O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

A coenzima Q transporta elétrons das NADH e succinato desidrogenase para o complexo bc1 da cadeia respiratória mitocondrial. Há dez produtos gênicos conhecidos em seu metabolismo; este trabalho foca o último a ser descrito: COQ10. Considerando a presença de coenzima Q no interior de células contendo este gene inativo, verificamos a atividade respiratória da coenzima Q em mutantes coq10. Através de inibidores do ciclo da coenzima Q no interior do complexo III da cadeia respiratória mitocondrial (antimicina A e mixotiazol) na linhagem coq10, notou-se sua resposta a antimicina A, mas não a mixotiazol, sugerindo a existência de semiquinonas, que também foram confirmadas em testes de ressonância paramagnética eletrônica. O possível transporte e distribuição da coenzima Q por Coq10p foi estudado através de mutações sítio-dirigidas em posições críticas de um túnel de ligação existente em sua estrutura modelar, bem como por análise de super-expressão da proteína. Este trabalho confirma o papel central de Coq10p no metabolismo respiratório. / Coenzyme Q transports electrons from NADH and succinate dehydrogenase to the bc1 complex of the mitochondrial respiratory chain. Ten gene products are involved in coenzyme Q metabolism. This work focuses on the last gene to be described: COQ10. Considering the presence of coenzyme Q in the interior of cells containing this gene inactive, we analyzed the respiratory activity of coenzyme Q in coq10 mutants. By using Q cycle inhibitors, in the interior of the complex III of mitochondrial respiratory chain (antimycin A and mixotiazol), in coq10 lineage, it was noted the response to antimycin A, but not mixotiazol, suggesting the existence of semiquinones, which were also confirmed in tests of electron paramagnetic resonance. The possible transmission and distribution of coenzyme Q by Coq10p was studied by site-directed mutagenesis at critical positions of a tunnel present in the molecular model structure, as well as analysis of over-expression of the protein. This study confirms the central role of Coq10p in respiratory metabolism.

A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa e a principal causa de demência re lacionada a idade. Os números em crescimento de pessoas afetadas pela DA estão diretamente ligados ao aumento na expectativa de vida da população mundial. A DA, por se tratar de uma doença multifatorial, envolve fatores genéticos, moleculares e ambientais.As principais alterações fisiopatológicas, hoje alvos de estudos, são os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis, compostas pelo peptídeo beta-amilóide (Aβ). O peptídeo Aβ tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. Diversos processos estão envolvidos na formação deste peptídeo, que uma vez formado desencadeia uma cascata de eventos que envolvem alterações na sinalização celular, ativação da neuroinflamação e geração de um desbalanço na produção de espécies reativas de oxigênio nas organelas presentes nos neurônios culminando na disfunção sináptica e morte celular. Apesar do intenso estudo sobre a fisiopatologia da DA observado nas últimas décadas, ainda não existe o conhecimento completo sobre as causas e sobre o mecanismo que levam a progressão da doença. Os receptores nicotínicos estão presentes no sistema nervoso e, de uma forma geral, são responsáveis pela liberação de neurotransmissores importantes para uma diversidade de processos cognitivos. O estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial estão correlacionados a um ciclo vicioso de desequilíbrio que desempenha um importante papel na patogênese da DA. Por isto, neste trabalho procuramos avaliar o efeito da nicotina em um modelo in vitro de toxicidade do peptideo Aß em cultura organotípica de hipocampo de ratos, bem como avaliar os efeitos desta droga sobre as proteínas relacionadas com a neurodegeneração, AKT e GSK-3ß . Além disso, avaliamos as alterações mitocondriais que a nicotina ocasionou em culturas organotipicas. Para isso, as culturas foram expostas ao peptideo Aß e á nicotina concomitantemente por um período de 48h. A morte celular foi aval iada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte de células principalmente em processo de necrose. As cul turas expostas ao peptídeo Aß quando tratadas com nicotina não apresentaram prevenção da morte celular. A nicotina não teve efeito sobre a fosforilação das proteínas AKT e GS K-3ß. através da análise obtida por Western blotting. Entretanto, na análise real izada por citometria de fluxo, utilizando as sondas mitocondriais MitoTracker® e MitoSOX®, observamos um aumento na produção do ânion superóxido, bem como uma diferença na massa mitocondrial nas culturas expostas ao peptideo com