Os éteres de bifenilas polibromados (PBDEs) são largamente usados como retardadores de chama e têm sido detectados no sangue humano, tecido adiposo e leite materno devido às suas propriedades físico-químicas e bioacumuladoras e à sua elevada persistência no meio ambiente. Muitos estudos têm relatado toxicidade hepática relacionada à exposição aos PBDEs. Como efeitos citotóxicos são frequentemente associados à disfunção mitocondrial,no presente estudo, investigamos a toxicidade do BDE-47 em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Nos seguintes parâmetros: potencial de membrana mitocondrial, consumo de oxigênio, interação com a membrana mitocondrial, liberação de cálcio, inchamento mitocondrial e os níveis de ATP da suspensão mitocondrial com a finalidade de observar a capacidade do composto em interferir com a bioenergética da organela. Avaliou-se ainda a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), dos níveis de GSH/GSSG, níveis mitocondriais de grupos sulfidrila de proteínas e níveis mitocondriais de NAD(P)H com o intuito de analisar o estado redox mitocondrial. Os congêneres BDE-47 e BDE-99 foram avaliados em concentrações que variaram entre 0,1 e 50 ?mol/L. Os dois congêneres de PBDEsapresentaram toxicidade mitocondrial afetando todos os parâmetros que avaliam a bioenergética mitocondrial culminandoum uma depleção do ATP. Por outro lado, nos ensaios de avaliação do estresse oxidativo os PBDEs estudados não demonstraram qualquer efeito, no entanto, afetaram a cadeia respiratória mitocondrial, o que normalmente reflete em um acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Estes resultados são explicados pelo mecanismo de ação destes compostos como retardante de chama, pois durante a combustão os retardantes de chama bromados realizam a neutralização de radicais livres (OHo e Ho). Conclui-se assim que os PBDEs podem levar à disfunção bioenergética e assim induzir a morte celular pela diminuição do ATP. Observou-se ainda que BDE-47 apresentou maior toxicidade do que o BDE-99 sobre os parâmetros estudados. / Polybrominated biphenyls ethers (PBDE) , widely used as flame retardants, have been detected in human blood, adipose tissue and breast milk due to their physicochemical and high bioaccumulative properties and environmental persistence. Many studies have reported liver toxicity related to exposure to PBDEs. As cytotoxic effects are often associated with mitochondrial dysfunction,in the present study, we investigated the toxicity of the BDE-47 and BDE-99 on isolated rat liver mitochondria. Assessing mitochondrial membrane potential, oxygen consumption, interaction with the mitochondrial membrane, calcium release, mitochondrial swelling and ATP levels of the mitochondrial suspension in order to observe the ability of the compounds to interfere with the bioenergetic organelle, and the formation of reactive oxygen species (ROS), GSH/GSSG levels, mitochondrial sulfhydryl groups and levels of mitochondrial NAD(P)H in order to analyze mitochondrial redox state. The congeners BDE-47 and BDE -99 were evaluated at concentrations ranging between 0.1 and 50 ?mol/L. Both PBDEs congeners showed mitochondrial toxicity affecting all parameters that assess mitochondrial bioenergetics and culminating with ATP depletion. On the other hand, no effect was observed in tests assessing oxidative stress, although they were able to inhibit the mitochondrial respiratory chain, which is usually reflected in an accumulation of reactive oxygen species. These results are explained by the mechanism of action of this compounds as flame retardants, because during the combustion brominated flame retardants perform the neutralization of free radicals (OHo and Ho). It follows that PBDEs can lead to mitochondrial dysfunction and thus induce bioenergetic cell death. It was also observed that The BDE-47 showed higher toxicity than BDE-99 in the studied model

O alto consumo de dietas hiperpalatéveis (HP) ricas em lipídios e carboidratos simples associado a hábitos sedentários são fatores que contribuem para o desenvolvimento de sobrepeso e obesidade. Estas alterações, promovem um estado proinflamatório, causam resistência periférica à insulina e ainda prejudicam o metabolismo cerebral. A glicose é considerada o principal substrato energético para o cérebro. No entanto, em condições de alta demanda energética outros substratos como corpos cetônicos e lactato, por exemplo, podem servir como alternativa energética. A teoria da lançadeira de lactato astrócito-neurônio (do inglês ANLS) propõe que o aumento da captação da glutamato pelos astrócitos aumenta a atividade glicolitica e a produção de lactato, que por sua vez é exportado dos astrócitos para o espaço extracelular via transportadores de monocarboxilados (MCTs) do tipo 1 e 4. Os transportadores MCT do tipo 2 presentes nos neurônios internalizam o lactato para que ele seja convertido em piruvato. A enzima piruvato desidrogenase (PDH) converte o piruvato em acetil-CoA dentro da matriz mitocondrial. Sendo assim, o lactato e outras substâncias em equilíbrio com o piruvato são direcionados para o metabolismo oxidativo. Assim, a PDH conecta o metabolismo citosólico e mitocondrial. Por outro lado, o aumento do metabolismo oxidativo é associado com o aumento de vazamento de prótons e com a produção de peróxido de hidrogênio pela mitocôndria. Consequentemente, pode haver uma menor produção de ATP pela mitocôndria. Neste estudo, os efeitos de uma dieta hiperpalatável (HP) e do exercício físico em parâmetros metabólicos no hipocampo e na memória foram investigados. Foram avaliados: os níveis de lactato, o imunoconteúdo dos MCTs e da PDH e atividade mitocondrial no hipocampo de camundongos. Camundongos C57BJ machos com 30 dias receberam uma dieta HP durante cinco meses e, praticaram atividade física voluntária durante o último mês. Os grupos foram: CDS (dieta controle sedentário), CDE (dieta controle exercício), HPS (dieta HP sedentário) e HPE (dieta HP exercício), (n=15 animais/grupo). Os resultados mostraram um aumento no imunoconteúdo de MCT 1 e 4 causados pela dieta e pelo exercício físico. O exercício físico causou um aumento na expressão de PDH. A expressão do MCT2 não apresentou diferença significativa entre os