A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa e a principal causa de demência re lacionada a idade. Os números em crescimento de pessoas afetadas pela DA estão diretamente ligados ao aumento na expectativa de vida da população mundial. A DA, por se tratar de uma doença multifatorial, envolve fatores genéticos, moleculares e ambientais.As principais alterações fisiopatológicas, hoje alvos de estudos, são os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis, compostas pelo peptídeo beta-amilóide (Aβ). O peptídeo Aβ tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. Diversos processos estão envolvidos na formação deste peptídeo, que uma vez formado desencadeia uma cascata de eventos que envolvem alterações na sinalização celular, ativação da neuroinflamação e geração de um desbalanço na produção de espécies reativas de oxigênio nas organelas presentes nos neurônios culminando na disfunção sináptica e morte celular. Apesar do intenso estudo sobre a fisiopatologia da DA observado nas últimas décadas, ainda não existe o conhecimento completo sobre as causas e sobre o mecanismo que levam a progressão da doença. Os receptores nicotínicos estão presentes no sistema nervoso e, de uma forma geral, são responsáveis pela liberação de neurotransmissores importantes para uma diversidade de processos cognitivos. O estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial estão correlacionados a um ciclo vicioso de desequilíbrio que desempenha um importante papel na patogênese da DA. Por isto, neste trabalho procuramos avaliar o efeito da nicotina em um modelo in vitro de toxicidade do peptideo Aß em cultura organotípica de hipocampo de ratos, bem como avaliar os efeitos desta droga sobre as proteínas relacionadas com a neurodegeneração, AKT e GSK-3ß . Além disso, avaliamos as alterações mitocondriais que a nicotina ocasionou em culturas organotipicas. Para isso, as culturas foram expostas ao peptideo Aß e á nicotina concomitantemente por um período de 48h. A morte celular foi aval iada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte de células principalmente em processo de necrose. As cul turas expostas ao peptídeo Aß quando tratadas com nicotina não apresentaram prevenção da morte celular. A nicotina não teve efeito sobre a fosforilação das proteínas AKT e GS K-3ß. através da análise obtida por Western blotting. Entretanto, na análise real izada por citometria de fluxo, utilizando as sondas mitocondriais MitoTracker® e MitoSOX®, observamos um aumento na produção do ânion superóxido, bem como uma diferença na massa mitocondrial nas culturas expostas ao peptideo com nicotina. / Alzheimer's Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of age-related dementia. The growing numbers of people affected by AD are directly linked to the increase in life expectancy of the world population. The AD, because it is a multifactorial disease, involving genetic, molecular and environmental factors. The main pathophysiological changes, today object of studies, are the neurofibrillary tangles formed by the hyperphosphorylated tau protein and the senile plaques, composed of the betaamyloid peptide (Aß). The Aß peptide has been considered the main responsible for synaptic dysfunction processes, neuronal death and consequent cognitive decline in AD patients. Several processes are involved in the formation of this peptide, which once formed triggers a cascade of events that involve alterations in cell signaling, activation of neuroinflammation and generate an imbalance in the production of reactive oxygen species in the organelles present in neurons culminating in synaptic dysfunction and cell death. Despite the intense study of the pathophysiology of AD observed in recent decades, there is still no complete knowledge about the causes and the mechanisms that lead to disease progression. Nicotinic receptors are present in the nervous system and, in general, are responsible for the release of neurotransmitters important for a variety of cognitive processes. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction is correlated to a vicious circle of imbalance plays an important role in the pathogenesis of AD. Therefore, in this study we evaluated the effect of nicotine on a model in vitro toxicity of Aß peptide in organotypic culture in rat hippocampus, and to evaluate the effects of this drug on proteins related to neurodegeneration, Akt and GSK-3β. In addition, we evaluated the mitochondrial alterations that nicotine caused in organotypic cultures. For this, the cultures were exposed to the Aß-peptide and nicotine concomitantly for a period of 48h. Cell death was evaluated from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell death mainly in necrosis process. Cultures exposed to Aß peptide when treated with nicotine did not show any preventing cell death. Nicotine had no effect on the phosphorylation of Akt and GSK-3β protein, obtained through the analysis by Western blotting. However, the analysis performed by flow cytometry using the mitochondrial probe MitoTracker® and MitoSOX®, an increase in the production of superoxide anion as well as a difference in mitochondrial mass in peptide cultures exposed to nicotine.

A deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-coa de cadeia longa (LCHAD) é um erro inato do metabolismo de ácidos graxos. Pacientes acometidos apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longano sangue e tecidos. A sintomatologia é bastante variada, sendo que os pacientes apresentam hepatopatia e cardiomiopatia severa, assim como retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, letargia e convulsões. Considerando que a patofisiologia do dano hepático encontrado nos pacientes com deficiência da LCHAD não está esclarecida, o presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos dos ácidos 3-hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico(3HPA) sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmentros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado (U), bem como o potencial de membrana (ΔΨm), inchamento, capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e estado redox do NAD(P) em mitocôndrias isoladas de fígado de ratos jovens. Os ácidos monocarboxílicos encontrados em maiores concentrações nos pacientes, 3HTAe 3HPA inibiram a respiração estimulada por ADP (estado 3), a desacoplada, o RCR, diminuíram o ΔΨm e o conteúdo de NAD(P)H e, em contraste, aumentaram a respiração lenta (estado 4) em mitocôndrias utilizando glutamato/malato ou sucinato como substratos. Além disso, o inibidor competitivo do translocador de nucleotídeo adenina (ANT) atractilosídeo atenuou o aumento no estado 4 provocado pelo 3HTA. Esses dados indicam que o 3HTA e o 3HPA atuam como inibidores metabólicos e desacopladores da fosforilação no fígado. Também verificamos que baixas concentrações desses ácidos graxos hidroxilados causam uma diminuição significante no ΔΨm e no conteúdo de NAD(P)H na presença de Ca2+. 3HTA e 3HPA também diminuíram a capacidade de retenção de Ca2+ e induziram inchamento em mitocôndrias. Os efeitos induzidos por 3HTA foram totalmente prevenidos pelos inibidores clássicos do poro de transição de permeabilidade (PTP) ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, um inibidor da captação de Ca2+, indicando abertura do PTP. Ademais, ditiotreitol e N-etilmaleimida não foram capazes de prevenir estes efeitos, descartando a oxidação dos grupamentos tióis do PTP como mecanismo de sua abertura. Finalmente, verificamos que o ácido dicarboxílico 3- hidroxitetradecanodioico (3HTDA), que também se acumula na deficiência da LCHAD e que é um análogo do 3HTA, não alterou os parâmetros de bioenergética mitocondrial. Em conjunto, nossos dados demonstram que os principais ácidos graxos monocarboxílicos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da LCHAD prejudicam a homeostase energética mitocondrial em fígado. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a disfunção hepática caracerística dos pacientes acometidos por essa doença. / Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencie is an inborn error of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids.Clinical presentation is characterized by a wide variety of symptoms, including severe hepatopathy and cardiomyopathy, as well as retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and developmental delay, lethargy and seizures.Considering that the pathophisiology of the hepatic damage found in LCHAD-deficient patients is not yet clear, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3- hydroxypalmitic (3HPA)on inportant parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and state uncoupled (U), as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P) redox state in isolated liver mitochondria from young rats. The monocarboxylic acids found at higher concentrations in LCHADdeficient patients, 3HTA and 3HPA, inhibited the ADP-stimulated (state 3) and uncoupled respiration, decreased ΔΨm and NAD(P)H content and, in contrast, increased resting (state 4) respiration in mitochondrial preparations supported by glutamate plus malate or succinate.Furthermore, the competitive inhibitor of adenine nucleotide translocase (ANT) atractyloside, attenuated the 3HTA-induced increase of state 4 respiration. These data indicate that 3HTA and 3HPA act as metabolic inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation in the liver.We also verified that low concentrations of these hydroxyl fatty acids caused a strong decrease of ΔΨm and NAD(P)H content in the presence of Ca2+. 3HTA and 3HPA also reduced Ca2+ retention capacity and induced swelling in mitochondria. The effects induced by 3HTA were totally prevented by the classical mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, a Ca2+ uptake blocker, indicating MPT pore opening. Furthermore, dithiothreitol and N-ethylmaleimide were not able to prevent these effects, making unlikely an oxidation of thiol groups of the MPT pore as a mechanism of its opening. Finally, the dicarboxylic 3-hydroxytetradecanodioic acid (3HTDA), which also accumulates in LCHAD deficiency and is an analogue of 3HTA, did not alter mitochondrial bioenergetics parameters. Taken together, our data demonstrate that the major monocarboxylic long chain fatty acids accumulating in LCHAD deficiency disrupt energy mitochondrial homeostasis in the liver. It is proposed that this pathomechanism may explain at least in part the hepatic alterations characteristic of the affected patients.

A deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-coa de cadeia longa (LCHAD) é um erro inato do metabolismo de ácidos graxos. Pacientes acometidos apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longano sangue e tecidos. A sintomatologia é bastante variada, sendo que os pacientes apresentam hepatopatia e cardiomiopatia severa, assim como retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, letargia e convulsões. Considerando que a patofisiologia do dano hepático encontrado nos pacientes com deficiência da LCHAD não está esclarecida, o presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos dos ácidos 3-hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico(3HPA) sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmentros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado (U), bem como o potencial de membrana (ΔΨm), inchamento, capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e estado redox do NAD(P) em mitocôndrias isoladas de fígado de ratos jovens. Os ácidos monocarboxílicos encontrados em maiores concentrações nos pacientes, 3HTAe 3HPA inibiram a respiração estimulada por ADP (estado 3), a desacoplada, o RCR, diminuíram o ΔΨm e o conteúdo de NAD(P)H e, em contraste, aumentaram a respiração lenta (estado 4) em mitocôndrias utilizando glutamato/malato ou sucinato como substratos. Além disso, o inibidor competitivo do translocador de nucleotídeo adenina (ANT) atractilosídeo atenuou o aumento no estado 4 provocado pelo 3HTA. Esses dados indicam que o 3HTA e o 3HPA atuam como inibidores metabólicos e desacopladores da fosforilação no fígado. Também verificamos que baixas concentrações desses ácidos graxos hidroxilados causam uma diminuição significante no ΔΨm e no conteúdo de NAD(P)H na presença de Ca2+. 3HTA e 3HPA também diminuíram a capacidade de retenção de Ca2+ e induziram inchamento em mitocôndrias. Os efeitos induzidos por 3HTA foram totalmente prevenidos pelos inibidores clássicos do poro de transição de permeabilidade (PTP) ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, um inibidor da captação de Ca2+, indicando abertura do PTP. Ademais, ditiotreitol e N-etilmaleimida não foram capazes de prevenir estes efeitos, descartando a oxidação dos grupamentos tióis do PTP como mecanismo de sua abertura. Finalmente, verificamos que o ácido dicarboxílico 3- hidroxitetradecanodioico (3HTDA), que também se acumula na deficiência da LCHAD e que é um análogo do 3HTA, não alterou os parâmetros de bioenergética mitocondrial. Em conjunto, nossos dados demonstram que os principais ácidos graxos monocarboxílicos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da LCHAD prejudicam a homeostase energética mitocondrial em fígado. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a disfunção hepática caracerística dos pacientes acometidos por essa doença. / Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencie is an inborn error of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids.Clinical presentation is characterized by a wide variety of symptoms, including severe hepatopathy and cardiomyopathy, as well as retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and developmental delay, lethargy and seizures.Considering that the pathophisiology of the hepatic damage found in LCHAD-deficient patients is not yet clear, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3- hydroxypalmitic (3HPA)on inportant parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and state uncoupled (U), as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P) redox state in isolated liver mitochondria from young rats. The monocarboxylic acids found at higher concentrations in LCHADdeficient patients, 3HTA and 3HPA, inhibited the ADP-stimulated (state 3) and uncoupled respiration, decreased ΔΨm and NAD(P)H content and, in contrast, increased resting (state 4) respiration in mitochondrial preparations supported by glutamate plus malate or succinate.Furthermore, the competitive inhibitor of adenine nucleotide translocase (ANT) atractyloside, attenuated the 3HTA-induced increase of state 4 respiration. These data indicate that 3HTA and 3HPA act as metabolic inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation in the liver.We also verified that low concentrations of these hydroxyl fatty acids caused a strong decrease of ΔΨm and NAD(P)H content in the presence of Ca2+. 