nicotina. / Alzheimer's Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of age-related dementia. The growing numbers of people affected by AD are directly linked to the increase in life expectancy of the world population. The AD, because it is a multifactorial disease, involving genetic, molecular and environmental factors. The main pathophysiological changes, today object of studies, are the neurofibrillary tangles formed by the hyperphosphorylated tau protein and the senile plaques, composed of the betaamyloid peptide (Aß). The Aß peptide has been considered the main responsible for synaptic dysfunction processes, neuronal death and consequent cognitive decline in AD patients. Several processes are involved in the formation of this peptide, which once formed triggers a cascade of events that involve alterations in cell signaling, activation of neuroinflammation and generate an imbalance in the production of reactive oxygen species in the organelles present in neurons culminating in synaptic dysfunction and cell death. Despite the intense study of the pathophysiology of AD observed in recent decades, there is still no complete knowledge about the causes and the mechanisms that lead to disease progression. Nicotinic receptors are present in the nervous system and, in general, are responsible for the release of neurotransmitters important for a variety of cognitive processes. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction is correlated to a vicious circle of imbalance plays an important role in the pathogenesis of AD. Therefore, in this study we evaluated the effect of nicotine on a model in vitro toxicity of Aß peptide in organotypic culture in rat hippocampus, and to evaluate the effects of this drug on proteins related to neurodegeneration, Akt and GSK-3β. In addition, we evaluated the mitochondrial alterations that nicotine caused in organotypic cultures. For this, the cultures were exposed to the Aß-peptide and nicotine concomitantly for a period of 48h. Cell death was evaluated from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell death mainly in necrosis process. Cultures exposed to Aß peptide when treated with nicotine did not show any preventing cell death. Nicotine had no effect on the phosphorylation of Akt and GSK-3β protein, obtained through the analysis by Western blotting. However, the analysis performed by flow cytometry using the mitochondrial probe MitoTracker® and MitoSOX®, an increase in the production of superoxide anion as well as a difference in mitochondrial mass in peptide cultures exposed to nicotine.

Orientador: Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: Com aumento global da temperatura, compreender como o metabolismo de bovinos se adapta ao estresse térmico, permitirá selecionar animais melhor adaptados ao aumento da temperatura ambiente. Uma das possibilidades é compreender como cada raça responde a esse efeito ambiente. O trabalho objetivou expor ao sol duas raças distintas de bovinos com diferente resistência ao calor e estudar as alterações no metabolismo mitocondrial e comportamental após a exposição ao sol ou não por 60 dias. Foram analisados 23 animais da raça Angus – susceptível ao calor (12 ao sol e 11 sob sombra) e 25 Nelores – tolerantes ao calor (13 ao sol e 12 sob sombra). Após todos os animais passarem por período de adaptação de 60 dias, foram divididos entre os grupos e analisados os parâmetros ambientais (THI, HLI e AHLU), movimentação (por radiotelemetria), concentrações séricas de testosterona e LH por radioimunoensaio, espessura de tecido adiposo subcutâneo por ultrassonografia e atividade enzimática mitocondrial de músculo esquelético do complexo I (NADH oxidoredutase). A atividade mitocondrial foi avaliada em amostras da musculatura do tríceps braquial colhidas por biópsia periodicamente ao longo do experimento. Os parâmetros ambientais caracterizam o desconforto térmico que os animais foram submetidos, principalmente Angus sol com índice de AHLU muito acima de estresse extremo. Os Angus se movimentaram mais que os Nelore durante o período experimental (p<0,05) e os Nelore se movimentaram mais à noite ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cattle farmers are suffering challenges in the animal breeding, consequence of the global increase of the temperature. Understanding how the homeothermic metabolism adapts to the thermal stress, allows the selection of better adapted animals to the of the environmental temperature increase. One of those possibilities is to understand each breed reacts to this ambient effect. The work aimed to expose in the sun two different bovine breeds that have different heat resistance and evaluate the mitochondrial metabolism and behavioral changes during sun exposure. Twenty