grupos. Não foram observadas alterações na memória no teste do Y-maze. No entanto, houve um aumento no nível de lactato em microdialisado de hipocampo no grupo HPE após a exposição ao teste. Não foi observada diferença significativa no metabolismo mitocondrial basal, e nem no potencial de membrana mitocondrial. A ativação do complexo II mitocondrial pelo succinato aumentou a produção de H2O2 no grupo HPS. Esse efeito foi revertido pelo exercício físico. Os resultados demonstram que o exercício e a dieta HP aumentaram a expressão dos MCTs 1 e 4, enquanto que a expressão de PDH apenas aumentou pelo exercício. Isto sugere uma adaptação da maquinaria metabólica hipocampal em resposta a estes estímulos ambientais. / The high consumption of saturated fats and simple sugar diets associated with sedentary habits are factors that contribute to the development of overweight and obesity. These consequences produce a pro-inflammatory state, resulting in periphery insulin resistance and damage the cerebral metabolism. The glucose is considered to be the main energetic substrate to the brain, other particular substrates, like ketonic bodies and lactate, may work as alternative energy sources during moments of high energetic demand. The theory of Astrocyte-Neuron Lactate Shuttle suggests that the increased uptake of glutamate by the astrocyte enhance the glycolytic activity and the production of lactate, which is exported from the astrocyte to the extracellular space via monocarboxylate transporters (MCTs) type 1 and 4. The MCTs type 2 residing inside the neurons accumulates lactate, which is converted into pyruvate. Furthermore, the dehydrogenase pyruvate enzyme (PDH) convert the pyruvate to Acetyl-CoA inside the mitochondrial matrix. Thus, the lactate and other substances in equilibrium are directed to the oxidative metabolism. This way, the PDH connects the cytosolic and mitochondrial metabolism. On the other hand, the increased oxidative metabolism is associated with the leakage of protons and with the hydrogen peroxide production by the mitochondria. Consequently, the ATP production might be reduced. In this study, the effects of a palatable diet and physical exercise in metabolic parameters in the hippocampus and memory were investigated. Were evaluated: lactate levels, the expression of MCTs and PDH and mitochondrial activity in the hippocampus. Male C57BJ mice with 30 days received a HP diet for five months and practiced voluntary physical activity during the last month. The groups were: CDS (control diet sedentary), CDE (control diet exercise), HPS (HP diet sedentary) and HPE (HP diet exercise), (n = 15 animals / group). The results showed an increase in immunocontent of MCT 1 and 4 caused by diet and exercise. The physical exercise caused an increase in PDH expression. The expression of MCT2 had no relevant impact among the groups. No changes were observed in memory in the Y-maze test even though it was observed an increase in lactate levels in hippocampal microdialysate of the HPE group after the exposure to test. There was no significant difference in basal mitochondrial metabolism nor in the mitochondrial membrane potential. The activation of the mitochondrial complex II by succinate increased H2O2 production in the HPS group. This effect was reversed by exercise. The results show that the exercise and the HP diet increased the expression of MCTs 1 and 4, while the PDH expression only increased by exercise. This suggests an adaptation of the hippocampal metabolic machinery in response to these environmental stimuli.

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

O alto consumo de dietas hiperpalatéveis (HP) ricas em lipídios e carboidratos simples associado a hábitos sedentários são fatores que contribuem para o desenvolvimento de sobrepeso e obesidade. Estas alterações, promovem um estado proinflamatório, causam resistência periférica à insulina e ainda prejudicam o metabolismo cerebral. A glicose é considerada o principal substrato energético para o cérebro. No entanto, em condições de alta demanda energética outros substratos como corpos cetônicos e lactato, por exemplo, podem servir como alternativa energética. A teoria da lançadeira de lactato astrócito-neurônio (do inglês ANLS) propõe que o aumento da captação da glutamato pelos astrócitos aumenta a atividade glicolitica e a produção de lactato, que por sua vez é exportado dos astrócitos para o espaço extracelular via transportadores de monocarboxilados (MCTs) do tipo 1 e 4. Os transportadores MCT do tipo 2 presentes nos neurônios internalizam o lactato para que ele seja convertido em piruvato. A enzima piruvato desidrogenase (PDH) converte o piruvato em acetil-CoA dentro da matriz mitocondrial. Sendo assim, o lactato e outras substâncias em equilíbrio com o piruvato são direcionados para o metabolismo oxidativo. Assim, a PDH conecta o metabolismo citosólico e mitocondrial. Por outro lado, o aumento do metabolismo oxidativo é associado com o aumento de vazamento de prótons e com a produção de peróxido de hidrogênio pela mitocôndria. Consequentemente, pode haver uma menor produção de ATP pela mitocôndria. Neste estudo, os efeitos de uma dieta hiperpalatável (HP) e do exercício físico em parâmetros metabólicos no hipocampo e na memória foram investigados. Foram avaliados: os níveis de lactato, o imunoconteúdo dos MCTs e da PDH e atividade mitocondrial no hipocampo de camundongos. Camundongos C57BJ machos com 30 dias receberam uma dieta HP durante cinco meses e, praticaram atividade física voluntária durante o último mês. Os grupos foram: CDS (dieta controle sedentário), CDE (dieta controle exercício), HPS (dieta HP sedentário) e HPE (dieta HP exercício), (n=15 animais/grupo). Os resultados mostraram um aumento no imunoconteúdo de MCT 1 e 4 causados pela dieta e pelo exercício físico. O exercício físico causou um aumento na expressão de PDH. A expressão do MCT2 não apresentou diferença significativa entre os grupos. Não foram observadas alterações na memória no teste do Y-maze. No entanto, houve um aumento no nível de lactato em microdialisado de hipocampo no grupo HPE após a exposição ao teste. Não foi observada diferença significativa no metabolismo mitocondrial basal, e nem no potencial de membrana