Les maladies mitochondriales représentent un ensemble très divers de pathologies. Au cours de ce travail, j’ai abordé leur complexité dans deux situations différentes : les déficits humains en complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’analyse des relations génotype/phénotype dans une cohorte de patients suspects de mutations sur un même gène nucléaire (POLG). Le complexe III joue un rôle central au sein de la chaîne respiratoire mitochondriale. Contrairement à sa caractérisation biochimique très complète, son rôle physiologique a été relativement mal établi. D'une cohorte de 2000 patients dont les activités de la chaîne respiratoire mitochondriale avaient été mesurées sur tissu hépatique ou musculaire, nous avons sélectionné 15 patients avec un déficit en complexe III pour lesquels nous disposions de fibroblastes exprimant un déficit respiratoire. L’origine génétique était initialement connue pour quatre des déficits (UQCRB, BCS1L x2, MT-CYB) et, au cours de ce projet, nous avons pu en identifier trois autres (CYC1, MT-CYB, LYRM7). Nous avons cherché à évaluer l'existence d'un lien entre le phénotype et les caractéristiques du déficit : gène impliqué, distribution tissulaire et profil des réponses cellulaires au déficit. Notre population de fibroblastes, hétérogène sur le plan génétique, s’est également révélée très variée quant aux conséquences biochimiques et cellulaires du déficit. Il ne semble donc pas exister de « profil type » des déficits en complexe III. Les atteintes liées à une mutation du gène POLG sont souvent considérées comme les maladies mitochondriales les plus fréquentes chez l’adulte. Elles sont associées à des présentations cliniques très diverses. Nous avons étudié la spécificité et la sensibilité des différents signes cliniques et biologiques considérés comme évocateurs et conduisant donc au séquençage de POLG. A cette fin, nous avons analysé rétrospectivement le phénotype clinique et les investigations mitochondriales chez 154 patients dont le séquençage du gène POLG avait été effectué révélant des mutations touchant les deux allèles du gène chez 34 patients, une seule mutation chez 10 patients et une séquence normale chez 110 patients. L’étude clinique a inclus les signes/symptômes cliniques, les données électrophysiologiques et l'imagerie cérébrale. Les investigations mitochondriales englobaient l’histologie musculaire, le dosage du lactate sanguin, la mesure des activités de la chaîne respiratoire et la recherche de délétions multiples de l’ADN mitochondrial musculaire. Cette étude a montré que les mutations du gène POLG étaient responsables de signes cliniques et paracliniques récurrents présentant donc une sensibilité et une spécificité, notamment en association, permettant de proposer un arbre décisionnel pour l’indication du séquençage du gène POLG. Cette étude a également permis d’établir l’histoire naturelle des maladies de l’adulte dues à des mutations délétères de POLG. En conclusion, la classification des maladies mitochondriales par une anomalie biochimique commune, un déficit en complexe III dans le cas présent, conduit à regrouper des atteintes très différentes, aussi bien sur le plan clinique que biochimique et cellulaire. Au contraire, même dans des affections réputées comme extrêmement diverses comme celles dues aux mutations du gène POLG, la classification par le gène atteint permet d’identifier des présentations récurrentes dans la classe d’âge étudiée, patients adultes dans le cas présent… / Mitochondrial diseases represent a very diverse set of pathologies. With this work, I approached their complexity in two different situations: phenotypic analysis of fibroblasts derived from patients with defects of the respiratory complex III and phenotypic analysis of a cohort of patients, the POLG gene of whom had been sequenced. The complex III plays a central role in the mitochondrial respiratory chain. Contrary to its complete biochemical characterization, its physiological role has been relatively poorly established. We selected 15 patients with complex III defect in liver and/or muscle and with fibroblasts expressing a respiratory defect. The genetic origin was initially known for four of these defects (UQCRB, BCS1L x2, MT- CYB) and during this project, we were able to identify three additional cases (CYC1, MT- CYB, LYRM7). We sought to assess the existence of a link between the disease phenotype and the defect characteristics: gene involved, tissue expression and cellular responses. Our population of fibroblasts, genetically heterogeneous, turned also to be diverse with respect to the biochemical and cellular consequences of the defect. A "typical" profile of complex III defect therefore does not seem to exist. Pathologies related to POLG mutations are often considered the most common mitochondrial diseases in adults. Their clinical presentation is very diverse. We have investigated the specificity and sensitivity of different clinical and biological signs considered as suggestive for POLG mutations and therefore leading to POLG sequencing. To that purpose, we retrospectively analyzed the clinical phenotype and mitochondrial investigations in 154 patients for which POLG had been sequenced revealing mutations affecting two alleles of the gene in 34 patients, one allele for 10 patients and a normal sequence for 110 patients. This study has shown that POLG mutations were responsible of recurrent clinical and paraclinical signs, whose sensitivity and specificity when considered in association allowed to propose a diagnostic flowchart for POLG sequencing. This study has also permitted to establish the natural story of diseases associated with deleterious POLG mutations in adults. In conclusion, classification of mitochondrial diseases by a common biochemical abnormality, a complex III defect in the present case, leads to group very different diseases that differ from their clinical, biochemical and cellular patterns. On the contrary, even in diseases considered highly diverse as those due to POLG mutations, classification by the affected gene allows to identify recurrent presentations in a population of adult patients with neurological presentation.