three Angus - susceptible to heat (12 in the sun and 11 in shadow) and 25 Nellore - heat tolerant (13 in the sun and 12 in shadow) animals were analyzed. After all the animals went through a 60 days adaptation period, the animals were sorted composing the groups and analyzed the environmental parameters, movement (by radiotelemetry) subcutaneous fat thickeness and mitochondrial enzymatic activity from squelectical muscle samples.The activity mitochondria were evaluated by the enzymatic reaction of the compound I (NADH oxidoreductase) in muscular tissue samples that were collected periodically during the experiment. The environmental parameters characterize the thermal discomfort that the animals were subjected to, mainly Angus sun with AHLU index well above extreme stress. The Angus moved more than the Nellore during the experimental period (p <0.05) and the Nellore moved more at night compared to the day (p <0.05).... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by GABRIELA DA SILVA FERREIRA (gabrielasf2@hotmail.com) on 2019-01-31T16:47:44Z No. of bitstreams: 1 TESE GABRIELA REAPRESENTAÇÃO.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) / Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2019-02-01T11:42:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferreira_gs_dr_araca_int.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-01T11:42:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferreira_gs_dr_araca_int.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) Previous issue date: 2019-01-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Com aumento global da temperatura, compreender como o metabolismo de bovinos se adapta ao estresse térmico, permitirá selecionar animais melhor adaptados ao aumento da temperatura ambiente. Uma das possibilidades é compreender como cada raça responde a esse efeito ambiente. O trabalho objetivou expor ao sol duas raças distintas de bovinos com diferente resistência ao calor e estudar as alterações no metabolismo mitocondrial e comportamental após a exposição ao sol ou não por 60 dias. Foram analisados 23 animais da raça Angus – susceptível ao calor (12 ao sol e 11 sob sombra) e 25 Nelores – tolerantes ao calor (13 ao sol e 12 sob sombra). Após todos os animais passarem por período de adaptação de 60 dias, foram divididos entre os grupos e analisados os parâmetros ambientais (THI, HLI e AHLU), movimentação (por radiotelemetria), concentrações séricas de testosterona e LH por radioimunoensaio, espessura de tecido adiposo subcutâneo por ultrassonografia e atividade enzimática mitocondrial de músculo esquelético do complexo I (NADH oxidoredutase). A atividade mitocondrial foi avaliada em amostras da musculatura do tríceps braquial colhidas por biópsia periodicamente ao longo do experimento. Os parâmetros ambientais caracterizam o desconforto térmico que os animais foram submetidos, principalmente Angus sol com índice de AHLU muito acima de estresse extremo. Os Angus se movimentaram mais que os Nelore durante o período experimental (p<0,05) e os Nelore se movimentaram mais à noite em comparação ao dia (p<0,05). As concentrações de testosterona aumentaram do período de adaptação para o experimento para ambas as raças e tratamentos. Os animais da raça Nelore apresentaram maior depósito de gordura subcutânea que os Angus. A atividade mitocondrial aumentou significativamente do período de adaptação (P0) para o experimento (P1) e não diferiu durante o experimento entre as raça e os tratamentos. Animais endotérmicos mantidos em altas temperaturas respondem com adaptações metabólicas e comportamentais mediante o estresse exposto. Os Nelore se movimentam mais à noite quando a temperatura é mais amena e os Angus durante o dia à procura de conforto térmico. A atividade mitocondrial é aumentada devido a alta demanda de ATP provavelmente em repercussão da necessidade de sinalizar biogênese mitocondrial, reparação celular, movimentação e níveis aumentados de testosterona. / Cattle farmers are suffering challenges in the animal breeding, consequence of the global increase of the temperature. Understanding how the homeothermic metabolism adapts to the thermal stress, allows the selection of better adapted animals to the of the environmental temperature increase. One of those possibilities is to understand each breed reacts to this ambient effect. The work aimed to expose in the sun two different bovine breeds that have different heat resistance and evaluate the mitochondrial metabolism and behavioral changes during sun exposure. Twenty three Angus - susceptible to heat (12 in the sun and 11 in shadow) and 25 Nellore - heat tolerant (13 in the sun and 12 in shadow) animals were analyzed. After all the animals went through a 60 days adaptation