mitocondrial. A ativação do complexo II mitocondrial pelo succinato aumentou a produção de H2O2 no grupo HPS. Esse efeito foi revertido pelo exercício físico. Os resultados demonstram que o exercício e a dieta HP aumentaram a expressão dos MCTs 1 e 4, enquanto que a expressão de PDH apenas aumentou pelo exercício. Isto sugere uma adaptação da maquinaria metabólica hipocampal em resposta a estes estímulos ambientais. / The high consumption of saturated fats and simple sugar diets associated with sedentary habits are factors that contribute to the development of overweight and obesity. These consequences produce a pro-inflammatory state, resulting in periphery insulin resistance and damage the cerebral metabolism. The glucose is considered to be the main energetic substrate to the brain, other particular substrates, like ketonic bodies and lactate, may work as alternative energy sources during moments of high energetic demand. The theory of Astrocyte-Neuron Lactate Shuttle suggests that the increased uptake of glutamate by the astrocyte enhance the glycolytic activity and the production of lactate, which is exported from the astrocyte to the extracellular space via monocarboxylate transporters (MCTs) type 1 and 4. The MCTs type 2 residing inside the neurons accumulates lactate, which is converted into pyruvate. Furthermore, the dehydrogenase pyruvate enzyme (PDH) convert the pyruvate to Acetyl-CoA inside the mitochondrial matrix. Thus, the lactate and other substances in equilibrium are directed to the oxidative metabolism. This way, the PDH connects the cytosolic and mitochondrial metabolism. On the other hand, the increased oxidative metabolism is associated with the leakage of protons and with the hydrogen peroxide production by the mitochondria. Consequently, the ATP production might be reduced. In this study, the effects of a palatable diet and physical exercise in metabolic parameters in the hippocampus and memory were investigated. Were evaluated: lactate levels, the expression of MCTs and PDH and mitochondrial activity in the hippocampus. Male C57BJ mice with 30 days received a HP diet for five months and practiced voluntary physical activity during the last month. The groups were: CDS (control diet sedentary), CDE (control diet exercise), HPS (HP diet sedentary) and HPE (HP diet exercise), (n = 15 animals / group). The results showed an increase in immunocontent of MCT 1 and 4 caused by diet and exercise. The physical exercise caused an increase in PDH expression. The expression of MCT2 had no relevant impact among the groups. No changes were observed in memory in the Y-maze test even though it was observed an increase in lactate levels in hippocampal microdialysate of the HPE group after the exposure to test. There was no significant difference in basal mitochondrial metabolism nor in the mitochondrial membrane potential. The activation of the mitochondrial complex II by succinate increased H2O2 production in the HPS group. This effect was reversed by exercise. The results show that the exercise and the HP diet increased the expression of MCTs 1 and 4, while the PDH expression only increased by exercise. This suggests an adaptation of the hippocampal metabolic machinery in response to these environmental stimuli.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica é uma das causas mais frequentes de lesões graves com comprometimento crônico das capacidades neurológicas e também de óbito neonatal do mundo. A HI cerebral resulta em alterações hemodinâmicas, bioquímicas e neurofisiológicas como uma consequência direta da falta de oxigênio e glicose. Esses processos podem levar a um dano cerebral por meio da ativação de mecanismos citotóxicos e apoptóticos, que causam prejuízo e morte à célula. Recentemente, alguns estudos mostraram que os danos gerados pela HI neonatal apresentam dimorfismo sexual. Na presente tese, foram avaliados os efeitos da HI neonatal sobre parâmetros de estresse oxidativo e de dano celular após a lesão encefálica em machos e fêmeas a fim de se detectar a contribuição do dimorfismo sexual para a lesão. Foi observado que a HI aumentou a produção de radicais livres causando peroxidação lipídica, e também aumentou a atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase (1h e 2h após a HI). Além disso, a HI inibiu a atividade da enzima Na+, K+-ATPase imediatamente após a lesão. Estes dados demonstram que a HI foi capaz de induzir o estresse oxidativo e levar à perda de homeostase celular através da alteração no controle da bomba de Na+ e K+ no encéfalo dos neonatos após a lesão. Tendo em vista que a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) na célula nós investigamos os efeitos da HI sobre a função mitocondrial. Machos e fêmeas expostos à HI apresentaram diminuição na atividade do complexo II da cadeia respiratória em hipocampo, além de diminuição da massa e do potencial de membrana (Δψ) mitocondrial tanto no córtex quanto no hipocampo, 2h após o insulto. Por outro lado, em 18h, a atividade dos complexos (I-III, II e IV) da cadeia respiratória mostrou uma inibição severa que foi acompanhada de diminuição de massa e Δψ mitocondrial em ambos os sexos, exceto pelo fato dos machos não apresentarem diminuição na massa mitocondrial. Esses dados mostram que a formação de espécies reativas bem como a peroxidação lipídica ocorre provavelmente devido à inibição da atividade dos complexos da cadeia respiratória. Tão importante quanto a disfunção mitocondrial induzida pela HI, os resultados apontam a presença de dimorfismo sexual neste parâmetro avaliado, uma vez que as fêmeas, além de apresentarem uma atividade dos complexos da cadeia respiratória per se maior quando comparadas aos machos, elas mostraram-se mais vulneráveis ao dano da HI. Com a finalidade de identificar a possível contribuição da autofagia para as diferentes alterações mitocondriais encontradas em machos e fêmeas, a atividade autofágica foi mensurada nos neonatos 18h após a lesão. Nós constatamos que as alterações encontradas – estresse oxidativo e disfunção mitocondrial – foram capazes de induzir a atividade autofágica. Entretanto esta se manifestou de forma distinta em córtex e hipocampo e também de maneira diferente em machos e fêmeas. No córtex, as