, abiotic stress has become one of the greatest threats to global agricultural productivity. Cold stress is one of these limiting factors. Therefore, Studying the plant response at the molecular level and identifying the genes or microRNAs whose function is determinant in these conditions can provide fundamental information to develop plants tolerant to this stress and thus be able to increase the production of food under adverse conditions. In this Ph.D. Thesis we have used a transversal approach to identify genes involved in stress response. We have used two different approaches. First we used classical molecular biology methods, which has allowed us to identify and characterize the BvCOLD1 gene of Beta vulgaris that encodes an aquaporin located in the endoplasmic reticulum and which upon overexpression in Arabidopsis thaliana conferred tolerance to cold and limiting conditions of Boron. So we showed that it is a fundamental gene for the transport of this essential trace element. In parallel, we undertook a systems biology approach based on melon plants (Cucumis melo) subjected to cold stress. This allowed us to identify 20 families of miRNA involved in the response to cold conditions. We have further studied the regulation of one of these miRNAs (miR319) and discovered that cold induces the alternative processing of its precursor. / Bustamante González, AJ. (2019). Caracterización de mecanismos implicados en la regulación de la respuesta a estrés por frío en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/118800

京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13609号 / 論医博第2319号 / 新制||医||1073(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 村川 泰裕, 教授 竹内 理, 教授 永井 純正 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese niedermolekularer Verbindungen, die an die prä-miRNA binden und dadurch die Reifung zur miRNA inhibieren. Daher sollten die RNA-Binder 2-Desoxystreptamin sowie Neamin mit Alkinen funktionalisiert und durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin 1,3-dipolare Cycloaddition (CuAAC) mit verschiedenen bivalenten Aziden verknüpft werden. Im Rahmen dieses Projekts wurde der synthetische Zugang zu den benötigten Alkin- sowie Azid-funktionalisierten Grundbausteinen optimiert. Ferner wurde ein effektives und zuverlässiges Protokoll für die CuAAC erarbeitet, welches es ermöglichte, 88 Testsubstanzen in guter Ausbeute und hoher Reinheit zu isolieren. Anschließend wurde die Substanzbibliothek in einem BRCA-Reifungsassay unter kompetitiven Bedingungen auf die Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Dabei wurden mehrere potente Inhibitoren der miRNA-Reifung mit IC50-Werten von bis zu 0.5 µM identifiziert. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Etablierung einer chemo-enzymatische RNA-Funktionalisierungsstrategie um prä-miRNA-Sonden herzustellen: In-vitro-Transkriptionen mit der T7-RNA-Polymerase sowie Ligationen mit der T4 RNA Ligase 1 waren das Fundament der enzymatischen RNA-Synthese, während die Funktionalisierung der RNA durch CuAAC erzielt wurde. Dafür wurden die neuen Verbindungen O-(5‘-Guanosin)-O-propargylmonophosphat sowie 3‘,5‘-O,O-Bisphosphat-5-ethinyluridin synthetisiert, durch in-vitro-Tran¬skription an das 5‘-Ende von prä-miRNAs eingeführt und anschließend durch CuAAC mit einem Fluoreszenzlöscher modifiziert. Das Uridinbisphosphat wurde durch CuAAC mit einem Fluorophor markiert und anschließend effizient mit der T4 RNA Ligase 1 an das 3‘-Ende verschiedener prä-miRNAs ligiert. Darüber hinaus war es auch möglich, das Alkin-modifizierte Uridinbisphosphat an das 3‘-Ende von prä-miRNAs zu ligieren, dieses durch eine zweite Ligation an eine definierte interne Position zu verschieben und abschließend durch CuAAC zu funktionalisieren. / The objective of this work was the synthesis of small molecules, which bind to pre-miRNAs to prevent their maturation to fully active miRNAs. To create a substance library of bivalent inhibitors, the RNA binding motifs 2-deoxystreptamine as well as neamine were alkyne modified and linked with several bisazides via a copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC). Hence, optimized syntheses of the basic building blocks along with an effective and reliable CuAAC-protocol were established. 88 test substances were isolated in good yield and high purity. Finally they were analyzed with regard to their potential to selectively inhibit the miRNA maturation. For this purpose, the assay was performed under competitive conditions with a set of two pre-miRNA-pairs. The initial screening revealed several inhibitors with IC50-values in the lower µM range. The second focus of this work was on the development of a synthetic access to alkyne modified ribonucleotides to establish a chemo-enzymatic functionalization strategy for RNAs using in-vitro-transcription, ligation and CuAAC. In this context, the syntheses of 3‘,5‘-O,O-bisphosphate-5-ethinyl uridine and O-(5‘-guanosine)-O-propargyl monophos-phate are described for the first time. The guanosine monophosphate was used as transcription starter to address the 5’-end of RNA and was consecutively labeled with an azido-tagged quencher. The uridine bisphosphate was conjugated with a fluorophor and introduced to the 3’-end of RNAs by T4 RNA ligase 1. Moreover, the uridine bisphosphate can be ligated to the 3’-end without a fluorophor attached, to serve as a connecting point for a further ligation with an oligonucleotide of any length. Thereby, the former terminal alkynylated uridine was shifted to a defined internal position by successive enzymatic reactions and was successfully derivatized with a fluorophor by CuAAC.

