Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Submitted by LUÍS LENIN VICENTE PEREIRA null (luislenin@gmail.com) on 2017-03-02T15:07:34Z No. of bitstreams: 1 Tese Luis Lenin Vicente Pereira.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T13:17:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_llv_dr_sjrp.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T13:17:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_llv_dr_sjrp.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A subordem Heteroptera possui sete infraordens com aproximadamente 80 famílias. A maioria ocorre em todos os continentes (exceto Antártica) e algumas ilhas. Além dos Heteroptera terrestres, há os aquáticos e semi-aquáticos que são amplamente distribuídos, e surpreendem por sua capacidade de habitar uma extraordinária variedade de ecossistemas, sendo encontrados em habitats de água doce e marinho, e variada faixa de altitude entre 0 e 4.700 m. Estudos sobre aspectos ultraestruturais da espermatogênese e, especificamente, a estrutura do espermatozoide em Heteroptera ainda são escassos, por este motivo o objetivo do presente estudo foi o de analisá-los, por meio de cortes semifinos corados com azul de toluidina ou impregnados por íons prata, e cortes ultra-finos analisados em microscopia eletrônica de transmissão, utilizando testículos de machos adultos das famílias Belostomatidae, Gelastocoridae, Gerridae, Mesoveliidae, Notonectidae e Veliidae. Após a análise ultraestrutural da espermatogênese foi possível determinar que o padrão flagelar do axonema é de 9+9+2 para todas as espécies analisadas sendo, portanto, o padrão para essa subordem, as mitocôndrias durante a espermatogênese assumem diferentes morfologias, sendo que inicialmente as mitocôndrias se unem formando o complexo mitocondrial e, posteriormente, se divide em dois derivados mitocondriais que estão posicionados bilateralmente em relação ao axonema. Os derivados mitocondriais apresentaram tamanhos diferentes para as espécies B. amnigenus (Notonectidae) e R. c. crassifemur (Gerridae) e para as demais espécies o tamanho foi semelhante. As células germinativas possuem em seu citoplasma o acúmulo de um material denominado corpo cromatóide estando localizado próximo ao núcleo. Com relação ao comportamento nucleolar da espécie Martarega brasiliensis foi observado de um a quatro corpúsculos nucleolares em células de Prófase I comprovando uma grande atividade sintética das células nessa fase da divisão celular. Células em Metáfase I apresentaram regiões organizadoras nucleolares na região telomérica de um dos autossomos. Ainda, nessa espécie, foi possível observar, em Anáfase I, vários corpúsculos nucleolares persistindo até a fase de Telófase I. Todas as ultraestruturas descritas nas espécies analisadas foram semelhantes às descritas na literatura para Heteroptera, corroborando as características sinapomórficas dessa subordem sendo elas: a) a presença de duas pontes que ligam o material intertubular do axonema flagelar às cisternas achatadas que aderem aos lados internos dos derivados mitocondriais; b) padrão flagelar do axonema de 9+9+2 e c) ausência de corpos acessórios. / The suborder Heteroptera has seven infraorders with approximately 80 families. Most occur in all continents, except Antarctica and some islands. In addition to terrestrial Heteroptera, there are also widely distributed aquatic and semi-aquatic species. This suborder have adapted to live in an extraordinary variety of ecosystems as freshwater and marine habitats and at altitudes ranging from 0 m to 4,700 m. The research concerning the ultrastructural aspects of spermatogenesis is a large and growing field of study, however, in the case of Heteroptera, research is still scarce. For this reason, the aim of this study was to analyze the ultrastructures and spermatogenesis through semi-thin sections stained with toluidine blue or silver ions (Ag-NOR) and ultrathin sections examined in transmission electron microscopy, using testes of adult males ofthe following families: Belostomatidae, Gelastocoridae, Gerridae, Mesoveliidae, Notonectidae and Veliidae. After ultrastructural analysis of spermatogenesis, it was possible to determine that the flagellar pattern of the axoneme is 9+9+2 for all species, being therefore, the pattern for this suborder. As spermatogenesis progresses, the mitochondria begins to cluster and concentrate on only one side of the cell. Then, the mitochondria combine to form a single mitochondrial complex, which subsequently divides into two mitochondrial derivatives. They are positioned on opposite sides of the axoneme. The mitochondrial derivatives presented different sizes for the species B. amnigenus (Notonectidae) and R. c. crassifemur (Gerridae) and for the other species the size was similar. The germ cells have in their cytoplasm the accumulation of a material denominated the chromatoid body, being located near the nucleus. Regarding the nucleolar behavior, M. brasiliensis showed nucleus in prophase I composed by the nucleolus and nucleolar corpuscles that varied from one to four, emphasizing that this insect has great synthetic activity during meiosis. The analysis of cells in metaphase I, showed that M. brasiliensis presents nucleolar organizing region (NOR) in at least one autosome. Furthermore, was not observed the phenomenon of nucleolar persistence. All the ultrastructures described in the analyzed species were similar to those described in the literature for Heteroptera, corroborating the synapomorphic characteristics of this suborder, being them: a) two opposite bridges in the axoneme connect the flattened cisterns adherent to the internal side of each mitochondrial derivative to the intertubular material; b) flagellar pattern of the axoneme of 9+9+2; c) accessory bodies are absent all along the flagellum.