La fraîcheur est un paramètre clé de la qualité du poisson. Les méthodes actuelles appliquées en routine pour déterminer la fraîcheur du poisson ne sont pas applicables à toutes les espèces et reflètent davantage un début d'altération du produit. Ainsi, la recherche d'indicateurs précoces de fraîcheur du poisson représente encore un défi majeur et d'actualité dans l'industrie de la pêche. Le but de ces travaux de thèse était de démontrer que les fonctions et l'intégrité mitochondriales étaient susceptibles de constituer des indicateurs précoces de la fraîcheur de filets de poisson. En effet, la mitochondrie est la "centrale" énergétique de la cellule eucaryote et joue un rôle clef dans les mécanismes de mort cellulaire tels que l'apoptose et la nécrose. Les fonctions et l'intégrité mitochondriales de cellules musculaires de filets de poisson ont été étudiées à différents temps de conservation post mortem à 4°C. Le modèle d'étude était la daurade royale (Sparus aurata) (lignée cellulaire de fibroblastes (SAF-1) et muscles de poisson). Dans un premier temps, la structure des mitochondries de poisson a été étudiée par microscopie électronique à transmission. De nombreuses dégradations de la structure des mitochondries ont été observées dans les filets à partir de 72 heures (J3) de conservation à 4°C. Ces altérations se sont accentuées à J4 et J6. La fonctionnalité des mitochondries a ensuite été évaluée selon deux approches : la respiration mitochondriale (oxygraphie) et le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨₘ) estimé avec la sonde fluorescente Rhodamine 123. A partir de 96 heures de conservation à 4°C (J4), ces deux paramètres ont été significativement impactés témoignant d'une altération des fonctions et de l'intégrité mitochondriales.Ces résultats sont ainsi en corrélation avec l'altération structurale observée par microscopie. En parallèle, une méthode d'évaluation du potentiel membranaire a été développée avec un fluorimètre à microvolume à partir d'un modèle bactérien puis de mitochondries isolées. Ces travaux de thèse ont démontré que l'étude des fonctionnalités mitochondriales constitue un marqueur fiable et précoce de la fraîcheur des filets de poisson. Des connaissances supplémentaires sur les mécanismes cellulaires post mortem ont également été apportées. Ces résultats constituent ainsi le point de départ pour le développement d'un kit d'évaluation de la fraîcheur et ouvrent la voie pour la recherche de marqueurs de fraîcheur et de congélation/décongélation basés sur les fonctionnalités et intégrité mitochondriales. / Freshness is a key parameter of fish quality. Current routine techniques to determine fish freshness are not applicable to all species and reflect a late stage of alteration. Thus, research on early indicators of fish freshness still represents a major and topical challenge in fishing industry. This PhD research project aimed to demonstrate that mitochondrial functions and integrity constitute early indicators of fish fillet freshness. Mitochondria are the powerhouse of the cell and play a central role in cell death mecanisms such as apoptosis and necrosis. Mitochondrial function and integrity in fish filet muscle cells were studied at different times of storage post mortem at 4°C. The species studied as a model was the gilthead seabream (Sparus aurata) (gilthead seabream fibroblast cell line (SAF-1) and fish fillets). Firstly, the structure of fish mitochondria was studied by transmission electron microscopy. Numerous mitochondrial structural alterations have been observed in fish fillet from 72 hours (D3) of storage at 4°C. These alterations were more pronounced at D4 and D6. Then, mitochondrial functionality was assessed with two approaches: mitochondrial respiration (oxygraphy) and mitochondrial membrane potential (ΔΨₘ) estimated with the fluorescent probe Rh123. From 96 hours of storage at 4°C (D4), these two parameters were significantly disrupted demonstrating the alteration of mitochondrial function and integrity. The results are in correlation with the mitochondrial structural alterations described by microscopy. In parallel, a method of mitochondrial membrane potential evaluation has been developed with a micro-volume fluorimeter, first using bacteria and then isolated mitochondria. This work demonstrated that the mitochondrial functionality study constitutes a reliable and early fish filet freshness indicator. Additional knowledge on cell mechanisms in post mortem condition has been brought. These results constitute the starting point for the development of a fish freshness assay kit and pave the way to research on others freshness and freeze-thawing indicators based on mitochondrial integrity and functionality.