Vorhersagen von miRNA-Bindestellen enthalten oft einen hohen Prozentsatz an falsch positiven Ergebnissen (24-70%). Gleichzeitig ist es schwierig die biologischen Interaktionen von miRNAs und ihren Zieltranskripten auf experimentellem Wege und Genom weit zu messen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Frage beantwortet, ob ChIP-Sequenzierungsdaten, von denen es immer mehr gibt, verwendet werden können, um Vorhersagen von miRNA-Bindestellen zu filtern. Dabei wurde von einem Netzwerk aus miRNAs und Transkriptionsfaktoren gebraucht gemacht, die Zieltranskripte gemeinsam regulieren. Zunächst wurden verschiedene Methoden getestet, mit denen „Peaks“ aus der ChIP-Sequenzierung Zielgenen zugeordnet werden können. Zielgenlisten des transkriptionalen Repressors RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) wurden mithilfe von ChIP-Sequenzierungsdaten erzeugt. Ein Algorithmus zur Suche nach überrepräsentierten miRNA-Zielgenen in REST-Genlisten basierend auf Vorhersagen von TargetScanHuman wurde entwickelt und angewandt. Die detektierten „enrichment“-miRNAs waren Teil eines vielfältig regulierten REST-miRNA-Netzwerks. Mögliche Funktionen von miRNAs wurden vorgeschlagen und ihre Rolle im gemeinsamen Netzwerk mit REST und im damit gebildeten Netzwerkmotiv (Inkoherente Schleife zur Vorwärtskopplung Typ 2) wurde analysiert. Es stellte sich heraus, dass ein Filtern der Vorhersagen tatsächlich möglich ist, da Gene, die sowohl von REST als auch von einer oder mehreren „enrichment“-miRNAs reguliert werden, einen höheren Anteil an wahren miRNA-Transkript-Interaktionen haben. / Predictions of miRNA binding sites suffer from high false positive rates (24-70%) and measuring biological interactions of miRNAs and target transcripts on a genome wide scale remains challenging. In the thesis at hand the question was answered if the ever growing body of ChIP-sequencing data can be applied to filter miRNA target predictions by making use of the underlying regulatory network of miRNAs and transcription factors. First different methods for association of ChIP-sequencing peaks to target genes were tested. Target gene lists of the transcriptional repressor RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) were generated by means of ChIP-sequencing data. An enrichment analysis tool based on predictions from TargetScanHuman was developed and applied to find ‘enrichment’-miRNAs with over-represented targets in the REST gene lists. The detected miRNAs were shown to be part of a highly regulated REST-miRNA network. Possible functions could be assigned to them and their role in the regulatory network and special network motifs (incoherent feedforward loop of type 2) was analyzed. It turned out that miRNA target predictions of genes shared by enrichment-miRNAs and REST had a higher proportion of true positive associations than the TargetScanHuman background, thus the procedure made a filtering possible.