A criopreservação, como já conhecido, causa danos da função celular podendo, com isso, apresentar redução da fertilidade. O desenvolvimento de técnicas para avaliar a viabilidade espermática, que visam aperfeiçoar o processo de avaliação seminal tem sido meta de muitas pesquisas. Este trabalho foi dividido em dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para o desenvolvimento e validação de técnicas práticas e de alta repetibilidade para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial de espermatozóides bovinos pela associação de sondas fluorescentes. O experimento 2 foi realizado para avaliar os efeitos que a criopreservação pode causar sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (pela técnica desenvolvida no experimento 1) e estrutura da cromatina de espermatozóides bovinos frente a dois diluidores diferentes, bem como verificar a existência de correlações entre alterações nas membranas e características de motilidade em espermatozóides bovinos criopreservados. No experimento 1 as associações das sondas iodeto de propídio (PI, para avaliar integridade da membrana plasmática) e aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA, para avaliar a integridade acrossomal), foram divididas em quatro protocolos, nos quais foram testadas diferentes sondas para avaliar a função mitocondrial. Rodamina 123 (R123, protocolo 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocolo 2), CMXRos ou MitoTracker red (protocolo 3) e no: iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1, protocolo 4). Estes protocolos foram testados e validados. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância, teste de Fisher e à análise de regressão linear pelo programa Stat-View® (SAS Institute, Inc. 1998). O protocolo 1 não apresentou resultados satisfatórios, não sendo possível validar, enquanto, os protocolos 2, 3 e 4 foram validados e apresentaram resultados bastante consistentes. O protocolo 4 foi escolhido para a utilização no experimento 2. Para o experimento 2 foram realizadas sete colheitas de sêmen de oito touros puros da raça Simental. Após a colheita, o sêmen foi avaliado quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor visualmente, motilidade por sistema computadorizado (CASA), características morfológicas por microscopia de interferência diferencial, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, pela associação de FITC-PSA, PI e JC-1, e integridade da estrutura da cromatina, pela técnica da acridina laranja. Após as análises, o sêmen foi dividido em duas alíquotas, sendo uma das alíquotas diluída com o diluidor Bioxcell® e a outra com o diluidor Botu-Bov®, envasado em palhetas e submetido a congelação com um sistema automatizado. Duas palhetas cada tratamento foram descongeladas e o sêmen foi avaliado quanto a motilidade e vigor visualmente, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial e estrutura da cromatina. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1985), os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey. Foram calculadas correlações lineares de Pearson. O nível de significância foi fixado em 5%. Foram observados efeitos da criopreservação e do diluidor sobre motilidade e vigor visual, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial. De forma que, após a criopreservação houve aumento dos danos nas estruturas espermática e o diluidor Botu-Bov® apresentou a maioria das características melhores quando comparado ao diluidor Bioxcell® / The process of cryopreservation causes damages in the sperm cellular function which may lead to a reduction in fertility. New techniques to evaluate sperm viability may improve the process of semen evaluation. The present work was divided in two experiments. Experiment 1 aimed the development and validation of practical techniques with high repetibility for simultaneous evaluation of integrity of plasmatic and acrosomal membrane and mitochondrial function of bovine spermatozoa by the strategic association of fluorescent probes. Objective of experiment 2 was to validate the effects of cryopreservation using two differents diluents on sperm motility, plasmatic, acrosomal, mitochondrial membranes integrity and chromatin structure of bovine spermatozoa. A second objective was to verify the correlations between alterations in membranes and motility characteristics in cryopreserved bovine spermatozoa. In experiment 1 propidium iodide (PI, to evaluate plasmatic membrane integrity) and the Pisum sativum agglutinin conjugated with fluorescein isothicyonate- (FITC-PSA, to evaluate acrosomal integrity). Probes were associated to evaluate mitochondrial function in four protocols: Rhodamine 123 (R123, Protocol 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocol 2), CMXRos or MitoTracker red (protocol 3), and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1, protocol 4). Results were submitted to analysis of variance, Fisher’s test and linear regression analysis by the program Stat-View® ( SAS Institute, Inc.1998). It was not possible to validate protocol 1, while the protocols 2, 3 and 4 were validated and showed consistent results. Protocol 4 was used in experiment 2. For experiment 2 seven ejaculates were collected from eight Simental bulls. Volume, concentration, motility and vigour of semen were evaluated subjectively, motility by computer system (CASA), morphological characteristics by differential interference microscopy, plasmatic and acrosomal membranes integrity and, mitochondrial function with FITC-PSA, PI and JC-1 association, and chromatin integrity by acridine orange technique. Then, semen was divided in two aliquots. One was diluted with Bioxcell® and the other with Botu-Bov® diluent, packaged in 0.5 mL straws and frozen using na automated system. Two straws of sêmen from each treatment were thawed and the semen parameter evaluated, as described above. The statistical analysis was performed using the Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 1985). Data were submitted to analysis of variance and Tukey’s test. Pearson’s linear correlations were calculated. Cryopreservation increased damages in spermatic structures. Botu-Bov® diluent was better in preserve the motility and membrane integrity (P⁢0,05) when compared to Bioxcell® diluent