3HTA and 3HPA also reduced Ca2+ retention capacity and induced swelling in mitochondria. The effects induced by 3HTA were totally prevented by the classical mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, a Ca2+ uptake blocker, indicating MPT pore opening. Furthermore, dithiothreitol and N-ethylmaleimide were not able to prevent these effects, making unlikely an oxidation of thiol groups of the MPT pore as a mechanism of its opening. Finally, the dicarboxylic 3-hydroxytetradecanodioic acid (3HTDA), which also accumulates in LCHAD deficiency and is an analogue of 3HTA, did not alter mitochondrial bioenergetics parameters. Taken together, our data demonstrate that the major monocarboxylic long chain fatty acids accumulating in LCHAD deficiency disrupt energy mitochondrial homeostasis in the liver. It is proposed that this pathomechanism may explain at least in part the hepatic alterations characteristic of the affected patients.

As doenças neurodegenerativas (DN), incluindo doença de Alzheimer e doença de Parkinson, estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas os estudos têm apontado para mecanismos comuns de toxicidade, que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose. Assim, as mitocôndrias constituem alvos importantes para futuras estratégias de neuroproteção visando tratar, prevenir ou retardar a neurodegeneração. A biodiversidade da fauna brasileira representa uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas moléculas com (i) atividade neuroprotetora e, portanto, potencial para originar novos fármacos para o tratamento destas doenças; ou ainda com (ii) atividade neurotóxica, podendo ser utilizadas como ferramentas de estudo de mecanismos de neurotoxicidade. O presente estudo teve por objetivo investigar o possível potencial neuroprotetor e/ou neurotóxico de peptídeos de baixo peso molecular, obtidos a partir do veneno de diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops por meio da investigação dos efeitos destes compostos na função mitocondrial de cérebro de rato. Duas das frações estudadas (obtidas a partir do veneno da B. atrox e da B. jararaca) apresentaram um interessante potencial protetor contra o intumescimento osmótico mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), eventos associados à transição de permeabilidade mitocondrial e à morte celular. Por outro lado, outra fração, obtida a partir do veneno da B. pirajai, apresentou potencial neurotóxico. Estes achados podem ser úteis para estudos mecanísticos e também no estabelecimento de futuras estratégias de tratamento das doenças neurodegenerativas, tendo as mitocôndrias como alvos terapêuticos (terapia alvo). / The neurodegenerative diseases, including Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases, are among the main causes of morbidity and mortality in Western countries. A definitive treatment for these neuropathies has not yet been found, but studies have indicated common mechanisms of toxicity, including mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis. Therefore, mitochondria represent important targets for the future neuroprotective strategies aimed to treat, prevent or delay the neurodegeneration. The Brazilian fauna biodiversity represents a promising and under explored source of new molecules with (i) neuroprotective activity and potential to originate new drugs for the treatment of these diseases; or yet, with (ii) neurotoxic activity, representing tools to study neurotoxicity mechanisms. The present study aimed to investigate the possible neuroprotective and/or neurotoxic potential of low-molecular-mass peptides extracted from the venom of different species of Bothrops genus snakes by investigating their effects on rat brain mitochondrial function. Two of the studied fractions (from B. atrox and B. jararaca venoms) presented an interesting protective potential against both the mitochondrial swelling and reactive oxygen species (ROS) production, events associated with mitochondrial permeability transition and cell death. On the other hand, other fraction (from B. pirajai venom) presented a neurotoxic potential. These findings might be useful for mechanistic studies and also for the establishment of future strategies of neurodegenerative diseases treatment, using mitochondria as therapeutic targets (targeted therapy).