Les études d'associations en génome entier ("GWAS") ont récemment permis la découverte de nombreux polymorphismes génétiques impliqués dans la susceptibilité aux maladies multifactorielles. Cependant, ces polymorphismes n'expliquent qu'une faible part de l'héritabilité génétique de ces maladies, nous poussant ainsi à explorer de nouvelles pistes de recherche. Une des hypothèses envisagées serait qu'une partie de cette héritabilité manquante fasse intervenir des phénomènes d'interactions entre polymorphismes génétiques. L'objectif de cette thèse est d'explorer cette hypothèse en adoptant une stratégie de recherche d'interactions basée sur des critères statistiques et biologiques à partir de données issues de différentes études "GWAS". Ainsi, en utilisant différentes méthodes statistiques, nous avons commencé par rechercher des interactions entre polymorphismes qui pourraient influencer le risque de thrombose veineuse. Cette recherche n'a malheureusement pas abouti à l'identification de résultats robustes vis à vis du problème des tests multiples. Dans un deuxième temps, à partir d'hypothèses "plus biologiques", nous avons tenté de mettre en évidence des interactions entre polymorphismes impliqués dans les mécanismes de régulation de l'expression génique associés aux microARNs. Nous avons pu ainsi montrer de manière robuste dans deux populations indépendantes qu'un polymorphisme au sein de la séquence du microARN hsa-mir-219-1 interagissait avec un polymorphisme du gène HLA-DPB1 pour en moduler l'expression monocytaire. Nous avons également montré que l'expression monocytaire du gène H1F0 était influencée par un phénomène d'interaction impliquant un polymorphisme du microARN hsa-mir-659. En apportant sa propre contribution à l'engouement récent que suscite la recherche d'interactions entre polymorphismes dans les maladies dites complexes, ce travail de thèse illustre clairement la difficulté d'une telle tâche et l'importance de réfléchir à de nouvelles stratégies de recherches. / Recently, Genome-Wide Association Studies (GWAS) have led to the discovery of numerous genetic polymorphisms involved in complex human diseases. However, these polymorphisms contribute only a little to the overall genetic variability of these diseases, suggesting the need for new kind of investigations in order to disentangle the so-called "missing heritability". The purpose of my PhD project was to investigate how different research strategies relying on statistical and biological considerations could help in determining whether part of this missing heritability could reside in interaction phenomena between genetic polymorphisms. Firstly, we applied different statistical methodologies and looked for interactions between polymorphisms that could influence the risk of venous thrombosis (VT). Even though this study was based on two large GWAS datasets, we were not able to identify pairwise interactions that survive multiple testing. This work suggests that strong interactive phenomena between common SNPs are unlikely to contribute much to the risk of VT. Second, by adopting a hypothesis-driven approach relying on biological arguments, we sought for interactions between microRNA related polymorphisms that could alter genetic expression. Using two large GWAS datasets in which genome-wide monocyte expression was also available, we were able to demonstrate the existence of two pairwise interaction phenomena on monocyte expression involving miRNAs polymorphisms: 1/ the expression of HLA-DPB1 was modulated by a polymorphism in its 3'UTR region with a polymorphism in the hsa-mir-219-1 microRNA sequence; 2/ similarly, the expression of H1F0 was influenced by a polymorphism in its 3'UTR region interacting with a polymorphism in the microRNA hsa-mir-659. Altogether, this project supports for the role of gene x gene interactions in the interindividual variability of biological processes but their identifications remain a tedious task requiring large samples and the development of new research strategies and methodologies.