A criopreservação, como já conhecido, causa danos da função celular podendo, com isso, apresentar redução da fertilidade. O desenvolvimento de técnicas para avaliar a viabilidade espermática, que visam aperfeiçoar o processo de avaliação seminal tem sido meta de muitas pesquisas. Este trabalho foi dividido em dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para o desenvolvimento e validação de técnicas práticas e de alta repetibilidade para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial de espermatozóides bovinos pela associação de sondas fluorescentes. O experimento 2 foi realizado para avaliar os efeitos que a criopreservação pode causar sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (pela técnica desenvolvida no experimento 1) e estrutura da cromatina de espermatozóides bovinos frente a dois diluidores diferentes, bem como verificar a existência de correlações entre alterações nas membranas e características de motilidade em espermatozóides bovinos criopreservados. No experimento 1 as associações das sondas iodeto de propídio (PI, para avaliar integridade da membrana plasmática) e aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA, para avaliar a integridade acrossomal), foram divididas em quatro protocolos, nos quais foram testadas diferentes sondas para avaliar a função mitocondrial. Rodamina 123 (R123, protocolo 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocolo 2), CMXRos ou MitoTracker red (protocolo 3) e no: iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1, protocolo 4). Estes protocolos foram testados e validados. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância, teste de Fisher e à análise de regressão linear pelo programa Stat-View® (SAS Institute, Inc. 1998). O protocolo 1 não apresentou resultados satisfatórios, não sendo possível validar, enquanto, os protocolos 2, 3 e 4 foram validados e apresentaram resultados bastante consistentes. O protocolo 4 foi escolhido para a utilização no experimento 2. Para o experimento 2 foram realizadas sete colheitas de sêmen de oito touros puros da raça Simental. Após a colheita, o sêmen foi avaliado quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor visualmente, motilidade por sistema computadorizado (CASA), características morfológicas por microscopia de interferência diferencial, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, pela associação de FITC-PSA, PI e JC-1, e integridade da estrutura da cromatina, pela técnica da acridina laranja. Após as análises, o sêmen foi dividido em duas alíquotas, sendo uma das alíquotas diluída com o diluidor Bioxcell® e a outra com o diluidor Botu-Bov®, envasado em palhetas e submetido a congelação com um sistema automatizado. Duas palhetas cada tratamento foram descongeladas e o sêmen foi avaliado quanto a motilidade e vigor visualmente, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial e estrutura da cromatina. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1985), os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey. Foram calculadas correlações lineares de Pearson. O nível de significância foi fixado em 5%. Foram observados efeitos da criopreservação e do diluidor sobre motilidade e vigor visual, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial. De forma que, após a criopreservação houve aumento dos danos nas estruturas espermática e o diluidor Botu-Bov® apresentou a maioria das características melhores quando comparado ao diluidor Bioxcell® / The process of cryopreservation causes damages in the sperm cellular function which may lead to a reduction in fertility. New techniques to evaluate sperm viability may improve the process of semen evaluation. The present work was divided in two experiments. Experiment 1 aimed the development and validation of practical techniques with high repetibility for simultaneous evaluation of integrity of plasmatic and acrosomal membrane and mitochondrial function of bovine spermatozoa by the strategic association of fluorescent probes. Objective of experiment 2 was to validate the effects of cryopreservation using two differents diluents on sperm motility, plasmatic, acrosomal, mitochondrial membranes integrity and chromatin structure of bovine spermatozoa. A second objective was to verify the correlations between alterations in membranes and motility characteristics in cryopreserved bovine spermatozoa. In experiment 1 propidium iodide (PI, to evaluate plasmatic membrane integrity) and the Pisum sativum agglutinin conjugated with fluorescein isothicyonate- (FITC-PSA, to evaluate acrosomal integrity). Probes were associated to evaluate mitochondrial function in four protocols: Rhodamine 123 (R123, Protocol 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocol 2), CMXRos or MitoTracker red (protocol 3), and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1, protocol 4). Results were submitted to analysis of variance, Fisher’s test and linear regression analysis by the program Stat-View® ( SAS Institute, Inc.1998). It was not possible to validate protocol 1, while the protocols 2, 3 and 4 were validated and showed consistent results. Protocol 4 was used in experiment 2. For experiment 2 seven ejaculates were collected from eight Simental bulls. Volume, concentration, motility and vigour of semen were evaluated subjectively, motility by computer system (CASA), morphological