As doenças neurodegenerativas (DN) estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas os estudos têm indicado mecanismos comuns de toxicidade que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose. Assim, as mitocôndrias constituem alvos importantes para futuras estratégias de neuroproteção a fim de tratar, prevenir ou até mesmo retardar a neurodegeneração. Neste contexto, o canabidiol (CBD), um constituinte não psicoativo da Cannabis sativa e cuja propriedade neuroprotetora tem sido sugerida por diferentes estudos, surge como uma alternativa bastante promissora. Diferentes mecanismos moleculares podem estar envolvidos na neuroproteção exercida pelo CBD. Embora o potencial efeito benéfico do canabidiol com relação às doenças neurodegenerativas já tenha sido sugerido, não há ainda estudos que abordem precisamente os mecanismos de proteção contra a toxicidade mitocondrial cerebral, evento chave no processo neurodegenerativo. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do CBD em mitocôndrias cerebrais de rato, bem como possíveis mecanismos de neuroproteção. Foram avaliados os seguintes parâmetros: função mitocondrial, estresse oxidativo mitocondrial e transição de permeabilidade de membrana mitocondrial (TPMM). Os resultados obtidos sugerem que o canabidiol é capaz de proteger as mitocôndrias cerebrais contra o intumescimento osmótico induzido por cálcio/fosfato, contra a produção de H2O2 induzida por terc-butil hidroperóxido e contra a peroxidação lipídica induzida por Fe2+ e citrato. A captação mitocondrial de cálcio e a capacidade fosforilativa não foram afetadas. / Neurodegenerative diseases (ND) are among the leading causes of mortality and morbidity in Western countries. There is not a definitive treatment for these neuropathies, but studies have indicated mechanisms of toxicity which include mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis. Therefore, mitochondria are important targets for future neuroprotective strategies to treat, prevent or even slow the neurodegeneration. In this context, cannabidiol (CBD), a constituent of non-psychoactive Cannabis sativa and whose neuroprotective property has been suggested by different studies, emerges as a promising alternative. Different molecular mechanisms may be involved in the neuroprotection exerted by CBD. Although the potential beneficial effects of cannabidiol in relation to neurodegenerative diseases has already been suggested, there are no studies addressing specifically the mechanisms of protection against mitochondrial toxicity brain, a key event in the neurodegenerative process. This study aimed to investigate the effects of CBD on rat brain mitochondria, as well as the mechanisms of neuroprotection. The following parameters were evaluated: mitochondrial function, mitochondrial oxidative stress and permeability transition of the mitochondrial membrane (MPT). The results suggest that cannabidiol can protect brain mitochondria against: the osmotic swelling induced by calcium/phosphate, the production of H2O2 induced by tert-butyl hydroperoxide and the lipid peroxidation induced by Fe2+ and citrate. The mitochondrial calcium uptake and phosphorylative capacity were not affected.