Les maladies cardiovasculaires constituent un problème de santé publique. Les pré et postconditionnement ischémiques mais aussi pharmacologiques constituent autant d‘avancées qui permettront l‘amélioration de la prise en charge des malades en situation d‘ischémie/reperfusion myocardique. Néanmoins, la morbi-mortalité des maladies cardiovasculaires reste importante et nécessite le développement de nouvelles techniques. Les premiers résultats de la thérapie cellulaire myocardique ont été décevants, et s‘il est désormais établi que l‘on ne peut régénérer le myocarde, les effets bénéfiques observés, notamment avec les cellules souches mésenchymateuses semblent en rapport avec un effet paracrine qui passe par l‘activation de la voie de signalisation PI3kinase/Akt sur un mécanisme comparable à celui du postconditionnement ischémique. Les médiateurs de cet effet sont vraisemblablement des facteurs de croissance comme le VEGF ou l‘IGF-1 même si un effet individuel direct de l‘une ou l‘autre de ces molécules n‘a pu être mis en évidence. La modulation de l‘activité de l‘ATP synthase mitochondriale est également une cible thérapeutique prometteuse. Cette enzyme inverse son activité et hydrolyse l‘ATP durant l‘ischémie, conduisant à dépléter le pool d‘ATP intracellulaire et accélérer la survenue de la mort cellulaire. De nouvelles molécules ayant un effet similaire à l‘IF1 permettent de bloquer cette inversion d‘activité de l‘ATP synthase, de préserver l‘ATP et donc d‘améliorer la survie cellulaire par un effet de type préconditionnement ischémique. Ces 2 techniques, très différentes mais non antinomiques, pourraient faire partie de l‘arsenal thérapeutique dans les années à venir / Cardiovascular diseases are a major problem of public health management. Ischemic and pharmacological pre and postconditioning should significantly improve the prognosis of patients suffering from myocardial ischemia/reperfusion. However, the morbi-mortality of these patients is still high and research must remain active. The first results of myocardial stem cell therapy show that we cannot regenerate myocardium but a recent meta-analysis reported positive effects that can be explained through a paracrine mechanism. Mesenchymal stem cells protect ischemic cardiomyocytes from reperfusion injury through a paracrine activation of the PI3kinase/Akt pathway in a similar way to ischemic postconditioning. The mediators of this protection could be growth factors such as VEGF or IGF-1 though we couldn’t demonstrate a direct effect of one or the other. Modulating the activity of the ATP synthase during ischemia is another promising therapeutic target. This enzyme reverses its activity and hydrolyses ATP when the supply in oxygen is impaired. This leads to the reduction of the cellular pool of ATP and accelerates cell death. We identified new small molecules with a similar effect to IF1 that can selectively inhibit the reverse activity of the ATP synthase, preserve ATP and thus increase cell survival in a preconditioning-like effect. These two different techniques could be part of the therapeutic arsenal against ischemia/reperfusion in the next decades.

La maladie coronaire d’origine ischémique reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde industrialisé.Le traitement de l’ischémie aiguë du myocarde est entré dans une nouvelle ère où la mortalité peut être diminuée de moitié en utilisant des procédures qui permettent un retour rapide du débit sanguin dans la zone ischémique du myocarde: la revascularisation.Cette reperfusion entraîne des complications appelées lésions de la reperfusion qui ont été décrites pour la 1ère fois par Jennings et al., en 1960. Le développement de stratégies cardioprotectrices associées à la reperfusion constitue un besoin majeur en clinique afin d’améliorer la fonction myocardique, de diminuer l'incidence des arythmies, de retarder l'apparition de la mort cardiomyocytaire et de limiter la taille de l’infarctus du myocarde lors de l'ischémie/reperfusion (I/R).La découverte de 2 formes principales de mécanismes cardioprotecteurs endogènes, a encouragé la recherche de nouveaux moyens pharmacologiques capables de protéger le myocarde ischémié/reperfusé et a développé nos connaissances sur les bases moléculaires des lésions et de la survie cellulaire au cours des processus d’I/R.L’étude des mécanismes responsables de l’induction de la mort cellulaire a permis de mettre en évidence le rôle joué par la mitochondrie et l’augmentation de la perméabilité de ses membranes, induite par la formation/ouverture d’un pore au niveau des points de contacts entre les membranes mitochondriales;ce pore a été appelé « pore de transition de la perméabilité mitochondriale » (mPTP).L’inhibition de l’ouverture de ce pore apparaît comme une stratégie privilégiée pour protéger le myocarde.Des études ont montré que les espèces réactives d’oxygène (EROs) jouent un rôle majeur dans les lésions de l’I/R et dans l’ouverture du mPTP.Il existe peu d’informations claires sur le seuil et la période de production (ischémie et/ou reperfusion) des EROs qui conduisent à l’ouverture du mPTP.Nous avons mis au point un modèle cellulaire d’hypoxie/réoxygénation (H/R) afin d’établir une relation causale entre la production d’EROs, l’ouverture du mPTP et la mort cellulaire tout en explorant le rôle de différents types d’EROs.Ce modèle d’H/R nous a permis de mesurer en temps réel et simultanément la production des EROs, l’ouverture du mPTP et la mort cellulaire.Nous avons montré que la production des EROs débute pendant la période d’hypoxie et