characteristics by differential interference microscopy, plasmatic and acrosomal membranes integrity and, mitochondrial function with FITC-PSA, PI and JC-1 association, and chromatin integrity by acridine orange technique. Then, semen was divided in two aliquots. One was diluted with Bioxcell® and the other with Botu-Bov® diluent, packaged in 0.5 mL straws and frozen using na automated system. Two straws of sêmen from each treatment were thawed and the semen parameter evaluated, as described above. The statistical analysis was performed using the Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 1985). Data were submitted to analysis of variance and Tukey’s test. Pearson’s linear correlations were calculated. Cryopreservation increased damages in spermatic structures. Botu-Bov® diluent was better in preserve the motility and membrane integrity (P⁢0,05) when compared to Bioxcell® diluent

Existe uma significativa associação entre a prevalência de doenças cardiovasculares e a síndrome metabólica. Evidências mostram que a obesidade está associada a alterações estruturais e funcionais do coração. As estatinas podem reduzir a síntese endógena de colesterol e, portanto, são utilizadas como uma importante ferramenta contra a hipercolesterolemia em pacientes obesos. O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos da rosuvastatina no metabolismo lipídico e dos carboidratos, morfometria do tecido adiposo e no remodelamento cardíaco de camundongos alimentados com uma dieta hiperlipídica. Neste trabalho foram utilizados 50 camundongos distribuidos em cinco grupos: grupo controle (alimentado com dieta padrão), grupo hiperlipídico (alimentado com dieta hipelipídica 60%), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 10 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 10 mg de rosuvastatina), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 20 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 20 mg de rosuvastatina), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 40 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 40 mg de rosuvastatina). Foram estudados os efeitos do tratamento com diferentes doses de rosuvastatina na massa corporal, metabolismo dos carboidratos e lipídios, pressão arterial, remodelamento na estrutura cardíaca e mudanças ultraestruturais no coração de camundongos C57BL / 6 machos alimentados com uma dieta hiperlipídica. O tratamento com rosuvastatina reduziu os níveis de lípidos no sangue, melhorou a resistência à insulina e diminuiu a pressão arterial dos camundongos alimentados com dieta rica em lipídeos. Além disso, atenuou o remodelamento cardíaco, diminuindo a fibrose intersticial e perivascular, e manteve a integridade morfológica mitocondrial, com menor produção de proteina desacopladora-2 (UCP2). Assim, a rosuvastatina tem efeitos benéficos sobre as alterações metabólicas dos carboidratos e lipídios, e no remodelamento cardíaco induzidas por dieta hiperlipídica. / There is a significant association between the prevalence of cardiovascular disease and metabolic syndrome. Evidence shows that obesity is associated with structural and functional changes in the heart. Statins can reduce the endogenous synthesis of cholesterol and are therefore used as an important tool against hypercholesterolemia in obese. The present work aims to study the effects of rosuvastatin in lipid and carbohydrate metabolism, adipose tissue morphometry and cardiac remodeling. In this work we studied the effects of rosuvastatin treatment on the body mass, insulin resistance, lipid profile, blood pressure, cardiac remodeling and structure and ultrastructural changes in the heart of the C57BL/6 male mice fed a high-fat diet. The rosuvastatin treatment reduced levels of blood lipids, improve insulin resistance, reduced blood pressure and body mass of high-fat mice. Furthermore, it attenuated cardiac remodelling, decreasing the interstitial and perivascular fibrosis, and maintained the integrity of mitochondrial morphology, with a lower production of UCP-2. Rosuvastatin had beneficial effects on cardiac changes induced by high-fat diet, as well as in mitochondrial morphology, thus controlled energy production to maintain cardiomyocyte integrity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmercury (MeHg) is a highly toxic environmental contaminant that can be accumulated on several tissues, inducing cellular dysfunction on various organs, especially in the central nervous system (CNS). The mechanisms involved in the uptake, accumulation and toxicity of mercury (Hg) remain unclear. However, it has been suggested that the neurotoxicity mediated by MeHg induces changes in both glutamatergic system and calcium homeostasis. Indeed, the literature reports that calcium per se is able in inducing cellular damage. Thus, mercury and calcium can exert distinct or linked toxic effect that lead to mitochondrial and cellular dysfunction. The purpose of this study was to analyze the mechanisms of uptake and accumulation of mercury on liver slices exposed to MeHg or MeHg-Cysteine complex, as well as to compare the mitochondrial and cellular toxicity caused by both forms of MeHg. Moreover, this work examined the role of glutamatergic system on the toxicity mediated by MeHg in slices of cerebral cortex from rats and the effects of calcium exposure in mitochondria sustained with different energetic substrates. Our results showed that the mercury uptake was higher in the slices exposed to the MeHg-Cys complex that MeHg exposed slices. Indeed, the pretreatment with methionine (Met) (for 15 min.) reduced Hg uptake in liver slices. Likewise, mitochondria isolated of liver slices showed similar effect on Hg uptake. Parameters as free radical generation; oxygen consumption and mitochondrial function/Cell viability were more affected