Processos que envolvem sensibilização são extremamente importantes para diversas áreas do conhecimento, incluindo a biologia, a química e a medicina. A aplicação de sensibilização em medicina tem se destacado, especialmente, em face de uma modalidade alternativa de tratamento de câncer denominada terapia fotodinâmica (TFD). Uma das linhas de pesquisas fundamentais para a evolução da terapia fotodinâmica é o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (Fs) com composição definida, que absorvam na janela terapêutica (600- 800nm) e que apresentem maior eficiência na indução de apoptose. Os Fs que apresentam cargas positivas e que são relativamente lipofílicos, permeiam membranas e são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, que tem papel central no controle da vida e da morte celular. Neste trabalho foi realizado um estudo da influência dos grupos funcionais na atividade dos Fs, através da funcionalização da protoporfirina IX (Pp IX). Foram estudadas três diferentes rotas sintéticas. Na rota I (esquema 14), utilizou-se como composto de partida a Hematoporfina IX (Hp IX), a qual foi funcionalizada com grupos aminas e amidas, respectivamente, nas hidroxilas e nas carboxilas. Esta rota forneceu baixo rendimento global (20%), e compostos de difícil purificação, no entanto obteve-se 1 composto puro. Na rota II (esquema 15), utilizou-se como composto de partida a Pp IX, a qual foi funcionalizada nos grupos vinílicos com grupos aminas. Obteve-se 4 compostos, com rendimento global de reação superior a 50%, mas observou-se que ocorre uma reação de eliminação que impede a quartenarização das aminas localizadas nas posições α ao anel porfirínico. Na rota III (esquema 16), os grupos carboxílicos de Pp IX foram transformados em cloreto de ácido, que foram substituídos por compostos bifuncionais, amina primária e um segundo grupo. Esta rota possibilitou a obtenção de 7 compostos, inclusive compostos quaternários com rendimento global de reação superior a 70%. Dois derivados da clorofilina, que apresentam a banda QIV com um ε elevado em 650nm, foram também sintetizados. Todos os compostos, foram caracterizados estruturalmente de forma inequívoca através do espectro eletrônico (UV-vis e fluorescência), vibracional no infravermelho, RMN de 1H e 13C (1D e 2D) e espectrometria de massa. A série de compostos obtidos permitiu um estudo da relação entre a estrutura química do Fs com a sua fotoatividade. As propriedades fotofísicas foram caracterizadas por espectro de absorção e de emissão, fotólise de relâmpago a laser, eficiência quântica de fluorescência e de geração de oxigênio singlete. Estas determinações indicaram que as propriedades fotofísicas dos Fs não foram consideravelmente alteradas no processo sintético. Foi determinada a formação de agregados em solução aquosa e o equilíbrio monômero agregado foi deslocado no sentido da formação do monômero na presença de micelas de CTAB e SDS e de soro fetal. Observou-se, que a contribuição para desagregação é mais eficiente quando a carga da micela é oposta à do Fs. Foi determinado o coeficiente de partição octanol/água (logPo/a) em função do pH e constatou-se que os compostos que têm carga líquida apresentam valores de logPo/a entre -1 e 1 na faixa de pH entre 3 e 10. A incorporação destes compostos em lipossomos, seguiu perfil esperado considerando a carga, o logPo/a e a característica anfifílica dos compostos sintetizadas. Genericamente a eficiência de morte celular fotoinduzida seguiu o perfil de incorporação das drogas em células HeLa. Os estudos comparativos da citolocalização foram realizados por co-encubação das porfirinas sintetizadas com rodamina 123 (Rd), que se concentra em mitocôndrias. A localização em organelas citoplasmáticas foi determinada através de imagens obtidas por microscopia de fluorescência confocal. A sobreposição da emissão da Rd foi de 80% e 31% com o composto catiônico PpNpNI e aniônico PpNetPO3, respectivamente, comprovando a localização mitocondrial do composto positivo. / Processes that involve sensitization are extremely important for several areas of knowledge, including biology, chemistry and medicine. The application of sensitization in medicine is especially important, in face of an alternative modality of cancer treatment called Photodynamic Therapy (PDT). One of the lines of basic research important for the evolution of PDT is the development of new photosensitizers (PS) with defined composition, that absorb in the therapeutical window (600-800nm) and that present greater efficiency in the induction of apoptosis. Positively charged PS with the proper lipophilic/hidrophilic balance permeate membranes and are attracted by the negative potential of mitochondria, which is an organelle that has central roles in the control of cell life and death. In this work the influence of the functional groups in the activity of PS was carried out, through the functionalization of protoporphyrin IX (Pp IX). Three different synthetic routes were used. In