fêmeas submetidas à HI tiveram aumento no número de autofagossomos (ativação da autofagia), porém diminuição dos autolisossomos, demonstrando uma possível inibição de algum passo final do processo. Já no hipocampo, os machos submetidos à HI tiveram indução da autofagia e as fêmeas apresentaram um aumento per se da atividade autofágica tanto nos animais controle quanto nos HI. É possível que o aumento das EROs pela cadeia respiratória e a perda de Δψ mitocondrial tenham induzido a autofagia após a lesão causada pela HI no encéfalo dos neonatos. Essas diferenças sexo-específicas são importantes não somente para entendermos o mecanismo de dano causado pelo insulto, mas também para direcionarmos os estudos sobre as estratégias terapêuticas de acordo com o sexo do indivíduo afetado. / Brain hypoxia-ischemia (HI) is one of the most common causes of severe chronic impairment of neurological abilities and also neonatal death in the world. Brain HI results in hemodynamic, biochemical and neurophysiological changes as a direct consequence of oxygen and glucose absence. These processes can lead to brain damage through activation of cytotoxic and apoptotic mechanisms, which cause injury and death to the cell. Recently, some studies have shown that the damage caused by neonatal HI presents sexual dimorphism. In this thesis, it was evaluated the effects of neonatal HI on oxidative stress parameters and cell damage after brain lesion in males and females to verify sexual dimorphism contribution to the lesion. It was observed that HI increased free radicals production leading to lipid peroxidation and also increased superoxide dismutase activity (1h and 2h after HI). Besides, HI inhibited Na+, K+-ATPase activity immediately after injury. These data demonstrated that HI was able to induce oxidative stress and lead to cell homeostase loss through modifications on Na+ and K+ pump control in neonatal brain after injury. Considering that mitochondria are the main source of reactive oxygen species (ROS) in cell we investigated the effects of HI on mitochondrial function. Males and females exposed to HI showed a decrease in complex II activity of hippocampal respiratory chain in addition to diminished mass and mitochondrial membrane potential (Δψ) in both cortex and hippocampus, 2h after insult. On the other hand, at 18h activity of respiratory chain complexes (I-III, II e IV) showed a severe inhibition that was accompanied by a decrease of mitochondrial mass and Δψ in both sexes, except that males do not show decrease in mitochondrial mass. These data demonstrated that reactive species formation and lipid peroxidation probably occur due to inhibition of respiratory chain complexes activities. Just as important as mitochondrial dysfunction induced by HI, results indicate the presence of sexual dimorphism on this parameter, since females, besides having a higher per se activity of respiratory chain complexes compared to males, they were more vulnerable to HI damage. In order to identify the possible contribution of autophagy to the distinct mitochondrial alterations found in males and females, autophagic activity was measured in neonates 18h after injury. We verify that changes found – namely oxidative stress and mitochondrial dysfunction - were able to induce autophagic activity. However, it manifested differently in cortex and hippocampus and also in males and females. In the cortex, females subjected to HI had an increase in autophagosomes (activation of autophagy), but decreased autolysosomes, showing a possible inhibition of a final step of the process. On hippocampus, males subjected to HI had autophagy induction and females showed a per se increase in autophagic activity in both control and HI animals. It is possible that ROS increased in respiratory chain and loss of mitochondrial Δψ had induced autophagy after lesion caused by HI in the neonatal brain. These sex-specific differences are important not only to understand the mechanism of damage caused by HI insult, but also to direct studies on the therapeutic strategies according to the sex of the affected subject.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-04T18:40:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 140676 bytes, checksum: bb8c24caaf23c65fb10d482525e49c6f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T18:40:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 140676 bytes, checksum: bb8c24caaf23c65fb10d482525e49c6f (MD5) Previous issue date: 1999-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho teve por objetivo avaliar a regulação da atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + (NAD + -IDH), por cátions divalentes e nucleotídeos de adenina, em mitocôndrias vegetais. Para isto, utilizaram-se extratos enzimáticos de mitocôndrias isoladas de hipocótilos e raízes de soja e de tubérculos de batata, tendo a atividade da enzima sido determinada, espectrofotometricamente, pela redução do NAD + a 340 nm. A NAD + -IDH, independente da fonte da enzima, apresentou atividade ótima em pH 7,5 e temperatura de 35 o C. O armazenamento em banho de gelo ocasionou perda progressiva de atividade enzimática, semelhante para os materiais utilizados. A -20 o C, a enzima extraída de soja mostrou maior estabilidade, em função do tempo, que a de tubérculos de batata. Os cátions Mn 2+ e Mg 2+ estimularam a atividade da enzima, além de reverterem os efeitos do EGTA, porém, o Ca 2+ não teve as mesmas influências. Houve pequena diminuição da atividade enzimática em presença do ADP e uma diminuição da atividade enzimática mais drástica em resposta ao ATP, independente da fonte da enzima. O cálcio não interferiu no efeito dos nucleotídeos de adenina. Os valores de K M app e V máx app aparentes não foram alterados pelo cálcio. Em média, os valores de K M app foram em torno de 0,10 mM. Para as mitocôndrias de batata V máx app foi de 28 nm min -1 e para soja, em torno de 13 nm min -1 . Os dados não permitem associar a capacidade de mitocôndrias em acumular Ca 2+ com um possível controle diferencial deste cátion sobre a atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + . / This work focused on the regulation of NAD + -isocitrate dehydrogenase, by cations and adenine nucleotides, in plant