by MeHg-Cys complex than MeHg alone. Met pre-treatment was effective in preventing the MeHg or MeHg-Cys-induced toxicity in both liver slices and mitochondria. In cortical brain slices, the neurotoxicity induced by MeHg was verified only at higher concentration tested and after 2 or 5 hours of exposure. In addition, compounds that potentially modulate glutamatergic system (MK-801, guanosine, organo selenium compounds) were effective in preventing the MeHg-induced free radical generation. In mitochondria isolated from liver, Ca2+ caused an inhibition on the complex I activity; however, calcium did not alter the mitochondrial complex II activity. At low concentration, calcium exposure caused a small decrease in the mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in Malate/Glutamate (Ma/Glu) and Succinate (Succ)-supported mitochondria. On the order hand, higher calcium levels were associated with a total ΔΨm loss in both Mal/Glu and Succ-oxidizing mitochondria. The mitochondrial redox state (NADP(H) and GSH pool) and oxygen consumption were extremely affected by calcium exposure only in Succ-supported mitochondria. Indeed, calcium caused an increase in free radical generation in mitochondria sustained with complex II substrate when compared to Mal/Glu-supported mitochondria. Taken together, our data collaborate to understanding the molecular mechanisms involved on the toxicology of mercury and calcium and consequently provide basis for further investigations on the role of Ca2+ and mercury in mitochondrial dysfunctions. In addition, the results obtained here may contribute to the discovery of new therapeutic agents capable of preventing or minimizing the damage induced by MeHg intoxication. / O metilmercúrio (MeHg) é um contaminante ambiental altamente tóxico que pode ser bioacumulado em diferentes tecidos e consequentemente induzir disfunções celulares em diversos órgãos, especialmente no sistema nervoso central (SNC). Os mecanismos pelos quais o mercúrio (Hg) entra nos tecidos, se acumula e causa toxicidade em células e organelas ainda não se encontram totalmente elucidados. No entanto, estudos têm sugerido que a neurotoxicidade mediada pelo MeHg envolve alterações no sistema glutamatérgico e na homeostase do cálcio. Por outro lado, sabe-se que o cálcio (Ca2+) per se causa efeitos tóxicos nas células e principalmente em mitocôndrias. Assim o Hg e o Ca2+ podem induzir efeitos distintos ou interligados, os quais geralmente culminam com disfunção mitocondrial e morte celular. Com base nestes parâmetros, o presente trabalho visa elucidar os possíveis mecanismos moleculares envolvidos na captação e no acúmulo de Hg em fatias hepáticas expostas a forma livre de MeHg+ ou à forma complexada MeHg-Cisteína (MeHg-Cys), bem como, relacionar estes aspectos com a toxicidade celular e mitocondrial causada por ambas as formas de MeHg. Também foi alvo deste estudo a investigação do papel do sistema glutamatérgico na toxicidade mediada pelo MeHg em fatias de córtex cerebral de ratos e os efeitos do cálcio em mitocôndrias isoladas e sustentadas com diferentes substratos energéticos. Com relação à captação de Hg, nossos resultados mostram que fatias expostas ao complexo MeHg-Cys acumulam mais Hg que fatias expostas ao MeHg sozinho. Também foi observado que o pré-tratamento (15 min) com metionina (Met) reduziu significativamente a captação e o acúmulo de Hg nas fatias. Resultados similares foram verificados em mitocôndrias isoladas dessas fatiais. Nos parâmetros bioquímicos: geração de radicais livres, consumo de oxigênio e viabilidade celular/atividade mitocondrial, o complexo MeHg-Cys causou efeitos mais tóxicos quando comparado com o MeHg sozinho. O pré-tratamento com Met foi efetivo em prevenir as alterações mediadas por ambas as formas de mercúrio testadas. Os efeitos neurotóxicos do MeHg em fatias de córtex cerebral foram observados apenas nas maiores concentrações usadas e após 2 ou 5 horas de exposição. A utilização de compostos que possivelmente modulam a homeostase glutamatérgica (MK-801, guanosina e compostos orgânicos de selênio) preveniram os efeitos induzidos por MeHg na geração de radicais livres. Os efeitos do cálcio foram analisados em mitocôndrias isoladas e sustentadas com o substrato energético do complexo mitocondrial I: Malato/Glutamato (Mal/Glu) e do complexo II Succinato (Succ). Os resultados obtidos mostram que o cálcio inibiu a atividade complexo I; mas não alterou a atividade complexo II. Em baixas concentrações o cálcio causou uma pequena diminuição no potencial de membrana (ΔΨm) nas mitocôndrias sustentadas com Mal/Glu ou Succ. Por outro lado, uma perda total do potencial foi observada quando as mitocôndrias, sustentadas com ambos os substratos, foram expostas a altas concentrações de cálcio. A exposição ao cálcio causou uma redução no potencial redox (conteúdo NADP(H) e GSH) e no consumo de oxigênio nas mitocôndrias sustentadas com Succ quando comparado com as que receberam Mal/Glu. A geração de radicais livres foi aumentada em mitocôndrias expostas ao cálcio e sustentadas com Succ quando comparadas com as mitocôndrias sustentadas com substrato do complexo I. De forma geral, nossos resultados colaboram para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida por MeHg e por cálcio, bem como para um melhor entendimento sobre o papel destes elementos na indução de disfunção mitocondrial. Além disso, os resultados obtidos poderão contribuir para a descoberta de novos agentes terapêuticos usados para prevenir ou minimizar danos teciduais associados à intoxicação humana por MeHg.