route I (scheme 14), Hematoporphyrin IX (Hp IX), was used as departure compound and it was modified with amino and amide groups in hydroxyls and carboxyls, respectively. We found low yield in the synthetic (20%) and purification steps. However 1 pure PS was obtained. In route II (scheme 15), Pp IX was used as departure compound, which was modified in the vinilic groups with amino groups. We obtained 4 compounds, with global yield superior than 50%, but it was observed that an elimination reaction occurs that hinders the quarternization of the amino groups located in position α to the porphyrin ring. Into route III (scheme 16), the carboxilic groups of Pp IX had been transformed into chloride acid, which was substituted by bi- functional groups, primary amine in one side and another group in the other. This route made it possible to obtain 7 compounds, including quaternary ammonium compounds with global yield superior than 70%. Two derivatives of chlorophyllin, that present QIV band with large extinction coefficient in 650nm, also were synthesized. All compounds were characterized structurally through the electronic and vibrational spectra (UV-vis and fluorescence, IR), RMN of 1H and 13C (1D and 2D) and mass spectrometry. This series of compounds allowed us to study the relation between the chemical structure of the Fs with its photoactivity. The photophysical properties were characterized by emission and absorption spectra, laser flash photolysis, fluorescence emission in the visible and NIR regions (generation of singlet oxygen). These determinations indicated that the photophysical properties of the PS were not modified in the synthetic process. The formation of aggregates were characterized in aqueous solution and the balance between aggregate and monomer species was dislocated in the direction of the formation of monomers in the presence of CTAB, SDS micelles and fetal serum. It was observed, that the disaggregating efficient is larger with micelles that have the opposite charges to that of the PS. The Octanol water partition coefficient (logPo/a), was determined as a function of pH. logPo/a values between -1 and 1 were observed for charged PS in the pH range of 3-10. The incorporation of these compounds in liposomes, followed the expected profile considering the charge, logPo/a and the amphifilic nature. Generically, the photoinduced cell death efficiency followed the profile of incorporation of the PS in HeLa cells. Comparative studies of cytolocalization were carried out by co-incubation of the cells with porphyrins and Rhodamine 123 (Rd), which localizes in mitochondria. The localization in cytoplasmic organelles was determined through fluorescence confocal microscopy images. The overlapping emission of the Rd was of 80% and 31% with the cationic PpNpNI and the anionic PpNetPO3 compounds, respectively, proving the mitochondrial localization of the positive PS.

A coenzima Q transporta elétrons das NADH e succinato desidrogenase para o complexo bc1 da cadeia respiratória mitocondrial. Há dez produtos gênicos conhecidos em seu metabolismo; este trabalho foca o último a ser descrito: COQ10. Considerando a presença de coenzima Q no interior de células contendo este gene inativo, verificamos a atividade respiratória da coenzima Q em mutantes coq10. Através de inibidores do ciclo da coenzima Q no interior do complexo III da cadeia respiratória mitocondrial (antimicina A e mixotiazol) na linhagem coq10, notou-se sua resposta a antimicina A, mas não a mixotiazol, sugerindo a existência de semiquinonas, que também foram confirmadas em testes de ressonância paramagnética eletrônica. O possível transporte e distribuição da coenzima Q por Coq10p foi estudado através de mutações sítio-dirigidas em posições críticas de um túnel de ligação existente em sua estrutura modelar, bem como por análise de super-expressão da proteína. Este trabalho confirma o papel central de Coq10p no metabolismo respiratório. / Coenzyme Q transports electrons from NADH and succinate dehydrogenase to the bc1 complex of the mitochondrial respiratory chain. Ten gene products are involved in coenzyme Q metabolism. This work focuses on the last gene to be described: COQ10. Considering the presence of coenzyme Q in the interior of cells containing this gene inactive, we analyzed the respiratory activity of coenzyme Q in coq10 mutants. By using Q cycle inhibitors, in the interior of the complex III of mitochondrial respiratory chain (antimycin A and mixotiazol), in coq10 lineage, it was noted the response to antimycin A, but not mixotiazol, suggesting the existence of semiquinones, which were also confirmed in tests of electron paramagnetic resonance. The possible transmission and distribution of coenzyme Q by Coq10p was studied by site-directed mutagenesis at critical positions of a tunnel present in the molecular model structure, as well as analysis of over-expression of the protein. This study confirms the central role of Coq10p in respiratory metabolism.