mitochondria, using enzymatic extracts from soybean roots and hypocotils and potato tuber. NAD + -IDH was assayed by following the reduction of NAD + at 340 nm. Maximum enzyme activity, regardless of the source of the enzyme (potato or soybean), was achieved at pH 7.5 in 25 mM HEPES and 35 o C. Both enzymatic extracts exhibited a progressive and similar loss of activity when stored in an ice bath. The enzymatic extract from soybean mitochondria showed the largest stability under storage at -20 o C. The cations Mn 2+ and Mg 2+ stimulated the enzymatic activity, in addition to reverting the effects of EGTA, even though Ca 2+ was not equally effective. There was a short inhibition of the enzymatic activity in presence of ADP, and a drastic inhibition in response to ATP. Calcium did not change the adenine nucleotides effect. K M app values were not altered by calcium and, on the average, they were in the range of 0.10 mM, regardless the source of the enzyme. The values of V max app were 28 nm min -1 , for potato, and 13 nm min -1 , for soybean. As a whole, the present results do not support the view that mitochondrial capacity in accumulating calcium is associated to the differential control of the calcium on the NAD + -isocitrate dehydrogenase activity. / Dissertação importada do Alexandria.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-13T14:18:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 468813 bytes, checksum: 5f47861b9adc0a6469d64eae05091b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T14:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 468813 bytes, checksum: 5f47861b9adc0a6469d64eae05091b03 (MD5) Previous issue date: 2001-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram estudados os efeitos do Al sobre alguns aspectos da respiração e sobre a atividade de algumas enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e do processo fermentativo, em dois cultivares de milho, um sensível (AG 122) e outro tolerante (AG 5011) ao Al. As plântulas dos dois cultivares, cultivadas em solução nutritiva, pH 4,0, durante 3 dias, foram tratadas com Al (0 e 185 μM) durante 0, 12, 24, 48 e 72 h. Determinaram-se, então, o crescimento radicular, o teor de Al, a taxa respiratória e a atividade da rota citocromo e da rota alternativa em ápices radiculares. Em mitocôndrias, isoladas de plântulas tratadas ou não com Al, durante 72 h, determinaram-se o consumo de oxigênio nos estados 3 e 4, a relação ADP/O e o coeficiente de controle respiratório, na presença ou não de Al adicionado ao meio de reação. Em mitocôndrias isoladas de plântulas crescidas na ausência de Al determinou-se, também, o efeito do Al sobre a atividade de algumas enzimas ligadas à cadeia transportadora de elétrons, ao ciclo dos ácidos tricarboxílicos e ao processo fermentativo. O tratamento com Al resultou em redução do crescimento radicular nos dois cultivares, principalmente no cultivar sensível, tendo a diferença entre eles aumentada com o tempo de exposição a este elemento. O Al acumulou-se, predominantemente, no sistema radicular, mas os cultivares não diferiram entre si. A respiração total nos ápices radiculares destacados foi severamente reduzida na presença de Al e sua intensidade aumentou com o tempo de exposição das plantas, tendo o cultivar sensível sido, em geral, mais afetado. A atividade da rota citocromo nos ápices radiculares decresceu na presença de Al nos dois cultivares, especialmente no cultivar sensível. A atividade da rota alternativa decresceu, também, na presença de Al, mas apenas no cultivar sensível. O Al, de maneira geral, inibiu a respiração no estado 3 e o coeficiente de controle respiratório nas mitocôndrias isoladas de plântulas crescidas na presença de Al, tendo sido o cultivar sensível, em geral, mais afetado. O Al, aplicado apenas no meio de reação, praticamente não teve efeito significativo sobre a atividade mitocondrial. A única exceção ocorreu quando se utilizou o L-malato como substrato. Neste caso, na presença de Al, observou-se redução na atividade respiratória durante o estado 3 e da rota citocromo nos dois cultivares. Todas as variáveis de respiração analisadas, na presença de Al, foram mais elevadas no cultivar tolerante, exceto a relação ADP/O. As plântulas dos dois cultivares, crescidas na presença de Al, apresentaram as atividades das enzimas NADH e da succinato citocromo c oxidoredutase inibidas pelo Al. Sob esta condição, o cultivar tolerante apresentou maior atividade da NADH citocromo c oxidoredutase, mas não se observou diferença estatística entre os cultivares quanto à succinato citocromo c oxidoredutase. De modo geral, a absorção de fosfato por mitocôndrias, isoladas de plântulas crescidas na presença de Al ou naquelas preparações em que o Al foi adicionado apenas ao meio de reação, decresceu na presença de Al. A velocidade de inchamento mitocondrial reduziu com o aumento da concentração do Al no meio de reação, mas os dois cultivares não diferiram entre si. A atividade da desidrogenase do malato no extrato enzimático bruto decresceu na presença do Al, nos dois cultivares. Quando o Al foi adicionado apenas no meio de reação, a atividade da isoforma mitocondrial, contudo, não foi significativamente alterada nos dois cultivares. A atividade da fumarase aumentou na presença de Al, mas os cultivares não diferiram entre si. A atividade da desidrogenase alcoólica decresceu fortemente na presença de Al e o cultivar tolerante, independentemente da presença de Al, apresentou maior atividade do que o cultivar sensível. / The effects of Al on some aspects of the respiratory metabolism and on the activity of some enzymes of the tricarboxylic acid cycle and of the fermentative process in two corn cultivars, one Al-sensitive (AG 122) and other Al-tolerant (AG 5011) were studied. Seedlings of the two cultivars, grown in nutrient solution, pH 4,0, for 3 days, were exposed to Al (0 and 185 μM) for 12, 24, 48 and 72 h and the root growth, the Al content, the respiratory rate and the activities of the cytochrome and of the alternative pathway were determined in root apices. In isolated mitochondria of previously Al treated seedlings for 72 h, the oxygen uptake in the coupled and uncoupled state, the ADP/O ratio and the respiratory control