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) / A mitocondria e importante no processo de manutencao da homeostase do calcio, na manutencao do potencial de membrana do neuronio, no processo de apoptose e na formacao de radicais livres (RL). Essas caracteristicas relacionam a mitocondria com a excitotoxicidade vista na epilepsia .Lesoes do DNA mitocondrial (DNAmt) via lesao oxidativa sao vistas em varias doencas sendo presumivel seu) aparecimento na epilepsia pela presenca de RL, ja largamente documentada nessa patologia. Nosso objetivo, no presente estudo, foi avaliar o possivel envolvimento da mitocondria no processo de epileptogenese, no modelo de epilepsia do lobo temporal induzido por pilocarpina. Para tanto, nos propusemos al avaliar o aparecimento de alteracoes do DNAmt, bem como o ocorrencia del disfuncoes de proteinas da cadeia respiratoria. Delecoes ou alteracoes da quantidade das moleculas de DNAmt e disfuncoes da citocromo c oxidade e na succinato desidrogenase foram estudadas em hipocampos de ratos submetidos ao modelo de epilepsia induzida por pilocarpina, com as tecnicas de Southern Blot ,I PCR, histoquimica, Western Blot e Imunohistoquimica. Foram utilizados animais) durante a fase cronica do modelo, quando inicia-se o aparecimento de crises) espontaneas e recorrentes. A analise do DNAmt nao mostrou deplecao ou um aumento de delecoes dos DNAmt nos animais experimentais. Esses dados sugerem que danos do DNAmt nao estejam envolvidos na patogenese da epilepsiaa(au) / Mitochondria have important fuctions in intracellular calcium homeostases, maintenance of neuronal membrane potential, apoptotic signalling and in free radicals production. These features may link mitochondria to a possible role on epilepsy excitotoxicity. Mitochondrial DNA (mtDNA) damage by oxidative lesions are observed in many diseases and it is supposed to occur in epilepsy due to the well stabilished presence of free radicals in this disease. Our aim in this study was to evaluate the possible role of mitochondria in epilepy. The study was performed in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy by studying mtDNA and respiratory chain proteins abnormalities. Deletions or quantitative alterations of mtDNA and dysfuntion of cytocrome c oxidase and succinate dehydrogenase were studied with Southern Blot, polymerase chain reaction (PCR), histochemistry, imunohistochemistry and Western Blot techniques. The animals were in chronic phase of the PILO model of epilepsy when spontaneous and recurrent seizures begin to occur. No mtDNA depletion was observed and increased frequency of mtDNA damage was not detected in epileptic animals. These data do not support the involvement of mtDNA damage in the pathogenesis epilepsy. The expression and distribution of the respiratory chain proteins (COX I, COX IV, SDH) enzymes studied were similar in both groups (control and epileptic animals) in the hippocampus. Furthermore, no difference in COX activity was observed by hystochemistry. The preservation of mtDNA and respiratory chain proteins show a relative maintenance of basal metabolism in epileptic hippocampus. Such data is reinforced by previous study that show no changes in glucose utilization in the chronic phase of this same model of epilepsy. It has been reported that NA+/K+ ATPase is upregulated in epilepsy, and this enzyme is crucial to the maintenance of membrane potential. In addition, this enzyme is highly dependent of mitochondrial ATP production. Considering that NA+/K+ ATPase is upregulated in epilepsy, we would expect a propotional increase in mitochondrial activity to mantain ATPase well function. However, our data do not demonstrate this increase in activity, which could indicate abnormalities in the link between energetic need and mitochondrial function. This hypothesis could be a possible target for future studies. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-coa de cadeia longa (LCHAD) é um erro inato do metabolismo de ácidos graxos. Pacientes acometidos apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longano sangue e tecidos. A sintomatologia é bastante variada, sendo que os pacientes apresentam hepatopatia e cardiomiopatia severa, assim como retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, letargia e convulsões. Considerando que a patofisiologia do dano hepático encontrado nos pacientes com deficiência da LCHAD não está esclarecida, o presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos dos ácidos 3-hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico(3HPA) sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmentros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado (U), bem como o potencial de membrana (ΔΨm), inchamento, capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e estado redox do NAD(P) em mitocôndrias isoladas de fígado de ratos jovens. Os ácidos monocarboxílicos encontrados em maiores concentrações nos pacientes, 3HTAe 3HPA inibiram a respiração estimulada por ADP (estado 3), a desacoplada, o RCR, diminuíram o ΔΨm e o conteúdo de NAD(P)H e, em contraste, aumentaram a respiração lenta (estado 4) em mitocôndrias utilizando glutamato/malato ou sucinato como substratos. Além disso, o inibidor competitivo do translocador de nucleotídeo adenina (ANT) atractilosídeo atenuou o aumento no estado 4 provocado pelo 3HTA. Esses dados indicam que o 3HTA e o 3HPA atuam como inibidores metabólicos e desacopladores da fosforilação no fígado. Também verificamos que baixas concentrações desses ácidos graxos hidroxilados causam uma diminuição significante no ΔΨm e no conteúdo de NAD(P)H na presença de Ca2+. 