A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa, cujo aparecimento pode estar ligado a mutações ou alterações na expressão do gene SNCA, o qual codifica a proteína a-sinucleína. A expressão do gene em Saccharomyces cerevisiae produz fenótipos típicos de células parkinsonianas, como a formação de corpos de Lewy, que levam a um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mitocôndria. Assim, a produção de melatonina, um antioxidante natural, poderia ser um possível tratamento para a expressão do de SNCA. Aqui, mostramos que a produção de a-sinucleína é prejudicial ao crescimento e à respiração de leveduras, fenótipo semelhante ao desafio com o agente oxidante menadiona. A produção ou suplementação farmacológica de melatonina possui efeito protetor, conferindo vantagem em meio seletivo para atividade respiratória, melhorando a função mitocondrial de leveduras parkinsonianas. Nossos resultados apontam para um papel promissor da melatonina na proteção das células contra danos oxidativos da produção de a-sinucleína em leveduras. / Parkinson\'s disease is a progressive neurodegenerative disorder often linked to mutation or expression alteration of the SNCA gene that encodes the a-synuclein (a-syn) protein. SNCA expression in Saccharomyces cerevisiae leads to deposition Lewy bodies that increase mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, one of the hallmarks of the disease. Hence, a possible treatment would be ROS neutralization through natural antioxidants, such as melatonin. Here we show that a-syn production is detrimental to yeast growth and respiration, similar to the phenotype observed during menadione oxidative challenge. Melatonin production or pharmacological supplementation confers antioxidant protection against oxidative agents, improving mitochondrial respiratory parameters from parkinsonian yeast grown with melatonin. Our studies point out to a promising role of melatonin in protecting yeast against a-syn and other species oxidative damage.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.

A prolina é convertida em glutamato através de dois passos de oxidorredução. Primeiro, prolina é oxidada em D1-pirrolina-5-carboxilato (P5C) que é convertido em glutamato pela TcP5CDH. Neste trabalho demonstrou-se que a enzima TcP5CDH catalisa a oxidação irreversível de gGSA formando glutamato e NADH/NADPH. A TcP5CDH forma um hexâmero que interage com a membrana interna mitocondrial. Os elétrons a partir de NADH abastecem a cadeia transportadora de elétrons para a síntese de ATP. Além disso vimos que a TcP5CDH é regulada positivamente nos estágios infectivos do parasita e, quando esta é induzida pela inserção de uma cópia ectópica, os mutantes apresentam mudanças morfológicas e alterações na expressão da TcGP82. O DSF, reportado como inibidor de aldeído desidrogenasses, interfere na atividade da TcP5CDH, bem como exibiu um efeito tripanocida. Ensaios de RNAi para a TbP5CDH e a análise da expressão desta enzima nas formas do parasita presentes na mosca tsé-tsé também foram discutidos. Os nossos dados reforçam a relevância bioquímica da via prolina-glutamato em T. cruzi, e constituem as primeiras evidências sobre a ocorrência do metabolismo de P5C nessas espécies de tripanossomatídeos. / Proline is converted into glutamate through two oxidorreduction steps. First, prolina is oxidized into D1-pyrroline-5-carboxylate (P5C), which is further converted in glutamate by TcP5CDH. In this work we demonstrate that TcP5CDH catalyzes irreversibly the oxidation of gGSA rendering glutamate and NADH/NADPH. The TcP5CDH undergoes a hexameric conformation interacting with inner mitochondrial membranes. Electrons from NADH fed electron respiratory chain for ATP synthesis. Moreover, we show that TcP5CDH is up regulated in infective stages (M e T). When an additional copy of TcP5CDH was ectopically introduced into parasites, mutant cells exhibited morphological changes and alterations in TcGP82. O DSF, reported as inhibitor of aldehyde dehydrogenases, interferes with TcP5CDH, as well as exhibited a trypanocidal effect. RNAi silencing assays for TbP5CDH and developmental expression of this enzyme throughout main insect stages within tsetse fly were also addressed. Our data support biochemical relevance of proline-glutamate pathway in T. cruzi, and constitute first evidences regarding occurrence of P5C metabolism over these trypanosomatid species.