No description available.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) hat aufgrund seines aggressiven Wachstums, seiner frühen Metastasierung und seiner fehlenden Frühsymptome eine sehr schlechte Prognose und ist daher die vierthäufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen in Deutschland. Ein weiteres Charakteristikum von PDAC ist die starke desmoplas-tische Reaktion. Eine Funktion für stromale pankreatische Sternzellen (PSCs) bei der Förderung des Wachstums, der Proliferation und der Metastasierung des Tumors konnte bereits nachgewiesen werden. Für die Beantwortung der Frage, welche molekularen Ursachen einen funktionellen Zusammenhang zwischen Tumoraggressivität und Stroma-zellen herstellen könnten, wurden bereits im Vorfeld dieser Arbeit differentielle Genex-pressionsanalysen durchgeführt. Dabei fiel u.a. auf, dass das sezernierte Glykoprotein secreted Frizzled-related protein 1 (SFRP1), im Vergleich zum entsprechenden nicht-tumorigenen Pankreasgewebe, im Stroma von PDAC-Patienten transkriptionell herunterreguliert war. SFRP1 ist bereits bekannt als Tumorsuppressorgen. In den meisten Fällen wird seine Wirkung auf die Hemmung des β-Catenin-abhängigen (kanonischen) Wnt-Signalweges zurückgeführt. Es wurde bereits sehr häufig beobachtet, dass SFRP1 durch eine Hypermethylierung seiner Promotorregion in einer Vielzahl von humanen Tumoren, darunter auch PDAC sowie PDAC-Vorstufen, herunterreguliert ist. Mit dem Abschalten der SFRP1-Expression wurden erhöhte Proliferation sowie verringerte Apoptose bei den betroffenen Zellen, Merkmale des aktivierten kanonischen Wnt-Signalweges, festgestellt. SFRP1 ist jedoch auch in der Lage nichtkanonische Wnt-Signalwege zu modulieren. Das Ziel dieser von der Deutschen Gesellschaft für Forschung geförderten Arbeit war es, die stromale SFRP1-Expression auf Proteinebene in Proben von PDAC-Patienten mit der von Patienten mit chronischer Pankreatitis zu vergleichen bzw. mit deren Überleben zu korrelieren. Ein möglicher Unterschied sollte mithilfe eines Zellkultur-modells auf einen funktionellen Effekt hin untersucht werden. Dafür sollten stabil und regulierbar SFRP1-überexprimierende Zelllinien aus PDAC- bzw. PSC-Zellen für die Einbindung in Migrationsassays etabliert werden. Für die Ergründung der Mechanismen, die zur Herunterregulierung der stromalen SFRP1-Expression führen könnten, sollte der Methylierungstatus der SFRP1-Promotorregion in PSC- sowie vergleichsweise in PDAC-Zellen mittels methylierungsspezifischer PCR und Bisulfitsequenzierung analysiert werden. Desweiteren sollten diese Zellen mit Hilfe eines Reportergenassays auf eine Mikro-RNA-bedingte Modulation der SFRP1-Expression hin untersucht werden. Die immunhistochemische SFRP1-Färbung von PDAC-Patientenproben auf Tissue-Microarrays (TMAs) ergab eine signifikante Reduktion der stromalen SFRP1-Färbung im Vergleich zur entsprechenden Expression im Stroma von Patienten mit chronischer Pankreatitis (CP). Die Ergebnisse der differentiellen Genexpressionsanalyse konnten also auf Proteinexpressionsebene bestätigt werden. Bei der Korrelation der stromalen SFRP1-Färbung mit dem Überleben der entsprechenden Patienten mit R1-Resektionsstatus zeigte sich ein leichter Überlebensvorteil für die Patienten mit positiver SFRP1-Färbung. Bei der Analyse der SFRP1-Expression auf RNA- und Proteinebene in Zellkulturmodellen von PDAC zeigte sich, dass zwei von vier PDAC-Zelllinien sowie die PSCs und normale Pankreasgangzellen SFRP1-RNA exprimierten. Auch bei anderen untersuchten Tumor- oder murinen PDAC-Zelllinien war das Verhältnis zwischen Linien mit SFRP1-RNA und Linien ohne SFRP1-RNA eher gemischt. Keine dieser Zelllinien jedoch exprimierte SFRP1-Protein bis auf eine murine Fibroblastenzelllinie (3T3). Um zu ergründen, wodurch die Diskrepanz zwischen SFRP1-RNA- und fehlender -Proteinexpression zustande kam, wurden Methylierungsanalysen durchgeführt. Dabei ergaben sich individuelle Methylierungsmuster für die verschiedenen DNAs, die eine fehlende Proteinexpression bei nur einem Teil der Zelllinien erklären würden. Daher wurde eine weitere Möglichkeit der Genexpressionsregulation in eukaryontischen Zellen als Ursache in Betracht gezogen, die Hemmung der Translation von SFRP1-mRNA in Protein durch miRNAs. Hierbei konnte mittels Reportergenassays nachgewiesen werden, dass miRNAs in PSCs und PDAC-Zellen eine kleine Stelle in der 3’-untranslatierten Region sowie Stellen in der kodierenden Sequenz von SFRP1 erkennen, daran binden und translational herunterregulieren konnten. Da keine endogene Proteinexpression festgestellt werden konnte, wurden drei PDAC-Zelllinien (PANC-1, AsPC1 und MIA PaCa-2) sowie eine PSC-Zelllinie (Klon2.2) für die stabile Transfektion mit humanem SFRP1 auf einem regulierbaren Vektor ausgewählt. Mithilfe der Lipofektion gelang es jedoch nur bei MIA PaCa-2 und Klon2.2-Zellen, stabile Einzelzellklone anzuziehen, jedoch mit relativ variablen SFRP1-Expressionen und -Regulierbarkeiten. Um noch mehr PDAC-Zelllinien in funktionellen Tests untersuchen zu können, wurden alle vier Zelllinien noch einmal mit einer weiteren Gentransfermethode, der retroviralen Transduktion, in stabil SFRP1-exprimierende Zelllinien umgewandelt. Um zu untersuchen, inwiefern das in den Patienten verlorengegangene SFRP1 das migratorische Verhalten von PDAC- und PSC-Zellen beeinflussen könnte, wurden Scratch- und Invasions- (Migrations) -Assays mit diesen Zellen durchgeführt und mit den Ergebnissen der