3HTA e 3HPA também diminuíram a capacidade de retenção de Ca2+ e induziram inchamento em mitocôndrias. Os efeitos induzidos por 3HTA foram totalmente prevenidos pelos inibidores clássicos do poro de transição de permeabilidade (PTP) ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, um inibidor da captação de Ca2+, indicando abertura do PTP. Ademais, ditiotreitol e N-etilmaleimida não foram capazes de prevenir estes efeitos, descartando a oxidação dos grupamentos tióis do PTP como mecanismo de sua abertura. Finalmente, verificamos que o ácido dicarboxílico 3- hidroxitetradecanodioico (3HTDA), que também se acumula na deficiência da LCHAD e que é um análogo do 3HTA, não alterou os parâmetros de bioenergética mitocondrial. Em conjunto, nossos dados demonstram que os principais ácidos graxos monocarboxílicos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da LCHAD prejudicam a homeostase energética mitocondrial em fígado. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a disfunção hepática caracerística dos pacientes acometidos por essa doença. / Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencie is an inborn error of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids.Clinical presentation is characterized by a wide variety of symptoms, including severe hepatopathy and cardiomyopathy, as well as retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and developmental delay, lethargy and seizures.Considering that the pathophisiology of the hepatic damage found in LCHAD-deficient patients is not yet clear, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3- hydroxypalmitic (3HPA)on inportant parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and state uncoupled (U), as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P) redox state in isolated liver mitochondria from young rats. The monocarboxylic acids found at higher concentrations in LCHADdeficient patients, 3HTA and 3HPA, inhibited the ADP-stimulated (state 3) and uncoupled respiration, decreased ΔΨm and NAD(P)H content and, in contrast, increased resting (state 4) respiration in mitochondrial preparations supported by glutamate plus malate or succinate.Furthermore, the competitive inhibitor of adenine nucleotide translocase (ANT) atractyloside, attenuated the 3HTA-induced increase of state 4 respiration. These data indicate that 3HTA and 3HPA act as metabolic inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation in the liver.We also verified that low concentrations of these hydroxyl fatty acids caused a strong decrease of ΔΨm and NAD(P)H content in the presence of Ca2+. 3HTA and 3HPA also reduced Ca2+ retention capacity and induced swelling in mitochondria. The effects induced by 3HTA were totally prevented by the classical mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, a Ca2+ uptake blocker, indicating MPT pore opening. Furthermore, dithiothreitol and N-ethylmaleimide were not able to prevent these effects, making unlikely an oxidation of thiol groups of the MPT pore as a mechanism of its opening. Finally, the dicarboxylic 3-hydroxytetradecanodioic acid (3HTDA), which also accumulates in LCHAD deficiency and is an analogue of 3HTA, did not alter mitochondrial bioenergetics parameters. Taken together, our data demonstrate that the major monocarboxylic long chain fatty acids accumulating in LCHAD deficiency disrupt energy mitochondrial homeostasis in the liver. It is proposed that this pathomechanism may explain at least in part the hepatic alterations characteristic of the affected patients.

A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa e a principal causa de demência re lacionada a idade. Os números em crescimento de pessoas afetadas pela DA estão diretamente ligados ao aumento na expectativa de vida da população mundial. A DA, por se tratar de uma doença multifatorial, envolve fatores genéticos, moleculares e ambientais.As principais alterações fisiopatológicas, hoje alvos de estudos, são os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis, compostas pelo peptídeo beta-amilóide (Aβ). O peptídeo Aβ tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. Diversos processos estão envolvidos na formação deste peptídeo, que uma vez formado desencadeia uma cascata de eventos que envolvem alterações na sinalização celular, ativação da neuroinflamação e geração de um desbalanço na produção de espécies reativas de oxigênio nas organelas presentes nos neurônios culminando na disfunção sináptica e morte celular. Apesar do intenso estudo sobre a fisiopatologia da DA observado nas últimas décadas, ainda não existe o conhecimento completo sobre as causas e sobre o mecanismo que levam a progressão da doença. Os receptores nicotínicos estão presentes no sistema nervoso e, de uma forma geral, são responsáveis pela liberação de neurotransmissores importantes para uma diversidade de processos cognitivos. O estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial estão correlacionados a um ciclo vicioso de desequilíbrio que desempenha um importante papel na patogênese da DA. Por isto, neste trabalho procuramos avaliar o efeito da nicotina em um modelo in vitro de toxicidade do peptideo Aß em cultura organotípica de hipocampo de ratos, bem como avaliar os efeitos desta droga sobre as proteínas relacionadas com a neurodegeneração, AKT e GSK-3ß . Além disso, avaliamos as alterações mitocondriais que a nicotina ocasionou em culturas organotipicas. Para isso, as culturas foram expostas ao peptideo Aß e á nicotina concomitantemente por um período de 48h. A morte celular foi aval iada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte de células principalmente em processo de necrose. As cul turas expostas ao peptídeo Aß quando tratadas com nicotina não apresentaram prevenção da morte celular. A nicotina não teve efeito sobre a fosforilação das proteínas AKT e GS K-3ß. através da análise obtida por Western blotting. Entretanto, na análise real izada por citometria de fluxo, utilizando as sondas mitocondriais MitoTracker® e MitoSOX®, observamos um aumento na produção do ânion superóxido, bem como uma diferença na massa mitocondrial nas culturas expostas ao peptideo com nicotina. / Alzheimer's Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of