qu’elle est directement liée à l’augmentation du temps d’hypoxie.Cette production d’EROs à l’hypoxie, plus particulièrement de radicaux hydroxyles et de peroxyde d’hydrogène, a été directement relié, à l’ouverture du mPTP et à la mort cellulaire lors de l’H/R.Nous avons utilisé ce modèle pour étudier le mécanisme d’action de deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices, un nouveau ligand de la protéine translocatrice mitochondriale (TSPO), le TRO 40303, et l’activation de la voie RISK par la morphine. Nous avons ainsi montré que (1) les propriétés cardioprotectrices du TRO40303 sont associées à une inhibition de l’ouverture du mPTP, ce qui n’avait pas pu être démontré au moyen d’expériences réalisées ex vivo et (2) l’activation de la voie RISK par la morphine, qui aboutit à une limitation de la taille d’infarctus associée à une amélioration des fonctions respiratoires mitochondriales, entraîne également une inhibition de l’ouverture du mPTP et un retard de la mort cellulaire des cardiomyocytes isolés soumis à une H/R.La suite de ce travail sera de rechercher si l’inhibition du stress oxydant peut constituer un mécanisme commun aux deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices en utilisant notre modèle d’H/R.Il serait possible d’étendre notre modèle à des animaux génétiquement modifiés pour appréhender les phénomènes impliqués dans cette activité antioxydante.A plus long terme, il sera nécessaire d’approfondir nos connaissances sur la production d’EROs pendant l’I/R en recherchant plus spécifiquement l’origine de cette production. / Ischemic coronary artery disease remains one of the main causes of mortality in the industrialized countries. The treatment of acute myocardial ischemia entered a new era where mortality can be reduced by 50% using revascularization procedures that allow a rapid return of blood flow to the ischemic area. However, this reperfusion leads to complications known as lethal reperfusion induced injury that have been described for the first time by Jennings et al., in 1960. It became crucial to develop cardioprotective strategies in combination with early reperfusion in order to improve myocardial function, to reduce the incidence of arrhythmias, to delay the onset of cardiomyocytes death and to limit the extension of infarct size following reperfusion. The discovery of two major forms of endogenous cardioprotective mechanisms, which consist of the realization of short cycles of ischemia/reperfusion (I/R) prior to a long period of ischemia (ischemic preconditioning) or before reperfusion after the long period of ischemia (Ischemic Postconditioning), encouraged the search for new pharmacological tools to protect the ischemic myocardium to develop our knowledge on the molecular mechanisms of lethal reperfusion injury and cell survival in the I/R process.The study of cell death mechanisms has highlighted the crucial role of the mitochondria and more specifically the increase in mitochondrial membrane permeability following I/R.One reason for increasing permeability is the formation/opening of a pore at mitochondrial membranes contact sites at reperfusion.This pore has been called "the mitochondrial permeability transition pore" (mPTP). Inhibition of this pore opening has been presented as a main strategy to protect the myocardium.Many studies have shown that reactive oxygen species (ROS) play a major role in I/R injury and mPTP opening, but there is very few information to date about the threshold and the period of ROS production (ischemia and/or reperfusion) that lead to mPTP opening.We designed a cellular model of hypoxia/reoxygenation (H/R) to establish a causal relationship between ROS production, mPTP opening and cell death while exploring the role of different types of ROS.This H/R model used freshly isolated adult rat cardiomyocytes and allowed us to measure online and simultaneously ROS production, mPTP opening and cell death. We have demonstrated that ROS production starts during the period of hypoxia and thisproduction is directly linked to the increase in the duration of hypoxia.This ROS production during hypoxia has been, for the first time, directly related to mPTP opening and cell death following H/R.We used this model to study the mechanism of action of two cardioprotective strategies, a new ligand of the mitochondrial translocator protein (TSPO), TRO 40303 and a RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) pathway activator, morphine. We have shown that (1) the cardioprotective properties of TRO40303 were associated with inhibition of mPTP opening, a mechanism that could not be demonstrated using ex vivo experiments and (2) morphine that provoked infarct size limitation associated with an improvement of mitochondrial respiratory functions through RISK pathway activation, also inhibited mPTP opening and delayed cell death of isolated cardiomyocytes subjected to H/R.Finally, a question comes into sight whether the inhibition of oxidative stress may be a common mechanism to both cardioprotective pharmacological strategies that we have described using our H/R model. To do this, it would be possible to extend our model to genetically modified animals specifically adapted to understand the phenomena involved in antioxidant activity.On long-term, it will be necessary to develop our knowledge on ROS production during I/R by looking for the origin of this production, more precisely the role of the mitochondria and the effect of other reactive species in order to target the treatment and to develop new cardioprotective strategies.