entsprechenden Leerkontrollen verglichen. Dabei ergab sich für MIA PaCa-2 sowohl mit den durch Lipofektion als auch mit den durch retrovirale Transduktion generierten Klonen/Zelllinien ein signifikant hemmender Einfluss der SFRP1-Überexpression auf das Migrationsverhalten im Scratch-Assay. PANC-1-Zellen schienen mit Lipofektions-SFRP1-Überständen signifikant schlechter durch Membranen zu migrieren und zeigten ebenfalls eine signifikante Migrationshemmung als retroviral transduzierte Zelllinie in Scatch- und Invasionsassay mit endogener SFRP1-Expression. Für PSCs zeigte sich eine SFRP1-abhängige Migrationshemmung im Scratch-Assay und in den Invasionsassays (mit endogener SFRP1-Überexpression und mit SFRP1-Anwesenheit im Überstand), allerdings nur mit Lipofektionsklonen. Es konnte also ein hemmender Einfluss von SFRP1 auf die Migration von PDAC- und PSC-Zellen nachgewiesen werden. Dieser würde theoretisch wegfallen, wenn SFRP1, wie im Tumorstroma von PDAC-Patienten nachgewiesen, herunterreguliert werden würde. Bei der Untersuchung eines Einflusses von SFRP1 auf die Expression weiterer Gene ergab sich, dass SFRP1 bei PDAC-Zellen keine Hemmung des kanonischen Wnt-Signalweges verursacht. Vielmehr scheint seine Überexpression einen positiven Effekt auf die Expression von Mitgliedern des nichtkanonischen planaren Zellpolaritätssignalweges (PCP) zu haben. Die Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen ist, dass ein Wegfall von SFRP1 im Stroma von PDAC in sehr frühen Phasen (und auch in den Tumorzellen selbst) durch miRNAs oder, im Falle der Tumorzellen, durch Hypermethylierung ausgelöst werden könnte. Sezernierte, tumorsupprimierende, parakrine Signale aus dem Stroma und autokrine Signale von den Tumorzellen selbst würden damit wegfallen und die planare Zellpolarität wäre nicht mehr aufrechterhaltbar. Damit würden sich die Polarität und die Migrationsbereitschaft der Tumorzellen so verändern, dass sie ungerichtet wandern könnten, wodurch das Risiko zur Metastasierung zunehmen könnte. Auf diese Weise könnte die stromale Herunterregulierung von SFRP1 bei der Aufrechterhaltung und Progression des PDAC eine Rolle spielen.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 636309 bytes, checksum: ca1e7c510537c62820f228b759c5a23d (MD5) Previous issue date: 2011-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O suíno (Sus scrofa) é considerado um animal de grande importância para produção de carne, sendo seu potencial de crescimento muscular objeto de grande interesse e geralmente associado com características determinadas na fase pré-natal durante a miogênese. Para o estudo de genes responsáveis por estas características, as etiquetas de sequências expressas (Expressed Sequence Tags - EST) fornecem informações diretas sobre o transcriptoma e indiretas sobre a relação entre o genoma e diferentes fenótipos, proporcionando o conhecimento sobre genes diferencialmente expressos (GDE) bem como sequências genômicas transcritas para o controle da expressão gênica como, por exemplo, alguns RNAs não codificantes. Características de tecidos musculares em suínos podem ser influenciadas diretamente por genes, e estes sendo regulados como, por exemplo, através de miRNAs, em diferentes fases de desenvolvimento. O presente trabalho teve como objetivo a identificação e a anotação in sílico de GDE e sequências não codificantes, com enfoque aos miRNAs, de bibliotecas de cDNA construídas a partir do músculo esquelético semi-membranoso de três diferentes raças de suínos (Duroc, Large White e naturalizada brasileira Piau) bem como a análise dos níveis de expressão dos genes identificados e miRNAs em sete fases de desenvolvimento do Longissimus Dorsi (21, 40, 70 e 90 dias pré-natal e 107, 121 e 171 dias pós-natal) de animais de linha comercial. Foram identificados 34 GDE sendo 21 pertencentes a uma rede gênica musculo-específica. Destes, 13 genes tiveram seus perfis de expressão analisados com o uso do qRT-PCR durante os sete períodos citados, formando quatro grupos de expressão semelhantes, um com maior expressão na fase pós-natal e três na fase pré-natal. Nas análises das sequências não codificantes um resultado importante foi a identificação de dois novos miRNAs em suínos, os quais tiveram suas sequências maduras similares aos miRNAs hsa-miR-1207-5p e hsa-miR-665 foram classificadas como verdadeiras pelo programa MiPred e formaram estruturas secundárias. Destes, encontrou-se 289 e 214 genes regulados por eles respectivamente, dos quais quatro são músculo-específicos. Os novos miRNAs tiveram seus perfis de expressão analisados com o uso do PCR em tempo real durante os sete períodos citados juntamente com outros três já identificados em suínos. Seus níveis de expressão mostraram diferenças entre os