ratio, in the presence or not of added Al to the reaction medium were determined. In isolated mitochondria from seedlings grown in the absence of Al, the effect of this ion on the activity of some enzymes of the electron transfer chain of the tricarboxylic acid cycle and of the fermentative process was also determined. Aluminum reduced the root growth in both cultivars, mainly in Al-sensitive cultivar, and the difference among them increased with the time of exposition to this ion. Aluminum accumulated, predominantly in the root system, but there was no statistical difference between cultivars. The total respiration in the root apices was severely reduced in the presence of Al and the reduction intensity increased with the time of exposition to Al and, generally, the Al-sensitive cultivar was more affected. The activity of the cytochrome pathway in the root apices decreased in the presence of Al in both cultivars, especially in Al-sensitive cultivar. The activity of the alternative pathway also decreased in the presence of Al, but only in the Al- sensitive cultivar. Generally, Al reduced the respiration rate in the coupled state and the respiratory control ratio in isolated mitochondria of seedlings grown in the presence of Al. The Al-sensitive cultivar, most of the time, was more affected than the Al-tolerant one. When added only to the reaction medium, Al practically did not have significant effect on the mitochondrial activity. The only exception occurred when the L-malate was used as substrate. In this case, it was observed a reduction on the respiration rate during the coupled state and on the activity of cytochrome pathway in both cultivars. In the presence of Al, all studied respiratory variables were higher in Al-tolerant cultivar, except the ADP/O ratio. When the seedlings were grown in the presence of Al, the activities of both NADH and succinate cytochrome c oxidoreductase were inhibited by Al. Under this condition, the Al-tolerant cultivar exhibited larger NADH cytochrome c oxidoreductase activity, but no statistical difference between cultivars was found with respect to succinate cytochrome c oxidoreductase activity. In general, the phosphate uptake by isolated mitochondria from seedlings previously treated with Al or just added to the reaction medium was reduced by Al. The mitochondrial swelling velocity reduced with the increase of Al concentration in the reaction medium, but the two cultivars did not show statistical difference. The malate dehydrogenase activity in the crude enzyme extract decreased in the presence of Al in both cultivars. The activity of the mitochondrial malate dehydrogenase isoform, however, in which Al was only added to the reaction medium, was not affected in both cultivars. The fumarase activity increased in the presence of Al, but there was no difference between cultivars. The alcoholic dehydrogenase activity was strongly reduced in presence of Al and the Al-tolerant cultivar, independent of the presence of Al, exhibited larger enzyme activity than the Al- sensitive cultivar. / Tese antiga

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 henrique_oliveira_ioc_mest_2014.pdf: 7127354 bytes, checksum: 38222c40296b518181621dea489e65c1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / T. gondii é parasito intracelular obrigatório, agente etiológico da toxoplasmose, doença com ampla distribuição mundial. Os transtornos mais severos (fase aguda) acometem pacientes imunocomprometidos. Hospedeiros imunologicamente sadios, uma vez infectados, apresentam cistos teciduais (fase crônica) de modo perene. Estudos sugerem que por possuírem um eficiente metabolismo energético, os principais tecidos eleitos para a cistogênese do T. gondii, são o nervoso e o muscular esquelético. O presente trabalho dedicou-se ao estudo das associações de mitocôndrias e do retículo endoplasmático (RE) à membrana do vacúolo parasitóforo (MVP) e à parede cística. Para tanto, foram utilizados bradizoítos e taquizoítos da cepa ME49 (tipo II) e culturas primárias de célula muscular esquelética (CME) e da linhagem C2C12. Nossas estratégias metodológicas contemplaram microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, respirometria de alta resolução e ensaios de efeito de um inibidor da fosforilação oxidativa (ISA-34) sobre a cistogênese Os dados obtidos apontam a ocorrência de: (i) associações entre mitocôndrias com a parede cística; (ii) aspectos peculiares ultraestruturais decorrentes de associações entre mitocôndrias e RE (rugoso e liso) da CME com a MVP de vacúolos contendo bradizoítos; (iii) manutenção do metabolismo mitocondrial da CME pelo T. gondii, durante a fase crônica; (iv) efeito inibitório do composto ISA-34 sobre o desenvolvimento de cistos teciduais. Estes resultados, além de iniciarem uma linha de pesquisa inédita a respeito das respostas do metabolismo energético da CME frente à cistogênese de T. gondii, também abrem novas perspectivas para uma terapia alternativa voltada para a fase crônica da toxoplasmose / Toxoplasma gondii is an obligatory intracellular parasite, agent of toxoplasmosis, disease with a worldwide distribution. The most severe disorders (acute phase) affect immunocompromised patients. Immun ologically healthy individuals, once infected, develop tissue cysts (chronic phase) that can persist for the host life span. Studies suggest that an efficient energetic metabolism, as in nervous and skeletal muscle tissues, leads to the development of T. g ondii cystogenesis. The present work aims the study of the association of skeletal muscle cell (SkMC) mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) to the parasitophorous vacuole membrane (PVM) and to the cyst wall (CW). Bradyzoites and tachyzoites from ME49 strain (type II) of T. gondii and SkMC cultures and C2C12 cell line were used. The methodological strategies employed were fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, high - resolution respirometry and assay using ISA - 34, an inhibitor of oxid ative phosphorylation. Our data point out: (i) associations between mitochondria and CW; (ii) ultrastructural aspects of the association of SkMC mitochondria and ER (rough and smooth) with PVM of bradyzoite - containing vacuoles; (iii) m aintenance of SkMC mi tochondrial metabolism by T. gondii and, (iv) inhibitory effect of ISA - 34 on the tissue cysts development. These results stimulate further investigation concerning the response of SkMC energy metabolism during cystogenesis of T. gondii and also open novel perspectives for an alternative therapy against toxoplasmosis chronic phase