Le facteur de transcription NF-κB régule l’expression d’une pléthore de gènes impliqués dans divers processus physiologiques notamment la prolifération et la survie cellulaires, l’inflammation ainsi que les réponses immunes. Il intervient également dans de nombreux processus pathologiques à l’exemple de certains cancers et maladies auto-immunes.L’activation de NF-κB suite à l’engagement de différents immunorécepteurs requiert la mise en place de larges signalosomes formés suite au recrutement de différents adaptateurs au niveau des immunorécepteurs engagés. Ces adaptateurs subissent des ubiquitinations non-dégradatives nécessaires pour la transduction du signal. Nous avons démontré dans un précédent travail que ces protéines ubiquitinylées s’accumulent au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique (RE) via la protéine réticulaire Métadhérine (MTDH). De plus, nos résultats suggèrent que l’ubiquitination est un prérequis nécessaire à l’adressage de ces protéines au RE. Afin d’évaluer la contribution des E3 ubiquitine ligases en charge de relayer NF-κB au niveau des organites, nous avons effectué le crible d’une banque de siRNAs dirigés contre les 46 E3 ligases transmembranaires en utilisant comme modèle la signalisation du TNF récepteur. Ce crible nous a permis d’identifier l’E3 ligase RNF121 comme régulateur positif de NF-κB. Bien que le mécanisme d’action de RNF121 ne soit pas complètement élucidé, nos données suggèrent qu’il agirait au niveau de la régulation de l’inhibiteur de NF-κB « IκBα ».Durant la deuxième partie de cette thèse, je me suis intéressée à la dynamique mitochondriale. Les mitochondries sont des organites dynamiques, dont la forme est maintenue grâce à une balance entre deux processus antagonistes appelés : fission et fusion. Il a été rapporté qu’en présence de certains stress modérés, les mitochondries hyperfusent, ce processus est appelé SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). Nous avons pu démontrer que la SIMH s’accompagne de l’activation de la voie canonique du facteur de transcription NF-κB via l’E3 ubiquitine ligase mitochondriale MULAN. Nos résultats suggèrent que durant le SIMH, MULAN forme un complexe avec TRAF2 et module son ubiquitination. Ces résultats suggèrent que la mitochondrie, de part sa dynamique, convertie un signal de stress en un signal de survie via l’activation de NF-κB. Pris dans leur ensemble, nos résultats illustrent la complexité de la régulation de NF-κB par ubiquitination et attribuent aux organites un nouveau rôle dans la transduction de la signalisation. / The transcription factor NF-κB regulates the expression of several genes implicated in various physiological processes such as cell proliferation and survival, inflammation and immune responses. Dysregulation of its activation is involved in diverse pathologies such as cancer and auto-immune diseases. Following the engagement of immunoreceptors, NF-κB signaling requires a large signalosome assembly containing different adaptor proteins. These adaptors undergo poly-ubiquitinylation in a non-degradative manner, which is essential for signal transduction. We demonstrated in previous work that these ubiquitinylated proteins accumulate at the surface of the endoplasmic reticulum (ER) via a reticular protein called “Methaderin” (MTDH). Furthermore, our results suggest that ubiquitinylation is a necessary prerequisite for protein addressing to the ER. To evaluate the contribution of E3 ubiquitin ligases in this process we performed a screen of a siRNA bank, targeting the 46 human transmembrane E3 ligases, using the TNF receptor signaling as a model. This screen enabled the identification of RNF121, a Golgi E3 ligase, as a positive regulator of NF-κB. Although the mechanism by witch RNF121 acts is not yet elucidated, our data suggest that it acts on the regulation of NF-κB inhibitor (IκBα). In the second part of this thesis, we investigated mitochondrial dynamics. Mitochondria are dynamic organelles; their shape is maintained due to a balance between two antagonist processes called: fusion and fission. It is known that moderate stress triggers mitochondrial hyperfusion, this process is called: SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). During this thesis, we demonstrated that SIMH is accompanied by NF-κB activation through the mitochondrial E3 ubiquitin ligase MULAN. Our results suggest that during SIMH, MULAN forms a complex with the protein TRAF2 and modulates its ubiquitinylation to allow NF-κB signaling transduction. This work shows that, through their dynamics, mitochondria convert stress signals into a prosurvival response via NF-κB activation.In summary, our results illustrate the complexity of the ubiquitin-dependant regulation of NF-κB and attribute a new role in signaling transduction to the organelles.