estágios pré- e pós-natal. Estes estudos podem fornecer valiosas informações possibilitando um maior entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento muscular. As análises de GDE em fases pré e pós-natal sugerem a presença de genes atuando especificamente em determinados estágios de desenvolvimento do músculo, contribuindo para melhor explicar suas funções. A identificação de dois novos miRNAs, somados a outros já identificados e postados nos bancos de dados em suínos, podem contribuir para um maior entendimento dos modos de regulação gênica, sendo de importância para os estudos de genética e melhoramento animal, permitindo o entendimento da fisiologia da deposição de músculo para produção de carne em suínos. / The pig (Sus scrofa) is considered an important animal for meat production. This interest revolves around the potential for muscle growth, which usually is associated with certain characteristics during prenatal myogenesis. To study the genes responsible for these characteristics, expressed sequence tags (EST) provide direct information about the transcriptome and indirectly on the relationship between the genome and different phenotypes, supplying knowledge about differentially expressed genes (DEG) as well as other transcribed genomic sequences for the control of gene expression, e.g., some non-coding RNAs. Characteristics of muscle tissue in pigs may have been directly influenced by genes, and those being regulated, for example, by miRNAs, in different stages of development. This study aimed to identify by in silico annotation, DEG and non-coding sequences, focusing on miRNAs, using cDNA libraries constructed from semi-membranous skeletal muscle of three different pig breeds (Duroc, Large White and naturalized Brazilian Piau ) as well as analysis of gene expression profiles of identified genes and miRNAs during seven stages of development (21, 40, 70 and 90 days prenatal and 107, 121 and 171 days postnatal) from commercial line animals Longissimus Dorsi muscle. Twenty-one identified genes out of 34 DEGs belongs to the muscle-specific path. From these, 13 genes had their expression profiles analyzed by qRT-PCR during the seven periods, forming four clusters of similar expression, with one having greater expression in the postnatal period and three in the prenatal. In the analysis of non-coding sequences, an important result was the identification of two new miRNAs in pigs, which had their sequences similar to mature miRNAs hsa-miR-1207- 5p and hsa-miR-665 which had their precursor sequences forming secondary structures and classified as real precursor sequence by MiPred program. From these, we found 289 genes and 214 respectively regulated by them, of which four are muscle-specific. The new miRNAs and other three which have been identified in previous studies in pigs had their expression levels analyzed by quantitative real time PCR during the mentioned seven periods. Their levels of expression differed between pre-and postnatal stages. These studies may provide valuable information allowing a better understanding of the molecular mechanisms involved in muscle development. Analyses of DEG in the pre-and postnatal periods suggest the presence of genes acting specifically on certain stages of muscle development, contributing to better explain their functions. The identification of two new miRNAs, together with other previously identified and posted on the databases in pigs, may contribute to a better understanding of gene regulation and is important for studies of genetics and animal breeding, allowing the understanding of the muscle deposition physiology to meat production in pigs.

miRNAs are non-coding RNAs of approx. 22 nucleotides in length that inhibit gene expression at the post-transcriptional level. By virtue of this gene regulation mechanism, miRNAs play a critical role in several biological processes and patho-physiological conditions, including cancers. miRNA behavior is a result of a multi-level complex interaction network involving miRNA-mRNA, TF-miRNA-gene, and miRNA-chemical interactions; hence the precise patterns through which a miRNA regulates a certain disease(s) are still elusive. Herein, I have developed an integrative genomics methods/pipeline to (i) build a miRNA regulomics and data analytics repository, (ii) create/model these interactions into networks and use optimization techniques, motif based analyses, network inference strategies and influence diffusion concepts to predict miRNA regulations and its role in diseases, especially related to cancers. By these methods, we are able to determine the regulatory behavior of miRNAs and potential causal miRNAs in specific diseases and potential biomarkers/targets for drug and medicinal therapeutics.