age-related dementia. The growing numbers of people affected by AD are directly linked to the increase in life expectancy of the world population. The AD, because it is a multifactorial disease, involving genetic, molecular and environmental factors. The main pathophysiological changes, today object of studies, are the neurofibrillary tangles formed by the hyperphosphorylated tau protein and the senile plaques, composed of the betaamyloid peptide (Aß). The Aß peptide has been considered the main responsible for synaptic dysfunction processes, neuronal death and consequent cognitive decline in AD patients. Several processes are involved in the formation of this peptide, which once formed triggers a cascade of events that involve alterations in cell signaling, activation of neuroinflammation and generate an imbalance in the production of reactive oxygen species in the organelles present in neurons culminating in synaptic dysfunction and cell death. Despite the intense study of the pathophysiology of AD observed in recent decades, there is still no complete knowledge about the causes and the mechanisms that lead to disease progression. Nicotinic receptors are present in the nervous system and, in general, are responsible for the release of neurotransmitters important for a variety of cognitive processes. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction is correlated to a vicious circle of imbalance plays an important role in the pathogenesis of AD. Therefore, in this study we evaluated the effect of nicotine on a model in vitro toxicity of Aß peptide in organotypic culture in rat hippocampus, and to evaluate the effects of this drug on proteins related to neurodegeneration, Akt and GSK-3β. In addition, we evaluated the mitochondrial alterations that nicotine caused in organotypic cultures. For this, the cultures were exposed to the Aß-peptide and nicotine concomitantly for a period of 48h. Cell death was evaluated from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell death mainly in necrosis process. Cultures exposed to Aß peptide when treated with nicotine did not show any preventing cell death. Nicotine had no effect on the phosphorylation of Akt and GSK-3β protein, obtained through the analysis by Western blotting. However, the analysis performed by flow cytometry using the mitochondrial probe MitoTracker® and MitoSOX®, an increase in the production of superoxide anion as well as a difference in mitochondrial mass in peptide cultures exposed to nicotine.

Existe uma significativa associação entre a prevalência de doenças cardiovasculares e a síndrome metabólica. Evidências mostram que a obesidade está associada a alterações estruturais e funcionais do coração. As estatinas podem reduzir a síntese endógena de colesterol e, portanto, são utilizadas como uma importante ferramenta contra a hipercolesterolemia em pacientes obesos. O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos da rosuvastatina no metabolismo lipídico e dos carboidratos, morfometria do tecido adiposo e no remodelamento cardíaco de camundongos alimentados com uma dieta hiperlipídica. Neste trabalho foram utilizados 50 camundongos distribuidos em cinco grupos: grupo controle (alimentado com dieta padrão), grupo hiperlipídico (alimentado com dieta hipelipídica 60%), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 10 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 10 mg de rosuvastatina), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 20 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 20 mg de rosuvastatina), grupo hiperlipídico + rosuvastatina 40 (alimentado com dieta hipelipídica 60% - acrescido de 40 mg de rosuvastatina). Foram estudados os efeitos do tratamento com diferentes doses de rosuvastatina na massa corporal, metabolismo dos carboidratos e lipídios, pressão arterial, remodelamento na estrutura cardíaca e mudanças ultraestruturais no coração de camundongos C57BL / 6 machos alimentados com uma dieta hiperlipídica. O tratamento com rosuvastatina reduziu os níveis de lípidos no sangue, melhorou a resistência à insulina e diminuiu a pressão arterial dos camundongos alimentados com dieta rica em lipídeos. Além disso, atenuou o remodelamento cardíaco, diminuindo a fibrose intersticial e perivascular, e manteve a integridade morfológica mitocondrial, com menor produção de proteina desacopladora-2 (UCP2). Assim, a rosuvastatina tem efeitos benéficos sobre as alterações metabólicas dos carboidratos e lipídios, e no remodelamento cardíaco induzidas por dieta hiperlipídica. / There is a significant association between the prevalence of cardiovascular disease and metabolic syndrome. Evidence shows that obesity is associated with structural and functional changes in the heart. Statins can reduce the endogenous synthesis of cholesterol and are therefore used as an important tool against hypercholesterolemia in obese. The present work aims to study the effects of rosuvastatin in lipid and carbohydrate metabolism, adipose tissue morphometry and cardiac remodeling. In this work we studied the effects of rosuvastatin treatment on the body mass, insulin resistance, lipid profile, blood pressure, cardiac remodeling and structure and ultrastructural changes in the heart of the C57BL/6 male mice fed a high-fat diet. The rosuvastatin treatment reduced levels of blood lipids, improve insulin resistance, reduced blood pressure and body mass of high-fat mice. Furthermore, it attenuated cardiac remodelling, decreasing the interstitial and perivascular fibrosis, and maintained the integrity of mitochondrial morphology, with a lower production of UCP-2. Rosuvastatin had beneficial effects on cardiac changes induced by high-fat diet, as well as in mitochondrial morphology, thus controlled energy production to maintain cardiomyocyte integrity.