ARCA2 est une ataxie autosomique récessive rare, caractérisée par une atrophie du cervelet et un léger déficit en Coenzyme Q10 (CoQ). La majorité des patients présentent des signes neurologiques supplémentaires comme l’épilepsie ou l’intolérance à l’exercice. La maladie est due à des mutations dans le gène COQ8A qui semble encoder une protéine kinase-like atypique, impliquée dans la biosynthèse du CoQ. Pour comprendre les mécanismes physiopathologiques, une souris Coq8a knock-out (KO) constitutif a été générée et récapitule les symptômes observés chez les patients. Le but de ce travail de thèse était de mieux comprendre certains aspects, notamment l’intolérance à l’exercice et l’ataxie. Malgré un déficit en CoQ dans les muscles, aucun défaut de respiration mitochondriale n’a été détecté dans un modèle cellulaire de muscle. Néanmoins, dans le cervelet, les niveaux de transcrits de 27 gènes sont dérégulés, précocement dans l’apparition de la pathologie chez les souris KO. Les voies métaboliques vont être explorées, ce qui devrait permettre de relier la fonction de COQ8A au taux de CoQ et aux symptômes observés chez les patients. / ARCA2, a rare form of recessive ataxia, is characterized by early onset progressive ataxia, cerebellar atrophy and a mild Coenzyme Q10 deficiency. Most of the patients show additional neurological signs such as epilepsy and exercise intolerance. Mutations in the COQ8A gene lead to ARCA2. COQ8A is suggested as being an unorthodox protein kinase like, with a regulatory role in CoQ biosynthesis, in mammals. To better understand ARCA2, a constitutive Coq8a knock-out (KO) mouse model was generated, which recapitulates most of the patient’s symptoms. Here we report the use of cellular models and the affected tissues to uncover the molecular signature of COQ8A loss and CoQ deficit. Despite CoQ deficit in the muscle, no mitochondrial bioenergetics defect was uncovered. In parallel, we have identified, by RT-qPCR, a key set of genes that are dysregulated in cerebellum, very early on in the pathology. We are currently investigating these pathways to uncover the link with COQ8A function. Altogether, our experiments will shed light on the early molecular events that lead to ARCA2 and may help draw a link between COQ8A function, CoQ pools and the symptoms observed in patients.

La mitochondrie est le siège principal de la production d’énergie sous forme d’ATP en conditions aérobies, mais aussi d’espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS). La fonction mitochondriale est étroitement liée à la production de ROS puisque ces derniers, selon leur taux, peuvent altérer ou optimiser le rendement énergétique. La plasticité structurale et fonctionnelle de la mitochondrie est essentielle au maintien de l’homéostasie dans toute situation qui nécessite des ajustements métaboliques comme l’exercice physique. Les mécanismes adaptatifs de la fonction mitochondriale et des ROS lors de l’entrainement sont encore loin d’être élucidés ainsi que l’impact du genre sur ces réponses. Dans cette perspective, deux modèles animaux (rat Wistar et anguille européenne) ont été choisis. Les effets d’un entrainement en endurance de même intensité (70% de la vitesse maximale aérobie de course ou de nage) ont été étudiés chez le rat Wistar et l’anguille européenne argentée. Cette dernière est une espèce endurante capable d’effectuer une migration de reproduction de 6000 km et caractérisée par un dimorphisme sexuel de taille. Des mesures in vitro de la consommation d’oxygène, la production radicalaire et d’ATP ont été effectuées simultanément à partir de fibres perméabilisées de cœur et de muscle squelettique. La vulnérabilité ou résistance de la fonction mitochondriale à l’exposition à un système générateur de ROS (mimant un stress oxydant) a également été étudiée. Avant entrainement, chez le rat Wistar, la femelle présente une fonction mitochondriale plus efficiente énergétiquement et plus résistante aux ROS, alors que chez l’anguille, ce profil métabolique et radicalaire est plutôt observé chez le mâle. Après entrainement, quelle que soit l’espèce, la meilleure performance physique observée s’accompagne de modifications métaboliques et radicalaires différentes selon le genre et l’espèce. Chez le rat, l’amélioration de la fonction mitochondriale se traduit différemment selon le sexe. Chez le mâle, l’entrainement induit une amélioration du rendement énergétique via un meilleur couplage entre oxydation et phosphorylation et/ou une meilleure utilisation des électrons au niveau de la chaine respiratoire. Chez la femelle, l’augmentation de la production d’ATP serait liée à l’augmentation de la consommation d’oxygène mitochondriale. Comme chez le rat, l’entraînement induit globalement chez l’anguille une amélioration du rendement énergétique et de la résistance de la fonction mitochondriale aux ROS, mais uniquement chez le mâle. L’ensemble de ces résultats montre des réponses métaboliques et radicalaires dépendantes du genre. Quelle que soit l’espèce, l’entrainement semble être chez le mâle plus bénéfique que chez la femelle en termes d’efficacité énergétique mitochondriale et de résistance de la fonction mitochondriale à un stress oxydant. Dans le contexte de la migration de l’anguille, ces adaptations permettraient au mâle, largement plus petit que la femelle, une efficacité de nage supérieure, permettant leur synchronisation d’arrivée sur le lieu de reproduction. Les similitudes interspécifiques de réponse à l’entraînement selon le genre confortent l’intérêt d’utilisation du modèle