period, the animals were sorted composing the groups and analyzed the environmental parameters, movement (by radiotelemetry) subcutaneous fat thickeness and mitochondrial enzymatic activity from squelectical muscle samples.The activity mitochondria were evaluated by the enzymatic reaction of the compound I (NADH oxidoreductase) in muscular tissue samples that were collected periodically during the experiment. The environmental parameters characterize the thermal discomfort that the animals were subjected to, mainly Angus sun with AHLU index well above extreme stress. The Angus moved more than the Nellore during the experimental period (p <0.05) and the Nellore moved more at night compared to the day (p <0.05). Testosterone concentrations increased from the adaptation period to the experimental for both breeds and treatments. The animals of the Nelore breed presented greater subcutaneous fat deposition than the Angus. Enzymatic mitochondrial activity increased significantly from the adaptation period (P0) to the experiment (P1) and did not differ during the experiment between breed and treatments. Homeothermic animals kept at high temperatures respond with metabolic and behavioral adaptations through exposed stress. The Nelore move more at night when the temperature is milder and the Angus during the day looking for thermal comfort. Mitochondrial activity is increased due to high ATP demand probably in repercussion of the need to signal mitochondrial biogenesis, cell repair, movement and increased levels of testosterone.

Processos que envolvem sensibilização são extremamente importantes para diversas áreas do conhecimento, incluindo a biologia, a química e a medicina. A aplicação de sensibilização em medicina tem se destacado, especialmente, em face de uma modalidade alternativa de tratamento de câncer denominada terapia fotodinâmica (TFD). Uma das linhas de pesquisas fundamentais para a evolução da terapia fotodinâmica é o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (Fs) com composição definida, que absorvam na janela terapêutica (600- 800nm) e que apresentem maior eficiência na indução de apoptose. Os Fs que apresentam cargas positivas e que são relativamente lipofílicos, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, que tem papel central no controle da vida e da morte celular. Neste trabalho foi realizado um estudo da influência dos grupos funcionais na atividade dos Fs, através da funcionalização da protoporfirina IX (Pp IX). Foram estudadas três diferentes rotas sintéticas. Na rota I (esquema 14), utilizou-se como composto de partida a Hematoporfina IX (Hp IX), a qual foi funcionalizada com grupos aminas e amidas, respectivamente, nas hidroxilas e nas carboxilas. Esta rota forneceu baixo rendimento global (20%), e compostos de difícil purificação, no entanto obteve-se 1 composto puro. Na rota II (esquema 15), utilizou-se como composto de partida a Pp IX, a qual foi funcionalizada nos grupos vinílicos com grupos aminas. Obteve-se 4 compostos, com rendimento global de reação superior a 50%, mas observou-se que ocorre uma reação de eliminação que impede a quartenarização das aminas localizadas nas posições &#945; ao anel porfirínico. Na rota III (esquema 16), os grupos carboxílicos de Pp IX foram transformados em cloreto de ácido, que foram substituídos por compostos bifuncionais, amina primária e um segundo grupo. Esta rota possibilitou a obtenção de 7 compostos, inclusive compostos quaternários com rendimento global de reação superior a 70%. Dois derivados da clorofilina, que apresentam a banda QIV com um &#949; elevado em 650nm, foram também sintetizados. Todos os compostos, foram caracterizados estruturalmente de forma inequívoca através do espectro eletrônico (UV-vis e fluorescência), vibracional no infravermelho, RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e espectrometria de massa. A série de compostos obtidos permitiu um estudo da relação entre a estrutura química do Fs com a sua fotoatividade. As propriedades fotofísicas foram caracterizadas por espectro de absorção e de emissão, fotólise de relâmpago a laser, eficiência quântica de fluorescência e de geração de oxigênio singlete. Estas determinações indicaram que as propriedades fotofísicas dos Fs não foram consideravelmente alteradas no processo sintético. Foi determinada a formação de agregados em solução aquosa e o equilíbrio monômero agregado foi deslocado no sentido da formação do monômero na presença de micelas de CTAB e SDS e de soro fetal. Observou-se, que a contribuição para desagregação é mais eficiente quando a carga da micela é oposta à do Fs. Foi determinado o coeficiente de partição octanol/água (logPo/a) em função do pH e constatou-se que os compostos que têm carga líquida apresentam valores