O alto consumo de dietas hiperpalatéveis (HP) ricas em lipídios e carboidratos simples associado a hábitos sedentários são fatores que contribuem para o desenvolvimento de sobrepeso e obesidade. Estas alterações, promovem um estado proinflamatório, causam resistência periférica à insulina e ainda prejudicam o metabolismo cerebral. A glicose é considerada o principal substrato energético para o cérebro. No entanto, em condições de alta demanda energética outros substratos como corpos cetônicos e lactato, por exemplo, podem servir como alternativa energética. A teoria da lançadeira de lactato astrócito-neurônio (do inglês ANLS) propõe que o aumento da captação da glutamato pelos astrócitos aumenta a atividade glicolitica e a produção de lactato, que por sua vez é exportado dos astrócitos para o espaço extracelular via transportadores de monocarboxilados (MCTs) do tipo 1 e 4. Os transportadores MCT do tipo 2 presentes nos neurônios internalizam o lactato para que ele seja convertido em piruvato. A enzima piruvato desidrogenase (PDH) converte o piruvato em acetil-CoA dentro da matriz mitocondrial. Sendo assim, o lactato e outras substâncias em equilíbrio com o piruvato são direcionados para o metabolismo oxidativo. Assim, a PDH conecta o metabolismo citosólico e mitocondrial. Por outro lado, o aumento do metabolismo oxidativo é associado com o aumento de vazamento de prótons e com a produção de peróxido de hidrogênio pela mitocôndria. Consequentemente, pode haver uma menor produção de ATP pela mitocôndria. Neste estudo, os efeitos de uma dieta hiperpalatável (HP) e do exercício físico em parâmetros metabólicos no hipocampo e na memória foram investigados. Foram avaliados: os níveis de lactato, o imunoconteúdo dos MCTs e da PDH e atividade mitocondrial no hipocampo de camundongos. Camundongos C57BJ machos com 30 dias receberam uma dieta HP durante cinco meses e, praticaram atividade física voluntária durante o último mês. Os grupos foram: CDS (dieta controle sedentário), CDE (dieta controle exercício), HPS (dieta HP sedentário) e HPE (dieta HP exercício), (n=15 animais/grupo). Os resultados mostraram um aumento no imunoconteúdo de MCT 1 e 4 causados pela dieta e pelo exercício físico. O exercício físico causou um aumento na expressão de PDH. A expressão do MCT2 não apresentou diferença significativa entre os grupos. Não foram observadas alterações na memória no teste do Y-maze. No entanto, houve um aumento no nível de lactato em microdialisado de hipocampo no grupo HPE após a exposição ao teste. Não foi observada diferença significativa no metabolismo mitocondrial basal, e nem no potencial de membrana mitocondrial. A ativação do complexo II mitocondrial pelo succinato aumentou a produção de H2O2 no grupo HPS. Esse efeito foi revertido pelo exercício físico. Os resultados demonstram que o exercício e a dieta HP aumentaram a expressão dos MCTs 1 e 4, enquanto que a expressão de PDH apenas aumentou pelo exercício. Isto sugere uma adaptação da maquinaria metabólica hipocampal em resposta a estes estímulos ambientais. / The high consumption of saturated fats and simple sugar diets associated with sedentary habits are factors that contribute to the development of overweight and obesity. These consequences produce a pro-inflammatory state, resulting in periphery insulin resistance and damage the cerebral metabolism. The glucose is considered to be the main energetic substrate to the brain, other particular substrates, like ketonic bodies and lactate, may work as alternative energy sources during moments of high energetic demand. The theory of Astrocyte-Neuron Lactate Shuttle suggests that the increased uptake of glutamate by the astrocyte enhance the glycolytic activity and the production of lactate, which is exported from the astrocyte to the extracellular space via monocarboxylate transporters (MCTs) type 1 and 4. The MCTs type 2 residing inside the neurons accumulates lactate, which is converted into pyruvate. Furthermore, the dehydrogenase pyruvate enzyme (PDH) convert the pyruvate to Acetyl-CoA inside the mitochondrial matrix. Thus, the lactate and other substances in equilibrium are directed to the oxidative metabolism. This way, the PDH connects the cytosolic and mitochondrial metabolism. On the other hand, the increased oxidative metabolism is associated with the leakage of protons and with the hydrogen peroxide production by the mitochondria. Consequently, the ATP production might be reduced. In this study, the effects of a palatable diet and physical exercise in metabolic parameters in the hippocampus and memory were investigated. Were evaluated: lactate levels, the expression of MCTs and PDH and mitochondrial activity in the hippocampus. Male C57BJ mice with 30 days received a HP diet for five months and practiced voluntary physical activity during the last month. The groups were: CDS (control diet sedentary), CDE (control diet exercise), HPS (HP diet sedentary) and HPE (HP diet exercise), (n = 15 animals / group). The results showed an increase in immunocontent of MCT 1 and 4 caused by diet and exercise. The physical exercise caused an increase in PDH expression. The expression of MCT2 had no relevant impact among the groups. No changes were observed in memory in the Y-maze test even though it was observed an increase in lactate levels in hippocampal microdialysate of the HPE group after the exposure to test. There was no significant difference in basal mitochondrial metabolism nor in the mitochondrial membrane potential. The activation of the mitochondrial complex II by succinate increased H2O2 production in the HPS group. This effect was reversed by exercise. The results show that the exercise and the HP diet increased the expression of MCTs 1 and 4, while the PDH expression only increased by exercise. This suggests an adaptation of the hippocampal metabolic machinery in response to these environmental stimuli.