poisson dans le champ de la physiologie de l’exercice. / Mitochondrion is the main site of aerobic energy (ATP) and reactive oxygen species (ROS) productions. Mitochondrial function is closely linked to ROS, which, according their rate, can alter or optimize energy efficiency. Structural and functional plasticity of mitochondria is essential to maintain homeostasis in any situation that requires metabolic adjustments as physical exercise. The adaptive mechanisms of mitochondrial function and ROS during training and the impact of gender on these responses are still far from being solved. In this perspective, two animal models (Wistar rat and European eel) were chosen.The effects of endurance training of the same intensity (70% of maximal aerobic speed running or swimming) were studied in Wistar rat and silver European eel. The latter is an enduring species capable of performing a spawning migration of 6000 km and characterized by sexual dimorphism in size. In vitro measurements of oxygen consumption, free radical and ATP productions were carried out simultaneously from heart and skeletal muscle permeabilized fibers. The vulnerability or resistance of the mitochondrial function to a ROS generating system exposure (mimicking oxidative stress) was also studied.Before training, in rat, female has a mitochondrial function energetically more efficient and more resistant to ROS, whereas in eel, this metabolic and radical profile is observed rather in male. After training, whatever the species, the improved physical performance observed is associated with various metabolic and radical changes which depending on gender and species. In rats, the improving of mitochondrial function translates differently according to gender. In male, training induces improvement in energy efficiency through a better coupling between oxidation and phosphorylation and/or better use of electrons at the respiratory chain level. In female, increasing in ATP production may be related to the increase in mitochondrial oxygen consumption. As in rats, training induces globally in eel an improvement in energy efficiency and resistance of mitochondrial function to ROS, but only in male. All these results show metabolic and radical responses depending on gender. Whatever the species, training seems to be most beneficial in males than in females in terms of mitochondrial energy efficiency and resistance of mitochondrial function to oxidative stress. In the context of eel migration, these adaptations allow to male, largely smaller than female, a higher swim efficiency, allowing their synchronization on breeding site. Interspecific similarities in training response by gender confirm the interest of fish model’s using in the field of exercise physiology.

La maladie de Parkinson (MP) est une affection neurodégénérative fréquente d’étiologie inconnue, touchant environ 5% de la population mondiale après 80 ans. Environ 10% des cas correspondent à des formes familiales à transmission mendélienne. Pendant longtemps, un dysfonctionnement mitochondrial a été soupçonné jouer un rôle dans la physiopathologie de la MP. Cette possibilité a été récemment corroborée par des découvertes majeures réalisées dans le cadre des formes autosomiques récessives. Parkine et PINK1, les produits de deux gènes associés à ces formes familiales, participent au sein d’une même voie moléculaire au contrôle de la qualité mitochondriale, par la régulation du transport, de la dynamique, de la biogenèse et de la clairance de ces organites.L’objectif de ce travail a été d’élucider certains des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation de l’homéostasie mitochondriale par Parkine et PINK1. Nous avons utilisé un ensemble d’approches de biologie moléculaire et cellulaire, de biochimie et de microscopie confocale, afin d’identifier et de caractériser des interacteurs moléculaires de Parkine et PINK1 à la membrane mitochondriale externe (MME).Dans la première partie de ce travail, nous avons découvert que la Parkine et PINK1 s’associent sur la MME de mitochondries dysfonctionnelles à proximité de la translocase de la MME (TOM), un complexe dédié à l’import de la grande majorité des protéines mitochondriales. Nous avons montré que ces interactions protéiques jouent un rôle clé dans l’activation du programme de dégradation mitochondriale régulé par la voie PINK1/Parkine. Nous avons également observé que la GTPase de type dynamine Drp1, impliquée dans la fission mitochondriale, est recrutée au niveau de mitochondries endommagées à proximité de Parkine et PINK1 ; ainsi, les processus de fission et de dégradation mitochondriales pourraient être spatialement coordonnés. Dans la deuxième partie de ce projet, nous avons caractérisé l’interaction fonctionnelle entre la Parkine et l’enzyme neuroprotectrice multifonctionnelle de la matrice mitochondriale, 17B-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 10 (HSD17B10), dont les taux s’étaient révélés être diminués chez la souris déficiente en Parkine. Nous avons mis en évidence un effet protecteur d’HSD17B10 vis-à-vis de la mitochondrie qui était indépendant de son activité catalytique. Nous avons de plus montré que la Parkine interagit directement avec HSD17B10 à proximité de la machinerie TOM et qu’elle régule positivement l’abondance mitochondriale de cette protéine ; cela suggère qu’elle pourrait promouvoir son import.Dans l’ensemble, ces résultats approfondissent notre connaissance des mécanismes moléculaires mis en jeu par la Parkine et PINK1 dans le contrôle de la qualité mitochondriale, élargissant