de logPo/a entre -1 e 1 na faixa de pH entre 3 e 10. A incorporação destes compostos em lipossomos, seguiu perfil esperado considerando a carga, o logPo/a e a característica anfifílica dos compostos sintetizadas. Genericamente a eficiência de morte celular fotoinduzida seguiu o perfil de incorporação das drogas em células HeLa. Os estudos comparativos da citolocalização foram realizados por co-encubação das porfirinas sintetizadas com rodamina 123 (Rd), que se concentra em mitocôndrias. A localização em organelas citoplasmáticas foi determinada através de imagens obtidas por microscopia de fluorescência confocal. A sobreposição da emissão da Rd foi de 80% e 31% com o composto catiônico PpNpNI e aniônico PpNetPO3, respectivamente, comprovando a localização mitocondrial do composto positivo. / Processes that involve sensitization are extremely important for several areas of knowledge, including biology, chemistry and medicine. The application of sensitization in medicine is especially important, in face of an alternative modality of cancer treatment called Photodynamic Therapy (PDT). One of the lines of basic research important for the evolution of PDT is the development of new photosensitizers (PS) with defined composition, that absorb in the therapeutical window (600-800nm) and that present greater efficiency in the induction of apoptosis. Positively charged PS with the proper lipophilic/hidrophilic balance permeate membranes and are attracted by the negative potential of mitochondria, which is an organelle that has central roles in the control of cell life and death. In this work the influence of the functional groups in the activity of PS was carried out, through the functionalization of protoporphyrin IX (Pp IX). Three different synthetic routes were used. In route I (scheme 14), Hematoporphyrin IX (Hp IX), was used as departure compound and it was modified with amino and amide groups in hydroxyls and carboxyls, respectively. We found low yield in the synthetic (20%) and purification steps. However 1 pure PS was obtained. In route II (scheme 15), Pp IX was used as departure compound, which was modified in the vinilic groups with amino groups. We obtained 4 compounds, with global yield superior than 50%, but it was observed that an elimination reaction occurs that hinders the quarternization of the amino groups located in position &#945; to the porphyrin ring. Into route III (scheme 16), the carboxilic groups of Pp IX had been transformed into chloride acid, which was substituted by bi- functional groups, primary amine in one side and another group in the other. This route made it possible to obtain 7 compounds, including quaternary ammonium compounds with global yield superior than 70%. Two derivatives of chlorophyllin, that present QIV band with large extinction coefficient in 650nm, also were synthesized. All compounds were characterized structurally through the electronic and vibrational spectra (UV-vis and fluorescence, IR), RMN of 1H and 13C (1D and 2D) and mass spectrometry. This series of compounds allowed us to study the relation between the chemical structure of the Fs with its photoactivity. The photophysical properties were characterized by emission and absorption spectra, laser flash photolysis, fluorescence emission in the visible and NIR regions (generation of singlet oxygen). These determinations indicated that the photophysical properties of the PS were not modified in the synthetic process. The formation of aggregates were characterized in aqueous solution and the balance between aggregate and monomer species was dislocated in the direction of the formation of monomers in the presence of CTAB, SDS micelles and fetal serum. It was observed, that the disaggregating efficient is larger with micelles that have the opposite charges to that of the PS. The Octanol water partition coefficient (logPo/a), was determined as a function of pH. logPo/a values between -1 and 1 were observed for charged PS in the pH range of 3-10. The incorporation of these compounds in liposomes, followed the expected profile considering the charge, logPo/a and the amphifilic nature. Generically, the photoinduced cell death efficiency followed the profile of incorporation of the PS in HeLa cells. Comparative studies of cytolocalization were carried out by co-incubation of the cells with porphyrins and Rhodamine 123 (Rd), which localizes in mitochondria. The localization in cytoplasmic organelles was determined through fluorescence confocal microscopy images. The overlapping emission of the Rd was of 80% and 31% with the cationic PpNpNI and the anionic PpNetPO3 compounds, respectively, proving the mitochondrial localization of the positive PS.

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012