Orientador : Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientadoras : Drª. Amanda do Rocio Andrade Pires ; Drª. Julie St-Pierre / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 26/10/2016 / Inclui referências: f. 78-97 / Resumo: Diferentes atividades biológicas têm sido atribuídas aos compostos mesoiônicos. Para a sidnona SYD-1 (3-[4-cloro-3-nitrofenil]-1,2,3-oxadiazolio-5-olato) foi descrita significativa atividade antitumoral contra Sarcoma 180, carcinoma de Erlich e Walker-256. Neste estudo foram avaliados os efeitos do SYD-1 em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), considerando sua elevada taxa de mortalidade e a existência de apenas um quimioterápico para o seu tratamento. Os efeitos do mesoiônico foram avaliados em células cultivadas em meio DMEM alta glucose (AG) e DMEM sem glucose e com galactose/glutamina (GAL) para direcionar o metabolismo destas células para a via glicolítica e fosforilação oxidativa, respectivamente. Ainda, com o fim de estabelecer uma possível seletividade, alguns ensaios também foram realizados em hepatócitos de rato em cultura mantidos em meio DMEM AG. SYD-1 reduziu de forma concentração dependente a viabilidade das células HepG2, avaliada por quatro metodologias diferentes. Pelo método do MTT, as reduções foram de ~22% e ~49% para 50 ?M de SYD-1, para células cultivadas em meio AG e GAL, respectivamente. Resultado similar foi obtido com a coloração com cristal violeta e atividade da enzima LDH no meio extracelular. No entanto, nenhum efeito foi observado utilizando a metodologia de exclusão do azul de tripan. Todos os estados da respiração (basal, leak e desacoplado), em células cultivadas, foram inibidos após o tratamento das células HepG2 com SYD-1 (25 e 50 ?M), sendo mais acentuado o efeito nas culturas mantidas em meio GAL. Nas mesmas condições, foi observada a diminuição nos níveis celulares de ATP (~29%). Os níveis de piruvato, por sua vez, diminuíram nas células tratadas com 50 ?M do SYD-1, com consequente aumento dos níveis de lactato. Em células cultivadas em meio AG, SYD-1 (50 ?M), após 24h de tratamento, também foi capaz de aumentar a expressão de PGC1? e reduzir a expressão de PGC1?. Após 72h de tratamento, com a mesma concentração de SYD-1, houve um aumento na expressão de PGC1?, bem como seus alvos downstream NFR1, NFR2 e Ndufb5 e, também da expressão de genes relacionados com a atividade antioxidante celular: CAT, PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3). SYD-1 (50 ?M) aumentou a expressão de caspase 3 em células HepG2 mantidas em meio AG, mas houve uma diminuição quando as células foram mantidas em meio GAL. Os níveis dos metabólitos piruvato, citrato ?-cetoglutarato e succinato também se apresentaram aumentados após tratamento com o composto (50 ?M meio AG). SYD-1 (25 ?M) inibiu ABCG2 e não foi substrato para transportadores relacionados à resistência aos tratamentos quimioterápicos (Pgp, ABCG2 e MRP1). SYD-1 diminuiu a viabilidade dos hepatócitos não tumorais somente na maior concentração (50 ?M) após 18h de tratamento. Ensaios com anexina V e iodeto de propídio sugeriram que esta redução deve-se à indução de apoptose nestas células. Considerados em conjunto, os resultados sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais pelo SYD-1 está relacionado com sua toxicidade em células HepG2 e que o mesoiônico é um candidato promissor para futuras investigações in vivo, visando sua aplicação para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Palavras-chave: Células HepG2; hepatócitos; SYD-1; bioenergética mitocondrial; família de coativadores PGC1; transportadores ABC. / Absract: Several biological activities have been described for mesoionic compounds. The sydnone SYD-1 (3-[4-chloro-3-nitrophenyl]-1,2,3-oxadiazolium-5-olate) has shown a significant antitumour activity against Ehrlich carcinoma, Sarcoma 180 and Walker-256. In this study the effects of the mesoionic compound SYD-1 were evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2), considering its high mortality rate and that only one drug is available for its treatment. The effects of SYD-1 were evaluated on cells grown in high glucose DMEM (AG) or DMEM without glucose and with galactose/glutamine (GAL), with the aim to force the metabolism to glycolytic or oxidative phosphorylation, respectively. Further, in order to establish its selectivity, some assays were also performed in rat hepatocytes grown in AG DMEM. SYD-1 reduced the viability of HepG2 cells in a dose-dependent manner, assessed from four different methods. MTT method showed reductions of ~22% and ~49% in viability after treatment with SYD-1 (50?M) for cells grown in AG and GAL, respectively. Similar results were obtained from staining with crystal violet and release of LDH in the culture medium. However, no effect was observed when the methodology was the exclusion of trypan blue. The respiration states (basal, leak and uncoupled) were inhibited after treatment with SYD-1 (25 and 50 ?M), being the effects more pronounced in cells grown in GAL medium in comparison to AG medium. At the same conditions, it was observed the decrease of ATP levels (~29%). In turn, the levels of pyruvate decreased by the treatment with 50 ?M of SYD-1 while lactate levels increased. In cells grown in AG, SYD-1 (50 ?M) was also able to increase the expression of PGC1? and reduce the expression of PGC1?, after 24h of treatment. After 72h of treatment, SYD-1 (50 ?M) increased the expression of PGC1? as well as its downstream targets NFR1, NFR2 and Ndufb5. The expression of genes related to the antioxidant activity (CAT PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3) were also increased by SYD-1 (50 ?M). The expression of caspase 3 increased in HepG2 cells maintained in AG medium and decreased in cells at GAL medium. The levels of the metabolites pyruvate, citrate, ?-ketoglutarate and succinate were also increased after treatment with the compound (50 ?M - AG medium). SYD-1 (25 ?M) inhibited ABCG2 and was not a substrate of transporters associated to chemotherapy resistance (Pgp, MRP1 and ABCG2). SYD-1 decreased the viability of non-tumour hepatocytes only at the highest concentration (50 ?M) after 18h of treatment. Results of assays with anexin-V and PI suggested that the mesoionic was able to induce apoptosis in these cells. Taken together, these results show that the effects of SYD-1 on mitochondrial functions are related to its cytotoxicity on HepG2 cells and suggest that the mesoionic is a promising candidate for future in-vivo investigations aiming to its use for the treatment of hepatocellular carcinoma. Keywords: HepG2 cells; hepatocytes; SYD-1; mitochondrial bioenergetics, PGC1 family coactivators, ABC transportes.