ainsi notre compréhension de leur rôle dans la physiopathologie des formes autosomiques récessive de MP. / Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder of unknown etiology, affecting nearly 5% of the world population over the age of 80. Nearly 10% of PD cases are familial forms with Mendelian inheritance pattern. Mitochondrial dysfunction has long been suspected to play a role in the physiopathology of sporadic PD. This possibility has been recently corroborated by major discoveries in the field of autosomal recessive PD. Parkin and PINK1, the products of two genes associated with these forms, participate in a common molecular pathway focused on maintenance of mitochondrial quality, with roles in mitochondrial transport, dynamics, biogenesis and clearance.The aim of this work was to elucidate some of the molecular mechanisms underlying the regulation of mitochondrial homeostasis by Parkin and PINK1. We used a combination of approaches in molecular and cell biology, biochemistry and confocal microscopy to identify and characterize molecular interactors of Parkin and PINK1 on the outer mitochondrial membrane (OMM).In the first part of my project, we discovered that Parkin and PINK1 associate on dysfunctional mitochondria in proximity of the translocase of the OMM (TOM), a complex devoted to the mitochondrial import of the vast majority of the mitochondrial proteins. We provided evidence that these associations play a key role in activation of the mitochondrial degradation program mediated by the PINK1/Parkin pathway. We also observed that the dynamin-related GTPase Drp1, involved in mitochondrial fission is recruited to defective mitochondria in proximity of Parkin and PINK1, suggesting that mitochondrial fission occurs at sites where mitochondrial clearance is initiated.In the second part of my project, we characterized the functional interaction between Parkin and the multifunctional neuroprotective mitochondrial matrix enzyme 17B-hydroxysteroid dehydrogenase type 10 (HSD17B10), previously found by the team to be altered in abundance in Parkin-deficient mice. We demonstrated that HSD17B10 exerts a mitochondrion-protective function independent of its enzymatic activity. In addition, we provided evidence that Parkin directly interacts with HSD17B10 at the TOM machinery and that it positively regulates its mitochondrial levels, possibly through the regulation of its mitochondrial import.Altogether, these results provide novel insights into the molecular mechanisms by which Parkin and PINK1 control mitochondrial quality, and deepen our understanding of the role of these proteins in the physiopathology of autosomal recessive PD.

L'atrophie optique autosomique dominante (ADOA) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A) sont deux neuropathies héréditaires respectivement liées aux mutations des gènes OPA1 et MFN2. Les protéines OPA1 et MFN2 sont impliquées dans la dynamique de fusion des mitochondries. Ces organites intracellulaires sont essentiels dans les processus de synthèse d'ATP. L'hypothèse d'un déficit énergétique impliqué dans la physiopathologie de ces neuropathies devait alors être testée. Nous avons mis en évidence une baisse d'efficacité des phosphorylations oxydatives dans les fibroblastes de peau de patients atteints d'ADOA et de CMT2A. Ce découplage est associé à une baisse d'activité du complexe IV et à une augmentation de l'activité du complexe V dans le cas de l'ADOA. Dans le cas de la CMT2A, le découplage est associé à une augmentation de l'activité et de la quantité de la translocase des nucléotides adényliques (ANT). Une étude sur mitochondries isolées de cerveaux d'un modèle murin MFN2(R94Q) de CMT2A montre une baisse d'activité des complexes II et V associée à l'ouverture du canal mitochondrial potassique sensible à l'ATP (mKATP). Nos résultats montrent qu'OPA1 et MFN2, deux protéines de la dynamique mitochondriale ont un rôle majeur dans la régulation énergétique mitochondriale.

Nos travaux de recherche menés dans l'ischémie cérébrale néonatale ont évalué l'effet de la Ciclosporine A sur la réduction du volume lésionnel, mais aussi sur le fonctionnement du métabolisme mitochondrial. Nous avons également étudié l'effet du postconditionnement ischémique et les conséquences hémodynamiques de la reperfusion. Le pore de perméabilité membranaire mPTP s'ouvre au cours de l'ischémie néonatale. La CsA, inhibiteur de la Cyclophiline D freine l'ouverture du pore mPTP, améliore la capacité de recapture du calcium par la mitochondrie, la respiration mitochondriale, et limite les effets inflammatoires de l'ischémie. Néanmoins, la CsA ne réduit pas le volume des lésions cérébrales. Nous avons pu montrer que la Cyclophiline D et le pore mPTP étaient bien deux acteurs majeurs dans la constitution des lésions induites par la reperfusion dans l'ischémie cérébrale focale néonatale. Le postconditionnement ischémique ne permet pas de réduire les volumes des lésions. Nous avons montré que la reperfusion chez le jeune était progressive et lente, sans hyperhémie comme chez l'adulte. Cette cinétique de reperfusion est identique dans les deux hémisphères, tant pour la perfusion tissulaire corticale que pour la perfusion des régions cérébrales profondes. La vasoconstriction cérébrale chez le jeune traduit le recrutement précoce de la circulation collatérale mais aussi les dysfonctionnements de la microcirculation cérébrale. Au final, ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques au profil particulier de la reperfusion dans le cerveau immature